具有细胞内穿透能力的诱导RNA干扰的核酸分子及用途的制作方法

技术领域

本发明涉及一种新型结构的具有细胞内穿透能力的RNAi诱导核酸分子及其用途，更具体地说，涉及一种具有优异的靶基因抑制效率且无需另外的细胞载体而具有细胞内穿透能力的新型结构的核酸分子以及利用该核酸分子的靶基因的表达抑制方法，所述核酸分子具有诱导RNAi的双链核酸分子中含有的至少一个核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯(Phosphorothioate)或者二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)取代且结合有亲油性化合物(lipophilic compound)的结构。

背景技术：

RNA干扰(RNA interference：RNAi)是非常特异的能够有效抑制基因表达的机制，该机制在细胞等中导入双链RNA(dsRNA)而诱导靶基因mRNA的分解，由此抑制靶基因的表达，其中，所述双链RNA(dsRNA)由具有与靶基因的mRNA同源序列的正义链和具有与靶基因的mRNA互补序列的反义链构成。

诱导这样的RNA干扰的siRNA是碱基序列能够特异性地抑制靶标基因表达的短长度(19～21bp)的双链RNA，因为其具有高效率性和靶标特异性，因此目前作为难以治疗的癌、病毒的感染以及遗传病等各种疾病的治疗剂备受关注。在利用siRNA的有效的治疗剂开发方面，还存在稳定性、沉默效率(silencing efficiency)、免疫反应、脱靶效应(off-target effects)等各种需解决的问题，其中体内(in vivo)的有效传递(delivery)成为最难以解决的问题而被指出。siRNA因为磷酸骨架(phosphate backbone)结构而带有高的负电荷(negative charge)，由此无法通过细胞膜，且因为其小的尺寸而在血液(blood)中快速地被去除，由此难以传递充分量的siRNA以在实际靶标部位上实施RNAi诱导。

目前，针对体外释药(in vitro delivery)开发出很多利用阳离子脂质体(cationic lipids)和阳离子聚合物(cationic polymers)的高效传递(delivery)方法(Sioud M，Sorensen DR Cationic liposome-mediated delivery of siRNAs in adult mice.Biochem Biophys Res Commun 2003；312：1220-1225)。但是，大部分情况下，在体内(in vivo)无法如体外(in vitro)那样高效率地传递siRNA，由于与生物体内存在的各种蛋白质发生相互作用(interaction)，因此存在siRNA的传递效率变弱的问题(Bolcato-Bellemin AL，Bonnet ME，Creusat G，et al.Sticky overhangs enhance siRNA-mediated gene silencing.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007；104：16050-16055)。另外，根据传递载体(delivery vehicle)的组成，与发生疾病的部位无关地会在肝或肺等特定脏器中高浓度地蓄积，因此还存在诱发毒性的问题。

一方面，已知结缔组织生长因子(Connective tisssue frowth factor，CTGF/CCN2)作为基质细胞蛋白(metricellular protein)的一种，其在细胞的分化、生长、迁移(migration)、ECM生成(ECM production)、附着(adhesion)等方面起到重要的作用。在各种脏器中诱导纤维化(fibrosis)而损坏脏器功能的慢性纤维化疾病(chronic fibrotic disorders)的情况下，确认到引起纤维化疾病(fibrotic disorder)的组织中CTGF被过表达，在皮肤的情况下已较好地研究出CTGF和纤维化(fibrosis)的关系。正常皮肤中CTGF表达被抑制成正常水平(basal level)，但在发生创伤的情况下，则观察到CTGF的表达暂时性地增加。与此相对，瘢痕瘤(keloid)或硬化症(localized sclerosis)的情况下，在创伤治愈之后CTFG的过表达仍然持续，利用反义(antisense)等抑制CTGF的表达时纤维化(fibrosis)以及瘢痕瘤(keloid)的生成被抑制，由此确认到CTGF在纤维化(fibrosis)以及肥厚性瘢痕的生成起到重要的作用(Sisco M，Kryger ZB，O'Shaughnessy KD，et al.Antisense inhibition of connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)mRNA limits hypertrophic scarring without affecting wound healing in vivo.Wound Repair Regen 2008；16：661-673.DOI：WRR416[pii])。在病理学方面，报告有全长CTGF分子与存在结缔组织细胞的过度增殖以及细胞外基质的过度沉积的状态相关联。本领域中还记载有：CTGF与血管内皮细胞移动、增殖以及血管新生相关的状态相关联。作为与这些状态相关的疾病以及障碍，可例举：皮肤以及主要器官的纤维症、癌，以及系统性硬化病、血管生成、动脉粥样硬化症、糖尿性肾病以及肾性高血压等相关疾病、障碍。另外，还报告有：CTGF对创伤治愈、结缔组织恢复、骨以及软骨恢复等方面也有用。对于上述内容，已公开有CTGF作为骨、组织或者软骨生成的诱导因子在骨质疏松症、骨关节炎或者骨软骨炎、关节炎、骨骼疾病、肥厚性瘢痕、烧伤、血管性肥大症或者声音(sound)治愈等方面起到作用(例如，参考文献(美国专利第5，837，258号))。

为此，本发明人等为了提供可在体外(in vitro)以及体内(in vivo)实施有效传递的具有朝向细胞内的穿透能力的新型结构的诱导RNAi的核酸分子而进行悉心研究的结果发现：诱导RNAi的双链核酸分子中含有的至少一种核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯(Phosphorothioate)取代并结合(conjugation)亲油性化合物(lipophilic compound)时，该核酸即使在体内(in vivo)也无需另外的细胞载体而具有优异的靶基因抑制效率并同时具有优异的细胞内穿透能力，从而完成了本发明。

该背景技术部分中记载的上述内容仅用于加深理解本发明的背景，对于本发明所属的技术领域的技术人员来说，可能未包含构成已知现有技术的内容。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第5，837，258号。

非专利文献

非专利文献1：Sioud M，Sorensen DR Cationic liposome-mediated delivery of siRNAs in adult mice.Biochem Biophys Res Commun 2003；312：1220-1225。

非专利文献2：Bolcato-Bellemin AL，Bonnet ME，Creusat G，et al.Sticky overhangs enhance siRNA-mediated gene silencing.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2007；104：16050-16055。

非专利文献3：Sisco M，Kryger ZB，O'Shaughnessy KD，et al.Antisense inhibition of connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)mRNA limits hypertrophic scarring without affecting wound healing in vivo.Wound Repair Regen 2008；16：661-673.DOI：WRR416[pii]。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种可在体外(in vitro)以及体内(in vivo)实施有效传递且具有朝向细胞内的穿透能力的新型结构的诱导RNAi的核酸分子及其用途。

为了达到上述目的，本发明提供一种RNAi诱导用核酸分子，其具有细胞内穿透能力(cell-penetrating ability)，其特征在于，在由包含与靶核酸(target nucleic acid)互补区域的第一链和与所述第一链形成互补结合的第二链构成的诱导RNAi的双链核酸分子中，所述核酸分子中含有的至少一个核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯(Phosphorothioate)或者二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)取代并结合有亲油性化合物(lipophilic compound)。

本发明还提供一种基因表达抑制用组合物，其含有所述核酸分子。

本发明还提供一种细胞内靶基因表达抑制方法，其包括细胞内导入所述核酸分子的步骤。

本发明还提供一种用于治疗或预防CTGF相关疾病或者障碍的药物组合物，其以编码结缔组织生长因子(Connective tisssue frowth factor，CTGF)的mRNA作为靶核酸并含有所述核酸分子。

本发明还提供一种CTGF表达抑制用核酸分子，其具有细胞内穿透能力，其特征在于，由包含与编码结缔组织生长因子(Connective tisssue frowth factor，CTGF)的mRNA互补区域的第一链和与所述第一链形成互补结合的第二链构成的诱导RNAi的双链核酸分子中，所述核酸分子中含有的1～31个核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯(Phosphorothioate)或者二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)取代，并结合有亲油性化合物，所述诱导RNAi的双链核酸分子具有选自于由序列号153以及154的碱基序列对所组成的组中的碱基序列对。

通过下述的详细说明以及所附的权利要求书，能够更加明确本发明的其它特征以及具体例。

附图说明

图1是表示siRNA、asiRNA、lasiRNA结构体对表1至表3的以CTGF作为靶标的24种序列的基因抑制效率的图表。

图2是表示胆固醇修饰使lasiRNA的细胞内吸收效率增加的荧光显微镜观察照片。

图3表示本发明的胆固醇以及PS修饰的lasiRNA结构(下划线：OMe修饰(modification)，＊：PS修饰(modification)，Chol：胆固醇(Cholesterol)，Cy3：Cy3)。

图4是表示硫代磷酸酯(Phosphorothioate)(PS)修饰使chol-lasiRNA向细胞内的吸收效率增加的荧光显微镜观察照片。

图5是硫代磷酸酯(Phosphorothioate)(PS)修饰使chol-lasiRNA的基因减少的效果比较图(各图表表示三次反复试验的平均和SD)。

图6表示将MyD88作为靶标的chol-lasiRNA-PS7的结构(下划线：OMe修饰(modification)，＊：PS修饰(modification)，Chol：胆固醇(Cholesterol))。

