一株降解头孢类抗生素的白地霉CM1及其应用的制作方法

本发明涉及一株能够降解头孢类抗生素的白地霉菌(galactomycescandidum)cm1，属于微生物技术领域。

背景技术：

头孢类抗生素是继青霉素之后发现的一类重要的β-内酰胺类抗生素，具有抗菌性强、抗菌谱广且耐青霉素酶等优点，被广泛应用于人类疾病的预防与治疗。据报道，抗生素进入人体和动物体后，不能被完全代谢吸收，有75％-90％的抗生素会以药物原型或代谢产物的形式随排泄物进入环境，有些抗生素的代谢产物的毒性甚至高于母体。另一方面，在头孢类抗生素在发酵过程中会产生大量的菌渣和废水，如果处理不当而排入环境，则可能会在土壤、水体及食品中残留。目前，已在食品、水体和土壤中频繁检测到头孢类抗生素残留，易诱导产生耐药菌及抗性基因，对生态环境和人类健康造成潜在威胁。目前，抗生素的残留问题已成为国内外关注的热点问题。

生物降解方法处理抗生素污染，是一种环保、低耗、高效的方法。然而，目前有关头孢类抗生素生物降解的研究报道极少，筛选得到的降解菌株更是稀缺，主要为细菌，仅能降解头孢类抗生素中某一种。细菌在降解抗生素过程中，容易被诱导产生抗性基因。本专利提供一株能够高效降解头孢类抗生素的真菌菌株cm1。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株能够降解头孢类抗生素的菌株cm1。

本发明所提供的头孢菌素降解菌株cm1，通过其形态特征观察，并对其18srdna进行提取，pcr扩增，在ncbi上进行blast比对和进化树构建分析，确定该菌株为白地霉(galactomycescandidum)，并命名为白地霉cm1(galactomycescandidumcm1)。该菌株于2017年11月10日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为：cgmccno.14633，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明所述菌株cm1，适生范围宽，在马丁氏培养基、马铃薯葡萄糖培养基、查氏培养基、无机盐培养基及以头孢类抗生素为唯一碳源的培养基中，均能较好生长。

本发明中的菌株cm1在马铃薯葡萄糖固体培养基的菌落形态为：25℃-35℃条件下培养2d的菌落直径为25-35mm，培养5-7d可铺满整个平板。菌丝丛白粉状，菌落平坦、疏松，表面干燥，无分泌物产生，呈平面扩散，有时呈放射样同心圆样生长。于显微镜下观察，菌丝有横隔，有的为二叉分枝，其孢子为节孢子，由菌丝断裂生成，呈圆筒形，两端平切，无色或淡色，孢子链集串分枝。

本发明所提供的菌株cm1对头孢类抗生素的适应浓度范围宽，在头孢类抗生素为唯一碳源浓度范围为50mg/l-10000mg/l的的无机盐培养基中均能生长。所述头孢类抗生素是指头孢拉定、头孢菌素c、头孢氨苄和头孢呋辛钠中的至少一种。

本发明所述菌株cm1，对头孢类抗生素的降解谱宽，在头孢呋辛钠为唯一碳源，浓度为50mg/l-300mg/l的培养基中，10d降解率可达到79％-100％。对以头孢氨苄和头孢拉定为唯一碳氮源且浓度为50mg/l-100mg/l时，6d-12d的降解率均可达到100％。

本发明所述菌株cm1，可在头孢呋辛钠为唯一碳、氮源培养基中生长。

本发明所述菌株cm1，在添加不同碳源条件下，可共代谢降解头孢类抗生素，降解效率提高。通过omnilog技术研究发现，cm1降解头孢类抗生素可利用的共代谢碳源种类多，主要有醇类、氨基酸类、糖类、羧酸类、糖类衍生物等。当添加共代谢碳源为氨基酸类、醇类、糖类或羧酸类时，cm1对头孢类抗生素的降解率比唯一碳源对照组提高47％-112％。

