本发明涉及生物发酵技术领域，具体而言，涉及一种利用三孢布拉氏霉菌制备番茄红素的方法及番茄红素制品。
背景技术：
三孢布拉氏霉当前主要应用于β胡萝卜素，有机理研究表明是由于三孢布拉氏霉发酵过程中环化酶的合成阻断了番茄红素的产生，从而产物主要为β胡萝卜素，用很多研究报道采用烟碱、咪唑等强烈刺激性物质来阻断发酵过程中环化酶的合成，从而有效促进番茄红素的合成，但是烟碱、咪唑等强烈刺激性物质被菌体利用后，产物残留量无法有效控制，严重影响番茄红素产品的品质。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用三孢布拉氏霉菌制备番茄红素的方法，该方法以不含有烟碱、咪唑等强烈刺激性物质的咖啡豆果皮肉水解液作为环化酶的阻断剂，降低产品中刺激性物质的残留，提高番茄红素产品的品质。
本发明的另一目的在于提供一种由上述的方法所制备得到的番茄红素制品，。
本发明是这样实现的：
一种制备番茄红素的方法，其包括：在发酵培养过程中，往接种有三孢布拉氏霉菌的发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
一种番茄红素制品，其由上述的制备番茄红素的方法所制备得到。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的制备番茄红素的方法，利用三孢布拉氏霉菌制备番茄红素，该方法以不含有烟碱、咪唑等强烈刺激性物质的咖啡豆果皮肉水解液作为环化酶的阻断剂，而是利用咖啡豆果皮肉水解液含有的含氮杂环生物碱类物质阻断环化酶的产生，降低产品中刺激性物质的残留，并促进环化酶的产生，有效地提高番茄红素产品产量和品质。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种利用三孢布拉氏霉菌制备番茄红素的方法及番茄红素制品进行具体说明。
一方面，本发明实施例提供了一种制备番茄红素的方法，其包括：在发酵培养过程中，往接种有三孢布拉氏霉菌的发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
本发明的发明人在研究中首次发现，由咖啡豆果皮肉经剪切处理、酸解处理以及酶解处理后得到咖啡豆果皮肉水解液含有生物碱类物质，一方面，其可以作为在以三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素中阻挡环化酶产生的阻断剂，避免含有烟碱、咪唑等强烈刺激性物质的添加，提高产品品质，另一方面，其可以有效促进甲羟戊酸代谢途径，利于番茄红素的合成，提高番茄红素产量。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵第15-25h期间，往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
在合适的发酵时间阶段加入咖啡豆果皮肉水解液可以提高番茄红素产量。在发酵第15-25h期间，往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液，可以促进番茄红素合成，提高其产量。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，咖啡豆果皮肉水解液的加入量为发酵液体积的4-8％。
需要说明的是，在发酵第15-25h期间以一次添加的方式将咖啡豆果皮肉水解液加入至发酵液中。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在第30h至发酵结束期间，以0.8-1.5g·l-1·h-1的流速往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
在第30h至发酵结束期间，以0.8-1.5g·l-1·h-1的流速往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液，可以进一步地促进甲羟戊酸代谢途径，提高番茄红素的产量。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，咖啡豆果皮肉水解液通过如下方法制备得到：
将咖啡豆果皮肉经剪切处理、酸解处理以及酶解处理后得到咖啡豆果皮肉水解液。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，剪切处理的剪切速度为4000-8000r/min，剪切时间为5-10min。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，酸解处理为：按质量百分比为1-5％的比例，往经剪切处理后的咖啡豆果皮肉中加入酸例如盐酸)，并加入与酸等量的水，混合均匀后，室温酸解4-8h。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，酶解处理为：按质量百分比为1-5％的比例，往将酸解处理后的咖啡豆果皮肉中加入酶，置于55-65℃条件下，酶解4-8h；
酶包括碱性蛋白酶和纤维素酶。
