用于癌症治疗的AXL特异性抗体药物缀合物的制作方法

本发明涉及结合至人axl的抗体-药物缀合物(adc)，其用于治疗用途，特别是与至少一种治疗剂组合治疗黑色素瘤。
背景技术：
axl是一种104-140kda跨膜蛋白，其属于哺乳动物受体酪氨酸激酶(rtks)的tam亚家族，且具有转化能力(paccez等人,2014)。在各种癌症(包括胃癌、前列腺癌、卵巢癌和肺癌)中已报道了axl的增强或从头表达(paccez等人,2014)。值得注意的是，已发现对酪氨酸激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂和/或化学疗法具有抗性的几种癌症显示出axl蛋白的增强或从头表达(wilson等人,2014;brand等人,2015;zhang等人,2012;blakely等人,2012)。特别是，对丝氨酸/苏氨酸激酶b-raf(braf)、mek和erk(mek也是酪氨酸激酶)抑制剂具有抗性的黑色素瘤细胞显示出增强的或从头的axl表达(müller等人,2014;konieczkowski等人,2014)。braf、mek和erk都是丝裂原活化蛋白激酶(mapk)途径的一部分。大多数恶性黑色素瘤在braf或nras中具有致癌突变，这可导致组成型活性mapk途径(sullivan等人,2016)。axl细胞外结构域由两个膜-远端n-末端免疫球蛋白(ig)样结构域(ig1和ig2结构域)和两个膜-近侧纤连蛋白iii型(fniii)重复(fn1-和fn2-结构域)的组合构成(paccez等人,2014)。axl可以在结合其配体，维生素k依赖性生长停滞特异性因子6(gas6)后被活化。gas6结合至axl导致axl二聚化、自磷酸化以及后续的细胞内信号传导途径的活化，如pi3k/akt、丝裂原活化蛋白激酶(mapk)、stat和nf-κb级联(leconet等人,2013)。在癌细胞中，axl表达已经与肿瘤细胞运动性、侵袭、迁移相关，并且参与上皮至间质转化(emt)(linger等人,2010)。已经描述了抗axl抗体，其通过下调受体表达、降低肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡来减弱nsclc和乳腺癌异种移植物的体内生长(li等人等人,2009；ye等人,2010；wo2011/159980,genentech)。也已报道了各种其它抗axl抗体(leconet等人,2013；iida等人,2014；wo2012/175691,inserm；wo2012/175692,inserm；wo2013/064685,pierrefabrémedicaments；wo2013/090776,inserm；wo2009/063965,chugaipharmaceuticals，wo2010/131733和wo2016/005593)，包括基于抗axl抗体和吡咯并苯并-二氮杂䓬(pbd)二聚体的adc(wo2014/174111,pierrefabrémedicament和spirogensarl)。然而，仍然需要改进的基于axl-adc的治疗黑色素瘤的方法，特别是考虑到对mapk抑制剂的抗性。发明概述本发明人已发现，基于抗axl抗体的adc(本文也称为“axl-adc”)可与一种或多种mapk途径的抑制剂组合用于有效治疗黑色素瘤。因此，在一个方面，本发明涉及包含结合至人axl的抗体的adc，其用于与一种或多种mapk途径的抑制剂组合治疗黑色素瘤。在一个实施方案中，一种或多种mapk途径的抑制剂包含braf抑制剂、mek抑制剂、erk抑制剂或其任何两种或更多种的组合。adc和一种或多种抑制剂可以例如同时、分开或顺序施用。在一个方面，本发明涉及包含结合至人axl的抗体的adc，其用于与braf抑制剂和mek抑制剂组合治疗黑色素瘤。adc、braf抑制剂和mek抑制剂可以例如同时、分开或顺序施用。在一个方面，本发明涉及治疗受试者的黑色素瘤的方法，该方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，和(ii)一种或多种mapk途径的抑制剂，其中adc和一种或多种抑制剂以治疗有效量同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，一种或多种mapk途径的抑制剂包含braf抑制剂、mek抑制剂、erk抑制剂或其任何两种或更多种的组合。在一个方面，本发明涉及治疗受试者的黑色素瘤的方法，该方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc；(ii)braf抑制剂；和(iii)mek抑制剂；其中adc、braf抑制剂和mek抑制剂以治疗有效量同时、分开或顺序施用。这些和其它方面和实施方案，包括使用基于特征在于其抗原结合特性或序列的抗axl抗体的axl-adc，适用于此类adc的治疗性部分，此类adc与某些治疗剂的组合，和治疗黑色素瘤的相关方法，在下面进一步详细描述。实际上，涉及根据本发明与一种或多种抑制剂组合用于治疗黑色素瘤的axl-adc的每个方面或实施方案同样适用于涉及通过施用axl-adc和一种或多种抑制剂治疗黑色素瘤的方法的方面或实施方案，反之亦然。此外，如本文任何方面或实施方案中所定义的任何axl-adc可以与一种或多种mapk途径的抑制剂组合使用，例如，如本文所述的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。