一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法。

背景技术：

番茄是果实类蔬菜的代表。番茄果实色彩鲜艳、肉厚汁多、风味独特，且富含多种维生素、有机酸、氨基酸、矿物质和类黄酮等，不仅营养价值高，还具有抗氧化、助消化、降血脂和抑癌等诸多益处，故深受消费者喜爱。

果径和果重是整个番茄选育过程中，被极为看重的性状。其重量从最初野生番茄的单果重几克发展到如今单果重量可达1kg甚至更高；其大小也从最开始的小果发展至极大果和极大果并存。不同国家和地区的消费者，对番茄的重量和大小有着不同的偏好，对于鲜食番茄而言，有人偏好大果，有人偏好樱桃番茄；对于加工番茄而言，厂商多偏向于选择处于中等大小的番茄，以便于生产。

目前，种植业内改善番茄重量和大小的方法，一般为改变肥料用量、施用特定化肥、改善种植方法等外部技术，无法对番茄本身的性状做出根本性改变，且操作困难，对环境、技术、操作人员等要求较高。即使研发出优良种植方法，也往往存在更换种植环境就难以得到相同种植结果的问题。

因此，深入到分子遗传机理，对番茄果径、果重进行研究，对其育种工作具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法，所述基因工程技术中，选择的基因为番茄的SlEB1基因。

优选的，所述SlEB1基因包括SlEB1a基因和SlEB1b基因；所述SlEB1a的DNA序列如SEQ ID NO 1所示；所述SlEB1b的DNA序列如SEQ ID NO 2所示。

优选的，所述的利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法，其具体步骤为：

(1)构建同时沉默SlEB1a基因和SlEB1b基因的RNAi载体：pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi；

(2)用所述RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi转化农杆菌；

(3)用农杆菌介导的遗传转化法转化番茄种子，常规种植后得到改善了果径、果重的转基因番茄。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法，对番茄的可食用性状改善具有极大应用价值；

2、本发明发现了SlEB1基因在番茄生长发育过程中的新作用，其与番茄的大小密切相关，沉默后可显著提高番茄成熟后的果径和果重；

3、本发明为改善番茄可食用性状提供了新思路，为深入研究番茄的基因组应用提供了理论基础。

附图说明

图1为SlEB1a和SlEB1b基因在番茄不同组织中的表达情况；

图2为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi自然红熟期果实对比图；

图3为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi自然红熟期果实果径大小对比图；

图4为WT、SlEB1-OE、SlEB1-RNAi自然红熟期果实重量对比图。

具体实施方式

实施例涉及的试剂、材料、仪器和测序说明：

本发明所用氯仿、异丙醇、乙醇等常规化学试剂购自成都市科龙化工试剂厂；

RNase-free的吸头和离心管购自爱思进生物技术(杭州)有限公司；

RNase-free ddH2O、DNA回收试剂盒、DNA连接试剂盒、定量PCR试剂盒、基因组DNA提取试剂盒和大肠杆菌DH5α感受态细胞购自康为世纪生物科技有限公司；

反转录试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；

高保真PCR酶购自北京全式金生物技术有限公司；

限制性内切酶和TRIzol Reagent购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

农杆菌EHA105感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。

DNA测序和引物合成均在成都擎科梓熙生物技术有限公司进行。

所用离心机为：ThermoFisher高速冷冻离心机，型号ST16R。

实施例一：番茄SlEB1基因的cDNA克隆和时空表达分析

1、SlEB1基因序列分析

搜索番茄基因组数据库，番茄有两个AtEB1同源基因，即SlEB1a(Solyc03g116370)和SlEB1b(Solyc02g092950)；SlEB1a的DNA序列如SEQ ID NO 1所示；SlEB1b的DNA序列如SEQ ID NO 2所示。

2、番茄总RNA的提取

(1)取等量番茄根、茎、叶、花和不同发育阶段的果实，分为各组，分别在液氮中充分研磨；再分别加入TRIzol Reagent(每100mg样品加入1mL TRIzol Reagent)，充分混匀后室温放置5min。

