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背景技术
嗅觉受体基因已通过同源性被表征为七个跨膜结构域g蛋白偶联受体(gpcr)。据估计，人类可能有500-750个嗅觉受体基因序列，而大鼠和小鼠中有500-1000个嗅觉基因。嗅觉受体集中在粘液包覆的纤毛的表面上，并且气味分子与嗅觉上皮中的嗅觉受体结合。由于哺乳动物可以检测到至少10,000种气味，而有大约1,000或更少的嗅觉受体，因此许多气味物必须与多个嗅觉受体相互作用。
嗅觉受体的辨别力使得它能够感知数千种挥发性化学物具有不同的气味。已知嗅觉系统使用组合受体编码方案来破译气味分子。一个嗅觉受体可识别多种气味物，并且一种气味物被多个嗅觉受体识别。气味物的轻微结构变化或环境中气味物浓度的变化导致这些受体的气味代码(odor-code)的变化。
每种哺乳动物嗅觉受体神经元仅编码一个嗅觉受体。表达相同嗅觉受体的神经元的轴突会聚到一个嗅球，然后嗅球将信息处理到大脑。嗅觉受体在结构上与g蛋白偶联受体(gpcr)相似，并包含七个通过环连接的跨膜(tm)结构域。功能上重要的残基存在于跨膜螺旋2-7上。
气味分子属于多种化学类别：从醇类、醛类、酮类和羧酸到含硫化合物和精油。气味分子的物理化学描述符在预测嗅觉受体的气味响应中起重要作用。基于配体中存在的碳原子数，高度同一的嗅觉受体序列可具有配体特异性结构偏差。食品中已鉴定/识别出约8000种气味物。已经表征了约400种食品气味物，而这个数字大致等于人体中发现的嗅觉受体的数量。气味物混合物的响应既不是其各组分的相加也不是其各组分的平均值。一些混合物导致在各个组分中不存在的新感知品种的出现。
本发明的一个目的是提供一种生物传感器，所述生物传感器产生混合物、组合物或分子的香气图(aromagraph)。本发明的一个目的是提供一种生物传感器，用于解构混合物、组合物或分子的组分，所述组分负责混合物、组合物或分子的香味(scent)、气味(smell)、(浓重的)气味(odor)、香气(aroma)和/或味道(taste)。本发明的另一个目的是提供一种用于判断和补救恶臭的生物传感器。
技术实现要素：
本发明涉及用于检测嗅觉受体处相互作用的生物传感器。在一些实施例中，本发明涉及利用本发明的生物传感器来检测嗅觉受体处气味物的相互作用。在一些实施例中，使用多个生物传感器来检测多个嗅觉受体处气味物的相互作用。在一些实施例中，多个生物传感器代表动物嗅觉受体库或该库的一部分。在一些实施例中，多个生物传感器代表人嗅觉受体库或该库的一部分。在一些实施例中，多个生物传感器代表检测溶液中的气味物的人嗅觉受体库的部分。在一些实施例中，多个生物传感器代表检测气相中的气味物的人嗅觉受体库的部分。在一些实施例中，多个生物传感器代表检测特定气味物的人嗅觉受体库的部分。在一些实施例中，多个生物传感器代表检测特定类别或类型的气味物的人嗅觉受体库的部分。
在一些实施例中，各生物传感器由嗅觉受体组成，所述嗅觉受体在其n-末端区域与将新生多肽靶向宿主细胞膜的多肽序列融合，并在其c-末端区域与稳定所述受体的多肽融合。在一些实施例中，与嗅觉受体的c-末端区域融合的多肽将所述受体靶向宿主细胞的外膜。在一些实施例中，生物传感器的n-末端部分来自大鼠嗅觉受体ri7(ri7)的1-55位。在一些实施例中，使用全长嗅觉受体而不与另一种蛋白质融合。在一些实施例中，编码融合受体的ri7部分或全长嗅觉受体的核酸之前是编码八个氨基酸flag标签(asp-tyr-lys-asp-asp-asp-asp-lys(seqidno:1))的核酸，例如用于鉴定和纯化嗅觉受体融合蛋白。在一些实施例中，嗅觉受体序列之后是编码绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的盒。gfp或rfp与嗅觉受体融合，以允许检测当嗅觉受体在宿主细胞中表达时嗅觉受体的位置。在一些实施例中，嗅觉受体是哺乳动物嗅觉受体。在一些实施例中，嗅觉受体是人嗅觉受体。在一些实施例中，人嗅觉受体是or1a1、or2w1、or2j2、or5p3或or6a2。在一些实施例中，在构建体中融合的orf序列包含编码嗅觉受体的氨基酸序列的从氨基酸第56位至氨基酸序列末端的核酸。
在一些实施例中，构建体用于接受orf盒以制成本发明的新生物传感器。在一些实施例中，将orf盒融合到构建体中，从而在构建体中编码全长人受体蛋白。在一些实施例中，编码全长人嗅觉受体的核酸与编码八个氨基酸flag标签(asp-tyr-lys-asp-asp-asp-asp-lys(seqidno:1))的核酸在框内融合。在一些实施例中，嗅觉受体序列之后是编码绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白的盒。
在一些实施例中，本发明的生物传感器还包含g蛋白和腺苷酸环化酶。在一些实施例中，g蛋白由三个亚基gα亚基、gβ亚基和gγ亚基构成。在一些实施例中，腺苷酸环化酶和g蛋白来自相同物种。在一些实施例中，腺苷酸环化酶和g蛋白来自不同物种。在一些实施例中，g蛋白亚基来自相同或不同物种。在一些实施例中，嗅觉受体、g蛋白和腺苷酸环化酶来自相同物种，并且在一些实施例中，所述组分的一种或多种来自不同物种。在一些实施例中，本发明的生物传感器多肽包括与seqidno:6-10和12-17具有70％、80％、90％、95％和99％序列同源性的多肽。
在一些实施例中，本发明的生物传感器包括直接或间接产生报道分子的多肽。在一些实施例中，本发明的生物传感器包括为报道分子(例如光学报告子)的多肽。在一些实施例中，多肽是腺苷酸环化酶。在一些实施例中，报道分子是camp。在一些实施例中，由生物传感器产生的报告子具有六至七个数量级的动态范围，并且与报告子偶联的生物传感器可以检测气味物和其他分子的结合，其范围为0.15份/十亿至约420,000份/十亿，或10-9m至约10-3m。在一些实施例中，检测窗口为六至七个数量级，在10m至10-12m的范围内。在一些实施例中，本发明的生物传感器具有九至十个数量级的动态范围。在一些实施例中，本发明的生物传感器可以检测气味物和其他分子的结合，其范围为10-11m至约10-2m。在一些实施例中，检测窗口为九至十个数量级，其范围在10m至10-12m内。在一些实施例中，本发明的生物传感器具有三至五个数量级的动态范围。在一些实施例中，检测窗口为三至五个数量级，其范围在10m至10-12m内。在一些实施例中，本发明的生物传感器具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个数量级的动态范围。
本发明还涉及编码本发明的生物传感器的核酸。在一个实施例中，本发明的核酸包括在严格杂交条件下与编码本发明的生物传感器多肽之一的核酸杂交的核酸。在一个实施例中，本发明的生物传感器多肽包括由在严格杂交条件下与编码上述生物传感器多肽的核酸杂交的核酸编码的多肽。在一个实施例中，本发明的核酸编码seqidno:6-10和12-17之一的多肽，或者是在严格杂交条件下与编码seqidno:6-10和12-17之一的多肽的核酸杂交的核酸。在一个实施例中，本发明的核酸编码与seqidno:6-10和12-17之一具有70％、80％、90％、95％和99％序列同一性的多肽。
本发明涉及宿主细胞内含有的生物传感器多肽和生物传感器核酸。在一些实施例中，宿主细胞是真核细胞。在一些实施例中，宿主细胞是真菌细胞、动物细胞、植物细胞或藻类细胞。在一些实施例中，真菌细胞选自酵母属、毕赤酵母属、曲霉属、金孢子菌属、或木霉属。在一些实施例中，真菌细胞是酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、黑曲霉、米曲霉、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)或里氏木霉。在一些实施例中，宿主细胞是源自中国仓鼠细胞、人肾细胞、猴肾细胞、人宫颈癌细胞或小鼠骨髓瘤细胞的哺乳动物细胞系。在一些实施例中，宿主细胞是人类细胞。在一些实施例中，宿主细胞是鼠科动物细胞。在一些实施例中，宿主细胞是犬科动物细胞。
本发明还涉及含有本发明的生物传感器多肽和生物传感器核酸的宿主细胞的应用。在一些实施例中，本发明涉及由具有生物传感器的宿主细胞制备的具有生物传感器的膜部分的应用。在一些实施例中，参考受体-报告子被包含在宿主细胞或膜部分中，以允许对本发明的生物传感器进行相对的实时测量。在一些实施例中，实时测量用于测量气味物与至少一个嗅觉受体的相互作用。在一些实施例中，实时测量用于测量气味物在多个不同嗅觉受体的相互作用。在一些实施例中，实时测量用于测量多种不同气味物在相同或不同嗅觉受体的相互作用。在一些实施例中，进行实时测量并与参考物进行比较，以提供气味物在嗅觉受体的相互作用的比较数。在一些实施例中，进行实时测量并与参考物进行比较，以提供不同气味物在相同或不同嗅觉受体的相互作用的比较数。在一些实施例中，测定数量vs.参考物会产生可以被比较和进行对比的分子、混合物和/或组合物的香气图。在一些实施例中，实时监测的报告子是光学报告子。在一些实施例中，实时监测的报告子是非光学报告子。在一些实施例中，参考物是g蛋白偶联受体，其对已知配体具有已知亲和力。在一些实施例中，参考受体具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个数量级的活性范围。在一些实施例中，参考受体具有2-4个数量级的活性范围，并且使用4-5个不同的参考受体来覆盖从10m至10-12m的嗅觉受体的活性范围。在一些实施例中，选择参考受体-配体对以具有与受测试的嗅觉受体-气味物对的亲和力相似的亲和力。在一些实施例中，受测试的气味物的浓度在一系列孔中在3、4、5、6、7、8、9或10个数量级的范围上变化，并与参考物进行比较。在一些实施例中，受测试的气味物的浓度在一系列孔中在3至10个数量级的范围上变化，并与参考物进行比较。在一些实施例中，嗅觉受体被鉴定为与受测试的气味物具有强烈的、中等的或弱的相互作用。在一些实施例中，参考受体与报告子相关，所述报告子不同于与嗅觉受体相关的报告子。在一些实施例中，不同的报告子是光学报告子。在一些实施例中，在相同反应中实时监测不同的光学报告子。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于鉴定混合物或组合物中的气味物，所述气味物促成所述混合物或组合物的香味、(浓重的)气味、气味、香气或味道。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于表征一种组合物、混合物或多种混合物和/或组合物的香味、(浓重的)气味、气味、香气或味道。在一些实施例中，生物传感器用于制成具有表征的香味、(浓重的)气味、气味、香气或味道的组合物或混合物的配方产品或配方。在该实施例中，可以通过使用生物传感器来寻找与被替代组分在嗅觉受体具有相似相互作用的替代组分，使组合物或混合物的组分被不同的组分替代而不损失表征的香味、(浓重的)气味、气味、香气或味道。在一些实施例中，替代组分来自天然来源(替代非天然组分)。在一些实施例中，替代组分被视为是健康的并且替代被视为是不健康的组分。在一些实施例中，替代组分成本更低。在一些实施例中，替代组分更易于制造或具有更好的性能。在一些实施例中，替代组分取代已被禁用或要不然变得昂贵、不可得或难以获得的成分。在一些实施例中，替代组分取代组合物中的两种或更多种成分。在一些实施例中，组合物是完全逆向工程化的，并且设计了一组产生组合物及其表征的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道的组分。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于制成具有已知香气图的分子文库，可用于建立或维持设计者的或所需的香味、(浓重的)气味、气味、香气或味道。在一些实施例中，来自具有或不具有已知香气图的文库的分子可用于构建模拟所需的已知混合物或组合物的香气图的混合物或组合物。在一些实施例中，来自文库的分子可用于构建满足香气图指标的混合物或组合物。在一些实施例中，香气图用于已知的混合物、组合物或分子。在一些实施例中，香气图用于设计的或理论的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，香气图用于对已知混合物、组合物或分子的所期望的修饰。在一些实施例中，来自文库的分子也可用于补救恶臭。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于标准化香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。例如，香气图可用于量化和表征不同的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道，为比较和对比组合物、混合物和/或分子创建共同的语言和描述。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于量化香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道与or库的相互作用。这些量化的相互作用可用于描述香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。例如，数百种香草调味品或香草提取物产品宣传它们提供香草风味(或气味、香味、香气)。本发明的生物传感器将量化这些香草产品与or库的相互作用，并允许在功能基础上标准化这些产品。一组核心or相互作用将定义香草响应，其中许多次要或副or相互作用产生这些香草产品之间的差异。标准化还允许针对品牌推广、商标和/或版权目的而定量描述香味、气味、香气、(浓重的)气味和/或味道。标准化还允许定量描述新的香味、气味、香气、(浓重的)气味和/或味道。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于补救恶臭。在该实施例中，生物传感器可用于发现可掩盖恶臭(例如，来自运动器材、衣服或鞋子，或依赖于香味/气味的产品)的分子。