附图说明图1.抗axl抗体与用以下转染的hek293细胞的结合曲线：(a)人axl-ecd，(b)食蟹猴axl-ecd，或(c)小鼠axl-ecd。所显示的数据是一个代表性实验的平均荧光强度(mfi)，如实施例2中所述。图2.抗axl抗体与小鼠-人axl嵌合体的结合如实施例3中所述进行。测试了以下智人axl(hsaxl)和小家鼠axl(mmaxl)嵌合蛋白：(a)hsaxl和模拟物，(b)hsaxl-mmecd，(c)hsaxl-mmig1，(d)hsaxl-mmig2，(e)hsaxl-mmfn1，(f)hsaxl-mmfn2。图3.在a431细胞中，抗axl抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。如实施例4中所述测定了在a431细胞中由抗axl抗体引起的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。图4.axl抗体-药物缀合物(axl-adc)的结合特性。如实施例5中所述测定了axl-adc与用人axl瞬时转染的hek293t细胞的结合。所显示的数据是一个代表性实验的平均荧光强度(mfi)。图5.由axl抗体-药物缀合物诱导的体外细胞毒性。如实施例6中解释的，测定了由axl抗体-药物缀合物诱导的细胞毒性。图6.允许结合至axl的抗体vh和vl变体。比对了具有相同vl或vh区的抗体，并且分别鉴定了vh(图a-d)或vl(图e)序列中的差异并在图中用方框标明。cdr区用下划线标明。图7.如实施例8中所述测定了lclc-103h细胞中由adc诱导的细胞毒性。图8.如实施例9中所述，在治疗性lclc-103h异种移植模型中mmae缀合的axl抗体的抗肿瘤活性。图9.如实施例10中所述，使用axl单克隆抗体的集合进行冷冻paxf1657肿瘤切片(胰腺癌pdx模型)的免疫组织化学染色。图10.(a)用axl-adc治疗性处理后的平均肿瘤尺寸(paxf1657模型)。未缀合的axlhumab(c)和未靶向的adc(d)未显示出抗肿瘤活性，表明axl-adc的治疗能力依赖于mmae的细胞毒性活性并且依赖于靶向结合，误差线表示s.e.m.。图11.抗axl抗体与小鼠-人axl嵌合体的结合如实施例11中所述进行。测试了以下智人axl(hsaxl)和小家鼠axl(mmaxl)嵌合蛋白：(a)hsaxl和模拟物，(b)hsaxl-mmecd，(c)hsaxl-mmig1，(d)hsaxl-mmig2，(e)hsaxl-mmfn1，(f)hsaxl-mmfn2。图12.人gas6(hgas6)在a431细胞上的结合，所述细胞已经与结合至axl的ig1结构域的抗体预孵育。所显示的数据是一个代表性实验的平均荧光强度(mfi)。图13.如实施例13中所述，在治疗性a431异种移植模型(其产生高水平的内源性gas6)中mmae缀合的axl抗体的抗肿瘤活性。图板a和b显示来自2个独立实验的结果。图14.如实施例13中所述，在治疗性lclc-103h异种移植模型(其表达低水平的内源性gas6)中mmae缀合的axl抗体的抗肿瘤活性。图板a和b显示来自2个独立实验的结果。图15.如实施例8中所述测定了a431细胞(a)和mda-mb231细胞(b)中axl-adc对细胞毒性的诱导。图16.甲状腺癌、食道癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌和子宫内膜癌中的axl染色。将axl阳性细胞的平均axl染色强度(od)绘制在x-轴上，而将axl阳性肿瘤细胞的百分比绘制在y-轴上。每个点代表源自个体患者的一个肿瘤核心。图17.指示不同肿瘤的经axl免疫染色的肿瘤核心的代表性实例。图18.axl抗体特异性结合axl而非其它tam受体家族成员。humab-axl抗体与用以下转染的hek293细胞的结合：人axl(a)，人mer(b)，人tyro3(c)，或与未转染的hek293细胞的结合(d)。为了确认经转染细胞的正确表达，将未转染的hek293f细胞和用axl(e)、mer(f)或tyro3(g)转染的细胞用mer特异性抗体和tyro3特异性抗体染色。所显示的数据是一个代表性实验的平均荧光强度(mfi)，如实施例15中所述。图19.在肿瘤细胞系的质膜上的axl抗体的检测，所述肿瘤细胞系已经与axl抗体在4℃孵育1小时，然后在4℃或37℃孵育过夜。在mda-mb-231细胞(a和b)和calu-1细胞(c和d)两者中，相比已在37℃孵育的细胞，在已在4℃孵育的细胞的质膜上检测到更多的抗体，说明在37℃下膜结合抗体的内化。图20.与axl抗体(其已与fab-tamra/qsy7复合)孵育后lclc-103h细胞的几何平均荧光强度。包括单独的igg1-b12和fab-tamra/qsy7作为阴性对照。图21.在建立的黑色素瘤细胞系和患者来源的低传代原发性黑色素瘤细胞系(pdx)中的axl表达。(a)在建立的黑色素瘤细胞系中观察到可变水平的axl表达。在plx4720抗性细胞系(a375-r、skmel28r、skmel147)中观察到增强的或从头axl表达。(b)在8/15种患者来源的原发性黑色素瘤细胞系中观察到axl表达。在建立的黑色素瘤细胞系和低传代pdx培养物中，axl表达与mitf表达负相关。图22.细胞表面上的axl蛋白表达。通过定量流式细胞术在axl阴性和axl阳性黑色素瘤细胞系中测定的axl表达的实施例。浅灰色曲线代表用axl特异性抗体染色，而深灰色曲线代表用同种型对照抗体染色。