其中，所述不同发育阶段分别为：IG1(Immature Green1，绿色未熟I期)、IG2(Immature Green1，绿色未熟Ⅱ期)、IG3(Immature Green1，绿色未熟Ⅲ期)、MG(Mature Green，绿熟期)、Br(Breaker，破色期)和RR(Red Ripening，自然红熟期)。

(2)每1mL TRIzol Reagent加200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min；4℃12000rpm离心15min，将上清转移到新的EP管。

(3)分别在各组的上清液中加入等体积的氯仿并充分混匀，4℃12000rpm离心15min，将上清转移到新的EP管；

(4)分别在步骤(3)得到的上清液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min；而后4℃12000rpm离心10min，去上清；

(5)分别对沉淀加1mL 75％的乙醇，4℃7500g离心5min，去上清，而后重复一次本步骤；

(6)再加1mL 75％的乙醇，4℃7500g离心5min，去上清；

(7)室温下，倒扣EP管晾干5min；加入30μL RNase-free ddH2O，55-60℃10min溶解沉淀；电泳检测总RNA的浓度和纯度。

3、番茄cDNA的合成

番茄的cDNA合成分以下两步进行：

(1)去除基因组DNA。

反应体系为5x gDNA Eraser Buffer 2.0μL，gDNA Eraser 1.0μL，总RNA 2μg，RNase-free ddH2O补齐至10μL；反应条件为42℃，2min。

(2)反转录cDNA。

反应体系为PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL，RT Primer Mix 1μL，5x PrimeScript Buffer 4μL，RNase-free ddH2O 4μL；反应条件为37℃15min，85℃5sec。

(3)合成的cDNA于-80℃条件下保存。

4、SlEB1a和SlEB1b基因编码区的PCR扩增

以步骤3合成的cDNA为模板，PCR扩增SlEB1a和SlEB1b基因的编码区。

反应体系为cDNA 1μL，10μM Forward Primer 1μL，10μM Reverse Primer 1μL，2.5mM dNTP 5μL，5x Fast Pfu Bffer 10μL，TransStart Fast Pfu DNA Polymerase 1μL，ddH2O 31μL；反应条件为95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃5min。

SlEB1a和SlEB1b基因的PCR扩增引物如下：

SlEB1a-F:5’ATGGCGAATATAGGGATAATGG3’；

SlEB1a-R:5’TCAGCTTTTACTTCCATCCACG3’；

SlEB1b-F:5’ATGGCGGCACACATAGGAATGATGG3’；

SlEB1b-R:5’TCAATATGTCACAAGTGATCCAC3’。

5、SlEB1a和SlEB1b基因时空表达的定量PCR分析

本步所使用的定量PCR仪为ABI 7500型荧光定量PCR仪。

反应体系为2x Ultra SYBR Mixture 10μL，10μM Forward Primer0.4μL，10μM Reverse Primer 0.4μL，cDNA 1μL，ddH2O 8.2μL。

反应条件为95℃10min；95℃15s，60℃1min(40个循环)；95℃15s，60℃1min；95℃15s，60℃15s。

SlEB1a和SlEB1b基因以及β-actin内参基因的定量PCR扩增引物如下：

SlEB1a-QP-F:5’TGACATGGATCAATGCCAGG3’；

SlEB1a-QP-R:5’ACCTTGTGCATTGGAACAGCT3’；

SlEB1b-QP-F:5’TGCTACCAAAAATGCCTCGAC3’；

SlEB1b-QP-R:5’TCCACTTGAAGAAGGCCTCG3’；

Actin-F：5’TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC3’；

Actin-R：5’CAGTTAAATCACGACCAGCAAGAT3’。

结果如图1所示。

结果表明，SlEB1a基因在番茄不同组织中的表达差异很大，而SlEB1b基因在番茄不同组织中的表达相对稳定，这暗示SlEB1a基因可能在番茄果实的发育成熟过程中作用更加重要。

实施例二：构建SlEB1a基因的过量表达载体和SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi载体

为验证SlEB1a基因的作用，构建了SlEB1a基因的过量表达载体；同时，考虑到SlEB1a和SlEB1b基因可能会有功能冗余，构建了SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi载体，以同时沉默SlEB1a和SlEB1b基因。