在一些实施例中，掩盖分子结合但不激活(以相同方式)引起恶臭味的嗅觉受体。在该实施例中，掩盖分子可以阻断感知恶臭的嗅觉受体。在一些实施例中，掩盖分子激活其他嗅觉受体，与由恶臭激活的嗅觉受体组合将恶臭感知改变为正面感知或无感知。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于产生具有所期望香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道的组合物或混合物。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于制备抑制食欲的组合物或混合物。在该实施例中，将抑制食欲的混合物或组合物置于产生用于将食欲抑制剂递送至受试者的气溶胶的装置中。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于调节产品的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道，以适应不同地理位置和/或不同人口群体中受试者的味觉。在一些实施例中，从固体释放所需的香味、气味、(浓重的)气味、和/或香气，所述固体含有针对所需香味、气味、(浓重的)气味、和/或香气的组分。在一些实施例中，空气清新剂递送系统用于提供所需的香味、气味、(浓重的)气味、和/或香气(例如，佳丽插入式空气清新剂(gladeplug-in)或其他空气清新剂产品)。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于通过鉴定引起某些受试者所期望的感知的香气景观或气味景观的组分来表征香气景观或气味景观。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于构建产生来自某些受试者的所期望反应的香气景观或气味景观。在一些实施例中，某些受试者将发现香气景观或气味景观具有吸引力、令人厌恶、令人振奋、令人放松或具有产生所期望行为的其他所期望状态。在一些实施例中，香气景观或气味景观用于品牌推广产品或服务。
在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于鉴定香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于唯一地鉴定香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于传达关于香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道的信息。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于处理香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于描述产品或服务。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于推销产品或服务。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于销售产品或服务。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于购买产品或服务。
在一些实施例中，香气图用于鉴定香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，香气图用于唯一地鉴定香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，香气图用于传达关于香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道的信息。在一些实施例中，香气图用于处理香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，香气图用于描述产品或服务。在一些实施例中，香气图用于推销产品或服务。在一些实施例中，香气图用于销售产品或服务。在一些实施例中，香气图用于购买产品或服务。
附图说明
图1示出了一些or构建体的质粒图谱。
具体实施方式
在描述各个实施例之前，应当理解，本发明的教导并不限于所述的具体实施例，并且因此当然是可以改变的。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施例的目的，并且不旨在是限制性的，因为本教导的范围将仅由所附权利要求书限定。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与在此描述的相似或等同的任何方法和材料也可用于实施或测试本教导，但是现在描述的是一些示例性方法和材料。
对于本领域技术人员在阅读本发明之后将显而易见的是，本文所述和所示的各个实施例的每一个具有各自的组成和特征，可以容易地与任何其他若干实施例的特征分离或组合，而不会脱离本教导的范围或精神。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来执行任何叙述的方法。
定义
如本文所用，“香气图(aromagraph)”是指由嗅觉受体库对气味物的响应的数字表示。
如本文所用，“香气景观(aromascape)”和“气味景观(odorscape)”可互换使用，并且两者均指位置环境中的(浓重的)气味、香气、气味和/或香味。香气景观或气味景观可以自然地发生或被工程化以从个体或个体组产生所期望的响应。香气景观或气味景观可以是营业地点区域，例如商店、酒店、或体育场所；户外区域，如在公园、体育或娱乐场馆找到的那些。
如本文所用，“有效量”是指如本文所述有效实现特定生物学结果的化合物、配方、材料或组合物的量。
如本文所用，术语“表达(express或expression)”是指由包含在核酸序列内的遗传信息产生蛋白质产物。
如本文所用，“表达载体”和“表达构建体”可互换使用，并且均定义为被设计用于细胞中蛋白质表达的质粒、病毒或其他核酸。载体或构建体用于将基因导入宿主细胞，由此载体会与细胞中的聚合酶相互作用以表达载体/构建体中编码的蛋白质。表达载体和/或表达构建体可以存在于染色体外或整合到染色体中的细胞中。当整合到染色体中时，包含表达载体或表达构建体的核酸将保留表达载体或表达构建体。
如本文所用，术语“融合蛋白”和“融合多肽”可互换使用，并且均指从已一起被克隆并编码单个多肽片段的不同基因获得的两个或更多个核苷酸序列。融合蛋白也被称为“杂合蛋白”或“嵌合蛋白”。如本文所用，术语“融合蛋白”包括从不同物种获得的多肽编码片段，以及从相同物种获得的编码片段。
如本文所用，当结合多核苷酸的部分使用时，术语“异源(的)”表示核酸包含两个或更多个通常未在自然界发现彼此呈相同关系的子序列。例如，核酸通常重组产生，具有两个或更多个序列，例如来自不相关的基因，排列以成为新的功能性核酸。类似地，“异源”多肽或蛋白质是指未在自然界发现彼此呈相同关系的两个或更多个子序列。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指原核或真核细胞，其中可以引入、表达和/或繁殖本发明的载体。微生物宿主细胞是原核或真核微生物的细胞，包括细菌、酵母、微观真菌和处于真菌和黏菌(slimemolds)生命周期中的微观相。典型的原核宿主细胞包括大肠杆菌的各种菌株。典型的真核宿主细胞是酵母或丝状真菌，或哺乳动物细胞，例如中国仓鼠细胞、鼠科nih3t3成纤维细胞、人肾细胞或啮齿动物骨髓瘤或杂交瘤细胞。
如本文所用，术语“分离的”是指不仅与存在于核酸或多肽的天然来源中的其他核酸或多肽分离而且还与其他细胞组分分离的核酸或多肽，并且优选指在(如果有的话)仅存在溶液、缓冲液、离子或通常存在于所述溶液、缓冲液、离子溶液中的其他组分下发现的核酸或多肽。术语“分离的”和“纯化的”不涵盖存在于其天然来源中的核酸或多肽。
如本文所用，术语“哺乳动物”是指温血脊椎动物，所有这些动物都拥有毛发并且哺乳它们的幼崽。
如本文所用，术语“天然发生的(naturallyoccurring)”意味着组分由单个基因编码，所述基因未被重组方法改变并且预先存在于生物体中。
如本文所用，“气味物(odorant)”是指可由至少一个嗅觉受体检测的任何物质。
如本文所用，“嗅觉”或“嗅觉接收(olfactoryreception)”是指通过与细胞信号传导途径偶联的嗅觉受体检测化合物。检测到的化合物被称为“气味物”并且可以是空气传播的(即，挥发性的)和/或在溶液中。
如本文所用，术语“嗅觉受体”或“or”在本文中可互换使用，指嗅觉受体、微量胺相关受体、犁鼻受体、甲酰肽受体、膜鸟苷酸环化酶、亚型gc-d受体和g蛋白偶联味觉受体。嗅觉受体包括由嗅觉受体、微量胺相关受体、犁鼻受体、甲酰肽受体、膜鸟苷酸环化酶、亚型gc-d受体和g蛋白偶联味觉受体制成的杂合受体。
如本文所用，“序列同一性的百分比”和“百分比同源性”在本文中可互换使用，指多核苷酸或多肽之间的比较，并通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定，其中对于两个序列的最佳比对，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包括相较于参考序列而言的添加或缺失(即，缺口(gap))。百分比可以通过以下方式计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以产生匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。可替代地，百分比可以通过以下方式计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目或者核酸碱基或氨基酸残基与缺口对齐的位置数目以产生匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。本领域技术人员理解，有许多已确定的算法可用于比对两个序列。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下方式进行：例如局部同源性算法(smithandwaterman，advapplmath.2:482,1981)；同源比对算法(needlemanandwunsch，jmolbiol.48:443,1970)；相似性捜索方法(pearsonandlipman，procnatlacadsci.usa85:2444,1988)；这些算法的计算机化执行(gcgwisconsin软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta)或目测检查(通常参见currentprotocolsinmolecularbiology，f.m.ausubeletal.,eds.,greenepublishingassociates,inc.和johnwiley&sons,inc.(1995副刊))。适于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的示例是blast和blast2.0算法，分别披露于：altschul等人，j.mol.biol.215:403-410,1990；和altschul等人，nucleicacidsres.25(17):3389-3402,1977。用于执行blast分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)网站公开地获得。用于核苷酸序列的blast可以使用具有以下默认参数的blastn程序：例如字长(w)为11，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及两条链的比较。用于氨基酸序列的blast可以使用具有如下默认参数的blastp程序：例如字长(w)为3，期望值(e)为10，以及blosum62评分矩阵(参见henikoffandhenikoff，procnatlacadsci.usa89:10915,1989)。序列比对和％序列同一性的示例性确定还可以采用gcgwisconsin软件包(accelrys，madisonwi)中的bestfit或gap程序，使用提供的默认参数。
如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可以是线性或支化的，它可以包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以被氨基酸以外的化学部分中断。所述术语还涵盖天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、peg化或任何其他操作或修饰，例如与标记性或生物活性组分缀合。
如本文所用，术语“纯化的”意味着所表示的核酸或多肽在基本上缺少其他生物大分子，例如多核苷酸、蛋白质等的情况下存在。在一个实施例中，纯化多核苷酸或多肽，使其构成所表示存在的生物大分子的按重量计至少95％、更优选按重量计至少99.8％(但是可以存在水、缓冲液和其他小分子，尤其是分子量小于1000道尔顿的分子)。
如本文所用，术语“实时”是指在反应或相互作用期间进行多次测量，而不是在反应结束时或在指定时间点进行单次测量。实时测量通常用于定量样本中组分的量，或提供样本中两种或更多种组分的相对定量。实时测量还可用于确定反应或相互作用的动力学参数。
如本文所用，术语“重组核酸”是指通常没有在自然界中找到的形式的核酸。例如，重组核酸的侧翼可能是不天然位于核酸侧翼的核苷酸序列，或者重组核酸可能具有通常在自然界中没有找到的序列。重组核酸最初可以通过限制性内切核酸酶操作核酸，或者可替换的使用诸如聚合酶链式反应等技术在体外形成。应当理解，一旦制备重组核酸并将其重新引入宿主细胞或生物体中，它可以非重组地复制，即使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；不过，此类核酸一旦被重组产生，尽管随后经非重组地复制，出于本发明的目的仍然被视为重组的。