图23.建立的黑色素瘤细胞系对igg1-axl-107-vcmmae的敏感性。黑色素瘤细胞系(a-f；cdx)用igg1-axl-107-vcmmae或同种型对照adcigg1-b12-vcmmae处理5天，一式三份。细胞活力用celltiter-glo测定法评估并针对adc浓度绘图。图24.原代黑色素瘤细胞培养物对igg1-axl-107-vcmmae的敏感性。低传代原代黑色素瘤细胞系(a-c；pdx)用igg1-axl-107-vcmmae或同种型对照adcigg1-b12-vcmmae处理8天，一式三份。细胞活力用celltiter-glo测定法评估并针对adc浓度绘图。图25.igg1-axl-107-vcmmae在黑色素瘤模型skmel147中的抗肿瘤功效。显示了用igg1‐b12、igg1‐b12‐vcmmae、igg1-axl-107或igg1-axl-107-vcmmae治疗性处理后的平均肿瘤尺寸(a)。(b)中显示了观察的(n=2)或用igg1-axl-107-vcmmae再次处理(n=4)的igg1-axl-107-vcmmae小鼠中的肿瘤尺寸。图26.将skmel28野生型细胞(红色)和plx4720抗性的skmel28-r细胞(绿色)1:1混合并用igg1-axl-107-vcmmae(axl-adc)、igg1-b12-mmae(b12-adc)、plx4720(plx)、达拉菲尼(dabr)、曲美替尼(tram)或所示的组合处理。(a)相对于未处理的细胞的细胞总数。(b)对应于skmel28-r/skmel28细胞比率的gfp/mcherry比率。图27.在原发性黑色素瘤样品中通过免疫组织化学检测的axl表达的实施例。(a)具有阳性+++axl染色强度的黑色素瘤的实施例，(b)具有+和++之间的阳性axl染色强度的黑色素瘤的实施例，(c)来自同一患者的用威罗菲尼治疗前后的黑色素瘤组织中axl表达的实施例；左侧=威罗菲尼前，axl染色强度弱+；右侧=威罗菲尼后，axl染色强度弱+至++，(d)在原发性黑色素瘤组织内具有++强度的异源axl表达的实施例。图28.ig1-axl-107-vcmmae在黑色素瘤异种移植模型m019r中的治疗效果，其在实施例18和19中描述。(a)用igg1-axl-107-vcmmae、igg1-b12-vcmmae或达拉菲尼加曲美替尼治疗后的平均肿瘤尺寸。(b)肿瘤细胞接种后第33天个体小鼠的肿瘤尺寸。****，p<0.0001。(c)如所示的，用dab/tram进行初始治疗30天后，用达拉菲尼加曲美替尼(dab/tram)、igg1-axl-107-vcmmae或dab/tram和igg1-axl-107-vcmmae三重组合再治疗的各组的kaplan-meyer图示。图29.igg1-axl-107-vcmmae在黑色素瘤异种移植模型m009r中的治疗效果，其在实施例18和20中描述。(a)用igg1-b12-vcmmae(对照adc)、igg1-axl-107-vcmmae、igg1-b12-vcmmae加达拉菲尼加曲美替尼，或igg1-axl-107-vcmmae加达拉菲尼加曲美替尼治疗性治疗后的平均肿瘤尺寸。(b)第一次治疗后第14天个体小鼠的肿瘤尺寸。**，p<0.01；***，p<0.001。图30.在nras-突变黑色素瘤细胞系中由igg1-axl-107-vcmmae诱导的体外细胞毒性。如实施例21中所解释的，测定axl抗体-药物缀合物的细胞毒性诱导。图31.通过免疫组织化学测定axl在nras突变黑色素瘤组织中的表达。如实施例22中所述，基于axl阳性肿瘤细胞的百分比和axl阳性肿瘤细胞的染色强度(1+，2+，3+)计算每个样品中的h评分。发明详述本发明至少部分基于以下令人惊讶的发现：在对braf抑制剂具有抗性的黑色素瘤的体内肿瘤模型中，axl-adc、braf抑制剂(达拉菲尼)和mek抑制剂(曲美替尼)的三重组合比例如单独的axl-adc，单独的braf和mek抑制剂的组合(实施例19)，或braf和mek抑制剂与对照adc的组合(实施例20)更有效。即使当黑色素瘤模型对用axl-adc作为单一药剂体外(以1μg/ml)或体内的治疗不敏感时也是如此(实施例20)。此外，braf抑制剂敏感性黑色素瘤细胞和braf抑制剂(plx4720)抗性黑色素瘤细胞混合物的体外研究表明，axl-adc和braf抑制剂(plx4720或达拉菲尼)的组合或axl-adc、braf抑制剂(达拉菲尼)和mek抑制剂(曲美替尼)的三重组合根除了braf抑制剂敏感和braf抑制剂抗性细胞二者(实施例17)。最后，在来自晚期nras突变黑色素瘤患者的10个肿瘤样品中的9个中，在至少一部分肿瘤细胞中检测到axl表达(实施例22)。这里报道的这些和其它结果表明axl-adc与一种或多种mapk途径激酶抑制剂例如激酶braf、mek和erk抑制剂的组合适用于治疗黑色素瘤。治疗应用本发明提供了axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与一种或多种mapk途径的激酶抑制剂，例如一种或多种丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶抑制剂组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，一种或多种丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶抑制剂选自braf抑制剂、mek抑制剂和braf抑制剂与mek抑制剂的组合。