本发明属于纳米药物技术领域，特别涉及一种用于输送疏水性药物的活性氧响应性纳米载体及其制备方法。
背景技术：
纳米药物载体可以大大提高难溶性药物的水溶性，有效延长药物在血液中的循环时间，提高药物的生物利用度，并且降低药物对正常细胞和组织的毒副作用；通过结构设计还可以实现对药物在体内的吸收、分布和代谢过程的控制，实现靶向给药和控制释放，提高药物疗效。
炎症、纤维化、肿瘤及老化等疾病往往伴有氧化应激，表现为局部活性氧物质(ROS)，主要包括OH·、H2O2等的浓度上调。具有活性氧响应性的智能纳米药物载体系统有望用于携带治疗或显像物质，实现针对疾病病灶的定位控制释放，因而受到广泛关注。发展中的氧化响应性载体主要有聚丙硫醚(PPS)、酮缩硫醇聚合物、含硒高分子及含芳基硼酸或硼酸酯高分子等。但现有的氧化响应体系制备及综合性能还有待优化提升，尚不能满足实际的应用需要。
聚天冬氨酸具有良好的生物相容性和体内生物可降解性，且易于进行化学修饰，被广泛地用于制备胶束、纳米凝胶等纳米药物载体。但传统的聚天冬氨酸纳米载体无法实现对体内病灶微环境的响应，限制了药物的靶向控制释放。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于提供一种用于输送疏水性药物的活性氧响应性纳米载体。本发明的另一目的在于提供由上述活性氧响应性纳米载体的制备方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于输送疏水性药物的活性氧响应性纳米载体，所述载体的结构是芳基硼酸酯氨基酸改性聚天冬氨酸，其具有通式I的结构：
其中，R为亚甲基、亚乙基或亚苯基；R1为H、甲酯或乙酯；n为1～10000的整数，x为1～4000的整数。
用于输送疏水性药物的活性氧响应性纳米载体的制备方法，包括以下步骤：
(1)羟基端保护的氨基酸溶于无水DMF，加入NaH，搅拌30min，再加入含4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的无水DMF，开环反应；反应完毕用水分散，三氯甲烷、乙酸乙酯萃取体系各三次，收集有机相，旋干，柱层析得到芳基硼酸酯修饰的氨基酸衍生物(II)：
式II中：R为亚甲基、亚乙基或亚苯基；R1为H、甲酯或乙酯；
其中，羟基端保护的氨基酸与NaH与4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的摩尔用量比例是1～2:3～5:1～2，无水DMF的量控制在10mL～20mL/g羟基端保护的氨基酸；
(2)将聚琥珀酰亚胺和芳基硼酸酯修饰的氨基酸衍生物溶于有机溶剂，摩尔比为1.0:(0.2～20)，搅拌反应，再调节反应体系pH值至8～12，继续搅拌反应，得到芳基硼酸酯氨基酸改性聚天冬氨酸粗品；(3)将得到的粗品经纯化，冻干，得到芳基硼酸酯氨基酸改性聚天冬氨酸纯品；
(4)将芳基硼酸酯氨基酸改性聚天冬氨酸溶于水，采用自组装法得到活性氧响应性纳米药物载体。
优选的，步骤(2)所述的有机溶剂是N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃或1,4二氧六环。
优选的，步骤(2)所述搅拌反应的时间是48～72h。
优选的，步骤(2)所述搅拌反应的温度是40～80℃。
优选的，步骤(2)所述继续搅拌反应的时间是6～12h。
优选的，步骤(2)所述继续搅拌反应的温度是室温。
优选的，步骤(2)所述的pH值调节剂是NaOH或KOH。
优选的，步骤(3)所述的纯化方法是透析或超滤。
优选的，步骤(4)所述的自组装法是透析法或旋转蒸发法。
反应机理
以芳基硼酸酯丝氨酸为例，采用本发明方法制备芳基硼酸酯氨基酸改性聚天冬氨酸的反应机理见下：苯硼酸酯丝氨酸裸露的氨基进攻聚琥珀酰亚胺使其开环，然后在碱性条件下，使剩下的未开环的琥珀酰亚胺开环裸露羧基，形成两亲性聚天冬氨酸聚合物。
活性氧响应性纳米药物载体的氧化响应性原理是：芳基硼酸酯氨基酸改性聚天冬氨酸自组装形成纳米载体，在过氧化氢等活性氧作用下，碳(C)、硼(B)、氧(O)重排形成硼酸酯；在体系中H2O分子的存在下，氧孤对电子进攻硼酸酯，硼酸酯断裂，形成硼酸；同时电子通过苯环转移至碳酸酯，致使其断裂解离，同时纳米载体解体以释放负载的药物。其反应式如下所示：
本发明的优点及有益效果
本发明提供一种有氧化响应性的苯硼酸酯改性聚天冬氨酸纳米药物载体，可负载疏水性药物，并在体内氧化应激病理环境中释放药物，从而实现抗氧化、抗肿瘤等疏水性药物的定位靶向释放，提高药物疗效，降低毒副作用，在抗炎、抗肿瘤治疗等领域具有重要的应用前景。
附图说明
图1是芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸1H NMR谱图，包含其分子式。
图2是H2O2处理芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸前后的1H NMR谱图。
图3是负载阿霉素前(A)和后(B)的芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸纳米载体的扫描电镜照片。
图4是不同环境下芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸纳米载体负载阿霉素的阿霉素释放曲线图。
图5是芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸纳米载体负载阿霉素对L929细胞和A549细胞存活率的影响的柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸(PASP-BSer)的制备