如本文所用，术语“重组多肽”是指由重组核酸表达的多肽，或经体外化学合成的多肽。
如本文所用，术语“重组变体”是指通过利用重组dna技术产生的氨基酸插入、缺失和取代而不同于天然发生的多肽的任何多肽。可以通过比较特定多肽的序列与同源肽的序列并最小化在高同源性区域中发生的氨基酸序列变化的数量来找到确定哪些氨基酸残基可以被替代、添加或缺失而不消除目的活性(例如酶促或结合活性)的指导。
如本文所用，术语“文库/库(repertoire)”或“文库/库(library)”是指编码多个不同嗅觉受体的基因的文库。在一些实施例中，库或文库代表一个物种，例如人、狗或猫的所有嗅觉受体。在一些实施例中，库或文库代表检测味道、香味、气味、香气和/或(浓重的)气味的嗅觉受体。在一些实施里中，库或文库代表检测所希望的、令人愉悦的、令人振奋的或不利的味道、香味、气味、香气和/或(浓重的)气味的嗅觉受体。在一些实施例中，库或文库代表一个类别、族或类型的嗅觉受体。
如本文所用，术语“报告子(reporter)”或“报道分子(reportermolecule)”是指能够间接或直接被检测的部分。报告子包括但不限于发色团、荧光团、荧光蛋白、发光蛋白、受体、半抗原、酶和放射性同位素。
如本文所用，术语“报告基因”是指编码可以直接或间接被检测的报道分子的多核苷酸。示例性报告基因编码酶、荧光蛋白、生物发光蛋白、受体、抗原表位和转运蛋白等。
如本文所用，“严格杂交条件”是指在42℃的温度在5xssc下在50％甲酰胺中的杂交，和在60℃在0.2xssc中洗涤过滤器(1xssc是0.15mnacl，0.015m柠檬酸钠)。严格杂交条件还包括针对洗涤的低离子强度和高温，例如0.015m氯化钠/0.0015m柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠(50℃)；用变性剂如甲酰胺杂交，例如50％(v/v)甲酰胺，与0.1％牛血清白蛋白/0.1％ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mm磷酸钠缓冲液(ph6.5)，与750mm氯化钠，75mm柠檬酸钠(42℃)；或50％甲酰胺，5xssc(0.75mnacl，0.075m柠檬酸钠)，50mm磷酸钠(ph6.8)，0.1％焦磷酸钠，5xdenhardt溶液，超声处理的鲑鱼精子dna(50μg/ml)，0.1％sds，和10％硫酸葡聚糖(42℃)，洗涤(42℃)，在0.2xssc(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺(55℃)中，接着进行由含有edta的0.1xssc组成的高严格洗涤(55℃)。
如本文所用，“实质同一性/基本同一性(substantialidentity)”是指具有至少80％序列同一性、至少85％同一性和89％-95％序列同一性的多核苷酸或多肽序列。在至少20个残基位置的比较窗口或至少30-50个残基的窗口上与参考序列相比，实质同一性还涵盖至少99％的序列同一性，其中通过将参考序列与包括缺失或添加或取代的序列在比较窗口上进行比较来计算序列同一性的百分比。在应用于多肽的特定实施例中，术语“实质同一性”意味着两个多肽序列在例如使用标准参数，即默认参数，通过程序gap或bestfit进行最佳比对时，共享至少80％序列同一性、优选至少89％序列同一性、至少95％序列同一性或更多(例如99％序列同一性)。
优选地，氨基酸“取代”是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸替代一种氨基酸(即保守氨基酸替代)的结果。氨基酸取代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和蛋氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
如本文所用，“味觉受体”是指用于检测甜味、苦味和鲜味(谷氨酸盐)的g蛋白偶联味觉受体，以及用于检测咸味和酸味的离子通道和离子通道型受体(ionotropicreceptor)。
如本文所用，“转染”或“转化”或“转导”定义为将外源核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代目标细胞及其子代。
除非上下文另外清楚指出，单数术语“一个/种(a或an)”和“所述/该(the)”包含复数指代。类似地，除非上下文另外清楚指出，词语“或/或者”意图包含“和/以及/并且”。关于物质(例如抗原)的浓度或水平给出的数值限制旨在是近似的。因此，当浓度表示为至少(例如)200μg时，意指该浓度应理解为至少近似“大约”或“约”200μg。
嗅觉受体
大多数嗅觉受体是g蛋白偶联的受体，其在受体被气味物激活后与g蛋白结合用于信号转导。gpcr具有七个α-螺旋跨膜区的保守结构特征。大多数嗅觉受体的长度为约320±25个氨基酸。长度差异主要是由于n-末端和c-末端区域的变化。大多数嗅觉受体包括位于tm3(跨膜切片3)与tm3和tm4之间的细胞内环的连接处的基序maydryvaic(seqidno:2)。在一些嗅觉受体中保守的其他基序包括，例如，第一细胞内环内的lhtpmy(seqidno:3)、tm6开始处的fstcssh(seqidno:4)和tm7中的pmlnpf(seqidno:5)。
在一些实施例中，本发明中使用的嗅觉受体是人嗅觉受体，或来自另一种哺乳动物的嗅觉受体，或来自另一种生物的嗅觉受体。在一些实施例中，本发明中使用的嗅觉受体是杂合嗅觉受体。在一些实施例中，将来自一个嗅觉受体的n-末端区域的氨基酸融合到第二个不同的嗅觉受体的n-末端区域。在一些实施例中，n-末端氨基酸来自供体嗅觉受体的氨基酸位置1-61。在一些实施例中，n-末端氨基酸来自供体嗅觉受体的氨基酸位置1-55。在一些实施例中，n-末端氨基酸是从氨基酸位置1-20或所述氨基酸直至第一跨膜结构域，或者氨基酸位置1-40(其包括第一跨膜结构域的共有序列)。在一些实施例中，n-末端氨基酸在其氨基酸位置1-61的n-末端区域被融合到接纳体嗅觉受体。在一些实施例中，将来自供体多肽的c-末端的氨基酸融合到接纳体嗅觉受体的c-末端。在一些实施例中，来自接纳体嗅觉受体c-末端的1-50个氨基酸被来自供体多肽的氨基酸替代。在一些实施例中，来自接纳体嗅觉受体c-末端的1-55个氨基酸被来自供体多肽的氨基酸替代。在一些实施例中，供体多肽是嗅觉受体。
在一些实施例中，接纳体嗅觉受体是人嗅觉受体，并且供体嗅觉受体是人嗅觉受体。在一些实施例中，接纳体嗅觉受体是人嗅觉受体，并且供体嗅觉受体是鼠科动物嗅觉受体。在一些实施例中，接纳体嗅觉受体是人嗅觉受体，并且供体嗅觉受体是酵母多肽。在一些实施例中，接纳体嗅觉受体是鼠科动物嗅觉受体，并且供体嗅觉受体是鼠科动物嗅觉受体。在一些实施例中，接纳体嗅觉受体是鼠科动物嗅觉受体，并且供体嗅觉受体是人嗅觉受体。在一些实施例中，接纳体嗅觉受体是鼠科动物嗅觉受体，并且供体嗅觉受体是酵母多肽。在一些实施例中，接纳体嗅觉受体是犬科动物嗅觉受体，并且供体嗅觉受体是犬科动物嗅觉受体。在一些实施例中，接纳体嗅觉受体是犬科动物嗅觉受体，并且供体嗅觉受体是人或鼠科动物嗅觉受体。在一些实施例中，接纳体嗅觉受体是犬科动物嗅觉受体，并且供体嗅觉受体是酵母多肽。
在一些实施例中，从供体嗅觉受体添加的氨基酸取代接纳体嗅觉受体中的相应氨基酸位置。在一些实施例中，来自供体嗅觉受体的添加的氨基酸增加接纳体嗅觉受体中的氨基酸总数。在一些实施例中，接纳体嗅觉受体在融合后具有更少的氨基酸(相较于起始接纳体嗅觉受体)。
大多数哺乳动物嗅觉受体可被分为两个系统发育组，i类和ii类嗅觉受体。i类嗅觉受体与鱼嗅觉受体类似，而ii类受体是哺乳动物的大多数特征。虽然在哺乳动物中，大多数嗅觉受体属于ii类，但哺乳动物也具有i类受体，例如，人和小鼠各自具有超过100个i类嗅觉受体。哺乳动物的嗅觉基因数量从灵长类动物的约800个(包括假基因)到狗和小鼠的约1,500个不等。功能性嗅觉受体的数量从鸭嘴兽的约262个和人的390个至大鼠的1,284个和小鼠的1,194个不等。
人嗅觉受体库包括约850个基因和假基因，包括18个基因家族和300个亚家族中的约390个推定功能基因。可以在以下数据库找到阐述将人嗅觉受体基因组织成家族和亚家族的数据库，以及所述嗅觉受体的多肽和核酸序列的链接：hugogenenomenclaturecommittee网站(www.genenames.org/genefamilies/or)、嗅觉受体数据库(senselab.med.yale.edu/ordb/info/humanorseqanal)和horde(人类嗅觉数据资源管理器，genome.weizmann.ac.il/horde/)，以上所有公开出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
小鼠嗅觉受体库包括大约1,296个基因和假基因，其中约80％是推定功能性的，属于228个家族。可以在嗅觉受体数据库(senselab.med.yale.edu/ordb/info/humanorseqanal，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)找到将鼠嗅觉受体基因组织成家族和亚家族的数据库，以及所述嗅觉受体的多肽和核酸序列的链接。
犬科动物嗅觉受体库包括约1,094个基因。quignon等人，genomebiol.vol.6，pp.r83-r83.9(2005)；olender等人，genomicsvol.83，pp.361-372(2004)；quignon等人，chapter13，cshmonographsvolume44：thedoganditsgenome(2006)；以上出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
其他哺乳动物的嗅觉受体库也在本发明的范围内，包括例如小鼠、大鼠、猫、奶牛和牛、马、山羊、猪和熊的嗅觉受体库。
在一些实施例中，生物传感器由具有氨基酸序列(or1a1、ncbi9606、up000005640、hgnc8179、np_055380.2、dmdm212276451)的人嗅觉受体1a1制成：
在一些实施例中，人嗅觉受体1a1的n-末端氨基酸被来自具有序列(or6a2、ncbi9606、up000005640、hgnc15301；np_003687.2)的人嗅觉受体6a2的n-末端氨基酸替代。
在一些实施例中，来自or6a2的n-末端区域的氨基酸(氨基酸位置1-61)与or1a1融合，以产生用于生物传感器的融合嗅觉受体。在一些实施例中，来自or6a2的n-末端区域的至少20个连续氨基酸与or1a1融合。在一些实施例中，or6a2的n-末端区域是氨基酸位置1-55。or6a2的这些氨基酸在or1a1的n-末端区域中的位置(范围为1-61)处融合。在一些实施例中，来自or6a2的n-末端序列与or1a1的氨基酸位置56融合。在一些实施例中，人or6a2未经修饰地用于生物传感器。在一些实施例中，通过与来自其他嗅觉受体的其他c-末端序列融合，人or6a2受体在其c-末端被修饰。在一些实施例中，通过融合来自其他嗅觉受体的n-末端序列，人or6a2在其n-末端被修饰。
在一些实施例中，生物传感器由人嗅觉受体2j2(or2j2，hgnc8260；np_112167)制成。
在一些实施例中，生物传感器由人嗅觉受体2w1(or2w1，hgnc8281；np_112165)制成。
在一些实施例中，生物传感器由人嗅觉受体5p3(or5p3，hgnc14784；np_703146)制成。
在一些实施例中，来自大鼠ri7嗅觉受体的n-末端氨基酸与人嗅觉受体的n-末端融合。大鼠ri7嗅觉受体具有n-末端序列：
在一些实施例中，大鼠ri7嗅觉受体的n-末端序列的氨基酸位置1-55与人嗅觉受体的n-末端融合。
在一些实施例中，嗅觉受体在其n-或c-末端与flag或his标签融合，以帮助生物传感器多肽的某些纯化和生物化学表征。