axl-adc和抑制剂可以同时、分开或顺序施用。然而，通常，根据不同的剂量方案，它们分开施用。本文描述了剂量方案的实例。然而，基于本公开内容和本领域技术水平，本领域技术人员(例如，医师)可以设想和实施其它合适的剂量方案。本文所用的“map激酶途径抑制剂”、“mapk途径抑制剂”、“mapk途径的抑制剂”或“mapk抑制剂”是指化合物，通常是药物化合物，其抑制mapk途径中的至少一种酶，导致其丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性的阻断。mapk途径是众所周知的细胞内信号传导途径，其由一系列蛋白质组成，所述蛋白质将来自细胞表面上的酪氨酸激酶受体的信号传递至细胞核中的dna。该途径的激活涉及许多丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶的后续磷酸化。这些通常被命名为mapkkk(例如，raf)、mapkk(例如，mek)和mapk(例如，erk)。raf蛋白激酶家族包括丝氨酸/苏氨酸激酶a-raf、b-raf(braf)和c-raf，它们共享ras作为共同的上游激活剂。mek1和mek2是双特异性激酶，催化例如erk1和erk2上的酪氨酸和苏氨酸两者的磷酸化。erk1和erk2反过来催化细胞质和核底物的磷酸化。mapk途径的一种或多种酶的抑制剂是已知的和/或在临床开发中用于治疗黑色素瘤和其它恶性肿瘤(参见例如表1和其中引用的参考文献)。mapk途径抑制剂的实例列于表1中，并包括丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶braf、mek和erk的抑制剂。本文所用的“丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂”或“s/thki”是指化合物，通常是药物，其至少抑制丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶例如braf、mek或erk的丝氨酸/苏氨酸激酶活性。丝氨酸/苏氨酸激酶是负责丝氨酸或苏氨酸残基的羟基磷酸化的酶，这是s/thkis直接或间接抑制的步骤。丝氨酸或苏氨酸的磷酸化导致细胞内信号转导级联的激活。可用于癌症治疗的s/thkis及其靶标的实例显示在下表1中，并且包括braf抑制剂例如威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼及其类似物或衍生物，和mek抑制剂例如曲美替尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib及其类似物和衍生物。在一个实施方案中，本文所用的术语“丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂”是指特异性抑制丝氨酸/苏氨酸激酶的蛋白质磷酸化活性，例如mek、erk、braf和/或其突变体(例如，brafv600突变体)的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的化合物。本文所用的“丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶抑制剂”或“s/th/tki”是指化合物，通常是药物，其抑制具有两种激酶活性的激酶例如mek的丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶活性的一种或两种。本文所用的“braf抑制剂”或“brafi”是人braf(uniprotkb-p15056(braf_human)的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的抑制剂，任选地也是其突变体和/或其同种型的抑制剂。在一个实施方案中，braf抑制剂抑制人braf的一种或多种突变体的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，例如在残基v600、l597或k601中具有突变的那些，例如v600e。例如，brafi可比它们抑制天然人braf更有效抑制突变brafi的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，因此对突变braf(本文中也称为“mutbrafi”)具有选择性。在另一个实施方案中，braf抑制剂抑制a-raf(uniprotkbp10398(araf_human))和c-raf(uniprotkbp04049(raf1_human))和/或其突变体的一种或两种的丝氨酸/苏氨酸激酶活性(在本文中也称为“raf抑制剂”或“泛-raf抑制剂”或“泛-rafi)。表1中列出了braf抑制剂的优选但非限制性的实例。本文所用的“mek抑制剂”或“meki”是mek1(uniprotkbq02750(mp2k1_human))、mek2(uniprotkbp36507(mp2k2_human))或两者的至少丝氨酸/苏氨酸激酶活性、酪氨酸激酶活性或两者，并且还可以或可选地抑制其它mek蛋白，例如mek5(uniprotkbq13163(mp2k5_human))的抑制剂。除非与上下文相矛盾，否则当本文提及mek的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂或s/thki时，抑制剂还可任选地抑制mek的酪氨酸激酶活性。