本发明所述菌株cm1在降解头孢类抗生素后，其降解产物对革兰氏阳性菌不产生抑菌圈，即对革兰氏阳性菌的生长已没有抑制作用，达到了对头孢抗生素无害化处理效果。所述革兰氏阳性菌是指藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌中的至少一种。而未用cm1菌降解处理的对照组，其溶液对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌圈在8mm-40mm，抑菌作用明显。由此可见，菌株cm1不仅可以降解头孢呋辛钠、头孢氨苄和头孢拉定三种头孢类抗生素，而且可以消除这三种头孢抗生素及其降解产物对革兰氏阳性菌的抑制和毒性作用，起到了去除头孢类抗生素的生物毒性作用。可用于环境中头孢类抗生素的去除和无害化处理。

本发明的有益效果：

菌株cm1适生范围宽、易培养，生长快，具有降解多种头孢类抗生素的功能，对液体和固体中残留的头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛钠、头孢菌素c等头孢类抗生素的降解效率高。经cm1菌株降解处理后，可消除头孢拉定、头孢氨苄和头孢呋辛钠对革兰氏阳性菌的毒性和抑制作用，可以达到生物降解与无害化的处理效果。该菌株培养成本低，使用方便，降解谱宽，且属于真菌，不易形成抗性菌株及抗性基因，可应用于生产菌剂，处理头孢类抗生素生产企业的废弃物和环境中残留的头孢类抗生素。

附图说明

图1为菌株cm1的菌落形态图。

图2为菌株cm1的孢子显微形态图。

图3为菌株cm1的系统发育树。

图4为菌株cm1在马铃培养基上的生长曲线。

图5为头孢呋辛钠的高效液相色谱谱图。

图6为头孢呋辛钠为唯一碳氮源时的降解曲线。

图7为菌株cm1降解头孢类抗生素产物的抑菌检测图((a)为头孢氨苄、(b)为头孢拉定、(c)为头孢呋辛钠)。

具体实施方式

下面具体实施方式，是对本发明技术方案作进一步具体的说明，但本发明不局限于以下所列举具体实施方式。

实施例1：

一、头孢类抗生素降解菌株cm1的筛选

1、材料准备

菌样品来源：某抗生素生产企业的新鲜菌渣。

马铃薯葡萄糖培养基(pda)：马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1l，ph自然，115℃灭菌30min。固体培养基添加琼脂10-15g。

马丁氏培养基：kh2po41.0g，mgso47h2o0.5g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1l，ph自然，115℃灭菌15min。固体培养基添加琼脂10g-15g。

无机盐培养基：(nh4)2no41.0g，k2hpo40.5g，kh2po40.5g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.2g，cacl20.1g，mnso4h2o0.01g，feso4·7h2o0.01g，蒸馏水1l，ph7.0，121℃灭菌15-20min。固体培养基添加琼脂10g-15g。

ⅱ号培养基：牛肉膏1.5g，蛋白胨6.0g，酵母浸出粉6.0g，葡萄糖1.0g，水1l，于115℃灭菌20min。固体培养基添加琼脂10g-15g。

2、菌株筛选

(1)菌株分离与纯化

将抗生素新鲜菌渣用0.9％的生理盐水分别稀释成10^-1-10^-8不同梯度溶液，震荡10-30分钟，然后分别涂布在添加有头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛钠浓度为100mg/l的马丁氏固体培养基和头孢抗生素菌渣固体培养基上，25℃-35℃培养2d-5d，得到不同菌落。然后，挑起单菌落，在上述的培养基上继续划线进行分离与纯化，直至得到单一菌落。

(2)菌株初筛

将上述步骤(1)得到的单菌落，分别在头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛钠为唯一碳源且浓度为50mg/l-10000mg/l无机盐固体培养基上划线，25℃-35℃培养1-7d，记录菌株生长过程，保存生长较好的菌株。