图7是对各种细胞穿透性lasiRNA(cell penetrating lasiRNA，cp-lasiRNA)的基因抑制效率进行比较的图表(括号内的CTGF或者MyD88表示cp-lasiRNA的靶标基因)。

图8是表示亲油性化合物修饰即疏水性修饰带来的本发明核酸分子的基因抑制效率的图表。

图9是表示反义链长度带来的本发明核酸分子的基因抑制效率的图表。

图10是PS2修饰的结构。

图11是表示磷酸骨架修饰带来的本发明核酸分子的基因抑制效率的图表。

图12是表示本发明核酸分子的体内(in vivo)靶标基因抑制效率的图表。

图13是表示本发明核酸分子在各浓度下的体内(in vivo)靶标基因抑制效率的图表。

图14是表示本发明的核酸分子在各时间段对靶标基因抑制效率的图表。

具体实施方式

除非另有定义，本说明书中使用的所有技术用语和科学用语具有与本领域技术人员的通常理解相同的意义。一般来说，本说明书中使用的命名法在该技术领域中广为人知且常规使用。

本发明的详细说明等中使用的主要用语的定义如下。

本申请中“RNAi(RNA干扰：RNA interference)”是指，在细胞等中导入由具有与靶基因的mRNA同源序列的链和具有与靶基因的mRNA互补序列的链构成的双链RNA(dsRNA)而诱导靶基因mRNA的分解，由此抑制靶基因的表达的机制。

本申请中“siRNA(小干扰RNA：small interfering RNA)”是指，序列特异性地介导有效的基因表达抑制(基因沉默：gene silencing)的短双链的RNA(dsRNA)。

本申请中“反义链(antisense strand)”是指，对所需的靶核酸(target nucleic acid)实际上或者100％互补的多核苷酸，例如，可与mRNA(信使RNA：messenger RNA)、不是mRNA的RNA序列(例如，微小RNA：microRNA、piwiRNA、tRNA、rRNA以及hnRNA)、或者编码DNA序列或非编码DNA序列整体互补或一部分互补。本申请中，反义链和引导链可以相互替换使用。

本申请中“正义链(sense strand)”是指，具有与靶核酸相同的核酸序列的多核苷酸，是与mRNA(信使RNA：messenger RNA)、不是mRNA的RNA序列(例如，微小RNA：microRNA、piwiRNA、tRNA、rRNA以及hnRNA)、或者编码DNA序列或非编码DNA序列整体相同或一部分相同的多核苷酸。

本申请中“基因”应视为最广泛的含义，其可以编码结构蛋白质或者调节蛋白质。此时，调节蛋白质包含转录因子、热休克蛋白或者DNA/RNA复制、转录和/或翻译相关的蛋白质。本发明中，成为表达抑制的对象的靶基因驻留于病毒基因组中，可整合成动物基因或可以以染色体外构成要素存在。例如，靶基因可以是HIV基因组上的基因。此时，siRNA分子在使哺乳动物细胞内HIV基因的翻译失活方面有用。

本发明的一实施方式涉及一种RNAi诱导用核酸分子，其具有细胞内穿透能力(cell-penetrating ability)，其特征在于，诱导RNAi的双链核酸分子中，所述核酸分子所含的至少一个核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯(Phosphorothioate)或者二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)取代，并结合有亲油性化合物(lipophilic compound)，所述诱导RNAi的双链核酸分子由包含与靶核酸(target nucleic acid)互补区域的第一链和与所述第一链形成互补结合的第二链构成。此时，第一链对应于siRNA的反义链，第二链对应于正义链。

本发明中，所述诱导RNAi的双链核酸分子中的第一链长度可以是16至121nt，优选为24至121nt长度。第一链包含与靶核酸互补的一部分区域，此时，其特征在于，包含与靶核酸互补的一部分区域的区域长度是16至31nt、19至31nt或者19至21nt。进一步，其特征在于，第二链具有13至25nt长度、13至21nt长度或者16至21nt长度。

优选地，本发明的诱导用双链核酸分子的特征在于，由包含与靶核酸互补的一部分区域且长度24～121nt的第一链和长度13～21nt的第二链构成，所述第二链具有和所述第一链中与靶核酸互补的一部分区域形成互补结合的区域。本发明的一实施例中，针对CTGF作为靶标的24种序列制作出具有如上所述结构的核酸分子，结果确认了与以往的siRNA相比总体上显示出更高的基因表达抑制效率的倾向。本发明人将如上所述的具有与第二链不形成互补结合的长的单链区域的诱导RNAi用双链核酸分子，即将具有长的反义链的siRNA命名为“lasiRNA”。

lasiRNA是，虽然具有比以往的siRNA更短的双链长度但具有高的基因抑制效率的新型结构的非对称型RNAi诱导结构。另外，基于长的突出(overhang)结构的反义(antisense)作用，可带来与siRNA或asiRNA相比增加的最大基因抑制效率，因此有望代替以往的结构而利用于治疗剂的开发。另外，相比于其它结构，具有更长的突出(overhang)长度，且突出(overhang)的各种修饰(modification)也具有保持高的活性的性质，因此其具有能够自由导入较多的化学修饰(chemical modification)而增加各种功能的特征。

如上所述的lasiRNA的特征在于，所述第一链的与靶核酸(target nucleic acid)互补的一部分区域的长度是19～21nt。因此，所述第一链包含不与第二链结合的单链区域，优选第一链在单链区域中还包含选自于由反义DNA、反义RNA、核酶以及DNA酶(DNAzyme)所组成的组中的核酸寡核苷酸。

本发明的特征在于，所述第一链中不与第二链形成互补结合的单链区域可直接连接或通过链接物连接于与所述第二链形成互补性结合的区域，此时，链接物是化学链接物(chemical linker)。此时，上述化学链接物是核酸(核酸部分(a nucleic acid moiety))、PNA(PNA部分(a PNA moiety))、肽(肽部分(a peptide moiety))、二硫键(a disulfide bond)或者聚乙二醇(聚乙二醇部分(a polyethylene glycol moiety))，但并不限定于此。

进一步，本发明的特征在于，所述第一链可在单链区域上还含有与上述靶核酸互补的序列，或者，含有与上述靶核酸不互补的序列，在互补的情况下，其可连续排列于本发明的核酸分子的双链区域中，即可连续排列于与siRNA的靶核酸互补的区域，或者，远离这些区域而排列。同样，siRNA靶标的序列(sequence)和上述单链区域的核酶(ribozyme)或DNA酶(DNAzyme)靶标的序列(sequence)可以连续排列或远离排列。另外，当所述第一链的单链区域具有与所述siRNA的靶基因互补的序列的情况下，若单链区域所包含的序列为反义DNA或者反义RNA时，则其特征在于，其序列与siRNA的靶基因的序列相互互补约70-80％以上，优选相互互补约80-90％以上，更加优选相互互补约95-99％以上；单链区域为核酶或者DNA酶(DNAzyme)时，其特征在于，其序列和siRNA的靶基因的序列相互互补约50-60％以上。

并且，所述单链区域可以是5至100nt。当5nt以下时，基因表达抑制效率的增加效果弱；当100nt以上时，RNA分子的合成效率降低。另外，所述单链区域具有9至100nt的长度，或者具有50nt以下的长度，更加优选具有10至15nt的长度。

本发明的特征在于，构成所述单链区域的碱基中至少一个以上包含庞大的(bulky)碱基类似物(base analog)。当扩增序列中包含如具有苯基的脱氧腺苷(deoxyadenosine)衍生物等的庞大的碱基类似物时，与该扩增序列以互补方式结合的mRNA链在庞大的碱基类似物位置中发生分裂(cleavage)。只要是诱导这种分裂(cleavage)的庞大的碱基类似物则可包含于本发明中，并没有特别的限制。

本发明中，当siRNA的反义链长长地延伸成与靶标mRNA序列互补的核酸结构体时，预测5'末端部分以RNAi原理发挥作用，同时，3'末端部分以反义机制发挥作用，或者，起到将5'末端siRNA部分诱导为靶标mRNA的作用。此时，反义3'末端的与mRNA互补的序列为DNA时，可诱导RNase H依赖性mRNA切割。另外，构成反义3’末端的单链区域的碱基中至少一个以上包含庞大的(bulky)碱基类似物(base analog)，或者，单链区域结合于mRNA形成凸出(bulge)结构时，预测也可诱导分裂(cleavage)。另外，第一链的单链区域中导入核酶(ribozyme)或DNA酶(DNAzyme)的核酸分子时，预测可诱导协同分裂(synergistic cleavage)。