优选地，mek抑制剂抑制mek1、mek2或两者的丝氨酸/苏氨酸激酶活性。表1中列出了braf抑制剂的优选但非限制性实例。本文所用的“erk抑制剂”是erk1(uniprotkbp27361(mk03_human))、erk2(uniprotkbp28482(mk01_human))或两者的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的抑制剂。erk抑制剂可以特异性地抑制erk1和erk2中的一种或多种，并且还可以或可选地特异性地抑制其它erk同种型。优选地，erki抑制erk1和erk2中至少一种的丝氨酸/苏氨酸激酶活性。表1中列出了erk抑制剂的优选但非限制性实例。表1-mapk途径抑制剂的实例在一个方面，本发明提供axl-adc，其包含结合至人axl的抗体，例如humax-axl-adc，用于与一种或多种mapk途径的抑制剂组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个实施方案中，一种或多种抑制剂包含表1中列出的抑制剂。优选地，根据本发明使用的抑制剂选自braf抑制剂、mek抑制剂和erk抑制剂。在一个具体实施方案中，一种或多种抑制剂由表1中列出的抑制剂组成，例如braf、mek或erk抑制剂。或者，在本文的任何方面或实施方案中，axl-adc可以与选自braf抑制剂、mek抑制剂和erk抑制剂的两种或更多种抑制剂组合使用，例如与braf抑制剂和mek抑制剂；braf抑制剂和erk抑制剂；mek抑制剂和erk抑制剂；或braf抑制剂、mek抑制剂和erk抑制剂组合。在一个具体实施方案中，两种或更多种抑制剂中的至少一种是表1中列出的抑制剂。在另一具体实施方案中，axl-adc与选自braf抑制剂、mek抑制剂和erk的两种抑制剂组合使用，例如其中两种抑制剂选自表1中列出的抑制剂。在一个实施方案中，一种或多种mapk途径的抑制剂包含braf抑制剂或由braf抑制剂组成。在一个具体实施方案中，braf抑制剂选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼、plx4720、gdc-0879、raf265、sb590885、az628或其任何治疗有效的类似物或衍生物。在另一个实施方案中，braf抑制剂选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼或其任何治疗有效的类似物或衍生物。优选地，braf抑制剂是威罗菲尼、达拉菲尼或其任何治疗有效的类似物或衍生物。在一个优选的实施方案中，braf抑制剂是威罗菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，braf抑制剂是威罗菲尼。威罗菲尼(plx4032)是一种braf激酶的口服生物可利用的、atp竞争性的小分子抑制剂，它特别结合并抑制例如包含某些突变的braf，例如但不限于残基v600(例如v600e)、残基l597(例如l597r;bahadoran等人，2013)和残基k601(dahlman等人，2012)中的氨基酸取代。在无细胞测定中，例如，在本文或在bollag等人，2010(其通过引用以其整体结合)所述的测定中，威罗菲尼可以例如具有约31nm的抑制braf(v600e)激酶活性的ic50。在另一个优选的实施方案中，braf抑制剂是达拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，braf抑制剂是达拉菲尼。达拉菲尼是braf激酶的抑制剂，其特别结合并抑制包含某些突变的braf，例如但不限于v600中的突变，例如v600e。在无细胞测定中，例如，在本文或在laguerre等人，2009(其通过引用以其整体结合)所述的测定中，达拉菲尼可以具有例如约0.8nm的抑制braf(v600e)激酶活性的ic50。在另一个优选的实施方案中，braf抑制剂是encorafenib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，braf抑制剂是encorafenib。encorafenib是braf激酶的抑制剂，其特别结合并抑制包含某些突变的braf，例如但不限于v600e。在无细胞测定中，例如，在本文或在stuart等人，2012(其通过引用以其整体结合)所述的测定中，encorafenib可以例如具有约4nm的抑制braf(v600e)激酶活性的ic50。在另一个优选的实施方案中，braf抑制剂是索拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，braf-抑制剂是索拉菲尼。索拉菲尼是braf激酶的抑制剂，其特别结合并抑制braf。在无细胞测定中，例如，在本文或在wilhelm等人，2004(其通过引用以其整体结合)所述的测定中，索拉菲尼可以例如具有约22nm的抑制braf激酶活性的ic50。在一个实施方案中，brafi选自ab-024、tak-580、bal-3833和bgb-283或其任何治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，一种或多种mapk途径的抑制剂包含mek抑制剂或由其组成。