(3)菌株复筛

上述步骤(2)得到的菌株，接种到马丁氏或pda固体培养基中进行活化培养，然后将活化的菌株按照3-8菌盘/瓶的接种量转接到头孢类抗生素唯一碳源，浓度为50mg/l-300mg/l的无机盐液体培养基中，所述头孢类抗生素为头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛钠、头孢菌素c中至少一种，25℃-35℃，150r/min-200r/min振荡培养，定期测定各菌株对头孢氨苄、头孢拉定、头孢菌素c、头孢呋辛钠4种头孢抗生素的降解率，获得降解谱宽、能够降解4种头孢类抗生素的降解菌株cm1。

二、菌株形态与分子生物学鉴定

1、菌落形态特征观察

菌株cm1在马铃薯葡萄糖固体培养基上于25℃-35℃条件下培养2d菌落直径为25-35mm，培养5d-7d可铺满整个平板。菌丝丛白粉状，菌落平坦、疏松，表面干燥，无分泌物产生，呈平面扩散，有时呈放射样同心圆样生长。菌株cm1的菌落形态见图1。于显微镜下观察，菌丝有横隔，有的为二叉分枝，其孢子为节孢子，由菌丝断裂生成，呈圆筒形，两端平切，无色或淡色，孢子链集串分枝。菌株cm1的孢子显微形态见图2。

2、菌株cm1的分子生物学鉴定

2.1基因组的提取

菌株cm1的dna提取采用ctab/nacl法，具体如下：

(1)菌株活化：配制马丁氏或pda固体培养基和液体培养基，115℃灭菌15min。菌株cm1在马丁氏固体培养基上划线，25℃-35℃培养1d-2d，然后挑取单菌落接种在马丁氏或pda液体培养基中，25℃-35℃，150r/min-180r/min条件下培养2d-3d，然后转接至新培养基中，在相同条件下继续培养2d，如此活化培养2-3代，过滤收集菌体。

(2)将步骤(1)中培养得到的菌体转入研钵中，加入少量液氮，反复研磨至菌体呈粉末状。将研磨好的菌体转入1.5ml的ep管中，加入600μl65℃预热的sds裂解液，65℃保温30min，期间不断摇匀。

(3)置于冰中冷却至室温，然后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)，充分混匀，4℃，10000g，离心10min，取上清液至新ep管中。

(4)向新ep管中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液(24:1)，充分混匀，4℃，10000g，离心10min，取上清液至新ep管中。

(5)向上清中加入1/10体积的3mnaac和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。

(6)4℃，10000r/min，离心10min，弃上清。

(7)使用500μl70％的冰乙醇洗涤dna2-3次，然后倒置晾干，加入50μl的te溶解。

(8)用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

2.2pcr扩增

采用酵母菌通用引物nl1(gcatatcaataagcggaggaaaag)和nl4(ggtccgtgtttcaagacgg)，对菌株的26srdna的d1/d2区全序列进行扩序，并采用真菌通用引物its1(tccgtaggtgaacctgcgg)和its4(tcctccgcttattgatatgc)，对菌株的18srdna-its基因序列扩增。pcr扩增采用50μl反应体系：5μl10×pcrbuffer，1μldntpmix，2μldna模板，4μlnl1(或its1)(5p)，4μlnl4(或its4)(5p)，0.25μltaqhs，37.75μlddh2o。

pcr反应条件：95℃5min，循环一次；95℃30s，55℃30s，72℃1min，循环35次；72℃7min。pcr循环结束后取pcr产物2μl，加6μl上样缓冲液，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

2.3测序及系统发育树构建

将扩增得到的26srdna的d1/d2区序列与18srdna-its序列，送北京诺赛基因组研究中心测序，得到菌株cm1的d1/d2区长度为590碱基(bp)，cm1的its区长度为374bp。得到菌株cm1的26srdna的d1/d2区基因序列如下：