其中，碱性蛋白酶的酶活为150万u/g、纤维素酶的酶活为100万u/g。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，酶中，碱性蛋白酶和纤维素酶的质量比为：(3-4):(6-7)。
另一方面，本发明实施例提供了一种番茄红素制品，其由上述任一项述的制备番茄红素的方法所制备得到。
本发明实施例提供的番茄红素制品具有番茄红素含量高，杂质少，品质高等特点。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的制备番茄红素的方法，其包括如下步骤：
1制备咖啡豆果皮肉水解液
1.1剪切处理：取咖啡豆果皮肉1000g，置于高速剪切机中，于8000r/min速度下剪切10min；得到咖啡豆果皮肉粉碎料。
1.2酸解处理：按质量百分比为2％的比例，往咖啡豆果皮肉粉碎料中加入10mol/l盐酸，并加入与酸等量的水，混合均匀后，置于室温条件下，酸解4h；得到咖啡豆果皮肉酸解液。
1.3酶解处理：将酶按质量百分比为2％的比例(酶：咖啡豆果皮肉粉碎料＝2％)加入至将咖啡豆果皮肉酸解液中，置于60℃条件下，酶解4h；即得咖啡豆果皮肉水解液。
其中，酶由碱性蛋白酶和纤维素酶组成，碱性蛋白酶与纤维素酶的重量比为3:7。
2发酵培养
2.1斜面培养
取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的孢子悬液，分别涂布于pda斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；
其中，三孢布拉氏霉菌正菌为三孢布拉氏霉菌bt7251(+)，保藏编号为cctccm2014378；三孢布拉氏霉菌负菌为三孢布拉氏霉菌bt7603(-)，保藏编号为cctccm2014379。
2.2种子培养
分别从三孢布拉氏霉菌正、负菌株的pda斜面培养基上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，再分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48h，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。
2.3发酵培养
将步骤2.2中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照正、负菌菌体质量比为1:5混合均匀，以10％(体积比)接种量接入50l发酵罐中，发酵培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度300转/分钟，通气量3vvm(l/l.min)，罐压0.1mpa，培养时间120h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/l。
其中，在发酵第20h，往发酵液中一次性加入咖啡豆果皮肉水解液，加入量为发酵液体积的5％；
在第30-120h期间，以1g·l-1·h-1的流速往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
3检测
发酵结束后，准确称量0.02g干菌体，用四氢呋喃萃取，用高效液相色谱法检测番茄红素产量，结果见表2。
其中，高效液相色谱检测方法参考如下：
(1)色谱条件：
色谱柱：suplexpkb-100(supelco)；250×4.6mm，5μm；
波长：472nm；
流速：0.5ml/min；
进样体积：10μl；
柱温：30℃；
(2)流动相配制及条件：
a相：甲醇
b相：称取50mgbht至1l容量瓶中，加20ml异丙醇溶解。加入0.2mln,n-二异丙基乙胺，25ml0.2％醋酸铵溶液，455ml乙腈，450ml甲醇，溶液恢复至室温，并用甲醇稀释至刻度。
流动相梯度表
4使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的番茄红素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得高纯度的番茄红素制品。
其中，在其他的实施例中，步骤3-4为可选步骤，生产者可根据实际情况选择进行。
实施例2
本实施例提供的制备番茄红素的方法，其包括如下步骤：
1制备咖啡豆果皮肉水解液
1.1剪切处理：取咖啡豆果皮肉800g，置于高速剪切机中，于4000r/min速度下剪切10min；得到咖啡豆果皮肉粉碎料。
1.2酸解处理：按质量百分比为2％的比例，往咖啡豆果皮肉粉碎料中加入10mol/l盐酸，并加入与酸等量的水，混合均匀后，置于室温条件下，酸解4h；得到咖啡豆果皮肉酸解液。
1.3酶解处理：将酶按质量百分比为2％的比例(酶：咖啡豆果皮肉粉碎料＝2％)加入至将咖啡豆果皮肉酸解液中，置于60℃条件下，酶解4h；即得咖啡豆果皮肉水解液。
其中，酶由碱性蛋白酶和纤维素酶组成，碱性蛋白酶与纤维素酶的重量比为4:6。
2发酵培养
同实施例1
不同的是，在发酵过程中，在发酵第24h，往发酵液中一次性加入咖啡豆果皮肉水解液，加入量为发酵液体积的6％；