下文序列中，下划线上的序列表示序列后括号内对应限制性内切酶的酶切位点，如括号内存在多个内切酶，则序列所代表的酶切位点与括号内的内切酶按顺序一一对应；中的序列为接头序列。

1、SlEB1a过量表达载体的构建

为方便后续检测，利用融合PCR技术将GFP基因连接在SlEB1a基因的N端(5’端)，而后利用限制性酶切置换掉植物表达载体pBI121上的GUS基因，最终构建pBI121:GFP-SlEB1a过量表达载体。具体步骤如下：

(1)GFP和SlEB1a基因融合PCR

GFP基因PCR扩增模板为本实验室现有的植物表达载体pTEX:GFP-HA；

扩增引物为：

F1:5’CGC GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGA 3’(BamHI)；

R1:

SlEB1a基因扩增模板为5.2中的番茄组织cDNA，扩增引物为

F2:

R2:5’GAC GAGCTCTC AGCTTTTACTTCCATCCACG 3’(SacI)。

融合PCR方案：

1)将待融合的GFP F1/R1片段10ng和SlEB1a F1/R1片段10ng混合，不加引物和pfu酶，进行预PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，51℃30s，72℃1min(5个循环)；72℃5min。

2)加入上述引物F1和R2以及pfu酶，进行常规PCR反应，反应条件为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃5min。

(2)pBI121:GFP-SlEB1a过量表达载体的构建

将上述融合PCR产物和pBI121载体分别用BamHI和SacI限制性内切酶双酶切，并电泳回收酶切片段；将回收的融合PCR产物和pBI121载体进行DNA连接反应，最终构建pBI121:GFP-SlEB1a过量表达载体。

2、SlEB1a/SlEB1b基因RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi的构建

构建思路：先分别从SlEB1a和SlEB1b基因中PCR扩增出一个200bp左右的DNA片段，然后用融合PCR技术将两片段融合成一个400bp左右的片段，再将该片段反向插入RNAi中间载体pSK-int的内含子两端，最后通过酶切和连接置换掉pBI121表达载体上的GUS基因，以构建同时沉默SlEB1a基因和SlEB1b基因的RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi。具体步骤如下：

(1)SlEB1a基因和SlEB1b基因RNAi片段的融合

以上述番茄组织cDNA为模板，PCR扩增SlEB1a基因和SlEB1b基因的RNAi片段，引物如下：

正向插入片段引物：

SlEB1aF1:CCG CTCGAGGGATCC ATGGCTGAAGCGTTACTGTGAG(Xhol I,BamHI)；

SlEB1aR1:

SlEB1bF1:

SlEB1bR1:CCC AAGCTT CCAGATTGATTTGTGCTGCT(HindIII)。

反向插入片段引物：

SlEB1aF2:GAC GAGCTC ATGGCTGAAGCGTTACTGTGAG(SacI)；

SlEB1aR2:

SlEB1bF2:

SlEB1bR2:CCG GAATTC CCAGATTGATTTGTGCTGCT(EcoR I)。

1)SlEB1a/SlEB1b基因正向插入片段融合PCR方案：将待融合的SlEB1a F1/R1片段10ng和SlEB1b F1/R1片段10ng混合，不加引物和pfu酶进行预PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，51℃30s，72℃1min(5个循环)；72℃5min。而后加入上述引物SlEB1aF1和SlEB1bR1以及pfu酶进行常规PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃5min。该融合片段命名为：SlEB1aF1/SlEB1bR1。

2)SlEB1a/SlEB1b基因反向插入片段融合PCR方案：将待融合的SlEB1a F2/R2片段10ng和SlEB1b F2/R2片段10ng一定量混合，不加引物和pfu酶进行预PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，51℃30s，72℃1min(5个循环)；72℃5min。加入上述引物SlEB1aF2和SlEB1bR2以及pfu酶进行常规PCR，反应条件为95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃5min。该融合片段命名为：SlEB1aF2/SlEB1bR2。