人嗅觉受体被分为18个家族：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、51、52、55和56。家族or1具有21名成员：or1a、or1b、or1c、or1d、or1e、or1f、or1g、or1h、or1i、or1j、or1k、or1l、or1m、or1n、or1p、or1q、or1r、oris、or1x、or1aa、和or1ab。家族or2具有41名成员：or2a、or2b、or2c、or2d、or2e、or2f、or2g、or2h、or2i、or2j、or2k、or2l、or2m、or2n、or2q、or2r、or2s、or2t、or2u、or2v、or2w、or2x、or2y、or2z、or2ad、or2ae、or2af、or2ag、or2ah、or2ai、or2aj、or2ak、or2al、or2am、or2ao、or2ap、or2as、和or2at。家族or3具有3名成员：or3a、or3b、和or3d。家族or4具有21名成员：or4a、or4b、or4c、or4d、or4e、or4f、or4g、or4h、or4k、or4l、or4m、or4n、or4p、or4q、or4r、or4s、or4t、or4u、or4v、or4w、和or4x。家族or5具有49名成员：or5a、or5b、or5c、or5d、or5e、or5f、or5g、or5h、or5i、or5j、or5k、or5l、or5m、or5p、or5r、or5s、or5t、or5v、or5w、or5ac、or5ah、or5ak、or5al、or5am、or5an、or5ao、or5ap、or5aq、or5ar、or5as、or5au、or5w、or5x、or5y、or5z、or5ba、or5bb、or5bc、or5bd、or5be、or5bh、or5bj、or5bk、or5bl、or5bm、or5bn、or5bp、or5bq、or5br、or5bs、和or5bt。家族or6具有21名成员：or6a、or6b、or6c、or6d、or6e、or6f、or6j、or6k、or6l、or6m、or6n、or6p、or6q、or6r、or6s、or6t、or6u、or6v、or6w、or6x、和or6y。家族or7具有9名成员：or7a、or7c、or7d、or7e、or7g、or7h、or7k、or7l、和or7m。家族or8具有18名成员：or8a、or8b、or8c、or8d、or8f、or8g、or8h、or8i、or8j、or8k、or8l、or8q、or8r、or8s、or8t、or8u、or8v、和or8x。家族or9具有12名成员：or9a、or9g、or9h、or9j、or9k、or9l、or9m、or9n、or9p、or9q、or9r、和or9s。家族or10具有29名成员：or10a、or10b、or10c、or10d、or10g、or10h、or10j、or10k、orion、or10p、or10q、or10r、or10s、or10t、or10u、or10v、or10w、or10x、or10y、or10z、or10aa、or10ab、or10ac、or10ad、or10ae、or10af、or10ag、or10ah、和or10ak。家族or11具有11名成员：or11a、or11g、or11h、or11i、or11j、or11k、or11l、or11m、or11n、or11p、or11q。家族or12具有1名成员：or12d。家族or13具有11名成员：or13a、or13c、or13d、or13e、or13f、or13g、or13h、or13i、or13j、or13k、和or13z。家族or14具有6名成员：or14a、or14c、or14i、or14j、or14k、和or14l。家族or51具有21名成员：or51a、or51b、or51c、or51d、or51e、or51f、or51g、or51h、or51i、or51j、or51k、or51l、or51m、or51n、or51p、or51q、or51r、or51s、or51t、or51v、和or51ab。家族or52具有22名成员：or52a、or52b、or52d、or52e、or52h、or52i、or52j、or52k、or52l、or52m、or52n、or52p、or52q、or52r、or52s、or52t、or52u、or52v、or52w、or52x、or52y、和or52z。家族or55具有1名成员：or55b。家族or56具有2名成员：or56a和or56b。
生物传感器
本发明涉及用于检测在嗅觉受体相互作用的生物传感器。在一些实施例中，生物传感器用于检测气味物在嗅觉受体的相互作用。在一些实施例中，生物传感器包含多个嗅觉受体，并且所述多个嗅觉受体用于检测气味物。在一些实施例中，生物传感器中的多个嗅觉受体代表动物嗅觉受体库或该库的一部分。在一些实施例中，生物传感器中的多个嗅觉受体代表人嗅觉受体库或该库的一部分。在一些实施例中，生物传感器中的多个嗅觉受体代表检测溶液中的气味物的人嗅觉受体库的部分。在一些实施例中，生物传感器中的多个嗅觉受体代表检测气相的气味物的人嗅觉受体库的部分。在一些实施例中，生物传感器中的多个嗅觉受体代表产生令人愉快的或正面反应的人嗅觉受体库的部分。在一些实施例中，生物传感器中的多个嗅觉受体代表产生不利或负面反应的人嗅觉受体库的部分。在一些实施例中，生物传感器中的多个嗅觉受体代表来自人嗅觉受体的18个家族之一的人嗅觉受体库的部分。
在一些实施例中，各生物传感器由嗅觉受体组成，所述嗅觉受体在其n-末端区域与将新生多肽靶向宿主细胞分泌装置以将嗅觉受体插入膜中的多肽序列融合，并在其c-末端区域与稳定所述膜中的受体的多肽融合。在一些实施例中，与嗅觉受体的c-末端区域融合的多肽将受体靶向宿主细胞的外膜。在一些实施例中，嗅觉受体是哺乳动物嗅觉受体。在一些实施例中，嗅觉受体是人嗅觉受体。在一些实施例中，全长嗅觉受体用于生物传感器。在一些实施例中，全长嗅觉受体是人嗅觉受体。
在一些实施例中，生物传感器包括g蛋白信号通路。可以使用许多g蛋白信号通路。在一些实施例中，g蛋白信号通路包含g蛋白介导的腺苷酸环化酶活化，由此产生camp作为第二信使。在一些实施例中，camp与camp活化的阳离子通道相互作用。
在一些实施例中，本发明的生物传感器还包含g蛋白和腺苷酸环化酶(例如uniproto60266)。在一些实施例中，g蛋白由三个亚基—gα亚基(例如uniprotp38405)、gβ亚基(例如uniprotp62879)和gγ亚基(例如uniprotp63218)组成。在一些实施例中，腺苷酸环化酶和g蛋白来自相同物种。在一些实施例中，腺苷酸环化酶和g蛋白来自不同物种。在一些实施例中，g蛋白亚基来自相同或不同物种。在一些实施例中，嗅觉受体、g蛋白和腺苷酸环化酶来自相同物种，而在一些实施例中，所述组分的一种或多种来自不同物种。在一些实施例中，生物传感器的嗅觉受体和g蛋白源自人多肽。在一些实施例中，本发明的生物传感器多肽包括与seqidno:6-10和12-17或来自18个人or基因家族的人or受体之一具有70％、80％、90％、95％和99％序列同源性的多肽。
在一些实施例中，生物传感器包括报告子。在一些实施例中，生物传感器的g蛋白直接与报告多肽相互作用以产生可检测的信号，例如腺苷酸环化酶是产生camp的报告多肽。可以检测camp分子本身(例如可商购的试剂盒，由例如thermofisherscientific,raybiotech,enzolifesciences,caymanchemical和cellbiolabs销售)。在一些实施例中，生物传感器的g蛋白与诱导报告子的多肽相互作用。在一些实施例中，g蛋白与多肽(例如腺苷酸环化酶)相互作用以产生第一信号，并且当报告子响应第一信号时，第二系统放大第一信号。在一些实施例中，多个扩增步骤用来增加在嗅觉受体的相互作用的检测。在一些实施例中，检测初始信号和放大的或多次放大的信号，以便增加生物传感器所检测到的结合相互作用的动态范围。
在一些实施例中，生物传感器包括一个或多个报告子。在一些实施例中，将编码报告蛋白的异源基因引入宿主细胞，使得宿主细胞表达报告子，并且当在生物传感器的嗅觉受体处发生适当的相互作用时，生物传感器激活报告子。在一些实施例中，将宿主细胞工程化以表达单一报告子。在一些实施例中，各自表达不同报告子的不同宿主细胞用来增强生物传感器的信号检测。在一些实施例中，宿主细胞经工程改造以表达两个或更多个报告产物，例如通过使用编码两个或更多个报告子的单一载体构建体。在一些实施例中，一个或多个报告子提供至少3、4、5、6、7、8、9或10个数量级的动态范围的检测，覆盖一系列嗅觉受体检测，范围为从约10-12m至约10m。
在一些实施例中，一个或多个报告子是荧光报告子、生物发光报告子、酶、和离子通道的一种或多种。荧光报告子的示例包括，例如，来自维多利亚水母(aequoreavictoria)或海肾(renillareniformis)的绿色荧光蛋白及其活性变体(例如，蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白等等)；来自水螅水母、桡足类动物、栉水母类、anthrozoas和奶嘴海葵的荧光蛋白及其活性变体；和藻胆蛋白及其活性变体。其他荧光报告子包括，例如，小分子，如cpsd(二钠3-(4-甲氧基{1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)磷酸苯酯，thermofisher目录号t2141)。生物发光报告子包括，例如，水母发光蛋白(和其他ca+2调节的发光蛋白)、基于荧光素底物的荧光素酶、基于腔肠素底物的荧光素酶(例如海肾属、高斯椰属和metridina)和来自海荧属的荧光素酶，及其活性变体。在一些实施例中，生物发光报告子包括，例如，北美萤火虫荧光素酶、日本萤火虫荧光素酶、意大利萤火虫荧光素酶、东欧萤火虫荧光素酶、宾夕法尼亚萤火虫荧光素酶、磕头虫荧光素酶、苹绕实蝇荧光素酶、海肾属荧光素酶、高斯椰属荧光素酶、海荧属荧光素酶、metrida荧光素酶、oluc、和红萤火虫荧光素酶，所有这些都可从thermofisherscientific和/或promega商购获得。酶报告子包括例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶和过氧化氢酶。离子通道报告子包括例如camp激活的阳离子通道。报告子还可以包括正电子发射断层扫描(pet)报告子、单光子发射计算机断层扫描(spect)报告子、光声报告子、x射线报告子和超声报告子。
在一些实施例中，抗体用于放大来自嗅觉受体结合相互作用的信号。在一些实施例中，报告子是可被抗体检测的多肽或小分子。在一些实施例中，在elisa中检测小分子或多肽。在一些实施例中，抗体夹心测定法用于放大来自小分子或多肽报告子的信号。
在一些实施例中，用本发明的生物传感器进行实时测量。在一些实施例中，报告子发光或产生可用光学传感器检测的分子。在这些实施例中，随着生物传感器与潜在配体相互作用，通过记录光发射随时间的变化，可以从生物传感器获得实时测量。实时测量可用于通过绝对测量或相对测量来量化结合相互作用。在绝对测量中，将实时信号与标准物进行比较以确定嗅觉受体处的结合活性。在一些实施例中，使用已知量的至嗅觉受体的配体来产生受体占有对报告基因输出的标准结合曲线。然后可以将测试配体的结合与标准曲线比较以定量测试配体在嗅觉受体的相互作用。在相对测量中，生物传感器包括内部参考，其允许比较在嗅觉受体的相互作用的差异。在一些实施例中，参考g蛋白偶联受体被包括在宿主细胞中，并且已知量的参考配体被添加到参考受体以充当标准物。在一些实施例中，参考受体偶联不同的报告子，例如，报告多肽，其提供来自嗅觉受体报告子的不同光学信号。在一些实施例中，参考和测试受体偶联不同的荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白gfp和红色荧光蛋白rfp。可以对于在相同的嗅觉受体的不同测试配体比较绿色荧光与红色荧光的比率，或者比较相同测试配体对不同嗅觉受体的结合。
在一些实施例中，从具有非光学报告子的生物传感器获得实时数据。在一些实施例中，来自第一报告系统的信号被第二报告系统放大，以增加来自嗅觉受体处的弱相互作用的信号。在一些实施例中，控制生物传感器的gtp/gdp比率以调节来自受体的g蛋白偶联信号转导的敏感性。在一些实施例中，控制gtp/gdp比率以改变生物传感器的动态范围。
根据报告基因表达的报告产物的类型，可以通过任何适当的检测方法和装置来检测报告基因的产物。举例来说，示例性报告基因编码产生光的蛋白质(例如荧光素酶或egfp)，并且可以使用光学成像检测该表型。在本文的描述中，报告子的表达意在包括相应报告基因的表达，导致编码的报告子或报道分子的表达。
在一个实施例中，本发明的多肽包括由核酸编码的多肽，所述核酸在严格杂交条件下与编码seqidno:6-10和12-17的多肽之一的核酸或编码来自人嗅觉受体的18个家族的人or受体之一的核酸杂交。在一个实施例中，本发明的多肽包括由核酸编码的多肽，所述核酸在严格杂交条件下与编码seqidno:6-10和12-17的多肽之一的核酸或编码来自人嗅觉受体的18个家族的人or受体之一的核酸杂交。在一个实施例中，本发明的多肽包括由在严格杂交条件下与编码seqidno:6或7的多肽的核酸杂交的核酸所编码的多肽。
在一个实施例中，本发明的多肽与seqidno:6-10和12-17之一或者来自人嗅觉受体的18个家族的人or受体之一具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。在一个实施例中，本发明的多肽与seqidno:6-7之一具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。在一个实施例中，本发明的epha3多肽与seqidno:6具有至少70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。
在一些实施例中，本发明的生物传感器中的人嗅觉受体的检测阈值为从约0.15份/十亿至约420,000份/十亿或在6-7个数量级的范围内。在一些实施例中，本发明的生物传感器中人嗅觉受体的检测范围为从约10-9m至约10-3m或在约6个数量级的范围上。在一些实施例中，检测范围在3、4、5、6、7、8、9或10个数量级上，配体范围为从10m至10-12m。
本发明的多肽涵盖本发明的多肽的片段和变体。因此，术语“片段或变体多肽”进一步考虑了序列的缺失、添加和取代，只要多肽如本文所述起作用。术语“保守性变异(conservativevariation)”表示用另一种生物学上相似的残基取代一种氨基酸残基，或替代核酸序列中的核苷酸，使得编码的氨基酸残基不会改变或被改变为另一种在结构上、化学上或要不然在功能上相似的残基。在这点上，特别优选的取代在性质上一般是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些取代。例如，氨基酸一般分为四个家族：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守性变异的示例包括用一种疏水残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代另一种疏水残基，或用一种极性残基取代另一种极性残基，如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、或谷氨酰胺取代天冬酰胺等；或用不会对生物活性产生重大影响的结构上相关的氨基酸类似保守性替代氨基酸。因此，具有与参考分子基本相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质免疫原性的次要氨基酸取代的蛋白质在参考多肽的定义范围内。本文包括由这些修饰产生的所有多肽。术语“保守性变异”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，条件是对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。