由19-21nt长度的反义链以及13-16nt长度的正义链构成的siRNA分子而言，反义链的5'方向的末端为钝端(blunt end)的siRNA结构体，能够在不阻碍siRNA的正义链带来的脱靶效应或其它RNAi机制的情况下，提供优异的靶基因表达抑制效率(韩国公开专利10-2009-0065880)。在这样的siRNA中适用本发明的结构时，能够最小化脱靶效应的同时显现出第一链的单链区域所包含的核酸寡核苷酸带来的如上所述的效果。本申请中，“脱靶效应(Off-target effect)”是指，尽管原本siRNA的使用目的是诱导具有与反义链互补序列的mRNA的分解从而获得抑制相应mRNA的基因表达的效果，但还包含如下效果：因siRNA的正义链发生其它mRNA的分解时，抑制由正义链发生的这样的预料不到的其它mRNA的分解和相应基因的表达的效果；siRNA的反义链与错误的靶进行配对而发生其它mRNA的分解的、由反义链引起的其它mRNA的分解以及相应基因的表达抑制效果。

本发明的一实施例中确认到，通过实施胆固醇修饰以及PS修饰，胆固醇的结合使lasiRNA的细胞穿透能力提高，但是，还确认到：未导入充分数量的PS时，仅以胆固醇，在没有另外的细胞载体的情况下，难以充分诱导有效的靶标基因抑制。此时，PS修饰的导入显示出与其导入量成比例地提高细胞穿透能力，但是，PS修饰过多时，确认到lasiRNA无法诱导RNAi的基因抑制。因此，与细胞一起培养(incubation)之后，通过基因抑制效率的比较，确定了最佳PS修饰(PS modification)的个数。即，本发明的核酸分子的特征在于，核酸分子中1至48个，优选1至31个，更加优选2至17个，进一步加优选4至17个或者12至17个的核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯取代。

此时，本发明的特征在于，所述核酸分子中，第一链所含的核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯取代。另外，本发明的特征在于，所述第一链中，与靶核酸互补的区域以外的区域中的核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯取代。此时，第一链所含的1至31个，优选1至17个，更加优选2至17个，进一步优选4至17个或者12个至17个的核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯取代。并且，本发明的特征在于，所述核酸分子中，第二链所含的1至21个，优选1至17个，更加优选2至17个，进一步优选4至17个或者12个至17个的核苷酸的磷酸骨架被硫代磷酸酯取代，

此时，本发明的另一实施例中确认到，利用如图10表示的PS2(二硫代磷酸酯：phosphorodithioate)修饰来代替PS时，虽显示出相比于PS减少的基因抑制效率，但是，相比于以往的siRNA结构带来了得以提高的基因抑制效率。因此，本发明的核酸分子的特征在于，核酸分子中一个以上的核苷酸的磷酸骨架被二硫代磷酸酯取代，此时，优选1至48个，更优选1至31个、进一步优选2至17个，特别优选4至17个或者12至17个核苷酸的磷酸骨架被取代，此时，第一链的1至31个、优选1至17个、更加优选2至17个、进一步优选4至17个或者12个至17个的核苷酸的磷酸骨架被二硫代磷酸酯取代，或者，第二链的1至17个、更加优选2至17个、进一步优选4至17个或者12个至17个的核苷酸的磷酸骨架被二硫代磷酸酯取代。

本发明中，亲油性化合物带来疏水性修饰，例如可利用脂质、亲油性肽或者亲油性蛋白质等。此时，作为脂质，可利用胆固醇、生育酚以及硬脂酸、棕榈酸等的碳原子数10个以上的长链脂肪酸等，但并不限定于此。并且，所述胆固醇等的亲油性化合物可结合于所述核酸分子的第一链或者第二链的5’末端或者3'末端，但并不限定于此。

本发明中，上述靶核酸可以是mRNA(信使RNA：messenger RNA)、微小RNA(microRNA)、piRNA(piwi相互作用RNA：piwi-interacting RNA)、编码DNA序列以及非编码DNA序列等，但并不限定于此。

本发明的核酸分子可以是通常合成而制，但并不限定于此。即，本发明中，所述核酸分子可以是化学合成或者酶法合成而制。本发明的siRNA分子可通过标准重组方法由自发性基因进行诱导，此时，在核苷酸序列级别上，与需要改变表达的靶基因的mRNA的至少一部分实质上互补。

此时，本发明的核酸分子的特征在于，包含化学修饰。所述化学修饰的特征在于，所述核酸分子所包含的至少一个核苷酸的核糖的2'位的羟基被氢原子、氟原子、-O-烷基、-O-酰基以及氨基中的任意一个取代，但并不限定于此，为了提高核酸分子的传递能力，也可以被-Br、-Cl、-R、-R'OR、-SH、-SR、-N3以及-CN(R＝烷基：alkyl、芳基：aryl、亚烃基：alkylene)中的任意一个取代。另外，至少一个核苷酸的磷酸骨架可被烷基磷酸酯形式(alkylphosphonate form)、氨基磷酸酯形式(phosphoroamidate form)以及硼烷磷酸酯形式(boranophosphate form)中的任意一个取代。另外，所述化学修饰的特征在于，所述核酸分子所包含的至少一种核苷酸被LNA(锁核酸：locked nucleic acid)、UNA(解锁核酸：unlocked nucleic acid)、吗啉(Morpholino)、PNA(肽核酸：peptide nucleic acid)中的任意一个取代。所述化学修饰的特征在于，所述核酸分子与选自于由脂质、细胞穿透性肽(cell penetrating peptide)以及细胞靶标配体所组成的组中的一个以上进行结合。

并且，为了有效实施体外(in vitro)以及体内(in vivo)传递，本发明的核酸分子，可与以往已知能够向细胞内有效传递寡核苷酸的脂质体(liposome)、阳离子聚合物(cationic polymer)、抗体(antibody)、适体(aptamer)、纳米粒子(nanoparticles)等的各种载体以及传递方法联合使用。

一方面，在本发明的一实施例中，无需另外的载体也可溶解于PBS等溶液而实施注射，仅通过此方式就可在体内(in vivo)对靶标部位显示90％以上的高的基因抑制效率，因此可确认，本发明的核酸分子无需另外的制剂化过程也可直接开发成注射剂形式的药物。

本发明的实施例记载了本发明的诱导RNAi的核酸分子带来有效的靶基因表达抑制效果，因此，本发明的另一实施方式涉及一种含有所述诱导RNAi的核酸分子的基因表达抑制用组合物。此时，所述核酸分子可以是结合有所述细胞载体的核酸复合物的形态。

本发明的实施例中，当适用于作为靶基因将CTGF作为靶的siRNA时，确认到其抑制效率优异，且穿透能力优异，但是，本发明的核酸分子结构在提供将其它靶基因作为靶的核酸分子的情况下，也能够得到相同结果，这一点对于本领域技术人员来说是显而易见的。

一方面，所述基因表达抑制用组合物能够以基因表达抑制用试剂盒(kit)的形态提供。基因表达抑制用试剂盒可以是瓶、桶(tub)、小袋(sachet)、封套(envelope)、管、安瓿(ampoule)等形态，它们的一部分或者整体可通过塑料、玻璃、纸、金属箔、蜡等形成。对于容器，可安装原先是容器的一部分的塞子，或者可安装可通过机械性、黏附性或其他手段附着于容器的能够完全或部分分离的塞子。对于容器，还可安装可通过注射针接近内容物的瓶塞。所述试剂盒还可以包含外包装，外包装可包含与构成要素的使用相关的使用说明书。

本发明的又一实施方式涉及一种细胞内靶基因表达的抑制方法，其利用所述诱导RNAi的核酸分子。即，本发明提供一种细胞内靶基因表达的抑制方法，其包含在细胞内导入所述诱导RNAi的核酸分子的步骤。

本发明特征在于，所述诱导RNAi的核酸分子的第一链与靶基因的mRNA序列互补。

本发明中，所述靶基因是内源性(endogeneous)基因或转基因(transgene)。

此时，本发明的核酸分子并非必须限定于合成siRNA，其还具有可适用于在细胞内利用表达载体等进行表达的siRNA或shRNA中的优点。即，本发明的核酸分子可在细胞内进行表达，由此抑制靶基因的表达。因此，本发明另一实施方式涉及一种基因表达抑制方法，其包含在细胞内使所述诱导RNAi的核酸分子表达的步骤。

一方面，本发明的核酸分子可将编码结缔组织生长因子(Connective tisssue frowth factor，CTGF)的mRNA作为靶核酸。本发明的一实施例中确认到：通过导入本发明结构的核酸分子能够抑制CTGF表达。本发明的另一实施方式涉及一种药物组合物，其用于治疗或者预防含有所述核酸分子的CTGF相关疾病或者障碍。

不仅如此，除了局部疾病施用的治疗剂以外，本发明的核酸分子通过同时使用以往已知的各种细胞特异性抗体(antibody)、适体(aptamer)、配体(ligand)等，有望开发出仅在所需的部位显现出基因抑制效果的基因调整治疗剂。

本发明的药物组合物，可单独包含所述诱导RNAi的核酸分子，或者可包含一个以上的药学上可接受的载体、赋形剂或者稀释剂而以药物组合物的形态提供，所述核酸分子可基于疾病及其重症程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、给药途径以及治疗时间等而以合适的药学上的有效量包含在药物组合物中。

上述叙述中，“药学上可接受的”是指，生理学上可接受且给药于人体时一般不引起胃肠障碍、眩晕等的过敏反应或类似反应的组合物。作为所述载体、赋形剂以及稀释剂的例，可例举：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸钠、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯(methylhydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁以及矿物油。