(2)pSK-int RNAi中间载体的构建

1)酶切。将SlEB1aF1/SlEB1bR1和pSK-int载体分别用Xhol I和HindIII限制性内切酶双酶切。

片段酶切反应体系：10x FastDigest Green Buffer 5μL、XholI 2μL、HindIII 2μL、SlEB1aF1/SlEB1bR1PCR片段10μL(0.5μg)、ddH2O 31μL。

pSK-int载体酶切反应体系：10x FastDigest Green Buffer 2μL、XholI 1μL、HindIII 1μL、pSK-int载体7μL(1μg)、ddH2O 9μL。

反应条件均为37℃水浴锅，1h。

2)电泳及条带回收。酶切反应完后，琼脂糖凝胶(1％)电泳，紫外透射分析仪下照胶，迅速切下条带。

3)DNA回收。DNA回收使用康为世纪生物科技有限公司的回收试剂盒，按试剂盒说明书进行操作。

4)DNA连接。将回收的SlEB1aF1/SlEB1bR1片段和pSK-int载体连接，连接反应体系为：DNA片段3μL、载体3μL、T4DNA Ligase 1μL、5x Buffer 2μL、ddH20 1μL，连接反应条件为22℃，1h。

5)大肠杆菌转化。在冰上，将10μL连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态，冰上放置30min；42℃热激60s；冰上放置2min；在超净台中加入LB培养液(5g/L Yeast extract，10g/L NaCl，10g/L tryptone)600μL，170rpm 37℃震荡培养50min；600rpm离心5min，留100-200μL培养液，弃去多余液体，混匀，将菌液均匀涂在含50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上；平板倒置37℃培养1d。

6)长出的菌落经DNA测序，测序检测成功后，即成功构建载体：pSK-int:SlEB1aF1/SlEB1bR1。

7)将上述构建的融合片段SlEB1aF2/SlEB1bR2和载体pSK-int:SlEB1aF1/SlEB1bR1分别用SacI和EcoRI限制性内切酶进行双酶切、电泳、DNA回收、DNA连接、大肠杆菌转化和DNA测序(具体步骤与上述步骤1)-6)相同)，从而构建pSK-int:SlEB1a/SlEB1b RNAi中间载体。

(3)RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi的构建

将上述的pSK-int:SlEB1a/SlEB1bRNAi中间载体用BamHI和SacI限制性内切酶双酶切，电泳回收SlEB1a/SlEB1bRNAi片段；再将pBI121载体用BamHI和SacI限制性内切酶双酶切，并电泳回收载体片段；然后将回收的SlEB1a/SlEB1b RNAi片段与pBI121载体片段连接，最终构建RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi(具体步骤与上述步骤1)-6)相同)。

实施例三：农杆菌介导的遗传转化法转化番茄品种AC⁺

整体思路为：将SlEB1a基因的过量表达载体pBI121:GFP-SlEB1a和SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi载体pBI121:SlEB1a/SlEB1bRi分别转化农杆菌EHA105，然后分别利用农杆菌介导的遗传转化法转化番茄品种AC⁺，番茄AC⁺种子来自实验室保存。具体步骤如下：

1、农杆菌转化

在冰上，往农杆菌EHA105感受态细胞中加入10μL质粒，轻轻混匀，放置40min；液氮冷击1min；迅速放入37℃水浴锅孵育5min；冰上放置2min；在超净台中加入LB培养液(5g/L Yeast extract，10g/L NaCl，10g/L tryptone)600μL，170rpm 28℃震荡培养4h；600rpm离心5min，留100-200μL培养液，弃去多余液体，混匀，将菌液均匀涂在含50mg/L卡那霉素和100mg/L利福平的LB固体培养基上；平板倒置28℃培养2d，长出的菌落经PCR验证后备用。

2、番茄遗传转化

(1)种子处理与播种

在超净台中将适量番茄品种AC⁺的种子置于50mL离心管中，用75％的乙醇处理2min，无菌水冲洗2～3次；再用20％的NaClO处理15min，无菌水冲洗10～20次；转移到无菌滤纸上晾干。

将无菌处理后的种子置于MS固体培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉，pH＝5.7)上，于25℃下，避光培养3天，待种子露白后，于25℃下光照培养16h。