本发明的“变体”多肽或核酸包括具有基本相似序列的多肽或核酸。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或天然多核苷酸中一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所用，“天然(native)”多核苷酸或多肽分别包含天然发生的核苷酸序列或氨基酸序列。还可以通过比较由变体多核苷酸编码的多肽与由参考多核苷酸编码的多肽之间的序列同一性百分比来评估本发明的特定多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体。“变体”蛋白质意指通过天然蛋白质中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的缺失或添加和/或天然蛋白质中一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代而源自天然蛋白质的蛋白质。本发明中包含的变体蛋白质具有生物学活性，即它们具有引发免疫应答的能力。
来自其他等位基因的本发明多肽的同系物意图在本发明的范围内。如本文所用，术语“同系物(homolog)”包括类似物和旁系同源物。术语“类似物(anolog)”是指具有相同或相似功能但在不相关的宿主生物中分别演变的两个多核苷酸或多肽。术语“旁系同源物(paralog)”是指通过基因组内的复制而相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可能是相关的。野生型多肽的类似物和旁系同源物可以通过翻译后修饰、氨基酸序列差异或两者与野生型多肽不同。尤其是，本发明的同系物一般会表现出与全部或部分的野生型多肽或多核苷酸序列的至少80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，并且会表现出类似的功能。变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指含有多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列的变化并且存在于天然群体(例如病毒物种或种类)中。所述天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽中1％-5％的变异。可以通过对许多不同物种中的目的核酸序列进行测序来鉴定等位基因变体，这可以通过使用杂交探针容易地进行以鉴定那些物种中的相同遗传基因座。任何和所有此类核酸变异和由天然等位基因变异导致的并且不改变目的基因的功能活性的所得氨基酸多态性或变异都包括在本发明的范围内。
如本文所用，术语“衍生物(derivative)”或“变体”是指多肽或编码多肽的核酸，其具有一个或多个保守性氨基酸变异或其他微小修饰，使得(1)当与野生型多肽相比时，相应的多肽具有基本上等同的功能或(2)产生针对与野生型多肽具有免疫反应性的多肽的抗体。这些变体或衍生物包括具有多肽一级氨基酸序列的微小修饰的多肽，其可以产生与未修饰的对应多肽相比具有基本等效活性的肽。这些修饰可能是有意的，如通过定点诱变，或可能是自发的。术语“变体”进一步考虑了对序列的缺失、添加和取代，只要多肽起到产生如本文所定义的免疫应答的作用。术语“变体”还包括对多肽的修饰，其中天然信号肽被异源信号肽替代以促进来自宿主物种的多肽的表达或分泌。术语“变体”还可以包括“拟表位/拟肽(mimitope)”，其是完全不同的蛋白质序列但具有相似的结构，也诱导交叉反应性免疫。
本发明的多肽还可包括用于引入糖基化位点或用于多肽修饰或衍生化的其他位点的氨基酸序列。在一个实施例中，上述本发明的多肽可包括可充当糖基化位点的氨基酸序列n-x-s或n-x-t。在糖基化过程中，寡糖链附接至三肽序列n-x-s或n-x-t中出现的天冬酰胺(n)，其中x可以是除pro之外的任何氨基酸。该序列被称为糖基化序列。该糖基化位点可以位于多肽的n-末端、c-末端或内部序列内。
宿主细胞
在本发明中，不同的真核细胞可用作宿主细胞。在一些实施例中，宿主细胞是真菌细胞、动物细胞、植物细胞或藻类细胞。在一些实施例中，真核细胞是真菌细胞，包括但不限于曲霉属、木霉属、酵母属、金孢子菌属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、亚罗酵母属、接合酵母属、裂殖酵母属、青霉属或根霉属的真菌。在一些实施例中，真菌细胞是酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、黑曲霉、米曲霉、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)或里氏木霉菌。
在一些实施例中，本发明的宿主细胞是动物细胞。在一些实施例中，宿主细胞是来自商业上有价值的家畜的细胞。在一些实施例中，动物细胞是哺乳动物细胞，例如牛科动物、犬科动物、猫科动物、仓鼠、小鼠、猪、兔、大鼠或绵羊的细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞是灵长类动物的细胞，包括但不限于猴、黑猩猩、大猩猩和人。在一些实施例中，哺乳动物细胞是小鼠细胞，因为小鼠通常用作其他哺乳动物的模型，尤其是用作人类的模型(参见例如hanna,j.等人，“treatmentofsicklecellanemiamousemodelwithipscellsgeneratedfromautologousskin”，science318:1920-23,2007；holtzman,d.m.等人，“expressionofhumanapolipoproteinereducesamyloid-βdepositioninamousemodelofalzheimer’sdisease”，jclininvest.103(6):r15-r21,1999；warren,r.s.等人，“regulationbyvascularendothelialgrowthfactorofhumancoloncancertumorigenesisinamousemodelofexperimentallivermetastasis”，jclininvest.95:1789-1797,1995；每份出版物在此被援引加入本文)。动物细胞包括例如成纤维细胞、上皮细胞(如肾、乳腺、前列腺、肺)、角质细胞、肝细胞、脂肪细胞、内皮细胞、造血细胞。在一些实施例中，动物细胞是成体细胞(例如终末分化的、分裂的或非分裂的)或干细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞系用作本发明的宿主细胞。在一些实施例中，所述细胞系衍生自中国仓鼠细胞、人肾细胞、猴肾细胞、人宫颈癌细胞或小鼠骨髓瘤细胞。这些和其他哺乳动物细胞系在本领域中是公知的，例如，可从thermofisherscientific、atcc(美国菌种保藏中心)和charlesriverlaboratoriesinternational，inc.公开获得的哺乳动物细胞系。在thermofisher、atcc和charlesriverlaboratories的网站上公开的细胞系出于所有目的整体被援引加入本文。
在一些实施例中，真核细胞是植物细胞。在一些实施例中，植物细胞是单子叶植物或双子叶植物的细胞，包括但不限于，苜蓿、杏仁、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆、黑莓、芸苔、西兰花、卷心菜、加拿大油菜、胡萝卜、花菜、芹菜、樱桃、菊苣、柑橘、咖啡、棉花、黄瓜、桉树、大麻、生菜、小扁豆、玉米、芒果、甜瓜、燕麦、木瓜、豌豆、花生、菠萝、李子、马铃薯(包括甘薯)、南瓜、小红萝卜、油菜籽、覆盆子、大米、黑麦、高粱、大豆、菠菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、番茄、芜菁、小麦、西葫芦和其他结果蔬菜(如番茄、胡椒、红辣椒、茄子、黄瓜、南瓜等)、其他鳞茎类蔬菜(如大蒜、洋葱、韭菜等)、其他仁果(如苹果、梨等)、其他核果(如桃子、油桃、杏、梨、李子等)、拟南芥、木本植物(如针叶树和落叶树)、观赏植物、多年生草、饲料作物、花卉、其他蔬菜、其他水果、其他农作物、草本植物、草或多年生植物部分(如鳞茎；块茎；根；冠；干；匍匐茎；分蘖；嫩枝；插枝(包括无根插枝、生根插枝和愈伤组织插枝或愈伤组织生成的小植株)；顶端分生组织等)。术语“植物”是指植物的所有物理部分，包括种子、幼苗、幼树、根、块茎、干、秆、叶和果实。
在一些实施例中，真核细胞是藻类，包括但不限于小球藻属(chlorella)、衣藻属(chlamydomonas)、栅藻属(scenedesmus)、等鞭金藻属(isochrysis)、杜氏藻属(dunaliella)、扁藻属(tetraselmis)、微拟球藻属(nannochloropsis)或原壁菌属(prototheca)。
核酸
在一些实施例中，本发明涉及编码至少部分本发明的各肽、多肽和蛋白质的核酸。在一些实施例中，核酸可以是天然的、合成的或其组合。本发明的核酸可以是rna、mrna、dna、cdna或合成核酸。
在一些实施例中，本发明的核酸还包括表达载体，例如质粒，或病毒载体，或线性载体，或整合到染色体dna中的载体。表达载体可含有使载体能够在一个或多个选定的宿主细胞中复制的核酸序列。所述序列对于多个细胞是公知的。来自质粒pbr322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌。在真核宿主细胞(例如哺乳动物细胞)中，表达载体可以整合到宿主细胞染色体中，并且然后与宿主染色体一起复制。类似地，载体可以整合到原核细胞的染色体中。在一些实施例中，载体与酵母yrp、yep和ycp中的自主复制质粒相关。这三种都是酿酒酵母/大肠杆菌穿梭载体，通常携带用于插入表达盒的多克隆位点(mcs)。在一些实施例中，使用酵母表位标签载体pesc。pesc载体可从agilenttechnologies商购获得。
表达载体还一般包含选择基因，也称为选择性标记。选择性标记在本领域中对于原核和真核细胞(包括本发明的宿主细胞)是公知的。一般，选择基因编码在选择性培养基中生长的经转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞不会在培养基中存活。通常的选择基因编码的蛋白质如下：(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型不足，或(c)提供无法从复合培养基获得的关键营养素，例如编码芽孢杆菌属的d-丙氨酸消旋酶的基因。在一些实施例中，示例性选择方案利用药物来阻止宿主细胞的生长。那些用异源基因成功转化的细胞产生一种赋予抗药性的蛋白质，并因此在选择方案中存活。用于细菌或真核(包括哺乳动物)系统的其他选择性标记在本领域中是公知的。酵母选择基因的示例包括ura3、trp1、leu2、his3、lys2、ade2、met15、hphnt1、和natnt2。dasilva等人，femsyeastresearch12:197-214(2012)，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。在一些实施例中，这些酵母选择基因与合适的营养缺陷型酵母菌株一起使用。
诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的示例包括但不限于gali、gal7、和gal10(半乳糖诱导型)cup1(铜离子诱导型)、adh2(葡萄糖抑制)的酵母启动子，和哺乳动物启动子，例如金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、c-fos启动子，thermofisher的t-rex系统(将人巨细胞病毒即早启动子的表达置于四环素操纵子的控制之下)，和intrexon的rheoswitch启动子。karzenowski,d.等人，biotechiques39:191-196(2005)；dai,x.等人，proteinexpr.purif42:236-245(2005)；palli,s.r.等人，eur.j.biochem.270:1308-1515(2003)；dhadialla,t.s.等人，annualrev.entomol.43:545-569(1998)；kumar,m.b等人，j.biol.chem.279:27211-27218(2004)；verhaegent,m.等人，annal.chem.74:4378-4385(2002)；katalam,a.k.等人，moleculartherapy13:s103(2006)；和karzenowski,d.等人，moleculartherapy13:s194(2006)，dasilva等人，femsyeastresearch12:197-214(2012)；美国专利号8,895,306、8,822,754、8,748,125、8,536,354，以上所有文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。
本发明的表达载体通常具有启动子元件，例如增强子，以调节转录起始的频率。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔往往是灵活的，使得当元件相对于彼此反向或移动时能保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以在活性开始下降之前增加至50bp。取决于启动子，似乎各元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