所述药物组合物还可包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂以及防腐剂等。另外，可通过本领域公知的方法，将本发明的药物组合物制造成剂型，以在给药于哺乳动物之后活性成分能够以快速、持续或者延迟的方式释放出。剂型可以是灭菌注射溶液等形式。

实施例

下面，通过实施例更加详细说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，对于本领域技术人员来说，本发明的范围并非限定于这些实施例是显而易见的。

实施例1：将CTGF作为靶的诱导RNAi的双链核酸分子的筛选

在为了有效的自我传递(self delivery)结构而导入各种化学修饰(chemical modification)之前，为了确保将CTGF作为靶标的高效率的诱导RNAi的双链核酸分子，设计针对CTGF的50种靶标序列之后进行筛选(screening)。

为了比较lasiRNA和以往RNAi诱导结构体的CTGF基因抑制效率，如表1至3所示，合成了将各碱基序列作为靶标的siRNA、asiRNA、lasiRNA结构体。表1至表3是针对CTGF作为靶标的24种序列的siRNA、asiRNA、lasiRNA结构体的碱基序列信息(大文字：RNA，小文字：DNA)。为了测试(test)各碱基序列以及结构的CTGF mRNA表达抑制效果，对HaCaT(ATCC)以10nM转染(transfection)各结构之后以实时定量PCR(Real-time PCR)方式测定CTGF mRNA表达程度。

表1

(大文字：RNA，小文字：DNA)

表2

(大文字：RNA，小文字：DNA)

表3

(大文字：RNA，小文字：DNA)

即，在100mm培养皿(petri dish)中的添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum)(Gibco公司)、100μg/ml青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Gibco公司)中，对HaCat细胞进行培养。当为Hacat的情况下，在即将进行转染(transfection)之前，在12-孔板(well plate)中种植(seeding)8X104个细胞。一方面，当为上述siRNA、asiRNA、lasiRNA时，在1X siRNA双向缓冲液(duplex buffer)(Biosesang公司)中以适合的浓度进行稀释，并在90℃温度下培养(incubation)2分钟、37℃温度下培养(incubation)1小时。退火(Annealing)后的siRNA在10％聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)中进行电泳之后，在EtBr中染色(staining)5分钟，并通过UV透射器(UV transiluminator)确认带(band)。基于Lipofectamine 2000转染试剂(英杰生命技术公司：Invitrogen)所提供的使用手册(manual)，对siRNA实施转染(transfection)之后，在24小时以后测定了mRNA水平(mRNA level)。

此时，转染(transfection)后使用分离试剂(Isol-RNA lysis reagent)(5PRIME公司)提取总RNA(total RNA)，其中500ng的RNA使用于cDNA合成。利用高容量cDNA反转录试剂盒(High-capacity cDNA反向(reverse)transcription kit)(Applied Biosystems公司)，并根据所提供的方案(protocol)来合成cDNA。合成的cDNA通过稀释(dilution)降低浓度之后，利用一步法实时定量PCR系统(step one real-time PCR system)(Applied Biosystems公司)，并根据所提供的方案(protocol)应用于定量的实时定量PCR(Real-time PCR)中。利用PCR试剂(power SYBR green PCR master Mix)(Applied Biosystems公司)确认靶标基因与基因特异性引物(primer)。使用于试验的引物(primer)碱基序列如下所述。

GAPDH-正向(forward)5’-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3’(序列号145)

GAPDH-反向(reverse)5’-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3’(序列号146)

CTGF-正向(forward)5’-CAA GGG CCT CTT CTG TGA CT-3’(序列号147)

CTGF-反向(reverse)5’-ACG TGC ACT GGT ACT TGC AG-3’(序列号148)

对24个碱基序列进行筛选(screening)的结果，如图1所示，确认到总24个碱基序列中的14个序列中lasiRNA具有相比于siRNA增加的活性(activity)(lasiRNA显示出相比于siRNA增加20％以上的基因抑制效率的情况)，在5种序列中显示出siRNA相比于lasiRNA更高的基因抑制效率，由此可确认lasiRNA相比于以往的siRNA总体上显示出更高的基因表达抑制效率的倾向。

特别是，对于显示出90％以上的基因抑制效率的siRNA和lasiRNA测定IC50的结果，确认到将第9号和第16号碱基序列作为靶标的lasiRNA具有最低的IC50，将第9号碱基序列选定为最终候选群以用于实施修饰(modification)试验和自我传递(self delivery)试验，其如下述表4所示。

表4

第9号的RNAi诱导双链核酸分子

(大文字：RNA，小文字：DNA)

实施例2：本发明的核酸分子的制造以及细胞内吸收率测定

2-1：胆固醇修饰的影响

首先，为了确认胆固醇修饰(modification)对lasiRNA的传递(delivery)带来的影响，将lasiRNA正义链(sense strand)，即将第二链的5’末端用cy3标记之后，用荧光显微镜确定胆固醇有无产生的吸收(uptake)差异。即，在HeLa细胞中以1uM培养(incubation)用cy3标记的lasiRNA或者chol-lasiRNA结构体，3小时后用荧光显微镜观察而比较细胞内传递的程度。

首先，在100mm培养皿(petri dish)中的添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum)(Gibco公司)、100μg/ml青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Gibco公司)中，对HeLa细胞(ATCC)进行培养。

对于胆固醇修饰(Cholesterol modification)的lasiRNA，在各自的单链Accell siRNA传递介质(single strand Accell siRNA传递介质(Accell siRNA delivery media))(Thermo scientific公司)中以适合的浓度进行稀释后使用，适用了胆固醇(Cholesterol)的单链(single strand)，是退火(Annealing)之前在90℃温度下培养(incubation)20～30秒之后使用。混合单链(single strand)和反义链(antisense strand)之后，在90℃温度下培养(incubation)30秒，在37℃温度下培养(incubation)1小时，将退火(Annealing)后的siRNA在10％聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)中进行电泳之后，在EtBr中染色(staining)5分钟，之后通过UV透射器(UV transiluminator)确认带(band)。

为了培养试验(incubation test)，在处理lasiRNA的24小时之前，在盖玻片底皿(Coverglass-bottom dish)(SPL)中种植(seeding)2X10⁵个HeLa细胞。去除准备的皿的培养基(culture media)之后，用2ml的1X DPBS洗涤(washing)两次。加入在37℃水浴(water-bath)中预先加热好的Accell siRNA传递介质(Accell siRNA delivery media)(Thermo scientific公司)100μL稀释而准备的siRNA并进行培养。3小时后去除Accell介质(Accell media)，用1X DPBS洗涤(washing)两次之后，用加有1ug/ml的Hoechst 33343(Sigma公司)的Opti-MEM(gibco公司)在37℃温度下培养(incubation)10分钟后对核进行染色。去除Hoechst之后，用1X DPBS(Gibco公司)洗涤(washing)两次后，加入到Opti-MEM介质中用显微镜(显微镜-奥林巴斯IX81，软件-MetaMorph)观察细胞的荧光。

其结果，如图2所示，确认胆固醇修饰带来的lasiRNA向细胞内的吸收率的结果，不存在胆固醇(Cholesterol)的情况下，在细胞内几乎观察不到cy3荧光，但是，lasiRNA中结合(conjugation)胆固醇(Cholesterol)的lasiRNA-chol情况下，显示出非常强的荧光。

其表示，lasiRNA结构通过胆固醇修饰，细胞内的传递(intracellular delivery)增加。

2-2：PS修饰(PS modification)的影响

进一步，为了确认在实施硫代磷酸酯直接导入于siRNA的修饰时是否增加lasiRNA的吸收率，在结合有胆固醇的chol-lasiRNA的反义链，即第一链的3'突出(overhang)中导入PS修饰(PS modification)，并测试(test)PS修饰(PS modification)带来的chol-lasiRNA的吸收率变化。HeLa细胞中以1uM培养(incubation)用cy3标记的chol-lasiRNA-PS(N)结构体，3小时后用荧光显微镜观察，比较了细胞内传递的程度。为了正确比较结构体之间的细胞穿透能力，设置chol-lasiRNA-PS0显示最小荧光的条件之后，比较了其它结构体的荧光强度。

为此，如图3所示，以Chol-lasiRNA的反义3’末端为起始，在导入0、4、7、12、17的PS修饰(PS modification)之后，与HeLa细胞一起进行培养(incubation)或者转染(transfection)，并如实施例2-1那样在荧光显微镜下观察PS修饰(PS modification)的个数带来的传递(delivery)效率差异。图3中，下划线以及红色表示OMe修饰(OMe modification)，＊表示PS修饰(PS modification)，Chol表示胆固醇，Cy3表示Cy3荧光物质。

其结果，如图4所示，可确认：不存在PS修饰(PS modification)的chol-lasiRNA-PS0的情况下，HeLa细胞中几乎观察不到荧光，相比于其它样品显示出低的吸收率。

并且，可确认：随着在lasiRNA的反义链即第一链中增加PS修饰(PS modification)，显示出逐渐发亮的荧光，全部样品(sample)中，PS各修饰有12、17个的chol-lasiRNA-PS12、chol-lasiRNA-PS17显示出最亮的荧光，随着在chol-lasiRNA中增加PS修饰(PS modification)的个数，内化(internalized)的lasiRNA量增加。

