内切葡聚糖酶NfEG12A突变体及其编码基因和应用的制作方法

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及内切葡聚糖酶nfeg12a突变体及其编码基因和应用。

背景技术：

纤维素、半纤维素和木质素是植物细胞壁的主要成分。纤维素是由吡喃葡萄糖以不同比例的β-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的长链多糖聚合物。β-葡聚糖链通过分子内和分子间氢键的紧密排列形成不可溶的纤维素微丝。

nfeg12a是一种偏高温酸性酶，最适温度65℃，最适ph5.0，是目前已知的该家族中酶活最高的酶，为了进一步提高其工业应用潜能，对该酶进行分子工程改造，以提高其催化水解纤维类底物的效率。

技术实现要素：

本发明的目的是提供内切葡聚糖酶突变体nfeg12a-y7w、nfeg12a-y111w、nfeg12a-y7/111w。

本发明的再一目的是提供编码上述内切葡聚糖酶突变体的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述内切葡聚糖酶突变体基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述内切葡聚糖酶突变体基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述内切葡聚糖酶突变体基因的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述内切葡聚糖酶突变体的应用。

本发明对内切葡聚糖酶nfeg12a进行定点突变，分别构建了突变体nfeg12a-y7w、nfeg12a-y111w、nfeg12a-y7/111w。

内切葡聚糖酶nfeg12a的氨基酸序列如seqidno.1所示：(加粗氨基酸序列为信号肽，下划线氨基酸为突变位点)

本发明在nfeg12a的7和111位点，通过定点突变构建了突变体nfeg12a-y7w、nfeg12a-y111w、nfeg12a-y7/111w，所述突变体为内切葡聚糖酶nfeg12a的第7位的氨基酸y、第111位的氨基酸y分别或同时突变为w，从而使其对β-1,3-1,4-葡聚糖和木葡聚糖的催化效率分别提高了0.5-0.8和0.9-2.5倍，提升了其工业应用价值。

根据本发明的具体实施方式，设计各突变引物，以编码内切葡聚糖酶nfeg12a基因的野生型质粒ppic9γ-nfeg12a为模板进行定点突变。纯化得到含有突变体密码子的质粒，并将其转化进毕赤酵母感受态细胞gs115中进行表达，得到重组突变体蛋白。

本发明通过pcr的方式引入突变，获得突变体内切葡聚糖酶nfeg12a-y7w、nfeg12a-y111w、nfeg12a-y7/111w。本发明还提供了包含上述内切葡聚糖酶基因的重组载体，命名为ppic9γ-nfeg12a-y7w,ppic9γ-nfeg12a-y111w,ppic9γ-nfeg12a-y7/111w。

将本发明所述的内切葡聚糖酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的内切葡聚糖酶基因插入到质粒ppic9γ上的eorri和noti限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于aox1启动子的下游并受其调控。

本发明还提供了包含上述基因的重组菌株，优选重组菌株为gs115/nfeg12a-y7w,gs115/nfeg12a-y111w，gs115/nfeg12a-y7/111w。

本发明还提供了一种制备内切葡聚糖酶突变体的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞毕赤酵母gs115，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶表达；

3)回收并纯化所表达的内切葡聚糖酶突变体。

本发明还提供了上述内切葡聚糖酶突变体的应用。

本发明的突变体nfeg12a-y7w,nfeg12a-y111w,nfeg12a-y7/111w的最适温度与最适ph均与野生酶一致，为65℃和ph5.0，这些突变体对β-1,3-1,4-葡聚糖和木葡聚糖的催化效率分别提高了0.5-0.8倍，且具有良好的耐热性和ph耐受性，因此在工业中有非常可观的应用前景。

附图说明

图1显示图nfeg12a及其突变体的酶学性质测定；

图2显示野生酶与突变酶的比活测定。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体ppic9及菌株gs115购自于invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自takara公司，连接酶购自sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)neosartoryafischerip1.培养基为马铃薯培养基(1000ml)：200g土豆煮汁，10g葡萄糖，25g琼脂，ph5.0。

(2)大肠杆菌培养基lb(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％nacl,ph7.0)。

(3)bmgy培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.00004％biotin，1％甘油(w/v)。

(4)bmmy培养基：除以0.5％甲醇代替甘油,其余成份均与bmgy相同，ph6.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1

1.突变的构建

突变体nfeg12a-y7w、nfeg12a-y111w、nfeg12a-y7/111w是通过定点突变的方法构建的，电泳验证pcr结果，若有目标条带，加入1μldmt酶于37℃下处理1h，以去除原质粒模板，后转化transi-t1测序。

2、各突变体载体转化毕赤酵母gs115及工程菌的筛选

制备受体感受态细胞。

用灭菌牙签从md板上挑取单克隆，按先后次序标号，先点到mm上，再点到相应编号的md平板上；将两平板置于30℃培养箱中培养2天。按编号挑取正常生长的转化子接种于3mlbmgy培养基中，装有bmgy培养基的离心管需要严格无菌且包有八层纱布，将其置于30℃、220rpm摇床培养48h；将摇床培养48h的菌液置于3000g离心10min，去上清，向离心管中加入1ml含有0.5％甲醇的bmmy培养基，在30℃、260rpm诱导培养。诱导培养48h后，将菌液置于12000rpm离心3min，取上清检测活性，从中筛选出具有葡聚糖酶活性的转化子。

