本发明涉及单宁酶制备领域，特别涉及一种单宁酶固态发酵培养基制备方法及其应用。
背景技术：
单宁酶(tannase，ec3.1.1.20)全称单宁酯酰水解酶，可以水解没食子酸单宁生成没食子酸和葡萄糖。单宁酶在自然界中有相当广泛的分布，早在20世纪20年代就有人在进行黑曲霉培养时发现菌丝内含有单宁酶，以后又陆续发现各类微生物，包括真菌、酵母、细菌都能产生单宁酶；单宁酶还存在于一些富含单宁的植物材料中，例如茶叶提取物中可以检测到单宁酶。
随着经济的发展和人们生活水平的提高，单宁酶已广泛应用于饮料、酿酒、食品、医药、化工、制革、化妆品等领域，特别是在制备药用中间体没食子酸和食品抗氧化剂没食子酸丙酯，以及在处理茶叶的“冷后浑”和啤酒沉淀等方面，有重要应用价值。
葡萄酒酿造在我国新疆、河北等地具有显著的地域产业优势，酿酒后的下脚料葡萄皮和葡萄籽通常作为垃圾处理。棉花在我国北方地区大面积种植，其秸秆是一种产量巨大的农业副产物，目前通常采用焚烧的方式处理，加剧了北方地区冬季的雾霾。通过将葡萄酒酿造下脚料与农业副产物与外加营养液的配合，可以发酵生产高经济价值的单宁酶，实现了这些废弃物的高价值转化，同时也可有助于解决环境污染问题。
菌丝体接种易于大规模培养和工厂化生产，并能够提供稳定的菌种来源，跨越过孢子萌发和菌体生长调整阶段，单宁酶合成周期得以提前。此外因已含有少量单宁酶的菌丝体在接种前被强制打碎成小段的菌体，接种在固态发酵培养基中后能够强烈的刺激微生物生长并利用营养物快速合成单宁酶。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明目的在于提供一种充分利用农林废弃物实现单宁酶高效生产的单宁酶固态发酵培养基制备方法及其应用。
为达到上述目的，本发明的提出的技术方案为：一种单宁酶固态发酵培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1固态发酵培养基原料预处理：取酿酒后烘干的葡萄皮、籽混合物，粉碎后过筛，取筛下物备用；取烘干或晒干的棉花秸杆，粉碎后过筛，取筛下物备用；将葡萄皮、籽粉末及棉花秸秆粉末按照质量比2:1-4:1的比例混合，充分搅拌均匀；
步骤2固体基质外加营养液制备：
准备下述重量份的原料：
玉米浆5-15ml，
硫酸铵40-60g，
将上述原材料完全溶解于1l去离子水中；调节营养液ph至5-6，获得固体基质外加营养液；
步骤3培养料制备及灭菌：将混合均匀的葡萄皮、籽杆粉末及棉花秸秆颗粒作为固体基质，与固体基质外加营养液按照质量体积比1:2-1:3（m/v），混合并搅拌均匀制备获得培养料；培养料经灭菌后获得单宁酶固态发酵培养基。
进一步的，步骤1中所述的葡萄皮、籽混合物高速粉碎后过30-50目筛。
进一步的，步骤1中所述的棉花秸杆粉碎后过8-16目筛。
进一步的，步骤2中所述的ph优选为5.5。
进一步的，步骤3所述的灭菌方法为121℃高压蒸汽灭菌10min。
本发明还包括一种单宁酶固态发酵培养基的应用，其特征在于：采用上述的单宁酶固态发酵培养基应用于单宁酶的制备。
进一步的，所述的单宁酶的制备包括以下步骤：
步骤1：将产单宁酶丝状真菌菌株打碎制备菌体悬液接入固态发酵培养基中，搅拌均匀；
步骤2：遮光，恒温静置培养，发酵后可获得最高单宁酶。
进一步的，所述的产单宁酶丝状真菌菌株为米曲霉菌丝体。
进一步的，步骤1中每15g单宁酶固态发酵培养基加入8ml菌丝体悬液。
进一步的，步骤2中恒温稳定为25-35℃。
进一步的，所述的发酵时间为72-120h。
采用上述技术方案，本发明所述的单宁酶固态发酵培养基制备方法及其应用，充分利用葡萄酒酿酒下脚料葡萄皮、籽和棉花秸秆作为固态发酵基质生产高经济价值的单宁酶，实现了葡萄酒酿造下脚料和农林废弃物的高值化利用，同时也可有助于解决我国北方地区焚烧棉秆等农林废弃物引起的环境污染问题。
具体实施方式
下面结合具体实施列，对本发明做进一步说明。