在第30-120h期间，以0.9g·l-1·h-1的流速往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
其余同实施例1。
实施例3
本实施例提供的制备番茄红素的方法，其包括如下步骤：
1制备咖啡豆果皮肉水解液
1.1剪切处理：取咖啡豆果皮肉800g，置于高速剪切机中，于6000r/min速度下剪切8min；得到咖啡豆果皮肉粉碎料。
1.2酸解处理：按质量百分比为5％的比例，往咖啡豆果皮肉粉碎料中加入10mol/l盐酸，并加入与酸等量的水，混合均匀后，置于室温条件下，酸解7h；得到咖啡豆果皮肉酸解液。
1.3酶解处理：将酶按质量百分比为5％的比例(酶：咖啡豆果皮肉粉碎料＝5％)加入至将咖啡豆果皮肉酸解液中，置于65℃条件下，酶解8h；即得咖啡豆果皮肉水解液。
其中，酶由碱性蛋白酶和纤维素酶组成，碱性蛋白酶与纤维素酶的重量比为5:5。
2发酵培养
同实施例1
不同的是，在发酵过程中，在发酵第15h，往发酵液中一次性加入咖啡豆果皮肉水解液，加入量为发酵液体积的8％；
在第30-120h期间，以1.2g·l-1·h-1的流速往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
其余同实施例1。
实施例4
本实施例提供的制备番茄红素的方法，其包括如下步骤：
1制备咖啡豆果皮肉水解液
1.1剪切处理：取咖啡豆果皮肉100g，置于高速剪切机中，于8000r/min速度下剪切5min；得到咖啡豆果皮肉粉碎料。
1.2酸解处理：按质量百分比为1％的比例，往咖啡豆果皮肉粉碎料中加入10mol/l盐酸，并加入与酸等量的水，混合均匀后，置于室温条件下，酸解8h；得到咖啡豆果皮肉酸解液。
1.3酶解处理：将酶按质量百分比为3％的比例(酶：咖啡豆果皮肉粉碎料＝3％)加入至将咖啡豆果皮肉酸解液中，置于65℃条件下，酶解8h；即得咖啡豆果皮肉水解液。
其中，酶由碱性蛋白酶和纤维素酶组成，碱性蛋白酶与纤维素酶的重量比为3.5:6.5。
2发酵培养
同实施例1
不同的是，在发酵过程中，在发酵第18h，往发酵液中一次性加入咖啡豆果皮肉水解液，加入量为发酵液体积的5％；
在第30-120h期间，以1.2g·l-1·h-1的流速往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
其余同实施例1。
实施例5
本实施例提供的制备番茄红素的方法，其包括如下步骤：
1制备咖啡豆果皮肉水解液
同实施例1。
2发酵培养
同实施例1，
与实施例不同的是，在发酵过程中，在发酵第25h，往发酵液中一次性加入咖啡豆果皮肉水解液，加入量为发酵液体积的7％；
在第30-120h期间，以1.5g·l-1·h-1的流速往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
其余同实施例1。
对比例1
本对比例的制备番茄红素的方法，包括如下：
发酵培养与实施例1基本相同，不同的是：
其中，在发酵第20h，往发酵液中一次性加入烟碱，加入量为发酵液体积的0.15％。
后续检测步骤同实施例1。
对比例2
本对比例的制备番茄红素的方法，包括如下：
发酵培养与实施例1基本相同，不同的是：
其中，在发酵第25h，往发酵液中一次性加入咪唑，加入量为发酵液体积的0.2％。
后续检测步骤同实施例1。
对比例3
本对比例的制备番茄红素的方法，与实施例1基本相同，不同的是在发酵培养过程中，在发酵第30h，往发酵液中一次性加入咖啡豆果皮肉水解液，加入量为发酵液体积的10％；
在第30-120h期间，以2g·l-1·h-1的流速往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
其余同实施例1。
对比例4
本对比例的制备番茄红素的方法，与实施例1基本相同，不同的是在发酵培养过程中，在发酵第10h，往发酵液中一次性加入咖啡豆果皮肉水解液，加入量为发酵液体积的2％；
在第30-120h期间，以0.4g·l-1·h-1的流速往发酵液中加入咖啡豆果皮肉水解液。
其余同实施例1。
表1实施例1-5的番茄红素生物制品中的番茄红素含量
表中：干菌体的番茄红素含量是指每100g干菌体含番茄红素量(g)。
从表1数据可以看出，实施例1-5提供的制备番茄红素的方法得到的番茄红素的含量明显高于对比例1-3，且施例1-5提供的制备番茄红素的方法得到的产品基本不含有烟碱和咪唑，大大地提高了番茄红素产品品质。
综上，作为环化酶阻断剂的烟碱、咪唑等强烈刺激性物质被菌体利用后，产物中残留量无法有效控制，严重影响番茄红素产品品质，本发明利用咖啡豆加工副产物咖啡豆果皮肉经过高速剪切后进行酸解和酶解，得到咖啡豆果皮肉水解液，其中，除了含有丰富的氨基氮能够促进菌体生长利用，更有一定量的含氮杂环和生物碱类物质，这些物质在发酵过程中能够有效的阻断环化酶的合成，从而提高番茄红素产量。
总之，本发明提供的制备番茄红素的方法采用咖啡豆果皮肉水解液为原料制备番茄红素具有成本低，原料来源安全品质高，副产物循环利用节约资源，番茄红素产量和品质高等特点。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。