本发明的核酸可以与另一核酸可操作地链接，以便在合适的启动子的控制下表达。为了实现核酸的有效转录，本发明的核酸还可以与和启动子或转录起始位点配合的其他调节元件可操作地链接，例如包含增强子序列、polya位点或终止子序列的核酸。除了本发明的核酸之外，可以掺入可以为用于确认核酸表达的标记物的基因(例如，药物抗性基因、编码报告酶的基因、或编码荧光蛋白的基因)。
在一些实施例中，修饰本发明的多肽是希望的。技术人员将认识到在给定核酸构建体中产生改变以生成变体多肽的许多种方式。这些公知的方法包括定点诱变、使用简并寡核苷酸的pcr扩增、将含有核酸的细胞暴露于诱变剂或辐射、化学合成所期望的寡核苷酸(例如，结合连接和/或克隆以生成大的核酸)和其他公知的技术(参见例如，gillamandsmith，gene8:81-97,1979；roberts等人，nature328:731-734,1987，所述文献出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。在一些实施例中，修饰编码本发明多肽的重组核酸以提供优选的密码子，所述密码子增强所选生物中核酸的翻译。
本发明的多核苷酸还包括包含与本发明的多核苷酸基本等效/等同的核苷酸序列的多核苷酸。根据本发明的多核苷酸可能与本发明的多核苷酸具有至少约80％、更通常至少约90％、甚至更通常至少约95％序列同一性。本发明还提供了多核苷酸的互补序列，其包含与编码上述多肽的多核苷酸具有至少约80％、更通常至少约90％、甚至更通常至少约95％序列同一性的核苷酸序列。多核苷酸可以是dna(基因组、cdna、扩增的、或合成的)或rna。用于获得此类多核苷酸的方法和算法是本领域技术人员公知的，并且可包括例如用于确定杂交条件的方法，所述杂交条件可常规分离具有所期望序列同一性的多核苷酸。
编码根据本发明的蛋白质类似物或变体的核酸(即，其中一个或多个氨基酸被设计为与野生型多肽不同)可以使用定点诱变或pcr扩增产生，其中引物具有所期望的点突变。关于合适的诱变技术的详细描述，参见sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.(1989)和/或currentprotocolsinmolecularbiology，ausubel等人编辑，greenpublishersinc.和wileyandsons，n.y(1994)，每篇文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文。使用本领域公知的方法进行化学合成，例如engels等人，angewchemintled.28:716-34,1989(出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)中描述的方法也可用于制备此类核酸。
在一些实施例中，用于产生变体的氨基酸“取代”优选地是用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸替代一氨基酸(即保守氨基酸替代)的结果。氨基酸取代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和蛋氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
“插入”或“缺失”通常在约1至5个氨基酸的范围内。允许的变异可以通过使用重组dna技术系统地在多肽分子中插入、缺失或取代氨基酸并测定所得重组变体的活性来实验性地确定。
可替代地，可以通过利用遗传密码中的“冗余”来合成或选择编码这些相同或相似多肽的重组变体。可以引入多个密码子取代，例如产生各种限制性位点的沉默变化，以优化克隆到质粒或病毒载体中或在特定的原核或真核系统中表达。多核苷酸序列中的突变可被反映在多肽或添加到多肽的其他肽的结构域中，以修饰多肽的任何部分的性质，改变特征，例如配体结合亲和力或降解/转换率。
可替代地，在需要改变功能的情况下，可以工程化插入、缺失或非保守性改变以产生改变的多肽或嵌合多肽。所述改变可以例如改变本发明多肽的一种或多种生物学功能或生物化学特征。例如，所述改变可以改变多肽特征，例如配体结合亲和力或降解/转换率。此外，可以选择所述的改变以生成更适于在所选择的用于表达的宿主细胞中表达、按比例放大等的多肽。
在优选的方法中，通过定点诱变改变编码新颖核酸的多核苷酸。该方法使用编码所期望氨基酸变体的多核苷酸序列的寡核苷酸序列，以及在经改变的氨基酸两侧的足以在正在被改变的位点的任一侧形成稳定的双链体的相邻核苷酸。一般，定点诱变技术是本领域技术人员所公知的，并且该技术例示于例如edelman等人，dna2:183(1983)等出版物中。在zollerandsmith，nucleicacidsres.10:6487-6500(1982)中描述了用于在多核苷酸序列中产生位点特异性变化的通用且有效的方法。
pcr也可用于产生核酸的氨基酸序列变体。当少量模板dna用作起始材料时，其序列与模板dna中相应区域略有不同的引物可产生所期望的氨基酸变体。pcr扩增产生产物dna片段群体，这些片段不同于在由引物指定的位置处编码靶标的多核苷酸模板。产物dna片段替代质粒中的相应区域，并且这给予所期望的氨基酸变体。
用于产生氨基酸变体的另外的技术是wells等人，gene34:315(1985)中描述的盒式诱变技术，以及本领域公知的其他诱变技术，例如像在sambrook等人(见上)和ausubel等人(见上)中的技术。
用生物传感器制备宿主细胞的过程/方法
如上所述，对嗅觉受体进行遗传工程化以在期望的宿主细胞中表达。嗅觉受体可以来自某些物种，或者可以是融合或杂合构建体。嗅觉受体或融合/杂合体的n-末端和c-末端序列将嗅觉受体或融合/杂合体定位于宿主细胞膜，并且如果合适的话，定位于宿主细胞的外膜。将这些嗅觉受体或融合/杂合基因构建体置于宿主细胞的合适表达载体中，并且然后将这些表达构建体或表达载体置于宿主细胞内。
在一些实施例中，也对宿主细胞进行遗传工程化以表达人g蛋白亚基。在一些实施例中，也对宿主细胞进行遗传工程化以表达人g蛋白亚基gα、gβ和gγ。在该实施例中，将编码人gα、gβ和gγ亚基的基因置于所期望的宿主细胞的适当控制序列(启动子、增强子、翻译起始序列、polya位点等)的控制下，并且将这些人gα、gβ和gγ亚基的构建体置于所期望的宿主细胞中。在一些实施例中，人g蛋白还与腺苷酸环化酶相关。在该实施例中，将合适的腺苷酸环化酶的基因置于所期望的宿主细胞的合适控制序列的控制下，并将该构建体置于所期望的宿主细胞中。
在本发明的方法中，使用如上所述的真核宿主细胞。在一些实施例中，使用真菌细胞。在一些实施例中，真菌细胞来自曲霉属、木霉属、酵母属、金孢子菌属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、亚罗酵母属、接合酵母属、裂殖酵母属、青霉属或根霉属。在一些实施例中，真菌细胞是酿酒酵母。在一些实施例中，可以使用源自哺乳动物的真核细胞(例如人细胞)或源自非人哺乳动物(例如猴、小鼠、大鼠、猪、马或狗)的细胞。用于本发明方法的细胞没有特别限制，并且可以使用任何细胞。
在一些实施例中，通过以下方式将编码生物传感器的核酸引入宿主细胞中：转染(例如gorman等人，proc.natl.acad.sci.79.22(1982):6777-6781，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、转导(例如cepkoandpear(2001)currentprotocolsinmolecularbiologyunit9.9；doi:10.1002/0471142727.mb0909s36，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、磷酸钙转化(例如kingston,chenandokayama(2001)currentprotocolsinmolecularbiologyappendix1c；doi:10.1002/0471142301.nsa01cs01，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、细胞穿透肽(例如copolovici,langel,eriste,andlangel(2014)acsnano20148(3),1972-1994；doi:10.1021/nn4057269，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、电穿孔(例如potter(2001)currentprotocolsinmolecularbiologyunit10.15；doi:10.1002/0471142735.im1015s03和kim等人(2014)genome1012-19.doi:10.1101/gr.171322.113，kim等人2014年描述了amazanucleofector，一种优化的电穿孔系统，以上两个文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、显微注射(例如mcneil(2001)currentprotocolsincellbiologyunit20.1；doi:10.1002/0471143030.cb2001s18，其出于所有目的以其全文被援引加入本文)、脂质体或细胞融合(例如hawley-nelsonandciccarone(2001)currentprotocolsinneuroscienceappendix1f；doi:10.1002/0471142301.nsa01fs10，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)、机械操作(例如sharon等人，(2013)pnas2013110(6)；doi:10.1073/pnas.1218705110，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)或用于将核酸递送至真核细胞的其他公知技术。一旦引入，核酸能以附加体的方式瞬时表达，或者可以使用以下众所周知的技术整合到真核细胞的基因组中：例如，重组(如lisbyandrothstein(2015)coldspringharbperspectbiol.mar2；7(3).pii:a016535.doi:10.1101/cshperspect.a016535，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)或非同源整合(如deyleandrussell(2009)curropinmolther.2009aug；11(4):442-7，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。通过引入靶向双链断裂(dsb)的基因组编辑技术可以促进同源和非同源重组的效率。产生dsb的技术的示例是crispr/cas9、talen、锌指核酸酶或等效系统(例如cong等人，science339.6121(2013):819-823，li等人，nucl.acidsres(2011):gkr188，gaj等人，trendsinbiotechnology31.7(2013):397-405，所有这些文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)，转座子，如睡美人(sleepingbeauty)(例如singh等人(2014)immunolrev.2014jan；257(1):181-90.doi:10.1111/imr.12137，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)，使用例如flp重组酶的靶向重组(例如o'gorman,foxandwahlscience(1991)15:251(4999):1351-1355，其出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)，cre-lox(例如sauerandhendersonpnas(1988):85；5166-5170)，或等效系统，或本领域已知的用于将核酸整合到真核细胞基因组中的其他技术。
在一个实施例中，将编码gα、gβ、gγ、腺苷酸环化酶、和嗅觉受体的核酸在基因组安全(safeharbor)位点(例如像ccr5、aavs1、人rosa26、或人类细胞的psip1基因座)整合到真核宿主细胞染色体中(sadelain等人，naturerev.12:51-58(2012)；fadel等人，j.virol.88(17):9704-9717(2014)；ye等人，pnas111(26):9591-9596(2014)，所有这些文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。酵母细胞(例如酿酒酵母)的安全位点包括例如酵母tyδ序列。在一个实施例中，宿主细胞是人细胞，并且使用基因编辑系统(例如像crispr、talen或锌指核酸酶系统)在ccr5和/或psip1基因座处进行编码gα、gβ、gγ、腺苷酸环化酶和嗅觉受体的核酸的整合。在一个实施例中，真核细胞是酿酒酵母细胞，并且crispr系统用于在tyδ基因座整合gα、gβ、gγ、腺苷酸环化酶和嗅觉受体。在一个实施例中，使用crispr系统在安全基因座处整合核酸也使安全基因座的一部分或全部缺失。在一个实施例中，真核细胞中的cas9可以源自编码cas9的质粒、编码cas9的外源mrna、或者单独的或在核糖核蛋白复合物中的重组cas9多肽(kim等人，(2014)genome1012-19.doi:10.1101/gr.171322.113.；wang等人，(2013)cell153(4).elsevierinc.:910-18.doi:10.1016/j.cell.2013.04.025，以上文献均出于所有目的以其全文形式被援引加入本文)。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人造膜囊泡)。可用现有技术的靶向递送核酸的其他方法，例如递送具有靶向纳米颗粒的多核苷酸或其他合适的亚微米大小的递送系统。