实施例3：CTGF表达抑制效率测定

实施例2中利用Cy3-标记lasiRNA的内化(internalization)试验结果，可确认，通过在lasiRNA结构中直接导入胆固醇(Cholesterol)和PS修饰(PS modification)，无需传递载体(delivery vehicle)或追加的试剂，也能够进行lasiRNA的有效的细胞内传递。但是，对siRNA导入各种化学修饰(chemical modification)时，已知多少减少siRNA的活性或根据修饰(modification)不同而siRNA的活性急剧减少，因此，为了确认各修饰(modification)对lasiRNA的活性带来的影响，将各种结构的lasiRNA转染(transfection)于HeLa细胞之后，测定CTGF mRNA的表达(expression)变化，由此测定各修饰(modification)对lasiRNA的基因表达抑制带来的影响。

为了确认PS修饰(PS modification)对lasiRNA的基因抑制效率带来的影响，将各种结构的PS修饰lasiRNA[chol-lasiRNA-PS(N)]转染(transfection)于HeLa细胞之后，测定CTGF基因的表达抑制效率。即，HeLa细胞中以10nM转染(transfection)chol-lasiRNA-PS(N)结构体，48小时后用实时定量PCR(Real-time PCR)测定CTGF mRNA的表达程度。

接着，实施试验24小时之前在24孔板中种植(seeding)2.5X10⁴个HeLa细胞之后，根据方案(protocol)利用lipofectamine 2000转染试剂对各lasiRNA进行转染(transfection)。之后，在5％CO2孵化器中培养48小时后，根据实施例1的方法测定mRNA表达水平(mRNA level)。

其结果，如图5所示，随着在反义链中增加PS修饰(PS modification)，显示出基因抑制效率降低的倾向，反义中导入12个以上的PS修饰(PS modification)时，观察到沉默活性(silencing activity)略微减少。反义中导入17个修饰(modification)的chol-lasiRNA-PS17的情况下，可确认，基因抑制效率急剧降低，几乎不显示对于CTGF表达的抑制效果，由此优选反义中最多使用17个以下PS，反义链中实施其以上的PS修饰(PS modification)时，作为自我传递(self-delivery)的修饰(modification)不合适。图5中，各图表显示出三次反复试验的平均和SD。

进一步，PS修饰(PS modification)的增加虽然提高chol-lasiRNA的自我细胞传递效率，但同时，根据其程度，还存在lasiRNA的沉默活性(silencing activity)减少的问题。为了确立无需载体(Vehicle)而诱导最佳沉默(silencing)的修饰(modification)结构，将具有多个PS修饰(PS modification)的chol-lasiRNA-PS(N)结构与HeLa一起进行培养(incubation)之后，测定CTGF mRNA水平(mRNA level)，并比较基因抑制效率。此时，以0.1μM、0.3μM以及1μM的浓度处理各个lasiRNA，还同时使用作为对照群的以MyD88为靶标的chol-lasiRNA-PS7(图6，红色：OMe修饰(OMe modification)，＊：PS修饰(PS modification)，Chol：胆固醇(Cholesterol))。即，HeLa细胞中同时培养(incubation)CTGF或者MyD88为靶标的chol-lasiRNA-PS(N)结构体，48小时后用实时定量PCR(Real-time PCR)测定CTGF mRNA的表达程度。

其结果，如图7所示，可确认：chol-lasiRNA-PS4的情况下，最高浓度的1uM也仅显示出约55％程度的基因抑制效率，chol-lasiRNA-PS7、chol-lasiRNA-PS12的情况下，1uM下可对CTGF的表达抑制达到约95％以上。为了更加正确地比较基因抑制效率，在更低的浓度下培养(incubation)各结构体之后测定CTGF mRNA水平(mRNA level)，其结果，PS12在低浓度下非常有效地抑制CTGF基因的表达。chol-lasiRNA-PS17与转染(transfection)的情况相同，在高浓度(1uM)下进行培养(incubation)时，也仅具有约50％程度的基因表达抑制效果，由此可知，与导入过多数量的PS修饰(PS modification)的方法相比，更需要根据传递(delivery)的增加和沉默活性(silencing activity)减少来优化适当的PS修饰(PS modification)个数。另外，以MyD88为靶标的chol-lasiRNA-PS7的情况下，对于CTGF几乎不显示基因抑制效率，由此可确认，cp-lasiRNA结构体是碱基序列特异性地抑制基因表达。

实施例4：其它亲油性化合物修饰的细胞内吸收率测定

为了观察使用胆固醇以外的其它亲油性化合物(lipophilic modification)修饰(即，疏水性修饰：hydrophobic modification)时的影响，用下述的序列制造以生存素(Survivin)为靶基因的本发明的cp-lasiRNA(细胞穿透性(cell penetrating)lasiRNA)。此时，cp-lasiRNA-1结合有胆固醇，cp-lasiRNA-2代替胆固醇在相应位置上结合有生育酚，cp-lasiRNA-3代替胆固醇在正义链的5'位上结合有硬脂酸。

<cp-lasiRNA(生存素)31mer>

cp-lasiRNA(生存素)反义31nt：5’

UGAAAAUGUUGAUCUCCUUUCCUAAGA＊C＊A＊T＊T 3’(序列号169)

cp-lasiRNA(生存素)Sense：5’GAGAUCAACAUUUU＊C＊A＊胆固醇.3’(序列号170)

下划线：OMe修饰，＊：PS(硫代磷酸酯键：phosphorothioate bond)

与实施例2相同地，在A549细胞株(ATCC)中各自以300mM培养(incubation)上述cp-lasiRNA-1、cp-lasiRNA-2、cp-lasiRNA-3，24小时后用实时定量PCR(Real-time PCR)测定生存素mRNA的表达程度。图8中表示出各两次反复试验的平均和SD。

转染(transfection)后使用分离试剂(Isol-RNA lysis reagent(5PRIME公司))提取总RNA(total RNA)，其中500ng的RNA使用于cDNA合成。利用高容量cDNA反转录试剂盒(High-capacity cDNA反向(reverse)transcription kit)(Applied Biosystems公司)，并根据所提供的方案(protocol)来合成cDNA。合成的cDNA通过稀释(dilution)降低浓度之后，利用一步法实时定量PCR系统(step one real-time PCR system)(Applied Biosystems公司)，并根据所提供的方案(protocol)，应用于定量的实时定量PCR(Real-time PCR)。利用PCR试剂(power SYBR green PCR master Mix)(Applied Biosystems公司)确认靶标基因与基因特异性引物(primer)。试验所用的引物(primer)碱基序列如下所述。

生存素

正向(forward)5'-GCA CCA CTT CCA GGG TTT AT-3'(序列号172)

反向(reverse)5'-CTC TGG TGC CAC TTT CAA GA-3'(序列号173)

其结果，如图8所示，可确认：在导入了胆固醇以外的其它疏水性修饰的情况下，也能够高效地抑制靶标基因。另外，硬脂酰基的情况下，即使结合于正义链的5’末端也显示出高的基因抑制效率，由此可知，本发明的核酸分子在各种位置中结合疏水性修饰，即结合亲油性化合物的情况下也能够得到所要达到的效果。

实施例5：不同反义链长度的靶标基因抑制效率观察

为了观察本发明的核酸分子的第一链的长度带来的靶标基因抑制效率，在相同的16nt的第二链(正义链)中组合31nt反义或者21nt的反义而制成cp-lasiRNA之后，处理于A549细胞株中。

<cp-lasiRNA(生存素)31mer>

cp-lasiRNA(生存素)反义31nt：

5’UGAAAAUGUUGAUCUCCUUUCCUAAGA＊C＊A＊T＊T 3’(序列号169)

cp-lasiRNA(生存素)正义：5’GAGAUCAACAUUUU＊C＊A＊胆固醇.3’(序列号170)

<cp-lasiRNA(生存素)21mer>

cp-lasiRNA(生存素)反义21nt：5’UGAAAAUGUUGAUCUCCU＊U＊U＊C＊C 3’(序列号171)

cp-lasiRNA(生存素)正义：5’GAGAUCAACAUUUU＊C＊A＊胆固醇.3’(序列号170)

下划线：OMe修饰，＊：PS(硫代磷酸酯键：phosphorothioate bond)

<cp-lasiRNA(CTGF)31mer>

cp-lasiRNA(CTGF)反义31nt：5’UCUUCCAGUCGGUAAGCCGCGAGGGCA＊G＊G＊C＊C 3’(序列号174)

cp-lasiRNA(CTGF)正义：5’CTTACCGACTGGAA＊G＊A＊chol.3’(序列号175)

<cp-lasiRNA(CTGF)21mer>

cp-lasiRNA(CTGF)反义21nt：5’UCUUCCAGUCGGUAAGC＊C＊G＊C＊G 3’(序列号176)

cp-lasiRNA(CTGF)正义：5’CTTACCGACTGGAA＊G＊A＊chol.3’(序列号175)