(2)组织预培养

待上述番茄种子长出子叶后，取植株，在无菌培养皿中将子叶切块，转移到预培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉+1mg/L6-BA+0.04mg/L IAA，pH＝5.7)上，于22℃下避光培养3天。

(3)侵染

取无菌培养皿，加上步骤(1)所述农杆菌制备的菌液(OD600约0.6)，而后将预培养的叶片浸入菌液中10min左右，取出叶片，在灭菌的滤纸上吸干菌液。

(4)共培养

将上述处理后的叶片转移至共培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉+0.2mg/L KH2PO4+0.1mg/L Kinetin+0.2mg/L 2,4-D+15mg/L乙酰丁香酮，pH＝5.7)，22℃避光培养3天。

(5)筛选

将共培养后的叶片转移至筛选培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉+500mg/L羧卞青霉素钠+100mg/L卡那霉素+2mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA，pH＝5.7)上，于25℃下光照培养16h，约20d继代一次，至其长出不定芽。

(6)生根

待所述不定芽长至2～3片叶后即可生根，切除底部多余的愈伤组织，移入生根培养基(4.33g/L MS盐+1％蔗糖+0.7％琼脂粉+500mg/L羧卞青霉素钠+2mg/L IAA，pH＝5.7)中，25℃光照培养16h。生根后的植株即为候选转基因植株。

实施例四：转基因植株的鉴定

1、取上述转基因植株的叶片，分别提取基因组DNA；以pBI121空载体为阳性对照，野生型植株基因组DNA为阴性对照。

以基因组DNA为模板，以NPTII-F:5’TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC3’和NPTII-R:5’GTCACCGACTTGAGCCATTTG3’为引物，PCR扩增NPTII基因(pBI121表达载体上的选择标记基因)片段；PCR产物进行电泳分析。长度为794bp的DNA片段电泳条带初步确定为转基因植株。

2、对过量表达GFP-SlEB1a基因的转基因植株，进一步提取叶片总蛋白，然后进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用GFP抗体进行免疫检测，有预期大小的蛋白条带的最终确定为GFP-SlEB1a过量表达转基因植株。筛选出过量表达GFP-SlEB1a的转基因植株5株。

3、对SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi转基因植株，进一步提取植株叶片的总RNA并反转录成cDNA；利用定量PCR技术检测SlEB1a和SlEB1b基因的表达情况(内参基因及其引物与实施例一的步骤5相同)，SlEB1a和SlEB1b基因表达量(相对于野生型)均明显下降的确定为SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi转基因植株。筛选出SlEB1a/SlEB1b基因的RNAi转基因植株7株。

实施例五：转基因和野生型果实大小和重量的比较

为方便表达，将SlEB1a过量表达转基因植株简称为SIEB1-OE，SlEB1a/SlEB1b基因RNAi转基因植株简称为SIEB1-RNAi，野生型植株简称为WT。

取转基因和野生型RR(自然红熟期)的果实，用精度为0.01mm的电子数显游标卡尺测量果实的横切直径和纵切直径，用精度为0.001g的电子天平称量果实的重量。

结果如图2、图3、图4所示。结果显示，SIEB1-OE-1和SIEB1-OE-2果实的横切直径和纵切直径分别比WT果实减小了9.7％、6.8％，SIEB1-RNAi-1和SIEB1-RNAi-2果实的横切直径和纵切直径则分别比WT果实增加了11.57％、9.77％(图2、图3)；SIEB1-OE-1和SIEB1-OE-2果实分别比WT果实轻30.81％和13.43％，SIEB1-RNAi-1、SIEB1-RNAi-2和SIEB1-RNAi-3果实则分别比WT果实重量增加了23.22％、21.70％和17.98％，(图4)差异均为极显著差异。

结果表明，SIEB1基因与番茄的生长发育密切相关，沉默该类基因后，可极显著提高番茄果实的果径大小和果实重量。而如果过表达SlEB1a基因，果径和果重会极显著降低。

本发明为改善番茄的可食用性状提供了新思路，为进一步研究番茄基因组的作用机理提供了理论依据，具有重要的现实意义和科研价值。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