生物传感器的用途
在一些实施例中，将编码生物传感器的组分的核酸(例如嗅觉受体、g蛋白和腺苷酸环化酶和/或其他报告子)置于合适的宿主细胞(例如酿酒酵母)中并将具有生物传感器的宿主细胞用于检测气味物。在一些实施例中，裂解宿主细胞并获得包含嗅觉受体、g蛋白和腺苷酸环化酶(和/或其他报告子)的膜部分。在该实施例中，膜部分用作生物传感器以检测气味物。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于鉴定与混合物、组合物或分子相互作用的嗅觉受体以及在每个嗅觉受体受混合物、组合物或分子的相互作用程度。嗅觉受体和相互作用程度的识别/鉴定产生了混合物、组合物或分子的香气图。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于解构混合物、组合物和/或分子的香气图，以鉴定混合物、组合物或分子的哪些组分或取代物产生了香气图。在一些实施例中，通过从混合物中除去组分并在生物传感器上测试减去组分的混合物来解构混合物的香气图。通过香气图的变化将鉴定促成香气图的被除去的组分。类似地，可以通过除去组分和鉴定香气图的变化来解构组合物。在一些实施例中，还在生物传感器上测试被除去的组分以表征组分的香气图。在一些实施例中，改变分子上的取代物以努力做到识别分子的哪些取代物与嗅觉受体相互作用。
在一些实施例中，香气图用于产生对于混合物、组合物和/或分子的指标。该香气图指标可用于产品的qc和qa。在一些实施例中，用于qc或qa的产品包括例如香辛料、调味料、香料、香水、食品、宠物用品。在一些实施例中，香气图指标用于产品的成分。在该实施例中，只要满足香气图指标，可以将成分换成不同的成分或来自不同来源的相同成分。在一些实施例中，新成分或来自不同来源的相同成分会要求稍加修饰(例如添加分子)以满足香气图指标。本发明的生物传感器和香气图的使用允许在依赖于香气、香味、气味、(浓重的)气味和/或味道的产品的形成和维持中的基本原理设计和基本原理取代。在一些实施例中，产品或组合物的香气图用于替代已变得不可用、昂贵或难以获得的产品或组合物中的成分。在一些实施例中，香气图用于用健康成分代替非健康成分。在一些实施例中，香气图用于用天然成分代替非天然成分。在一些实施例中，香气图用于用更便宜的成分代替一成分。在一些实施例中，香气图用于用更少成分代替多种成分。在一些实施例中，产品或组合物是(食用)香料或(日化)香精，并且(食用)香料或(日化)香精的香气图用于构建该(食用)香料或(日化)香精的替代配方。本发明还涉及由这些新配方制成的新产品。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于标准化香味、气味、香气、(浓重的)气味和/或味道。在一些实施例中，香气图用于标准化香味、气味、香气、(浓重的)气味和/或味道。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于量化香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道与or库的相互作用。这些量化的相互作用可用于描述香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。例如，数百种香草调味品或香草提取物产品宣传它们提供香草风味(或气味、香味、香气)。本发明的生物传感器可以量化这些香草产品与or库的相互作用，并允许在功能基础上标准化这些产品。一组核心or相互作用将定义香草响应，其中许多次要或副or相互作用产生这些香草产品之间的差异。标准化还允许针对品牌推广、商标和/或版权目的而定量描述香味、气味、香气、(浓重的)气味和/或味道。标准化还允许定量描述新的香味、气味、香气、(浓重的)气味和/或味道。在一些实施例中，风味轮(flavorwheel)的要素被数字化为香气图，并且来自风味轮的定性术语与嗅觉受体处的量化的相互作用相关联。关于风味轮，参见谷歌图片(googleimages)。例如，风味轮描述符焦糖(蜂蜜、奶油糖、黄油、酱油、巧克力、糖浆)、化学品(二氧化硫、乙醇、乙酸、乙酸乙酯、湿羊毛(wetwool)、湿狗(wetdog)、二氧化硫、焦火柴、卷心菜、臭鼬、大蒜、硫醇、硫化氢、橡胶、柴油、煤油、塑料、焦油)、土味的(发霉、发霉的软木、蘑菇、尘土飞扬)、花香(天竺葵、紫罗兰、玫瑰、橙花)、果味的(葡萄柚、柠檬、黑莓、覆盆子、草莓、黑醋栗、樱桃、杏、桃、苹果、菠萝、甜瓜、香蕉、草莓酱、葡萄干、西梅、无花果、邻氨基苯甲酸甲酯)、草本或植物的(切绿草、灯笼椒、桉树、薄荷、青豆、芦笋、绿橄榄、黑橄榄、朝鲜蓟、干草、稻草、茶叶、烟草)、微生物的(似鼠的、似马的、酸奶、汗、酸菜、酒渣(leesy)、面包酵母)、坚果的(核桃、榛子、杏仁)、氧化的(雪利酒)、辛辣的(薄荷脑、酒精)、辣椒(甘草茴香、黑胡椒、丁香)和木质的(烟熏的、烧焦的吐司、咖啡、药用、酚醛、培根、橡木、雪松、香草)通过它们的嗅觉受体响应来量化。
在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于鉴定香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于唯一地鉴定香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于传达关于香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道的信息。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于处理香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于描述产品或服务。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于推销产品或服务。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于销售产品或服务。在一些实施例中，量化的香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道用于购买产品或服务。
在一些实施例中，香气图用于鉴定香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，香气图用于唯一地鉴定香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，香气图用于传达关于香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道的信息。在一些实施例中，香气图用于处理香味、气味、(浓重的)气味、香气和/或味道。在一些实施例中，香气图用于描述产品或服务。在一些实施例中，香气图用于推销产品或服务。在一些实施例中，香气图用于销售产品或服务。在一些实施例中，香气图用于购买产品或服务。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于补救恶臭。在一些实施例中，恶臭产生于具有表征的香味、气味、香气、(浓重的)气味和/或味道的产品的制造中。可以在本发明的生物传感器上测试具有恶臭的产品的批次，并将获得的香气图与产品的香气图指标相比较。这将鉴定导致恶臭的新的或经改变的嗅觉受体相互作用。在一些实施例中，通过解构具有恶臭的产品来鉴定哪种组分引起恶臭以补救恶臭。在一些实施例中，恶臭是由新嗅觉受体处的新相互作用引起的。在该实施例中，可以通过添加阻断新嗅觉受体被激活的抑制剂来补救恶臭。可替代地，可以添加激活其他嗅觉受体的分子，其与新嗅觉受体刺激相结合将恶臭的感知转化为令人愉快的、轻微的或不被感知的气味、香味、香气、(浓重的)气味和/或味道。在一些实施例中，恶臭是由组分的不平衡引起的，这改变了香气图指标中嗅觉受体处的相互作用。在该实施例中，可以通过平衡产品的组分来除去恶臭，以恢复产品的香气图指标。在一些实施例中，可以通过增加某些成分的量来平衡香气图，以基于成分的香气图合理地将香气图平衡至产品指标。在一些实施例中，可以通过添加已知刺激或抑制某些嗅觉受体的分子来平衡香气图，以使具有恶臭的产品的香气图回到具有其香气图指标的平衡。
在一些实施例中，恶臭与运动装备、衣服或鞋子有关。可以在本发明的生物传感器上表征恶臭以产生恶臭香气图。在一些实施例中，通过添加阻断恶臭香气图中的嗅觉受体被激活的抑制剂来补救恶臭。可替换地，可以添加激活其他嗅觉受体的分子，其与被恶臭刺激的嗅觉受体相结合，将恶臭的感知转化为令人愉快的、轻微的或不被感知的气味、香味、香气、(浓重的)气味和/或味道。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于制备具有所期望香气图指标的混合物、组合物或分子。例如，本发明的生物传感器可用于解构尸胺和/或腐胺的香气图。已知这些化合物在一些受试者中引起规避行为。解构某些部分对尸胺和腐胺香气图的贡献可以鉴定负责这些分子的规避行为的嗅觉受体。然后可以使用基本原理设计来制造混合物、组合物或分子，其可以刺激这些嗅觉受体以引起规避行为，而不产生尸胺或腐胺的难闻气味。所述合理设计的香气、香味、味道或气味可用于气溶胶中以引起规避行为并抑制受试者的食欲。可替换地，合理设计的香气、香味、味道或气味可用于使受试者远离一个区域，因为由这些嗅觉受体引起的规避行为会使受试者回避该香味、味道、香气和/或气味。
在一些实施例中，合理设计的香气、香味、气味、(浓重的)气味和/或味道是从已知的香气、香味、气味、(浓重的)气味和/或味道逆向工程的。该逆向工程可以产生用于制备已知的香气、香味、气味、(浓重的)气味和/或味道的新配方。在一些实施例中，合理设计的香气、香味、气味、(浓重的)气味和/或味道包括例如新车气味、香水、(日化)香精或(食用)香料。在一些实施例中，香水或香精存档在osmothèque。在一些实施例中，将来自osmothèque的存档香精或香水的香气图用于产生用于制作该香精或香水的新配制品和配方。在一些实施例中，来自osmothèque的香精或香水的配方已经丢失，而本发明的生物传感器和香料图用于产生用于制作香精或香水的配方和配制品。
在一些实施例中，合理设计的香气、香味、味道和/或气味通过将其置于材料(塑料、皮革、布、木材、蜡等)中而被递送到环境中，其中香气、香味、味道和/或气味随时间从所述材料缓慢释放。在一些实施例中，当经受不同组的条件时，香气、香味、味道和/或气味从材料中释放出来。例如，香气、香味、味道和/或气味可以放置在材料中，在所述材料加热(例如，类似于gladplug-ins)后被释放。除温度之外的其他条件变化也可用于释放香气、香味、味道和/或气味，包括例如溶剂、ph、气流、光等可用于从材料释放香气、香味、味道和/或气味。
在一些实施例中，设计香气图指标来解释在特定受试者的社会经济、文化、地理或其他分群的味觉的差异。在一些实施例中，针对香气景观或气味景观创建香气图指标，以在来自特定社会经济、文化、地理和/或其他分群的受试者中产生期望的响应或状态。在一些实施例中，香气图指标被设计以使来自特定社会经济、文化、地理和/或其他分群的受试者放松、吸引其注意、排斥等。在一些实施例中，为产品创建香气图指标，使得特定社会经济、文化、地理和/或其他分群的受试者会对产品具有期望的响应。在一些实施例中，香气图指标被创建或定义为产品或服务品牌推广的一部分。
在一些实施例中，本发明的生物传感器和香气图用于针对不同地理位置的消费者口味定制产品。在一些实施例中，产品香气、香味、气味、(浓重的)气味和/或味道可被设计成对于不同地理位置的消费者具有吸引力。在一些实施例中，来自不同文化和/或地理位置的一类或一组产品的香气图可用于为不同的地理/文化市场定制该类或组的新产品。例如，可以通过利用来自这些地理区域的类似类型产品的香气图以鉴定消费者所亲睐的那些类型产品的or相互作用来为中东或印度市场设计巧克力产品。利用这些关于or受体和香气图的信息，可以为这些不同的市场合理设计巧克力产品。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于检测和诊断疾病。许多疾病与可用于诊断疾病的气味或味道有关。例如，可以由患者的呼吸检测到某些肺、肝、肾和消化系统疾病，并且可以通过患者的气味检测糖尿病、精神分裂症、帕金森病和某些传染病(结核和伤寒)，并且可以通过犬类的嗅觉库来检测一些癌症。在一些实施例中，与患者的皮肤、汗液、毛发、唾液和其他身体分泌物(例如耳垢)相关的气味、香味和/或味道可与疾病诊断有关。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于产生患者的香气图，所述患者患有可通过气味、香味和/或味道检测的疾病。在一些实施例中，香气图基于人嗅觉受体库。在一些实施例中，香气图基于犬嗅觉受体库。在一些实施例中，香气图基于小鼠或大鼠嗅觉受体库。在一些实施例中，香气图基于哺乳动物嗅觉受体库。然后可以通过采集气味、呼吸或其他样本来诊断患者的疾病，并筛选它们以查看是否检测到某种疾病的香气图。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于鉴定与疾病相关的or组。在一些实施例中，制作用于这些疾病特异性or的配体小组，并且可用于通过患者对与疾病相关的or的反应的变化来监测疾病。例如，嗅觉差是阿尔茨海默病的早期预警信号之一。嗅觉的降低与大脑感知某些or的能力丧失和嗅觉受体记忆的丧失(嗅觉与某些or的刺激的关联)有关。or响应和or记忆的丧失可用作阿尔茨海默病的早期预警信号，也可用于监测对于抗阿尔茨海默病治疗的响应，因为在某些情况下嗅觉的丧失是可逆的。在一些实施例中，可以测试具有阿尔茨海默病风险的患者在疾病相关的or和or记忆中的嗅觉丧失。在一些实施例中，可以针对疾病相关的or的嗅觉丧失和针对or记忆对达到特定年龄的患者进行筛选。在一些实施例中，气味物小组可用于监测患者的与疾病相关的or的嗅觉。