实施例1
（1）单宁酶固态发酵培养基的制备
步骤1固态发酵培养基原料预处理：取酿酒后烘干的葡萄皮、籽混合物，粉碎后过40目筛，取筛下物备用；取烘干或晒干的棉花秸杆，粉碎后过10目筛，取筛下物备用；将葡萄皮、籽粉末及棉花秸秆粉末按照质量比3:1的比例混合，充分搅拌均匀；
步骤2固体基质外加营养液制备：
准备下述重量份的原料：
玉米浆10ml，
硫酸铵50g，
将上述原材料完全溶解于1l去离子水中；调节营养液ph至5.5，获得固体基质外加营养液；
步骤3培养料制备及灭菌：将混合均匀的葡萄皮、籽杆粉末及棉花秸秆颗粒作为固体基质，与固体基质外加营养液按照质量体积比1:3（m/v）即1kg的固体基质中加入3l的固体基质外加营养液，混合并搅拌均匀制备获得培养料；取混合均匀的培养料15g装入500ml锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌10min后获得单宁酶固态发酵培养基；
（2）单宁酶的制备
步骤1：将培养3天的米曲霉菌丝体打碎制备菌体悬液按照每瓶培养基接种8ml的接种量接入固态发酵培养基中，搅拌均匀；
步骤2：遮光，恒温30℃静置培养，发酵96h后分离获得单宁酶产量284u/gds。
实施例2
（1）单宁酶固态发酵培养基的制备
步骤1固态发酵培养基原料预处理：取酿酒后烘干的葡萄皮、籽混合物，粉碎后过30目筛，取筛下物备用；取烘干或晒干的棉花秸杆，粉碎后过8目筛，取筛下物备用；将葡萄皮、籽粉末及棉花秸秆粉末按照质量比2:1的比例混合，充分搅拌均匀；
步骤2固体基质外加营养液制备：
准备下述重量份的原料：
玉米浆5ml，
硫酸铵40g，
将上述原材料完全溶解于1l去离子水中；调节营养液ph至6.0，获得固体基质外加营养液；
步骤3培养料制备及灭菌：将混合均匀的葡萄皮、籽杆粉末及棉花秸秆颗粒作为固体基质，与固体基质外加营养液按照质量体积比1:2（m/v）即1kg的固体基质中加入2l的固体基质外加营养液，混合并搅拌均匀制备获得培养料；取混合均匀的培养料15g装入500ml锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌10min后获得单宁酶固态发酵培养基；
（2）单宁酶的制备
步骤1：将培养3天的米曲霉菌丝体打碎制备菌体悬液按照每瓶培养基接种8ml的接种量接入固态发酵培养基中，搅拌均匀；
步骤2：遮光，恒温25℃静置培养，发酵96h后分离获得单宁酶产量268u/gds。
实施例3
（1）单宁酶固态发酵培养基的制备
步骤1固态发酵培养基原料预处理：取酿酒后烘干的葡萄皮、籽混合物，粉碎后过50目筛，取筛下物备用；取烘干或晒干的棉花秸杆，粉碎后过16目筛，取筛下物备用；将葡萄皮、籽粉末及棉花秸秆粉末按照质量比4:1的比例混合，充分搅拌均匀；
步骤2固体基质外加营养液制备：
准备下述重量份的原料：
玉米浆15ml，
硫酸铵60g，
将上述原材料完全溶解于1l去离子水中；调节营养液ph至5.0，获得固体基质外加营养液；
步骤3培养料制备及灭菌：将混合均匀的葡萄皮、籽杆粉末及棉花秸秆颗粒作为固体基质，与固体基质外加营养液按照质量体积比1:2.5（m/v）即1kg的固体基质中加入2.5l的固体基质外加营养液，混合并搅拌均匀制备获得培养料；取混合均匀的培养料15g装入500ml锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌10min后获得单宁酶固态发酵培养基；
（2）单宁酶的制备
步骤1：将培养3天的米曲霉菌丝体打碎制备菌体悬液按照每瓶培养基接种8ml的接种量接入固态发酵培养基中，搅拌均匀；
步骤2：遮光，恒温35℃静置培养，发酵120h后分离获得单宁酶产量257u/gds。
尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。