本发明涉及一种低温尿嘧啶dna糖苷酶的制备方法。
背景技术：
目前pcr交叉污染防治中添加的尿嘧啶dna糖苷酶来源于常温微生物，其在低温下的失活效果不明显，只能在高温加热才能失活，导致pcr过程中目的基因扩增产量低，使得基于pcr的核酸检测灵敏度降低。
目前pcr中添加的尿嘧啶dna糖苷酶来源于常温微生物，其只能在30-40度具有最高活性，同时只有在70度以上才失活。
技术实现要素：
本发明针对现有pcr检测中添加的尿嘧啶dna糖苷酶的缺陷，开发了一种低温尿嘧啶dna糖苷酶的制备方法，该方法制备出了在低温发挥活性的尿嘧啶dna糖苷酶，该尿嘧啶dna糖苷酶来自于嗜冷微生物colwelliapsychrerythraea，并经过基因改造，使得其在20-25度的温度范围内，能够有效发挥最高活性，而在高温迅速丧失活性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是设计一种低温尿嘧啶dna糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、设计合成嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶基因，并插入pet28表达载体，构建dna连接酶的重组表达质粒；重组嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶n端带有来源于pet28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化；
步骤二，重组表达嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶；将嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主bl21（de3），得到嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶重组表达菌株；将表达菌株培养至od600=0.6，加入0.5mm诱导剂iptg，在20℃温度下培养12小时，诱导嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶表达；
嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如seqidno:1所示。
seqidno:1
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第三步，嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶亲和纯化；将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液（20mmtris-hcl,ph8.0,300mmnacl,0.5mmdtt，10vol%甘油）；超声波破碎菌体，离心收集含有嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶的菌体裂解上清液；利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶；
第四步，检测嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶活性温度依赖性；利用含du的单链dna作为底物，加入嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶，测定酶活性与温度依赖性。具体酶活性温度依赖性结果见图1。结果表明嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶在20-25内具有最高酶活性。
本发明的优点和有益效果在于：本发明为一种来自于嗜冷微生物colwelliapsychrerythraea的低温型尿嘧啶dna糖苷酶。由于该尿嘧啶dna糖苷酶来源于低温微生物，在20-25度表现最高的酶活性，而在50度加热5分钟即完全失活。显著改善了pcr的交叉污染防治效果。
附图说明
图1为基于开发的低温型尿嘧啶dna糖苷酶水解du的最优曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例：
一种低温尿嘧啶dna糖苷酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、设计合成嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶基因，并插入pet28表达载体，构建dna连接酶的重组表达质粒；重组嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶n端带有来源于pet28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化；
步骤二，重组表达嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶；将嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主bl21（de3），得到嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶重组表达菌株；将表达菌株培养至od600=0.6，加入0.5mm诱导剂iptg，在20℃温度下培养12小时，诱导嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶表达；
嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如seqidno:1所示。
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第三步，嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶亲和纯化；将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液（20mmtris-hcl,ph8.0,300mmnacl,0.5mmdtt，10vol%甘油）；超声波破碎菌体，离心收集含有嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶的菌体裂解上清液；利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶；
第四步，检测嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶活性温度依赖性；利用含du的单链dna作为底物，加入嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶，测定酶活性与温度依赖性。具体酶活性温度依赖性结果见图1。结果表明嗜冷细菌colwelliapsychrerythraea尿嘧啶dna糖苷酶在20-25内具有最高酶活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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