将上述测序结果与网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中基因序列比对，发现菌株cm1的26srdna的d1/d2区基因序列与galactomycescandidum中的一些菌株的序列同源性为99％。cm1的its序列与galactomycescandidum一些菌株的序列同源性为98％。依据1d/02区比对结果，在genebank里查找相关菌株序列，用clustalx软件进行序列比对，再用mega6.0软件构建系统发育树(见图3)，结果显示，菌株cm1与菌株galactomycescandidumcbs607.85聚于同一分支，系统发育关系最为密切。

三、菌株cm1鉴定为新功能菌株

根据菌株cm1菌落形态特征和分子生物学鉴定结果，确定菌株cm1为白地霉(galactomycescandidum)，并命名为白地霉cm1(galactomycescandidumcm1)。该菌株已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏号为cgmccno.14633，保藏日期为2017年11月10日。

目前，国内外尚无文献报道白地霉(galactomycescandidum)具有降解头孢类抗生素的功能，因此菌株cm1是一株具有降解头孢类抗生素的新功能菌株。

实施例2：

菌株cm1生长与降解特性

一、菌株cm1的生长

1、菌株cm1在不同培养基上的生长

经试验发现，菌株cm1在多种培养基中，如在马丁氏培养基、马铃薯培养基、查氏培养基、无机盐培养基中均能生长。生长快，培养容易。将菌株cm1在马铃固体培养基划线，室温(20℃-37℃)下培养5d-10d，菌株cm1可长满9cm的平板，其生长曲线见图4。

2、菌株cm1在不同浓度头孢类抗生素培养基上生长实验

菌株cm1在以头孢类抗生素为唯一碳源的培养基中，能较好生长。配制以头孢拉定、头孢氨苄、头孢呋辛钠为唯一碳源且3种头孢类抗生素的浓度分别为50mg/l、100mg/l、500mg/l、1000mg/l、5000mg/l、10000mg/l的无机盐固体培养基，挑取少许cm1菌丝，在无机盐固体培养基平板上划线，于室温下避光培养。经观察得知，培养2-6d，菌株cm1在3种头孢抗生素浓度为50mg/l、100mg/l、500mg/l、1000mg/l、5000mg/l、10000mg/l的平板上生长良好，适应头孢类抗生素的浓度范围宽。

二、菌株cm1对头孢类抗生素降解

1、菌株活化与接种培养

将菌株cm1接种在马丁氏或pda固体培养基上活化24-48h，然后在固体培养基上用1ml枪头的大头取菌盘，按照3-8菌盘/瓶的接种量，分别接种到以头孢呋辛钠为唯一碳源且浓度为50mg/l、100mg/l、150mg/l200mg/l、250mg/l、300mg/l的的无机盐液体培养基，同时以相同的接种量接种到以头孢氨苄、头孢拉定为唯一碳氮源且浓度为100mg/l的无机盐液体培养基中，在25-37℃,150-200r/min条件下，避光振荡培养，每隔1-2d取样测定培养液中头孢类抗生素的含量与降解液的抑菌活性。

2、菌株cm1对头孢类抗生素降解

采用高效液相色谱法(hplc)和抑菌圈法测定。

高效液相色谱仪为岛津lc20at；色谱柱填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相a为醋酸盐缓冲液(醋酸钠0.68g，冰醋酸5.8g，水1000ml，用冰醋酸调节ph值至3.4)，流动相b为乙腈；流速1.000ml/min；柱温30℃；进样量10μl；检测波长274nm；采用a:b＝85:15的比例等度洗脱和5％-40％的梯度洗脱两种方法检测。图5为浓度为100mg/l的头孢呋辛钠hplc色谱图，头孢呋辛钠的保留时间在29.5±0.5min。

采用抑菌圈方法测定，指示菌株选用藤黄微球菌(acccno.41016)。取100-250μl藤黄微球菌活化培养液，在ⅱ号固体培养基上均匀涂布，然后在培养基上放置2-8片无菌6mm滤纸片，并在滤纸片上分别滴加待测样4μl，25-37℃培养24-48h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径大小并计算相对降解率。