将含有较高的内切葡聚糖酶酶活菌株接种于300mlbmgy培养基的1l三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100ml含有0.5％甲醇的bmmy培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5ml甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。

3、本发明所述的突变内切葡糖酶活力的测定

3.1内切葡聚糖酶的活性单位(u)定义：在给定的条件下，每分钟分解葡聚糖生成1μmold-(+)-还原糖所需的酶量。

3.2重组酶反应最适ph和ph稳定性的测定：

将纯化好的重组内切葡聚糖酶在65℃下，不同ph的底物中进行酶学反应，以测定其最适ph。所用缓冲液为：ph2.0–8.0的mcilvaine缓冲液(0.2m磷酸氢二钠/0.1m柠檬酸)，ph7.0–9.0的0.1mol/l的tris-hcl缓冲液，以及ph10.0–12.0的gly-naoh缓冲液。

ph稳定性测定：将浓缩后的纯酶液在不同ph值的缓冲液中置于37℃下处理1h，再用最适ph的缓冲液作适当稀释，在最适ph和最适温度的条件下测定剩余酶活性。

3.3重组酶反应最适温度和温度稳定性的测定：

葡聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液体系(ph5.0)及不同温度下进行酶促反应。耐热性测定为葡聚糖酶在65℃和70℃下分别处理10、20、30、60min后，于最适温度下进行剩余酶活性测定。

3.4重组酶比活、km值及vmax的测定重组酶

参照李宁的方法(李宁,2009)，测定反应的一级反应时间。确定测定km及vmax的反应时间为5min。用不同浓度的葡萄糖(0.5，0.4，0.25，0.2，0.2，0.175，0.15、0.1、0.05％)为底物，在最适条件下测定酶活性，计算出相应的反应速度，利用graphpadprism5软件计算km值及vmax。

按照bio-rad试剂盒的方法，绘制标准曲线。测定方法：首先通过标准曲线计算目的蛋白的含量，其次是在最适条件下测得重组酶的酶活，用酶活数除以蛋白的浓度可得酶的比活。比活力的定义为：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数。

野生酶与突变酶的基本性质测定，结果如图1所示，从结果可以看出，相比于野生酶nfeg12a，突变酶nfeg12a-y7w、nfeg12a-y111w、nfeg12a-y7/111w的最适温度与最适ph均没有改变，均为65℃，ph5.0。在ph稳定性方面，野生酶与突变酶的的稳定范围均在ph2～9，在ph10和11的条件下剩余约40％-80％左右的相对酶活力。在热稳定性方面，野生酶与突变酶均在65℃下保持稳定，70℃处理20min已丧失酶活力。这些结果说明，突变体的基本酶学性质并没有改变

野生酶及突变酶的动力学实验测定如以下表1所示。

表1nfeg12a及其突变体的动力学参数测定

通过对酶及其突变体的动力学参数分析发现，与野生酶相比，所有突变体的km值均降低，kcat值出现不同程度的变化，最终使得nfeg12a-y7w,nfeg12a-y111w,和nfeg12a-y7/111w对β-葡聚糖的催化效率分别提高到2.0，1.8和1.5倍。当以木葡聚糖为底物时，所有的突变体均表现出提高的底物亲和力和催化效率，且双突变体nfeg12a-y7/111w提高的最明显，达到3.5倍。这些结果说明，7和111位点为w时，有利于提高gh12对底物的亲和力，尤其是对支链的木葡聚糖。

野生酶与突变酶的比活测定

nfeg12a对β-葡聚糖的比活为6587u/mg，对木葡聚糖的比活为102u/mg。与野生酶相比，单突变体对两类底物的比活均增加，nfeg12a-y7w和nfeg12a-y111w对β-葡聚糖的比活提高为野生酶的1.4和1.5倍，对木葡聚糖的比活均提高到了2倍。但是双突变体nfeg12a-y7/111w的比活与野生酶一致，但对木葡聚糖的比活提高到2倍。此外，nfeg12a对木葡聚糖与β-葡聚糖两类底物的活性百分比为1.5％。当y被w替换后，相对酶活占比均提高，提高最显著的是nfeg12a-y7/111w，占比分别达到3.2％。这说明单独在7或者111位点引入w有利于两类底物的结合，而在两个位点同时引入w时，更有利于支链的木葡聚糖的水解。

序列表

<110>中国农业科学院饲料研究所

<120>内切葡聚糖酶nfeg12a突变体及其编码基因和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>234

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metlysthrphealaileleuglyalaphepheserseralaleuala

151015

glnthrleucysaspglntyralathrtyrserasnglyargtyrthr

202530

valasnasnasnleutrpglylysserserglyserglyserglncys

354045

thrtyrvalaspserileserasnserglyvalalatrphisthrthr

505560

trpthrtrpserglyglyaspasnglnvallyssertyralaasnser

65707580

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859095

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100105110

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glyasptyrgluleumetiletrpleualaargtyrglyservalgln

130135140

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225230