一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌及其应用，属于微生物领域。
【背景技术】
[0002] 布拉迪酵母菌，又称布拉氏酵母（Saccharomycesboulardii)属于酿酒酵母的一 个亚种，其没有病原性，能在37°C高温下良好生长，并具有独特的生物活性。布拉迪酵母菌 能够有效地治疗人和动物的各种腹泻，且未发现不良反应。布拉迪酵母菌进入人和动物肠 道后，不仅可W降解致病菌产生的毒素和中和细菌毒素，还能够刺激肠道黏膜从而增强免 疫功能，同时调节肠道内微生态环境的平衡，阻止病原菌的侵袭，且布拉迪酵母菌制剂属于 天然微生态制剂，不仅无毒副作用，还可W提供一定的营养物质。因此，布拉迪酵母菌在畜 牧业上的应用越来越广泛。
[0003] 布拉迪酵母菌作为益生菌中唯一的真菌，对提高畜禽生长性能有显著效果，可用 于改善单胃动物营养和健康的饲料添加剂。但是布拉迪酵母菌在生长过程中，不形成芽胞， 抗逆性较差，在液体条件下难W长期保存。在体内，作为外源菌，受胃肠道环境影响较大，容 易丢失活性，从而失去其益生功效。
[0004] 中国专利文献CN104388325A公开了一株饲用布拉氏酵母，命名为：布拉氏酵 母（Saccharomycesboulardii)SH94,保藏号为CCTCCNo;M2014211。上述布拉氏酵母 从华中农业大学果园根际上壤中分离，并应用于制备仔猪饲料添加剂。所述布拉氏酵母 (Saccharomycesboulardii)SH94具有较强的耐胃液肠液的能力，但是其在40°C处理化， 存活率达到60%，在70°C处理2min及在80°C处理30s后，存活率维持在60%，该菌株具有 一定的耐热能力，但是耐热性不是很强。在实际应用中，布拉氏酵母产品在添加使用于配合 颗粒饲料时，往往要经过高温高湿的制粒处理，此过程中布拉氏酵母活性会大量的丧失，会 导致产品中有效成分损失较大，产品的保质期也较短，限制了其大规模应用。
【发明内容】
[0005] 为此，本发明针对于现有技术中布拉迪酵母菌在添加入饲料时高温高湿处理过程 中活性降低的问题，提供一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用W下技术方案：
[0007]一株耐高温高湿的布拉迪酵母菌（Saccharomycesboulardii)，其保藏编号为 CGMCCNo. 10381，该菌株已于2015年1月21日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中屯、（简称CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[000引 所述耐高温高湿的布拉迪酵母菌（Saccharomycesboulardii)通过W下方法分离 筛选得到：
[0009]将慕枝皮粉碎，并将一定量慕枝皮粉碎物在含有50yg/mL氨节青霉素的（YPD) 液体培养基中28°C好氧培养至培养基呈混浊状态，取适当培养及稀释后涂平板，根据菌落 形态挑取典型酵母菌单菌落（白色，大小l-2mm，湿润隆起，有酒香味），通过镜检粗筛出酵 母菌。通过生理生化、16SrDNA测序分析，最终筛选到一株布拉氏酵母（Saccharomyces boulardii)。该菌株已于2015年1月21日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中屯、保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。其保藏编号为CGMCCNo. 10381，建 议的分类名为布拉迪酵母菌（Saccharomycesboulardii)。
[0010] 该菌株具体有典型的布拉氏酵母形态特征：该菌株在YTO琼脂糖固体培养基上繁 殖形成的菌落为圆形，大而湿润，呈乳白色，光滑，边缘清晰，生长迅速；镜检显示细胞个体 较大，呈近球形，多边芽殖。
[0011] 生理生化特征：发酵葡萄糖。耐热能力实验结果显示布拉迪酵母菌在100%湿度、 751：和851：下处理1111111(图4)后，菌粉产品在100%湿度751：和851：处理1111111存活率分 别可达58. 4%和57. 9%。在110°C和130°C高温下分别处理30s、45s和60s，结果表明，该 布拉迪酵母菌存活率保持在64-83% (图4B)。耐人工胃液和肠液能力实验结果显示布拉 迪酵母菌在抑2. 0的人工合成胃液中处理30min、90min和ISOmin后存活率降至29. 1%、 23. 5%和18. 2%巧A)。在模拟肠液中处理30min、90min和ISOmin后，布拉迪酵母菌存活 率降至80. 61 %、65. 42%和41.68%。W上生理生活化结果表明，该布拉迪酵母菌具有很好 的高温高湿耐受力和较高的肠环境耐受力。但胃环境耐受力较弱。
[0012] 一种布拉迪酵母菌添加剂，含有上述的布拉迪酵母菌。
[0013] 上述布拉迪酵母菌添加剂中，含有上述布拉迪酵母菌的微胶囊。
[0014] 上述布拉迪酵母菌添加剂中，所述布拉迪酵母菌的微胶囊的制备方法包括步骤如 下：