测定结果显示，在头孢呋辛钠为唯一碳源且浓度为50mg/l-300mg/l的条件下，菌株cm1对头孢呋辛钠的降解率为79％-100％。在头头孢氨苄、头孢拉定为唯一碳氮源且浓度为100mg/l的条件下，菌株cm1对头孢氨苄(6d)和头孢拉定(12d)的降解率为100％。

另外，菌株cm1在头孢呋辛钠为唯一碳、氮源培养基中也能较好生长和降解。在头孢呋辛钠为唯一碳、氮源且浓度为100mg/l培养基中，12d降解率可达到97％。图6为头孢呋辛钠为唯一碳氮源的降解曲线。

三、菌株cm1共代谢降解头孢类抗生素实验

利用omilog技术研究95种碳源对菌株cm1降解头孢类抗生素的影响效果，研究结果显示，菌株cm1可通过共代谢方式降解头孢类抗生素，可利用的共代谢碳源种类有氨基酸类、糖类、醇类、糖类衍生物等。

利用摇瓶培养也发现，添加碳源为类，可以促进菌株cm1对头孢类抗生素的降解。具体方法为，将菌株cm1接种在马丁氏或pda固体培养基上活化24-48h，然后按照3-8菌盘/瓶的接种量，分别接种到添加了头孢呋辛钠和其它碳源无机盐液体培养基中，添加的碳源为氨基酸类、醇类、糖类、羧酸类，氮源为有机氮源与无机氮源中至少一种。在25-37℃,150-200r/min条件下，避光振荡培养，每隔1-2d取样测定培养液中头孢类抗生素的含量。测定结果显示，共代谢碳源添加，可以使菌株cm1对头孢类抗生素的降解率比头孢类抗生素为唯一碳源对照组提高47％-112％，降解时间缩短。

四、头孢类抗生素降解产物抑菌活性测定

采用抑菌圈法测定，指示菌株选用革兰氏阳性菌，所选的革兰氏阳性菌是指藤黄微球菌(acccno.41016)、枯草芽孢杆菌(acccno.10243)和金黄色葡萄球菌(acccno.01334)中的至少一种。具体方法为：取活化24-48h的革兰氏阳性菌的活化培养液100-250μl，在ⅱ号或牛肉膏蛋白胨固体培养基上均匀涂布，然后在培养基上放置2-8片无菌6mm滤纸片，并在滤纸片上分别滴加上述二、三中得到的头孢呋辛钠、头孢氨苄、头孢拉定经cm1降解后的降解液4μl，同时在1个滤纸片上滴加没接菌的抗生素的对照液，作为对照(ck)，25-35℃培养24-48h，使用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。结果显示，浓度为100mg/l的头孢呋辛钠、头孢氨苄、头孢拉定唯一碳氮源培养液，经菌株cm1降解后，其降解液中降解产物对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌作用消失。说明菌株cm1不仅可以降解头孢类抗生素，而且可以消除头孢类抗生素降解产物对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制和毒性作用，起到了无害化处理效果。

图7为菌株cm1降解头孢类抗生素产物的抑菌检测图,其中(a)头孢氨苄抑菌圈，(b)为头孢拉定抑菌圈，(c)为头孢呋辛钠抑菌圈。图中3片滤纸片最上边的一片为对照组(ck)，为未接种菌株cm1的对照组的抑菌圈；下面两片为2个平行实验组，分别为cm1降解产物的抑菌圈。

以上所述的实施例为本发明的目的、技术方案和有益效果的详细说明，本发明的实施方式不受上述实施例的限制，任何在本发明的精神和原则范围内所做的改进、简化、替代、组合等，均视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>北京理工大学

<120>一株降解头孢类抗生素的白地霉cm1及其应用

<130>1

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>590

<212>dna

<213>白地霉(galactomycescandidum)

<400>1

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