本发明属于基因工程领域和蛋白质工程领域，具体是一种基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法。
背景技术：
人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域(简称Fn3)是一类能够耐受多个氨基酸插入、缺失或替换而保持其折叠及三级结构不变的骨架蛋白，具有稳定性高、可溶性高的特点，可在大肠杆菌中高水平表达。Fn3作为一个小的独立折叠单元，不含半胱氨酸和二硫键，由四条β-折叠和一条α-螺旋组成；其片段之间形成三个loop区域(BC loop区、DE loop区及FG loop区)。经大量研究表明FGloop区具有较高的灵活性，其突变或缺失对于骨架蛋白Fn3的结构和稳定性影响不大。此外，Fn3还具有非常高的热稳定性(Tm值高达87℃)；室温条件下，在pH值2-11.3的范围内仍能保持蛋白质的天然构象。Fn3的结构特点为以其为基础合成稳定的人工结合蛋白提供了良好的条件，非常适合作为融合蛋白在大肠杆菌中表达纯化。以上特点为基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位提供可能。
抗原表位(Antigenic epitope)，又称抗原决定簇(Antigenic determinant，AD)，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。抗原表位通常是指外来蛋白质等物质的其中一部分序列。针对蛋白质类抗原的抗原表位一般仅由几个到十几个氨基酸组成。在应用酶联免疫吸附剂测定(简称ELISA)检测蛋白质类抗原含量时，需要有被检测的蛋白抗原作为标准物，通常采取双抗体夹心法来进行检测。其中一个抗体作为捕获抗体，固定在固体表面；另外一个抗体用酶或荧光标记，作为检测抗体。蛋白质类抗原，特别是小分子肽类普遍存在不稳定，容易降解，制备成本较高等特点。例如脑钠肽前体N端部分(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-proBNP)是心肌细胞在合成多肽类激素B型脑钠肽(BNP)过程中产生的无生物活性的、由76个氨基酸组成的直链多肽片段。心衰患者血液中BNP以及NT-proBNP两种多肽的浓度与心衰严重程度成正比，心衰患者血浆BNP浓度可增至几个ng/mL，而NT-ProBNP可高达几十个ng/mL。NT-proBNP生物半衰期为60-120分钟，相比生物半衰期仅为20分钟的BNP要长的多，目前国际上已经公认NT-ProBNP是测定心衰的一个特异性标志物。但是多肽NT-proBNP作为抗原标识物，其分子量小(76个氨基酸)，只有8.45kD，且不稳定，分离和纯化难度也大，同时易降解。所以，需要通过基因重组方式，将编码目标蛋白质类双抗原表位序列重组在一个稳定的蛋白质基因序列中，例如Fn3为非常稳定的蛋白质，利用大肠杆菌可大量表达该稳定蛋白质，将目标蛋白质表位展示在稳定的Fn3重组蛋白上，作为相应蛋白抗原替代物具有重要的研究价值。
本发明采用人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域(Fn3)，通过展示脑钠肽前体N端NT-proBNP双抗原表位，高效生产稳定的抗原蛋白替代物，提供解决蛋白质类抗原制备难的方法，为制备免疫学检测标准品提供有效途径。
技术实现要素：
本发明为解决蛋白质类抗原制备难的问题，提供一种基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法，为制备免疫学检测标准品提供有效途径。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)通过基因重组，构建能在大肠杆菌中表达人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位的重组蛋白表达载体；
(2)将步骤(1)中构建的重组蛋白表达载体转化大肠杆菌工程菌株，筛选出阳性转化子；
(3)将步骤(2)筛选出的阳性转化子进行诱导表达和纯化，获得所需重组蛋白。
上述方法还包括对步骤(3)获得的重组蛋白进行双抗体夹心ELISA法检测。
进一步地，步骤(1)具体过程为：将编码抗原表位的碱基序列，如编码脑钠肽前体N端第12-21的氨基酸的碱基序列(NT-proBNP12-21表位)，替换人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域编码FG loop区的碱基序列(编码Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys的碱基序列)，并将编码另一个抗原表位碱基序列，如编码脑钠肽前体N端第62-73的氨基酸的碱基序列(NT-proBNP62-73表位)，通过编码SSNNNNNNNNNN短肽重组在以上基因的3′端。S代表丝氨酸残基，N代表天冬酰胺残基。在以上融合基因的5′端重组编码6个组氨酸标签，用于重组蛋白鉴定及分离纯化。同时在5′端和3′端分别引入酶切位点NcoⅠ和HindⅢ。将以上融合基因用酶切位点NcoⅠ和HindⅢ构建到pET28大肠杆菌胞内表达载体上，即得到重组蛋白表达载体。
进一步地，步骤(2)中得到的重组蛋白表达载体转化大肠杆菌工程菌株，应用含抗生素的LB固体培养基平板筛选出阳性转化子。
进一步地，步骤(3)具体过程为：将步骤(2)筛选出的阳性转化子，在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4～0.6时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4小时，获得大肠杆菌胞内表达重组蛋白；将上述获得的大肠杆菌胞内表达重组蛋白经常规镍柱纯化，即获得利用大肠杆菌生产制备的人纤维连接蛋白III型结构域展示双抗原表位的抗原替代物。
应用上述方法制备的重组蛋白作为ELISA检测试剂盒中的标准抗原替代物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明方法可以简单、快速、高效制备具有展示双抗原表位的抗原替代物，为生产相应的免疫学检测标准品建立技术平台，此方法合成重组蛋白成本低、周期短、稳定性高，技术上容易操作。