下划线：OMe修饰，*：PS(硫代磷酸酯键：phosphorothioate bond)

即，通过与实施例1相同的方法，在A549细胞株(ATCC)中分别转染(transfection)上述核酸分子，或者，与实施例2同样地进行培养(incubation)，24小时后用实时定量PCR(Real-time PCR)测定靶标基因mRNA的表达程度。图9中表示出各两次反复试验的平均和SD。图9A表示具有21mer反义的CTGF靶标cp-lasiRNA的基因抑制效率，9B表示具有31mer反义的CTGF靶标cp-lasiRNA的基因抑制效率，9C表示具有21mer反义的生存素靶标cp-lasiRNA的基因抑制效率，9D表示具有21mer反义的生存素靶标cp-lasiRNA的基因抑制效率。CTGF是利用实施例1的引物测定抑制效率，生存素是利用实施例4的引物测定抑制效率。

如图9所示，可确认：将CTGF作为靶标的cp-lasiRNA的情况下，转染(trnasfection)和培养(incubation)中具有31nt反义(antisense)的情况比具有21nt反义(antisense)的情况均显示出更高的靶标基因抑制效率(图9A-B)，将以生存素(Survivin)为靶标的cp-lasiRNA进行培养(incubation)的情况下也同样地，31nt反义显示出更高的靶标基因抑制效率。即，本发明的核酸分子能够设计具有19nt～31nt的各种长度的反义，即具有第一链的核酸分子，并利用其可有效地抑制靶标基因，但是，具有31nt长度的情况比21nt的反义可更加有效地抑制靶标基因。

实施例6：PS2修饰的效果确认

核酸分子中一个以上的核苷酸磷酸骨架被硫代磷酸酯修饰以外，通过如图10所示结构的二硫代磷酸酯(PS2)进行修饰时，通过下述方式观察其效果。

即，将在下述的cp-lasiRNA(生存素)以及下述的cp-lasiRNA(生存素)的相同位置中代替PS修饰导入了PS2修饰的cp-lasiRNA(生存素)-PS2，通过实施例1或者2的方法在A549细胞株中进行转染(transfection)或者培养(incubation)，24小时后通过与实施例4相同的方法实施实时定量PCR(Real-time PCR)，测定生存素(Survivin)基因的表达程度。各自实施两次反复试验，图表中表示出反复试验的平均和SD。

<cp-lasiRNA(生存素)>

cp-lasiRNA(生存素)反义31nt：5’UGAAAAUGUUGAUCUCCUUUCCUAAGA*C*A*T*T 3’(序列号169)

cp-lasiRNA(生存素)正义：5’GAGAUCAACAUUUU*C*A*胆固醇.3’(序列号170)

下划线：OMe修饰，*：PS(硫代磷酸酯键或二硫代磷酸酯键：phosphorothioate bond or phosphorodithioate bond)

其结果，如图11所示，可确认：没有观察到追加的硫修饰(sulfur modification)(PS2)带来基因抑制效果的提高，与以往的cp-lasiRNA相比显示出减少的基因抑制效果。

实施例7：本发明的核酸分子在体内(in vivo)靶中的基因抑制效率测定

目前，在利用RNAi技术的治疗剂开发当中，难点之一就是在体内(in vivo)进行有效RNA传递的技术开发。目前已开发的大多数载体技术中存在如下问题：在体外(in vitro)具有高效率，但适用于体内(in vivo)时其效率显著减少。对此，为了确认本发明的核酸分子在体内(in vivo)是否同样具有高的基因抑制效果，未使用另外载体，大鼠的皮肤中仅注射cp-lasiRNA，由此比较了靶标基因的表达抑制效果。

即，按照图12表示的浓度将PBS、siRNA(CTGF)、cp-lasiRNA(CTGF)或者cp-lasiRNA(Scrambled)溶解于100ul的PBS中，并将其皮内注射于大鼠皮肤之后，24小时后收集组织而测定靶标基因的表达效率。此时，大鼠(Rat)的腹腔中注射(injection)舒泰(Zoletil)和龙朋溶液(rompun solution)而麻醉之后，对大鼠(SD Rat，Orient Bio公司)背部全部实施除毛。在除毛部分的皮肤中画出半径5mm的圆之后，中心部位上用胰岛素注射器(insulin syringe)(BD，31G)皮内注射100ul的PBS、siRNA或者cp-lasiRNA。注射(injection)后，到标记的天数时，用8mm活检穿孔器(biopsy punch)摘取皮肤组织，进行基因表达分析。使用的核酸分子如下。

cp-lasiRNA(CTGF)反义Rat：5'-UCUUCCAGUCGGUAGGCAGCUAGGGCA*G*G*G*C-3'(序列号177)

cp-lasiRNA(CTGF)正义Rat：5'-CCTACCGACTGGAA*G*A*胆固醇.3'(序列号178)

下划线：OMe修饰，*：PS(硫代磷酸酯键：phosphorothioate bond)

作为siRNA利用了如下siRNA。

siRNA(CTGF)反义：5'-CUGCCUACCGACUGGAAGATT-3'(序列号179)

siRNA(CTGF)正义：5'-CUGCCUACCGACUGGAAGATT-3'(序列号180)

下划线：OMe修饰

此时，用试剂盒(RNeasy Fibrous tissue mini kit(Qiagen))提取RNA，并将总1ug的RNA用于cDNA合成中。利用高容量cDNA反转录试剂盒(High-capacity cDNA反向(reverse)transcription kit)(Applied Biosystems公司)，并根据所提供的方案(protocol)来合成cDNA。合成的cDNA通过稀释(dilution)降低浓度之后，利用一步法实时定量PCR系统(step one real-time PCR system)(Applied Biosystems公司)，并根据所提供的方案(protocol)利用于定量的实时定量PCR(Real-time PCR)。利用PCR试剂(power SYBR green PCR master Mix)(Applied Biosystems公司)确认靶标基因与基因特异性引物(primer)。使用于试验的引物(primer)碱基序列如下所述。图12的各图表表示五次反复试验的平均和SD。

CTGF-Rat

正向(forward)5'-GGC TCG CAT CAT AGT TG-3'(序列号181)

反向(reverse)5'-CGG GAA ATG CTG TGA GGA GT-3'(序列号182)

按照标识出的浓度将PBS、siRNA(CTGF)、cp-lasiRNA(CTGF)或者cp-lasiRNA(Scrambled)溶解于100ul的PBS中，并将其皮内注射于大鼠皮肤之后，24小时后收集组织而测定靶标基因的表达效率。各个图表表示五次反复试验的平均和SD。

其结果，如图12所示，与处理PBS、cp-lasiRNA(scrambled)或者siRNA(CTGF)的群相比，处理cp-lasiRNA(CTGF)的群中CTGF的表达减少了80～90％以上，由此可确认cp-lasiRNA在体内(in vivo)也可以高效地控制靶标基因。

另外，为了确认Cp-lasiRNA在体内(in vivo)的基因抑制效率，通过与上述相同的方法，将100ug/注射～0.1ug/注射范围的cp-lasiRNA注射于大鼠之后测定靶标基因的表达。

其结果，如图13所示，可确认：cp-lasiRNA(CTGF)在约0.3ug/注射的低浓度下也具有图70％以上的高的靶标基因抑制效率，具有约0.21ug/注射的IC50值。各个图表表示出两次反复试验的平均和SD。

另外，通过与上述相同的方法注射cp-lasiRNA(CTGF)之后，在第一天(Day1)、第二天(Day2)、第三天(Day3)以及第六天(Day6)分析组织而测定基因表达。即，第一天(Day1)皮内注射cp-lasiRNA(CTGF)之后，在所标记的日期摘取组织，用实时PCR(Realtime PCR)确认CTGF的表达。

其结果，如图14所示，可确认：cp-lasiRNA(CTGF)最少以5天以上抑制靶标基因的表达。各个图表表示两次反复试验的平均和SD。

工业实用性

如上说明，本发明的核酸分子结构通过同时导入胆固醇修饰以及硫代磷酸酯修饰，能够维持优异的基因抑制效率，并且无需另外的细胞载体而具有细胞内穿透能力，由此能够以充分诱导RNAi的量传递到实际的靶标部位，从而可解决以往技术中存在的体内(in vivo)传递问题。因此，本发明的核酸分子能够代替以往的siRNA分子而应用于采用siRNA进行的癌或病毒感染治疗等中，因此具有实用性。

以上，对于本发明内容的特定部分进行了详细叙述，本领域技术人员应该明白这样的具体叙述仅是优选的实施方式，本发明的范围并不限定于此。因此，本发明的实际范围由所附的权利要求书及其同等物来定义。

序列表Free Text

已附上电子文件。

序列表

<110> 奥利克斯医药有限公司（Olix Pharmaceuticals Inc.）

<120> 具有细胞内穿透能力的诱导RNA干扰的核酸分子及其用途

<130> PP-B1231

<150> KR 10-2012-0053950

<151> 2012-05-22

<160> 182

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.12的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.12）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 1

gcgaggagug ggugugugat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.1的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.1）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 2

uccucgcagc auuucccggt t 21

<210> 3

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.1的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.1）