成都碧青生物科技有限公司

<120> 一种利用基因工程技术改善番茄果径、果重的新方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1042

<212> DNA

<213> 番茄SlEB1a基因(Solyc03g116370)

<400> 1

attgtgagtt tttgtttctt cctttttttc tcattccatc tgctttcgta gaattgaaac 60

aagaagaaaa atggcgaata tagggataat ggatagtgcc tattttgttg gaaggaatga 120

gctattgaca tggatcaatg ccaggttaca gcttaatctt acccgcattg aagaggttgc 180

atctggggct gtgcagtgtc agatgatgga catgacctat ccaggagctg ttccaatgca 240

caaggttaac tttgatgcaa agactgaata tgacatgatc caaaactaca aagtgctgca 300

agatgtgttt agcaagctaa aaattgacaa gcatattgaa gttaacaggc ttgttaaggg 360

ccgtccattg gataatttgg agtttctgca atggctgaag cgttactgtg agtctgtaaa 420

tggtggtatt atgaatgaga actataatcc tctggaacgt agaagtaagg ttggaaggga 480

acgaaatgtg aagggttctc agagatctgc aaagtcactt ctaactaaca acagtcataa 540

ccctggatta ggggaaggct tgactaagac tacaggaata aaacaaggaa ggtcaagtcc 600

agtaatgggt ggggttaatt cttcaacgga gattcaggct ttgtcaaagg aggttacaga 660

tctcaagctc tctgttgacc atttggagaa agaaagagat ttttattttg caaagttacg 720

agatattgag attctctgtc agactccaga cttagaagat atcccgatgg ctatggcagt 780

taaaaagata ttatatgctg ctgatgcaag agaatcagct ttggccgaag ctcaagaagt 840

tctaagtcac tccgtggatg gaagtaaaag ctgaattgga attggaatat gataagtaaa 900

aattgcgtgc agtagtttct taaatgtaga ggttactgtt tcatctttgg tgaaatgttg 960

ctaagctttc tgttgtgtac atccatgtgc tctttttttg gctttgaaag agaagtctct 1020

ctaatgtgta cttggtggag at 1042

<210> 2

<211> 1042

<212> DNA

<213> 番茄SlEB1b基因(Solyc02g092950)

<400> 2

attgtgagtt tttgtttctt cctttttttc tcattccatc tgctttcgta gaattgaaac 60

aagaagaaaa atggcgaata tagggataat ggatagtgcc tattttgttg gaaggaatga 120

gctattgaca tggatcaatg ccaggttaca gcttaatctt acccgcattg aagaggttgc 180

atctggggct gtgcagtgtc agatgatgga catgacctat ccaggagctg ttccaatgca 240

caaggttaac tttgatgcaa agactgaata tgacatgatc caaaactaca aagtgctgca 300

agatgtgttt agcaagctaa aaattgacaa gcatattgaa gttaacaggc ttgttaaggg 360

ccgtccattg gataatttgg agtttctgca atggctgaag cgttactgtg agtctgtaaa 420

tggtggtatt atgaatgaga actataatcc tctggaacgt agaagtaagg ttggaaggga 480

acgaaatgtg aagggttctc agagatctgc aaagtcactt ctaactaaca acagtcataa 540

ccctggatta ggggaaggct tgactaagac tacaggaata aaacaaggaa ggtcaagtcc 600

agtaatgggt ggggttaatt cttcaacgga gattcaggct ttgtcaaagg aggttacaga 660

tctcaagctc tctgttgacc atttggagaa agaaagagat ttttattttg caaagttacg 720

agatattgag attctctgtc agactccaga cttagaagat atcccgatgg ctatggcagt 780

taaaaagata ttatatgctg ctgatgcaag agaatcagct ttggccgaag ctcaagaagt 840

tctaagtcac tccgtggatg gaagtaaaag ctgaattgga attggaatat gataagtaaa 900

aattgcgtgc agtagtttct taaatgtaga ggttactgtt tcatctttgg tgaaatgttg 960

ctaagctttc tgttgtgtac atccatgtgc tctttttttg gctttgaaag agaagtctct 1020

ctaatgtgta cttggtggag at 1042