677mg(3.3mmol)的叔丁氧羰基(Boc)丝氨酸(C8H15NO5)溶于20mL的无水DMF，加入216mg(9mmol)的NaH，搅拌30min，再加入含890mg(3mmol)4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的20mL无水DMF，室温反应12h。反应完毕用水分散，三氯甲烷、乙酸乙酯萃取体系各三次，收集有机相，旋干，柱层析得到芳基硼酸酯修饰叔丁氧羰基丝氨酸700mg。室温下用三氟乙酸脱掉叔丁氧羰基保护基，得到裸露氨基的芳基硼酸酯丝基酸。
100mg(1.03mmol)聚琥珀酰亚胺(PSI)和3.96g(12.36mmol)芳基硼酸酯丝基酸溶于20mLN,N-二甲基甲酰胺，70℃条件下搅拌48h。加入1M NaOH溶液调节体系pH至10，继续搅拌6h。粗产物在透析袋(3.5KDa)中透析48h，冻干1d，得到产物(PASP-BSer)。氘代试剂(TFA)处理，1H-NMR谱图如图1所示。
实施例2
芳基硼酸酯苏氨酸改性聚天冬氨酸的制备，包括以下步骤：
393mg(3.3mmol)的苏氨酸(C4H9NO3)溶于20mL的无水DMF，加入216mg(9mmol)的NaH，搅拌30min，再加入含890mg(3mmol)4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯的20mL无水DMF，室温反应12h。反应完毕用水分散，三氯甲烷、乙酸乙酯萃取体系各三次，收集有机相，旋干，柱层析得到芳基硼酸酯修饰苏氨酸550mg。
100mg(1.03mmol)聚琥珀酰亚胺(PSI)和4.022g(12.36mmol)芳基硼酸酯苏氨酸溶于20mLN,N-二甲基甲酰胺，70℃条件下搅拌48h。加入1M NaOH溶液调节体系pH至10，继续搅拌6h。粗产物在透析袋(3.5KDa)中透析48h，冻干1d，得到芳基硼酸酯苏氨酸改性聚天冬氨酸。
实施例3
芳基硼酸酯丝氨酸甲酯改性聚天冬氨酸的制备
756mg(3.3mmol)的叔丁氧羰基(Boc)丝氨酸甲酯(C9H17NO5)用20mL的无水乙腈溶解，加入486mg(9mmol)的氢氧化钾，搅拌30min，加入890mg(3mmol)的4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，65℃反应2h，抽滤，滤液旋干，柱层析纯化得到芳基硼酸酯修饰叔丁氧羰基丝氨酸甲酯，室温下用三氟乙酸脱掉保护基，得到裸露氨基的苯硼酸酯丝氨酸甲酯。
100mg(1.03mmol)聚琥珀酰亚胺(PSI)和4.022g(12.36mmol)芳基硼酸酯丝氨酸甲酯溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺，70℃条件下搅拌48h。加入1M NaOH溶液调节体系pH至10，继续搅拌6h。粗产物在透析袋(3.5KDa)中透析48h，冻干1d，得到芳基硼酸酯丝氨酸甲酯改性聚天冬氨酸。
实施例4
芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸的氧化响应性。
将实施例1制备的芳基硼酸酯丝基酸(BSer)称取7.5mg溶于600μL的CDCl3中，充分均匀，移入核磁管中，加入10μL 3％的H2O2溶液，室温孵育12h，测试1H-NMR，氘代试剂(D2O)处理，H2O2处理前后的1H NMR谱图对比如图2所示。证实BSer发生氧化响应性分解。
将实施例1制备的芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸(PASP-BSer)自组装负载阿霉素药物，负载前后的扫描电镜照片如图3所示。
实施例5
芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸自组装及其自组装负载阿霉素(DOX)和释放行为
分别在磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH值7.4)和含1mMH2O2、10uMH2O2的PBS(pH＝7.4)中进行负载DOX的芳基硼酸修饰聚天冬氨酸(PASP-BSer-DOX)的药物释放实验(37℃恒温，转速100rpm)，采用高效液相色谱(HPLC)测定DOX浓度随时间的变化，得到释放曲线如图4所示。其中，在模拟正常机体环境条件下，DOX累计释放量约20％，较稳定；在氧化条件1mM H2O2下，DOX释放量约为25％；而在氧化条件10μMH2O2下迅速增大至约60％，表明PASP-BSer-DOX表现出显著的氧化响应性释放行为，而且呈现浓度依赖性。
实施例6细胞毒性检测
将不同浓度的实施例1制备的芳基硼酸酯丝基酸改性聚天冬氨酸(PASP-BSer)纳米载体及其负载阿霉素后的PASP-BSer-DOX纳米粒子和自由药物DOX，分别与活性氧升高的肿瘤细胞：A549(人非小细胞肺癌细胞)和正常细胞：L929(小鼠成纤维细胞)共培养24h，采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测细胞活性，如图5所示。结果显示：与L929正常细胞相比，活性氧响应性的PASP-BSer-DOX纳米药物对A549细胞具有更高的毒性，且其选择性抗肿瘤作用优于DOX。
本发明的实施方式不限于此，按照本发明的上述内容，利用本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。