在一些实施例中，气味物小组在疾病相关的or具有从强到弱相互作用的不同相互作用。在一些实施例中，本发明的生物传感器可用于鉴定与疾病相关的or并鉴定可用于诊断早期阿尔茨海默病的配体。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于药物发现中。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于设计药物和/或药物组合物的口味、味道、气味、香味和/或香气。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于鉴定和掩盖与药物和/或药物组合物相关的口味、味道、气味、香味和/或香气。在一些实施例中，被掩盖的口味、味道、气味、香味和/或香气在某些受试者中产生负面响应。在一些实施例中，被掩盖的口味、味道、气味、香味和/或香气在某些受试者中产生正面或成瘾性响应。在一些实施例中，本发明的生物传感器用于设计遏制滥用配方。在一些实施例中，不利物(adversant)配方用于阿片类药物，包括例如，氢可酮(维柯丁(vicodin))、氧可酮(奥斯康定(oxycontin)、扑热息痛(percocet)、roxicodone、盐酸羟考酮片(oxecta))、吗啡(kadian、硫酸吗啡(avinza))、可待因、丁丙诺啡(buprenex、butrans)、布托啡诺(布托啡诺(stadol))、二氢吗啡酮(盐酸二氢吗啡酮(dilaudid)、hydrostat、exalgo)、羟甲左吗喃(左吗喃(levo-dromoran))、哌替啶(德美罗(demerol))、美沙酮(多罗芬(dolophine)、methadose)、纳布啡(nubain)、羟吗啡酮(止痛药盐酸羟氢吗啡酮(numorphan))、喷他佐辛(镇痛新(talwin))、丙氧芬(cotanal-65，达尔丰(darvon))、芬太尼(sublimaze、actiq、durogesic、fentora、matrifen、hadid、onsolis、instanyl、abstral、lazanda)、曲马多(盐酸曲马多片剂(ultram))、和他喷他多(nucynta)。在一些实施例中，配方中包含的不利物产生口味、味道、气味、香味和/或香气，使受试者产生回避行为或其他强烈负面反应。在一些实施例中，不利物由两种或更多种组分构成，所述组分在一起感测时产生负面反应，但当单独感测时不诱导负面反应。在一些实施例中，可以在遏制滥用配制品中工程化两种组分以在不同时间释放，但是当配制品被压碎或提取以滥用药物时，这释放两种组分以形成不利物。在一些实施例中，当两种组分结合时形成的不利物在室温下变成气体，或在组分混合并且药物配制品被加热后变成气体。
在一些实施例中，不利物被设计应用于产品中。在一些实施例中，将不利物施用于产品，包括例如烟草或大麻。在这些实施例中，将不利物配制成吸附到植物组织中，使其在使用烟草或大麻时一同释放，例如，可以将不利物设计为当烟草或大麻燃烧时被释放。在一些实施例中，不利物是改变产品与受试者的or的相互作用的物质，导致不利的香气、香味、味道、气味和/或口味。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于鉴定or组的气味物小组。在一些实施例中，气味物小组用于监测个体的嗅觉和/或味觉。在一些实施例中，气味物小组用于监测一组个体(例如用于测试产品的气味和/或味道的一组个体)的嗅觉和/或味觉。在一些实施例中，气味物小组用于设定个体的基线。在一些实施例中，气味物小组用于设定个体的嗅觉/味觉组的指标。在一些实施例中，指标用于为每个味觉/嗅觉小组研究设定个体小组。
在一些实施例中，本发明的生物传感器用于鉴定口味、味道、气味、香味和/或香气的组分，使得各种口味、味道、气味、香味和/或香气的组分一起释放或依次释放以在所期望的时间产生所期望的效果。在一些实施例中，释放一系列组分，使得在第一时间段，所述组分产生在第一时间段内产生所期望响应的口味、味道、气味、香味和/或香气，并且然后在第二时间段释放另一组或不同组的组分以改变或引入新的口味、味道、气味、香味和/或香气，以在第二时间段内产生不同的所期望的响应。在不同时间段内这种口味、味道、气味、香味和/或香气的变化可以根据需要重复多个时间段。
在一些实施例中，本发明涉及具有由本发明的生物传感器产生的已知香气图的气味物的小组或文库。这些气味物的小组或文库可以进行混合和匹配，以制作具有所期望香气图的组合物。在一些实施例中，装置包含气味物的小组或文库，并且可以通过混合来自小组或文库的气味物来制作将满足特定香气图的组合物。在一些实施例中，装置从组合物产生香气图，并制作与测试组合物的香气图匹配的组合物。在一些实施例中，装置在远离组合物测试发生的位置制作匹配测试组合物的香气图的组合物。在一些实施例中，装置在远离输入所期望香气图的位置制作匹配测试组合物的香气图的组合物。
在本说明书中引用的所有公开出版物和专利在此被援引加入本文，如同每份单独公开出版物或专利被具体并且单独地指示为被援引加入并且在此被援引加入本文以结合所引用的这些公开出版物来披露和描述方法和/或材料。
实例
实例1：在酵母细胞中制作生物传感器
替代or1a1的n-末端55个氨基酸，将人or6a2受体的n-末端55个氨基酸与人or1a1受体的n-末端区域融合，以得到生物传感器嗅觉受体，其序列为：
将编码该嗅觉受体的核酸工程化到酵母细胞中，所述酵母细胞先前已被工程化以表达人g蛋白亚基gα、gβ和gγ，以及腺苷酸环化酶。将酵母用构建体进行工程化，所述构建体将如下人gα、gβ和gγ亚基：
置于酵母gali或gal10启动子的控制下。还将酵母菌株工程化，以表达人腺苷酸环化酶(人腺苷酸环化酶5型，np_001186571.1)：
或人腺苷酸环化酶3(uniprotkb:o60266)：
置于酵母gali或gal10启动子的控制下。
测试具有表达杂合嗅觉受体，人gα、gβ和gγ亚基以及人腺苷酸环化酶的酵母细胞的生物传感器的组分表达和杂合or的信号转导。
实例2：使用实时检测来定量嗅觉受体库的配体结合
将如实例1中所述的多个生物传感器用于来自or家族or7的人嗅觉受体。还对具有or7家族嗅觉受体的酵母细胞进行遗传修饰以包括通过由camp激活的对照区表达的重组gfp基因。因此，当生物传感器被气味物激活时，生物传感器会产生gfp，并且可以通过荧光监测活性。
or7家族中的嗅觉受体是哺乳动物信息素的受体，例如与雄烯酮相关的那些。针对一个小组的雄烯酮相关分子筛选气味物小组，所述分子包括雄甾二烯醇(5,16-雄甾烯-3β-醇)、雄甾二烯酮(雄甾-4,16,-二烯-3-酮)、雄甾烷醇(5α-雄甾-16-烯-3α-醇)和雌甾四烯(雌甾-1,3,5(10),16-四烯-3-醇)。
将表达or7家族的嗅觉受体的不同成员的酵母细胞置于单独的孔或容器中，用来自小组的各气味物进行询问，并在时间点0、10秒、20秒、30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟和1小时处进行荧光读取。
实例3：用人嗅觉受体or1a1制作生物传感器
将全长人嗅觉受体or1a1用于制作表达质粒nixp218和nixp354。在nixp218和nixp354中，编码or1a1的核酸处于gal1-10启动子的控制下。or构建体的质粒图谱示于图1中。在nixp354中，or1a1在其n-末端与flag标签(seqidno:1)融合，并在其c-末端与红色荧光蛋白(rfp)的编码序列融合。
将质粒nixp354或nixp218置于单倍体酿酒酵母(mata菌株)中。使用flag标签监测来自nixp354的or1a1的表达以测量表达(使用免疫测定)，并且通过来自rfp的荧光监测or1a1的细胞定位。通过将具有nixp218的酿酒酵母菌株与互补的酿酒酵母菌株(matα)交配来评估生物传感器的功能，所述互补的酿酒酵母菌株经人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶修饰。将这两种酵母菌株一起交配使or1a1受体与人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶发生功能性关联。or1a1受体的功能可以在刺激or1a1受体后通过camp测定来评估。
实例4：用人嗅觉受体or2j2制作生物传感器
将全长人嗅觉受体or2j2用于制作表达质粒nixp219和nixp352。在nixp219和nixp352中，编码or2j2的核酸处于gal1-10启动子的控制下。or构建体的质粒图谱示于图1中。在nixp352中，or2j2在其n-末端与flag标签(seqidno:1)融合，并在其c-末端与红色荧光蛋白(rfp)的编码序列融合。
将质粒nixp352或nixp219置于单倍体酿酒酵母(mata菌株)中。使用flag标签监测来自nixp352的or2j2的表达以测量表达(使用免疫测定)，并且通过来自rfp的荧光监测or2j2的细胞定位。通过将具有nixp219的酿酒酵母菌株与互补的酿酒酵母菌株(matα)交配来评估生物传感器的功能，所述互补的酿酒酵母菌株经人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶修饰。将这两种酵母菌株一起交配使or2j2受体与人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶发生功能性关联。or2j2受体的功能可以在刺激or2j2受体后通过camp测定来评估。
实例5：用人嗅觉受体or2w1制作生物传感器
将全长人嗅觉受体or2w1用于制作表达质粒nixp220和nixp351。在nixp220和nixp351中，编码or2w1的核酸处于gal1-10启动子的控制下。or构建体的质粒图谱示于图1中。在nixp351中，or2w1在其n-末端与flag标签(seqidno:1)融合，并在其c-末端与红色荧光蛋白(rfp)的编码序列融合。
将质粒nixp351或nixp220置于单倍体酿酒酵母(mata菌株)中。使用flag标签监测来自nixp351的or2w1的表达以测量表达(使用免疫测定)，并且通过来自rfp的荧光监测or2w1的细胞定位。通过将具有nixp220的酿酒酵母菌株与互补的酿酒酵母菌株(matα)交配来评估生物传感器的功能，所述互补的酿酒酵母菌株经人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶修饰。将这两种酵母菌株一起交配使or2w1受体与人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶发生功能性关联。or2w1受体的功能可以在刺激or2w1受体后通过camp测定来评估。
实例6：用人嗅觉受体or5p3制作生物传感器
将全长人嗅觉受体or5p3用于制作表达质粒nixp217和nixp353。在nixp217和nixp353中，编码or5p3的核酸处于gal1-10启动子的控制下。or构建体的质粒图谱示于图1中。在nixp353中，or5p3在其n-末端与flag标签(seqidno:1)融合，并在其c-末端与红色荧光蛋白(rfp)的编码序列融合。
将质粒nixp353或nixp217置于单倍体酿酒酵母(mata菌株)中。使用flag标签监测来自nixp353的or5p3的表达以测量表达(使用免疫测定)，并通过来自rfp的荧光监测or5p3的细胞定位。通过将具有nixp217的酿酒酵母菌株与互补的酿酒酵母菌株(matα)交配来评估生物传感器的功能，所述互补的酿酒酵母菌株经人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶修饰。将这两种酵母菌株一起交配使or5p3受体与人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶发生功能性关联。or5p3受体的功能可以在刺激or5p3受体后通过camp测定来评估。
实例7：用人嗅觉受体or6a2制作生物传感器
使用全长人嗅觉受体or6a2制作表达质粒nixp239。在nixp239中，编码or6a2的核酸处于gal1-10启动子的控制下。or构建体的质粒图谱示于图1中。
将质粒nixp239置于单倍体酿酒酵母(mata菌株)中。通过将具有nixp239的酿酒酵母菌株与互补的酿酒酵母菌株(matα)交配来评估生物传感器的功能，所述互补的酿酒酵母菌株经人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶修饰。将这两种酵母菌株一起交配使or6a2受体与人g蛋白亚基gα、gβ和gγ以及腺苷酸环化酶发生功能性关联。or6a2受体的功能可以在刺激or6a2受体后通过camp测定来评估。
实例8：制作具有生物传感器的细胞提取物
在本实例中，使用具有由来自实例3-7的or1a1、or2j2、or2w1、or5p3和or6a2制成的生物传感器的酵母细胞。将具有嗅觉受体、g蛋白和腺苷酸环化酶的酵母细胞在搅拌器中用玻璃珠裂解。通过以600xg离心裂解物除去细胞碎片。将剩余的裂解物在超速离心机(104,300xg)中离心，得到具有嗅觉受体、g蛋白和腺苷酸环化酶的膜部分。将膜部分重新悬浮并置于多孔板中以检测气味物。
在本说明书中引用的所有公开出版物和专利被援引加入本文，如同每份单独公开出版物或专利被具体并且单独地指示为被援引加入并且通过被援引加入本文以结合所引用的公开出版物来披露和描述所述方法和/或材料。
本领域的技术人员使用至多常规实验会认识到或能够确定本文所述的本发明特定实施例的许多等同方案。所述等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。
序列表
<110>阿罗姆斯公司
<120>用于检测气味、香味和味道的生物传感器
<130>arx.0007
<140>pct/us2017/019179
<141>2017-02-23
<150>us62/299,005
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