在一个实施方案中，mek抑制剂是曲美替尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib、refametinib、pimasertib、u0126-etoh、pd184352、bix02189或其任何治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，mek抑制剂是曲美替尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib、refametinib、pimasertib、u0126-etoh、pd184352或其任何治疗有效的类似物或衍生物。优选地，mek抑制剂是曲美替尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib或其任何治疗有效的类似物或衍生物。最优选地，mek抑制剂是曲美替尼或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，mek抑制剂是曲美替尼。曲美替尼是一种mek1/2抑制剂，在无细胞测定中，对于mek1和mek2的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性的抑制，其分别可以例如具有约0.92nm和1.8nm的ic50，例如，在本文或在yamaguchi等人，2011(其通过引用以其整体结合)中描述。在一个实施方案中，mek抑制剂是binimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物，例如binimetinib。binimetinib是一种mek1/2抑制剂，在无细胞测定中，对于mek1和mek2的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性的抑制，其可以例如具有约12nm的ic50，例如，在本文或在pheneger等人，2006(其通过引用以其整体结合)中描述。在一个实施方案中，mek抑制剂是cobinimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物，例如cobinimetinib。cobimetinib是一种mek1抑制剂，在无细胞测定中，对于mek1的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性的抑制，其可以例如具有约4.2nm的ic50，例如，在本文或在hoeflich等人，2012(其通过引用以其整体结合)中描述。在一个实施方案中，mek抑制剂是selumetinib或其治疗有效的类似物或衍生物，例如selumetinib。selumetinib是一种mek1抑制剂，在无细胞测定中，对于mek1的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性的抑制，其可以例如具有约14nm的ic50，例如，在本文或在huynh等人，2007(其通过引用以其整体结合)中描述。在一个实施方案中，一种或多种mapk途径的抑制剂包含erk抑制剂或由其组成。在一个实施方案中，erk抑制剂是ltt-462、ulixertinib(bvd-523)、vtx11e、sch772984或其任何治疗有效的类似物或衍生物。uxixertinib是一种erk1/2抑制剂，在无细胞测定中，例如，在本文或在ward等人，2015(其通过引用以其整体结合)所述的测定中，其可以例如具有约<0.3nm的抑制mek2激酶活性的ic50。如本文所用，药物的“衍生物”是从参比药物通过直接化学反应衍生或可衍生的化合物。如本文所用，参比药物的“类似物”或“结构类似物”是与药物具有相似结构和/或作用机制但在至少一个结构元件上不同的化合物。参比药物(例如，威罗菲尼、达拉菲尼或曲美替尼)的“治疗活性的”或“治疗有效的”类似物或衍生物与药物相比具有相似或改善的治疗功效，但可以在例如稳定性、靶特异性(即，其抑制哪种类型的激酶)、选择性(即，其抑制的激酶的同种型或突变体)、抑制活性、溶解度、毒性等的一个或多个中不同。表1显示了braf、mek、erk等抑制剂，它们具有相似的特异性(分别是braf、mek、erk等抑制作用)、相似的选择性或在其作用机制中具有其它相似性。在一个具体实施方案中，根据本发明的激酶抑制剂(例如，丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂)的类似物或衍生物在合适的测定中在抑制激酶活性方面与参比药物具有相同或相似的激酶特异性，以及任选选择性，和类似或改善的ic50。例如，在合适的测定中类似物或衍生物可具有这样的ic50，其为参比药物的ic50的小于约1000％，例如小于约300％，例如小于约200％，例如小于约120％，例如小于约100％，例如小于约80％，例如小于约50％，和任选地，大于约1％，例如大于约10％，约20％或约40％。或者，在合适的测定中，类似物或衍生物可具有小于约5μm的ic50，例如小于约1μm，例如小于约500nm，例如小于约200nm，例如小于100nm，例如小于约50nm，例如0.01nm至1μm，0.05nm至200nm，或0.1nm至100nm之间。用于测量蛋白激酶抑制剂的特异性、选择性和活性的合适测定法是本领域众所周知的(参见例如，lynette等人2009和uitdehaag2012)。