<400> 3

aggagugggu guguga 16

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.1的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.1）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 4

uccucgcagc auuucccggt t 21

<210> 5

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.1的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.1）

<400> 5

aggagugggu guguga 16

<210> 6

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.1的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.1）

<400> 6

ucacacaccc acuccucgca gcauuucccg g 31

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.2的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.2）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<400> 7

agaccugugg gaugggcaut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.2的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.2）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 8

caggucuugg aacaggcgct t 21

<210> 9

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.2的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.2）

<400> 9

ccugugggau gggcau 16

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.2的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.2）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 10

caggucuugg aacaggcgct t 21

<210> 11

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.2的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.2）

<400> 11

ccugugggau gggcau 16

<210> 12

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.2的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.2）

<400> 12

augcccaucc cacaggucuu ggaacaggcg c 31

<210> 13

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.3的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.3）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 13

acaggaagau guacggagat t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.3的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.3）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 14

uuccuguagu acagcgauut t 21

<210> 15

<211> 16

<212> RNA

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<220>

<223> CTGF asiRNA No.3的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.3）

<400> 15

ggaagaugua cggaga 16

<210> 16

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.3的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.3）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 16

uuccuguagu acagcgauut t 21

<210> 17

<211> 16

<212> RNA

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<220>

<223> CTGF lasiRNA No.3的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.3）

<400> 17

ggaagaugua cggaga 16

<210> 18

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.3的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.3）

<400> 18

ucuccguaca ucuuccugua guacagcgau u 31

<210> 19

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.4的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.4）

<220>

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<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 19

gcaccagcau gaagacauat t 21

<210> 20

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.4的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.4）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 20

uaugucuuca ugcuggugct t 21

<210> 21

<211> 16

<212> RNA

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<220>

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<400> 21

ccagcaugaa gacaua 16

<210> 22

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.4的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.4）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 22

uaugucuuca ugcuggugct t 21

<210> 23

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<212> RNA

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<220>

<223> CTGF lasiRNA No.4的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.4）

<400> 23

ccagcaugaa gacaua 16

<210> 24

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.4的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.4）

<400> 24

uaugucuuca ugcuggucca gccagaaagc u 31

<210> 25

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.5的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.5）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 25

gaagacauac cgagcuaaat t 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.5的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.5）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 26

uuuagcucgg uaugucuuct t 21

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<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.5的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.5）

<400> 27

gacauaccga gcuaaa 16

<210> 28

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.5的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.5）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 28

uuuagcucgg uaugucuuct t 21

<210> 29

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.5的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.5）

<400> 29

gacauaccga gcuaaa 16

<210> 30

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.5的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.5）

<400> 30

uuuagcucgg uaugucuuca ugcuggugca g 31

<210> 31

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.6的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.6）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 31

gcuaaauucu guggaguaut t 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.6的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.6）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 32

auacuccaca gaauuuagct t 21

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.6的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.6）

<400> 33

aaauucugug gaguau 16

<210> 34

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.6的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.6）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 34

auacuccaca gaauuuagct t 21

<210> 35

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.6的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.6）

<400> 35

aaauucugug gaguau 16

<210> 36

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.6的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.6）

<400> 36

auacuccaca gaauuuagcu cgguaugucu u 31

<210> 37

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.7的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.7）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 37

gcgaggucau gaagaagaat t 21

<210> 38

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.7的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.7）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 38

uuguucuuca ugaccucgct t 21

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<212> RNA

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<220>

<223> CTGF asiRNA No.7的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.7）

<400> 39

aggucaugaa gaagaa 16

<210> 40

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.7的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.7）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 40

uuguucuuca ugaccucgct t 21

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<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.7的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.7）

<400> 41

aggucaugaa gaagaa 16

<210> 42

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.7的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.7）

<400> 42

uuguucuuca ugaccucgcc gucagggcac u 31

<210> 43

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.8的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.8）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 43

uggaagagaa cauuaagaat t 21

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<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.8的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.8）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 44

uucuuaaugu ucucuuccat t 21

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<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.8的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.8）

<400> 45

aagagaacau uaagaa 16

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<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.8的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.8）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 46

uucuuaaugu ucucuuccat t 21

<210> 47

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.8的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.8）

<400> 47

aagagaacau uaagaa 16

<210> 48

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.8的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.8）

<400> 48

uucuuaaugu ucucuuccag gucagcuucg c 31

<210> 49

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.9的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.9）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 49

cggcuuaccg acuggaagat t 21

<210> 50

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.9的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.9）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 50

ucuuccaguc gguaagccgt t 21

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<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.9的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.9）

<400> 51

cuuaccgacu ggaaga 16

<210> 52

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.9的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.9）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 52

ucuuccaguc gguaagccgt t 21

<210> 53

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.9的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.9）

<400> 53

cuuaccgacu ggaaga 16

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<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.9的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.9）

<400> 54

ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31

<210> 55

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

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<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 55

gcaugaagcc agagagugat t 21

<210> 56

<211> 21

<212> DNA/RNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<222> (1)..(19)

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<220>

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<222> (20)..(21)

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ucacucucug gcuucaugct t 21

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<213> 人工序列(Artificial)

<220>

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<212> DNA/RNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 58

ucacucucug gcuucaugct t 21

<210> 59

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.10的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.10）

<400> 59

ugaagccaga gaguga 16

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.10的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.10）

<400> 60

ucacucucug gcuucaugcc caugucuccg u 31

<210> 61

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.10的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.10）

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<222> (1)..(19)

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<222> (20)..(21)

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caccauaggu agaauguaat t 21

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<212> DNA/RNA

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uuacauucua ccuauggugt t 21

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<220>

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cauagguaga auguaa 16

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uuacauucua ccuauggugt t 21

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<220>

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<400> 65

cauagguaga auguaa 16

<210> 66

<211> 31

<212> RNA

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<220>

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<211> 21

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gcaggcuaga gaagca 16

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<220>

<223> CTGF lasiRNA No.11的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.11）

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<212> DNA/RNA

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<220>

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ccagagagug agagacauut t 21

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<220>

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<220>

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<222> (1)..(19)

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<222> (20)..(21)

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<212> DNA/RNA

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<222> (1)..(19)

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<220>

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<222> (20)..(21)

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<212> RNA

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<223> CTGF lasiRNA No.13的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.13）

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<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

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<220>

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<210> 82

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.14的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.14）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 82

ucuuccaggu cagcuucgct t 21

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.14的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.14）

<400> 83

aagcugaccu ggaaga 16

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<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.14的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.14）

<400> 84

ucuuccaggu cagcuucgca aggccugacc a 31

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<211> 21

<212> DNA/RNA

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<220>

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<220>

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<220>

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<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

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ccggagacaa ugacaucuut t 21

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<212> DNA/RNA

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<220>

<223> CTGF siRNA No.15的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.15）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

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<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

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<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 86

aagaugucau ugucuccggt t 21

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<212> RNA

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<220>

<223> CTGF asiRNA No.15的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.15）

<400> 87

gagacaauga caucuu 16

<210> 88

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.15的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.15）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

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<222> (20)..(21)

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<400> 88

aagaugucau ugucuccggt t 21

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<220>

<223> CTGF lasiRNA No.15的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.15）

<400> 89

gagacaauga caucuu 16

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<220>

<223> CTGF lasiRNA No.15的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.15）

<400> 90

aagaugucau ugucuccggg acaguuguaa u 31

<210> 91

<211> 21

<212> DNA/RNA

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<220>

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<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

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<222> (20)..(21)

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ucuuugaauc gcuguacuat t 21

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<211> 21

<212> DNA/RNA

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<220>

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<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

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uaguacagcg auucaaagat t 21

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<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.16的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.16）

<400> 93

uugaaucgcu guacua 16

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<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.16的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.16）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 94

uaguacagcg auucaaagat t 21

<210> 95

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.16的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.16）

<400> 95

uugaaucgcu guacua 16

<210> 96

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.16的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.16）

<400> 96

uaguacagcg auucaaagau gucauugucu c 31

<210> 97

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.17的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.17）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 97

uugcgaagcu gaccuggaat t 21

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<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.17的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.17）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 98

uuccagguca gcuucgcaat t 21

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<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.17的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.17）

<400> 99

cgaagcugac cuggaa 16

<210> 100

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.17的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.17）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 100

uuccagguca gcuucgcaat t 21

<210> 101

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.17的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.17）

<400> 101

cgaagcugac cuggaa 16

<210> 102

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.17的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.17）

<400> 102

uuccagguca gcuucgcaag gccugaccau g 31

<210> 103

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.18的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.18）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 103

caacuaugau uagagccaat t 21

<210> 104

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.18的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.18）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 104

uuggcucuaa ucauaguugt t 21

<210> 105

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.18的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.18）

<400> 105

cuaugauuag agccaa 16

<210> 106

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.18的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.18）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 106

uuggcucuaa ucauaguugt t 21

<210> 107

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.18的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.18）

<400> 107

cuaugauuag agccaa 16

<210> 108

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.18的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.18）