[0015] (1)将布拉迪酵母菌菌液加入到海藻酸钢-碳酸巧溶液中，得到浓度为 IX106c化/mL菌液作为水相；将表面活性剂SpanSO分散于液体石蜡中作为油相，往油相中 加入水相，W4(K)巧m揽拌5min形成稳定的乳化液；向其中加入冰醋酸酸解碳酸巧解离出 Ca2+，与海藻酸钢产生凝胶化反应，形成海藻酸巧微胶囊，固定化时间为lOmin;最后去离子 水多次冲洗，通过分液漏斗分离沉降海藻酸巧微胶囊；
[0016] (2)将海藻酸巧微胶囊加入到培养基中，培养微胶囊化的布拉迪酵母菌至菌体充 满微胶囊内部80% W上的空间，过滤分离得到微胶囊。
[0017] 一种布拉迪酵母菌微胶囊培养方法，将上述的布拉迪酵母菌包于微胶囊中，然后 在YTO培养基中，28 °C下，好氧培养微胶囊化的布拉迪酵母菌。
[001引上述述的耐高温高湿的布拉迪酵母菌或上述布拉迪酵母菌添加剂在制备动物饲 料添加剂中的用途。
[0019] 上述用途中，所述动物为肉鸡。
[0020] 上述耐高温高湿的布拉迪酵母菌或上述布拉迪酵母菌添加剂在家禽饲养中作为 抗生素使用的用途。
[0021] 上述的耐高温高湿的布拉迪酵母菌或上述布拉迪酵母菌添加剂在制备抗生素药 物中的用途。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有W下优点：
[0023] 1、本发明的保藏编号为CGMCCNo. 10381的布拉迪酵母（Saccharomyces boulardii)具有较高的活性，其株增殖速度、最大生物量（即菌体最终密度）都显著高于同 类酿酒酵母菌株，并且具有很强的耐高温耐湿的能力；本发明的布拉迪酵母菌在100%湿 度75°C和85°C处理Imin存活率分别可达58. 4%和57. 9%;在110°C和130°C高温下分别 处理30s、45s和60s，存活率保持在64-83 %，上述耐高温耐湿的能力使本发明的布拉迪酵 母作为饲料添加剂在进行高温高湿处理过程中保存较高的活性。
[0024] 2、本发明的布拉迪酵母菌添加剂含有布拉迪酵母菌的微胶囊，为了提高本申请的 布拉迪酵母的胃肠环境能力耐受性，将布拉迪酵母菌进行微囊化，提供了布拉迪酵母菌微 胶囊，所述布拉迪酵母菌微胶囊；（1)将布拉迪酵母菌通过微囊化转变成一种稳定的细粉 颗粒，改变微生态制剂产品的形态，该种微胶囊产品具有良好的流动性和分散性，很容易与 其它饲料混合均匀，便于运输、贬存和添加使用；（2)微胶囊化后的酵母菌耐酸性和热稳定 性得到提高，由于微胶囊的保护，能够有效地防止菌体失活，提高布拉迪酵母菌产品的稳定 性。在体内，还能防止胃液的破坏，从而使尽可能多的菌体到达肠道，真正起到保健和治疗 的作用；（3)可将配伍禁忌的各种成分在同一产品中隔开。（4)使不溶于水的物质能均匀地 分散在水溶性介质中。本发明的微胶囊对畜禽均无毒副作用，且来源广，价格便宜可作为饲 料添加剂替代抗生素使用，可提高肉鸡的日增重、免疫器官指数、疾病抵抗力、抗氧化性、免 疫球蛋白。
【附图说明】
[0025] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照 本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本文公开内容所作出 的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
[0026] 图1布拉迪酵母与普通酿酒酵母生长曲线，每隔化测定菌体密度（n= 3， 冲<0.0巧。
[0027] 图2微囊化和游离布拉迪酵母生长曲线，每隔化测定菌体密度（n= 3,冲<0.05)。 [002引图3微囊化布拉迪酵母发酵前后对比。
[0029] 图4微囊化和游离布拉迪酵母在高温高湿条件下存活率。（n= 3,冲<0. 05， *冲<0. 01)。
[0030] 图5微囊化和游离布拉迪酵母菌在模拟胃液和肠液中存活率。（n= 3,冲<0. 05， *冲<0. 01)。
【具体实施方式】
[0031] 实施例1 ;微囊化布拉迪酵母菌及其生长曲线
[0032] 一、方法；
[003引1.生长活性比较；
[0034] 本发明布拉迪酵母为一种酿酒酵母，将之与普通酿酒酵母（(Saccharomyces cerevisiae)，购于ATCC)进行生长活性对比。
[0035] 方法如下：将活化两代的待测菌株W1%的接种量（约2X106c化/mL)接种于装有 lOOmLYro培养基的300血S角瓶中，28°C，180巧m培养，每2小时取样，测定600皿处吸光 值。W培养时间为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制生长曲线。
[0036] 为了提高本申请的布拉迪酵母的胃肠环境能力耐受性，将布拉迪酵母菌进行微囊 化，制备布拉迪酵母菌微胶囊。
[0037] 其中，布拉迪酵母菌微胶囊的制备方法如下：
[003引按与海藻酸钢一定的质量比（1 ;1.5)，称取碳酸巧，分散于少量蒸馈水中，然后加 入一定浓度完全溶解的海藻酸钢溶液（海藻酸钢浓度为l-2g/L)，揽拌均匀，并加入布拉迪 酵母菌菌液，使其初始接种浓度为1X106c化/mU作为水相；表面活性剂SpanSO充分分散 于液体石蜡中作为油相，按一定水油两相体积比值（1 ;5-6)，往油相中加入水相，W4(K)巧m 揽拌5min形成稳定的乳化液；向其中加入冰醋酸酸解碳酸巧解离出Ca2+，与海藻酸钢产生 凝胶化反应，形成海藻酸巧微胶囊，固定化时间为lOmin;最后去离子水多次冲洗，通过分 液漏斗分离沉降海藻酸巧微胶囊，将适于微胶囊产品加入到YTO培