例如，本文所述的例如威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib或索拉菲尼的braf抑制剂类似物或衍生物的braf抑制活性；如本文所述的例如曲美替尼、conimetinib、binimetinib或selumetinib的mek抑制剂类似物或衍生物的mek抑制活性；或者如本文所述的例如vtx11e或ltt-462或ulixertinib的erk抑制剂的类似物或衍生物的erk抑制活性可以在tsai等人(procnatlacadsciusa.2008feb26;105(8):3041–3046)描述的测定法中评估，其通过引用以其整体结合。具体地，根据制造商的说明，使用z'-lyte生化测定形式(selectscreen;invitrogen)，可分析所选择激酶、激酶变体和/或激酶同种型被类似物或衍生物(与母体药物相比)的抑制。简言之，braf突变体(例如braf(v600e))的brafi(例如威罗菲尼或达拉菲尼)的ic50值可通过raf激酶活性测量来确定，例如，如下：野生型raf和突变体的激酶活性通过测量生物素化的bad蛋白(bcl2-相关的细胞死亡激动剂)的磷酸化来测定。对于每种酶(0.01ng)，在20mmhepes(ph7.0),10mmmgcl2,1mmdtt,0.01%(v/v)tween-20,50nm生物素-bad蛋白质和1mmatp中在室温下进行20μl反应。用5μl含有20mmhepes(ph7.0)，200mmnacl，80mmedta，0.3％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)的溶液在5分钟时终止反应。终止溶液还包括磷酸-bad(ser112)抗体、链霉抗生物素蛋白包被的供体珠和蛋白a受体珠。将抗体和珠在室温下在黑暗中在终止溶液中预孵育30分钟。抗体的最终稀释度为1/2000，各珠的最终浓度为10μg/ml。将测定板在室温下孵育1小时，然后在perkinelmeralphaquest读数器上读数。突变体活性是在三个不同实验中一式两份测定的两个不同批次的纯化蛋白的平均值。或者，代替测定绝对ic50值，可以使用参比化合物(例如，威罗菲尼或达拉菲尼)作为对照，并且可以计算与参比药物相比的相对抑制活性，通常以％表示。简言之，mek例如mek1的meki(例如曲美替尼)的ic50值可以通过mek激酶活性测量来测定，例如，如下：抗mek1抗体用于免疫沉淀mek1分子。mek激酶活性测量为免疫分离的mek1在使用mbp(髓鞘碱性蛋白)作为测定的终点的偶联测定中活化重组erk1的能力。磷酸化的mbp在14％sds-page凝胶上分离并真空干燥，然后暴露于x射线胶片。或者，代替测定绝对ic50值，可以使用参比化合物(例如，曲美替尼)作为对照，并且可以计算与参比药物相比的相对抑制活性，通常以％表示。还可以使用比mbp更特异性的底物，例如纯化的重组rsk、mnk或elk1和根据该蛋白质上的磷酸化位点制备的肽。在一个方面，本发明提供了用于以下治疗受试者的黑色素瘤的方法的axl-adc，该方法包括施用axl-adc与至少一种作为丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂的治疗剂组合，其中adc和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，所述至少一种治疗剂由s/thki组成或包含s/thki，所述s/thki是braf抑制剂、mek抑制剂或其组合。在一个实施方案中，s/thki是braf抑制剂，例如威罗菲尼(plx4032)或其治疗有效的衍生物或类似物，例如plx4720或达拉菲尼；或vtxkiie。在一个实施方案中，s/thki是mek抑制剂，例如selumetinib(azd6244)或曲美替尼。在一个实施方案中，axl-adc用于与一种或多种s/thki组合治疗黑色素瘤的方法，所述s/thki选自braf抑制剂、mek抑制剂或erk抑制剂或其任何两种或更多种的组合。在一个实施方案中，所述一种或多种s/thki包含braf抑制剂，例如威罗菲尼(plx4032)、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼或其治疗有效的衍生物或类似物，例如plx4720。在一个实施方案中，所述一种或多种s/thki包含mek抑制剂，例如曲美替尼、cobimetinib、binimetinib或selumetinib(azd6244)或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，所述一种或多种s/thki包含erk抑制剂，例如vtxkiie、ltt-462或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，所述一种或多种s/thki由braf抑制剂组成，例如威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib或索拉菲尼。在一个实施方案中，所述至少一种s/thki由mek抑制剂组成，例如曲美替尼、cobimetinib、binimetinib或selumetinib。在一个实施方案中，一种或多种s/thki由erk抑制剂组成，例如ulixertinib、vtxiie、sch772984或ltt-462。以下是根据本文任何方面或实施方案治疗黑色素瘤的具体实施方案：在一个具体实施方案中，s/thki是威罗菲尼。在一个具体实施方案中，s/thki是达拉菲尼。