<400> 108

uuggcucuaa ucauaguugg gucugggcca a 31

<210> 109

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.19的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.19）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 109

guaccagugc acgugccugt t 21

<210> 110

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.19的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.19）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 110

caggcacgug cacugguact t 21

<210> 111

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.19的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.19）

<400> 111

ccagugcacg ugccug 16

<210> 112

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.19的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.19）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 112

caggcacgug cacugguact t 21

<210> 113

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.19的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.19）

<400> 113

ccagugcacg ugccug 16

<210> 114

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.19的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.19）

<400> 114

caggcacgug cacugguacu ugcagcugcu c 31

<210> 115

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.20的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.20）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 115

agugcauccg uacucccaat t 21

<210> 116

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.20的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.20）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 116

uugggaguac ggaugcacut t 21

<210> 117

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.20的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.20）

<400> 117

gcauccguac ucccaa 16

<210> 118

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.20的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.20）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 118

uugggaguac ggaugcacut t 21

<210> 119

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.20的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.20）

<400> 119

gcauccguac ucccaa 16

<210> 120

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.20的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.20）

<400> 120

uugggaguac ggaugcacuu uuugcccuuc u 31

<210> 121

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.21的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.21）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 121

caugauguuc aucaagacct t 21

<210> 122

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.21的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.21）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 122

ggucuugaug aacaucaugt t 21

<210> 123

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.21的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.21）

<400> 123

gauguucauc aagacc 16

<210> 124

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.21的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.21）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<400> 124

ggucuugaug aacaucaugt t 21

<210> 125

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.21的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.21）

<400> 125

gauguucauc aagacc 16

<210> 126

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.21的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.21）

<400> 126

ggucuugaug aacaucaugu ucuucuucau g 31

<210> 127

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.22的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.22）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 127

ccaugaccgc cgccaguaut t 21

<210> 128

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.22的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.22）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 128

auacuggcgg cggucauggt t 21

<210> 129

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.22的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.22）

<400> 129

ugaccgccgc caguau 16

<210> 130

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.22的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.22）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 130

auacuggcgg cggucauggt t 21

<210> 131

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.22的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.22）

<400> 131

ugaccgccgc caguau 16

<210> 132

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.22的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.22）

<400> 132

auacuggcgg cggucauggu uggcacugcg g 31

<210> 133

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.23的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.23）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 133

gaacauuaag aagggcaaat t 21

<210> 134

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.23的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.23）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 134

uuugcccuuc uuaauguuct t 21

<210> 135

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.23的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.23）

<400> 135

cauuaagaag ggcaaa 16

<210> 136

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.23的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.23）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 136

uuugcccuuc uuaauguuct t 21

<210> 137

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.23的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.23）

<400> 137

cauuaagaag ggcaaa 16

<210> 138

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.23的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.23）

<400> 138

uuugcccuuc uuaauguucu cuuccagguc a 31

<210> 139

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.24的正义链（sense strand of CTGF siRNA No.24）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 139

ggaagacacg uuuggcccat t 21

<210> 140

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF siRNA No.24的反义链（antisense strand of CTGF siRNA No.24）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 140

ugggccaaac gugucuucct t 21

<210> 141

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.24的正义链（sense strand of CTGF asiRNA No.24）

<400> 141

agacacguuu ggccca 16

<210> 142

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF asiRNA No.24的反义链（antisense strand of CTGF asiRNA No.24）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 142

ugggccaaac gugucuucct t 21

<210> 143

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.24的正义链（sense strand of CTGF lasiRNA No.24）

<400> 143

agacacguuu ggccca 16

<210> 144

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF lasiRNA No.24的反义链（antisense strand of CTGF lasiRNA No.24）

<400> 144

ugggccaaac gugucuucca gucgguaagc c 31

<210> 145

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 正向引物（forward primer）

<400> 145

gagtcaacgg atttggtcgt 20

<210> 146

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 反向引物（reverse primer）

<400> 146

gacaagcttc ccgttctcag 20

<210> 147

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF 正向引物（forward primer）

<400> 147

caagggcctc ttctgtgact 20

<210> 148

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> CTGF 反向引物（reverse primer）

<400> 148

gacaagcttc ccgttctcag 20

<210> 149

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> siRNA的正义链（sense strand of siRNA）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 149

cggcuuaccg acuggaagat t 21

<210> 150

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> siRNA的反义链（antisense strand of siRNA）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 150

ucuuccaguc gguaagccgt t 21

<210> 151

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> asiRNA的正义链（sense strand of asiRNA）

<400> 151

cuuaccgacu ggaaga 16

<210> 152

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> asiRNA的反义链（antisense strand of asiRNA）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 152

ucuuccaguc gguaagccgt t 21

<210> 153

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> lasiRNA的正义链（sense strand of lasiRNA）

<400> 153

cuuaccgacu ggaaga 16

<210> 154

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> lasiRNA的反义链（antisense strand of lasiRNA）

<400> 154

ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31

<210> 155

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(0)的正义链（sense strand of Chol-lasiRNA-PS(0)）

<400> 155

cuuaccgacu ggaaga 16

<210> 156

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(0)的反义链（antisense strand of Chol-lasiRNA-PS(0)）

<400> 156

ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31

<210> 157

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(4)的正义链（sense strand of Chol-lasiRNA-PS(4)）

<400> 157

cuuaccgacu ggaaga 16

<210> 158

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(4)的反义链（antisense strand of Chol-lasiRNA-PS(4)）

<400> 158

ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31

<210> 159

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(7)的正义链（sense strand of Chol-lasiRNA-PS(7)）

<400> 159

cuuaccgacu ggaaga 16

<210> 160

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(7)的反义链（antisense strand of Chol-lasiRNA-PS(7)）

<400> 160

ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31

<210> 161

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(12)的正义链（sense strand of Chol-lasiRNA-PS(12)）

<400> 161

cuuaccgacu ggaaga 16

<210> 162

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(12)的反义链（antisense strand of Chol-lasiRNA-PS(12)）

<400> 162

ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31

<210> 163

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(17)的正义链（sense strand of Chol-lasiRNA-PS(17)）

<400> 163

cuuaccgacu ggaaga 16

<210> 164

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(17)的反义链（antisense strand of Chol-lasiRNA-PS(17)）

<400> 164

ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31

<210> 165

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(7)-cy3的正义链（sense strand of Chol-lasiRNA-PS(7)-cy3）

<400> 165

cuuaccgacu ggaaga 16

<210> 166

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(7)-cy3的反义链（antisense strand of Chol-lasiRNA-PS(7)-cy3）

<400> 166

ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31

<210> 167

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(7)的正义链（sense strand of Chol-lasiRNA-PS(7)）

<400> 167

ccagaccaaa uuugca 16

<210> 168

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> Chol-lasiRNA-PS(7)的反义链（antisense strand of Chol-lasiRNA-PS(7)）

<400> 168

ugcaaauuug gucuggaagu cacauuccuu g 31

<210> 169

<211> 31

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> cp-lasiRNA (survivin)的反义链（antisense strand of cp-lasiRNA (survivin)）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 169

ugaaaauguu gaucuccuuu ccuaagacat t 31

<210> 170

<211> 16

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> cp-lasiRNA (survivin)的正义链（sense strand of cp-lasiRNA (survivin)）

<400> 170

gagaucaaca uuuuca 16

<210> 171

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> cp-lasiRNA (survivin)的反义链（antisense strand of cp-lasiRNA (survivin)）

<400> 171

ugaaaauguu gaucuccuuu c 21

<210> 172

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 172

gcaccacttc cagggtttat 20

<210> 173

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 173

ctctggtgcc actttcaaga 20

<210> 174

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> cp-lasiRNA (CTGF) 反义（cp-lasiRNA (CTGF) antisense） 31nt

<400> 174

ucuuccaguc gguaagccgc gagggcaggc c 31

<210> 175

<211> 16

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> cp-lasiRNA (CTGF) 正义（cp-lasiRNA (CTGF) sense）

<400> 175

cttaccgact ggaaga 16

<210> 176

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> cp-lasiRNA (CTGF) 反义（cp-lasiRNA (CTGF) antisense） 21nt

<400> 176

ucuuccaguc gguaagccgc g 21

<210> 177

<211> 31

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> cp-lasiRNA (CTGF) 反义大鼠（cp-lasiRNA (CTGF) Antisense Rat）

<400> 177

ucuuccaguc gguaggcagc uagggcaggg c 31

<210> 178

<211> 16

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> cp-lasiRNA (CTGF) 正义大鼠（cp-lasiRNA (CTGF) Sense Rat）

<400> 178

cctaccgact ggaaga 16

<210> 179

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> siRNA (CTGF) 反义（siRNA (CTGF) antisense）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（rivonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 179

cugccuaccg acuggaagat t 21

<210> 180

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> siRNA (CTGF) 正义（siRNA (CTGF) sense）

<220>

<223> 分子结合RNA/DNA（Molecule is combined RNA/DNA）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(19)

<223> 核糖核苷酸（ribonucleotides）

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(21)

<223> 脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleotides）

<400> 180

cugccuaccg acuggaagat t 21

<210> 181

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 181

ggctcgcatc atagttg 17

<210> 182

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<220>

<223> 引物（primer）

<400> 182

cgggaaatgc tgtgaggagt 20