附图说明
图1是本发明Fn3展示双抗原表位的氨基酸序列图(氨基酸序列以英文名称单字母表示)；图中，1)Fn3氨基酸序列，2)rFn3-2-epitopes氨基酸序列；
图2是本发明pET28-rFn3-2-epitopes的表达载体结构图；
图3是本发明考马斯亮蓝染色和Western blot蛋白印迹检测重组蛋白rFn3-2-epitopes表达；图中，图A为考马斯亮蓝染色：1)预染Marker，2)纯化后的重组蛋白rFn3-2-epitopes；图B为Western blot蛋白印迹：1)鼠源抗NT-proBNP的12-21氨基酸残基表位的单克隆抗体13G12(购于Hy Test Ltd)检测重组蛋白，2)鼠源抗NT-proBNP的62-73氨基酸残基表位的单克隆抗体15C4(购于Hy Test Ltd)检测重组蛋白；
图4是本发明双抗体夹心ELISA法检测重组蛋白rFn3-2-epitopes；为鼠源抗NT-proBNP的12-21氨基酸残基表位的单克隆抗体13G12与鼠源抗NT-proBNP的62-73氨基酸残基表位的单克隆抗体15C4双抗体夹心ELISA法检测重组蛋白rFn3-2-epitopes。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护范围。
一种基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法，包括以下步骤：
1.构建能在大肠杆菌中表达人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位的重组蛋白表达载体：
本步骤采用脑钠肽前体N端第12-21的氨基酸表位(NT-proBNP12-21表位)和脑钠肽前体N端第62-73的氨基酸的表位(NT-proBNP62-73表位)为模型，通过基因重组，将编码其中一个抗原表位的碱基序列替换人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域编码FG loop区的碱基序列(即编码Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys的碱基序列)，并将编码另一个抗原表位的碱基序列通过编码SSNNNNNNNNNN(S代表丝氨酸残基，N代表天冬酰胺残基)短肽重组在以上基因的3′端；在5′端引入编码6个组氨酸残基的碱基序列，作为分离纯化标签，方便后续的蛋白质纯化。同时在5′端和3′端分别引入用于克隆的酶切位点NcoⅠ和HindⅢ。将以上编码Fn3展示双抗原表位的融合基因克隆到大肠杆菌胞内表达载体pET28上，完成大肠杆菌胞内表达Fn3展示双抗原表位重组蛋白的表达载体构建。
2.将构建的重组蛋白基因表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，应用含抗生素的LB固体培养基平板筛选出阳性转化子。
3.基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位基因重组蛋白的诱导表达和纯化：
将步骤2筛选出的阳性转化子，在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.4-0.6时，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达4小时。在此过程中，大肠杆菌胞内表达重组蛋白。表达的重组蛋白经常规镍柱纯化，即用重组蛋白的组氨酸标签进行亲和层析，获得表达的重组蛋白。
4.分别用抗所展示的两个抗原表位的抗体进行双抗体夹心ELISA法检测重组蛋白。
实施例1
人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白表达载体的构建：
将编码NT-proBNP12-21氨基酸残基表位的碱基序列替换编码Fn3FG loop区的碱基序列(即编码Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Lys的碱基序列)，将编码NT-proBNP62-73氨基酸残基表位的碱基序列替换编码Fn3的3′端的碱基序列，以实现通过人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域稳定表达NT-proBNP双抗原表位基因的方法。在编码两个短肽碱基序列中引入编码SSNNNNNNNNNN(S代表丝氨酸残基，N代表天冬酰胺残基)短肽的碱基序列，以延长两个抗原表位之间的距离，减小两者间的相互影响；在5′端引入编码6个组氨基酸残基的碱基序列，作为重组蛋白分离纯化标签，方便后续的蛋白质纯化；同时在5′端和3′端分别引入酶切位点NcoⅠ和HindⅢ用于克隆。获得编码重组蛋白rFn3-2-epitopes的融合基因，氨基酸序列见图1。
将以上融合基因用酶切位点NcoⅠ和HindⅢ构建到pET28大肠杆菌表达载体上，得到重组表达载体pET28-rFn3-2-epitopes，融合的重组蛋白可在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行胞内表达，表达载体结构见图2。
实施例2
大肠杆菌BL21(DE3)转化：
取0.1μg重组后质粒pET28-rFn3-2-epitopes热激转化100μL大肠杆菌BL21(DE3)化学感受态细胞。具体操作为：将以上质粒与化学感受态细胞轻轻混匀后，冰浴3分钟，接着42℃热激80秒，冰浴5分钟，然后加入37℃预热好的200μL SOC培养基；37℃温箱放置30分钟后，于37℃、220rpm振荡培养1小时；分别取50μL、100μL培养后菌液梯度涂板，所用培养基为含卡那霉素抗生素(终浓度为50μg/mL)的LB固体培养基。于37℃温箱过夜培养，长出阳性单克隆。
其中，LB固体培养基配方为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂糖粉15g/L，加ddH2O配制而成，pH＝7.2。
实施例3
人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的诱导表达：
实施例2中得到的阳性转化子，挑取单克隆后在含有卡那霉素抗生素(终浓度为50μg/mL)的LB固体培养基上划线，于37℃温箱过夜培养。挑取单克隆接种于含有卡那霉素抗生素(终浓度为50μg/mL)的3mL LB液体培养基中，37℃、220rpm过夜培养。次日，以1:100的比例将菌液接种到含有卡那霉素抗生素(终浓度为50μg/mL)的500mL LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD600nm达到0.5。然后，添加终浓度为0.2mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，在26℃、220rpm条件下诱导表达4小时。在此过程，大肠杆菌胞内表达重组蛋白rFn3-2-epitopes。最后，于4℃、5000rpm低温离心10分钟，收取含有重组蛋白的菌体。
LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，加ddH2O配制而成，pH＝7.2。
LB固体培养基配方为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂糖粉15g/L，加ddH2O配制而成，pH＝7.2。
通过上述诱导表达，获得高水平胞内表达重组蛋白rFn3-2-epitopes的大肠杆菌BL21(DE3)。
实施例4
人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的分离纯化：
将实施例3中所得的高水平胞内表达重组蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)，通过超声破碎、低温高速离心等方法获得包含可溶性蛋白的上清液，进行镍柱纯化。
用平衡缓冲液平衡镍柱10个柱体积，将上述所得上清液平衡后低速上柱。样品上柱完毕后，继续用20mM咪唑浓度的缓冲液洗20个柱体积，接着分别用含有40、60、80、100、120、240、500mM咪唑浓度的缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱液，即获得纯化后的重组蛋白。用SDS-PAGE检测蛋白表达量，并用Western blot蛋白印迹检测表达的蛋白是否为重组蛋白rFn3-2-epitopes。检测结果见图3。
纯化后的重组蛋白rFn3-2-epitopes采用脱盐柱除盐，-20℃低温保存。
实施例5
人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的双抗体夹心ELISA法检测：
将脱盐后的重组蛋白rFn3-2-epitopes，通过BCA法测得蛋白浓度。
用Hy Test Ltd公司生产的鼠源抗NT-proBNP62-73氨基酸残基表位的单克隆抗体15C4作为捕获抗体(抗体1:2000稀释，终浓度3.5μg/mL)，于96孔酶标板上37℃包被3小时；5％BSA作为封闭液，过夜封闭；然后分别加梯度稀释的重组蛋白rFn3-2-epitopes，37℃共孵育2小时，并以包被缓冲液作为空白对照组，每组做三个平行孔；分别加Hy Test Ltd公司生产的辣根过氧化酶标记的鼠源抗NT-proBNP12-21氨基酸残基表位的单克隆抗体13G12作为检测抗体(1:2000稀释，终浓度0.35μg/mL)，37℃共孵育2小时。然后经PBST洗涤液洗孔5次后，最后加底物TMB显色10分钟，用2M的硫酸终止，于波长450nm处读取光密度OD值。用所得OD值做出与蛋白浓度关系曲线图，获得重组蛋白rFn3-2-epitopes与单抗15C4和13G12的双抗体夹心ELISA检测标准曲线。见图4。
以上步骤每次包被完抗体、封闭液和蛋白后，都用PBST洗涤液洗孔。
所述PBST洗涤液配方为：氯化钠(NaCl)8g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)0.27g/L，磷酸氢二钠(Na2HPO4)1.42g/L，氯化钾(KCl)0.2g/L，吐温-20(Tween-20)0.05％，加去离子水配制而成，pH＝7.4。
由上述可以看出，本发明主要有以下显著的特点：于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域(Fn3)上引入了可表达NT-proBNP双抗原表位的基因序列，并通过大肠杆菌胞内表达载体在大肠杆菌体内获得了高表达的稳定重组蛋白rFn3-2-epitopes。
从以上实例来看，该方法可以快速、高效获得能够表达NT-proBNP双抗原表位的重组蛋白，为进一步研究NT-proBNP的检测方法建立技术平台。
本发明实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和通用方法，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以有其它的实施方式。如可以在人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域(Fn3)上引入NT-proBNP的其他抗原表位，或者其他蛋白质类抗原表位。因此，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利保护范围之内。
序列表
<110> 大连大学
<120> 一种基于人纤维连接蛋白Ⅲ型结构域展示双抗原表位制备抗原替代物的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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gttgattata ccattactgt ttacgcagta actgggcgtg gcgattcacc ggcgtcctct 240
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<210> 2
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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