在一个具体实施方案中，s/thki是encorafenib。在一个具体实施方案中，s/thki是索拉菲尼。在一个具体实施方案中，s/thki是曲美替尼。在一个具体实施方案中，s/thki是cobimetinib。在一个具体实施方案中，s/thki是binimetinib。在一个具体实施方案中，s/thki是selumetinib。在一个具体实施方案中，s/thki是ulixertinib。在一个具体实施方案中，s/thki是vtxkiie。在一个具体实施方案中，s/thki是ltt-462。在一个具体实施方案中，s/thki是plx4720。如实施例19和20中所述，humax-axl-adc、braf抑制剂和mek抑制剂的组合有效治疗体内抗性braf突变体黑色素瘤模型。因此，在一个方面，本发明提供axl-adc，其包含结合至人axl的抗体，例如humax-axl-adc，用于与mapk途径的两种抑制剂组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个实施方案中，两种抑制剂中的至少一种(本文中称为“第一”和“第二”抑制剂)，任选地两者，选自表1中列出的抑制剂，或其治疗有效的类似物或衍生物。例如，在单独的实施方案中，第一抑制剂选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼、曲美替尼、cometinib、binimetinib、selumetinib、ltt-462、ulixertinib、sch772984和vtxkiie，和第二抑制剂独立地选自表1中第一抑制剂之外的其它抑制剂。更优选地，第一抑制剂和第二抑制剂均选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼、曲美替尼、cometinib、binimetinib、selumetinib、ltt-462、ulixertinib、sch772984和vtxkiie。优选地，根据本发明使用的第一和第二抑制剂均独立地选自braf、mek和erk抑制剂。更优选地，第一和第二抑制剂的组合选自braf抑制剂和mek抑制剂，braf抑制剂和erk抑制剂，mek抑制剂和erk抑制剂。最优选地，axl-adc用于与braf和mek抑制剂组合治疗黑色素瘤。在一个实施方案中，第一抑制剂是braf抑制剂，和第二抑制剂是选自曲美替尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib的mek抑制剂或其任何类似物或衍生物。在一个实施方案中，第一抑制剂是braf抑制剂，和第二抑制剂是选自vtxkiie和ltt-462的erk抑制剂或其任何类似物或衍生物。在一个实施方案中，第一抑制剂是mek抑制剂，和第二抑制剂是选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib和索拉菲尼的braf抑制剂或其任何类似物或衍生物。在一个实施方案中，第一抑制剂是mek抑制剂，和第二抑制剂是选自vtxkiie和ltt-462的erk抑制剂或其任何类似物或衍生物。在一个实施方案中，第一抑制剂是erk抑制剂，和第二抑制剂是选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼的braf抑制剂或其任何类似物或衍生物。在一个实施方案中，第一抑制剂是erk抑制剂，和第二抑制剂是选自曲美替尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib的mek抑制剂或其任何类似物或衍生物。在一个实施方案中，axl-adc用于与braf抑制剂和选自(a)至(p)的mek抑制剂的组合，组合治疗受试者中的黑色素瘤：(a)威罗菲尼和曲美替尼；(b)威罗菲尼和cobimetinib；(c)威罗菲尼和binimetinib；(d)威罗菲尼和selumetinib；(e)达拉非尼和曲美替尼；(f)达拉非尼和cobimetinib；(g)达拉非尼和binimetinib；(h)达拉非尼和selumetinib；(i)encorafenib和曲美替尼；(j)encorafenib和cobimetinib；(k)encorafenib和binimetinib；(l)encorafenib和selumetinib；(m)索拉菲尼和曲美替尼(n)索拉菲尼和cobimetinib；(o)索拉菲尼和binimetinib；或(p)索拉菲尼和selumetinib。在一个具体实施方案中，(a)至(p)中任一项的braf抑制剂是指定braf抑制剂的治疗有效的类似物或衍生物。在一个具体实施方案中，(a)至(p)中任一项的mek抑制剂是指定mek抑制剂的治疗有效的类似物或衍生物。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与威罗菲尼和曲美替尼组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与威罗菲尼和cobimetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与威罗菲尼和binimetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与威罗菲尼和selumetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与达拉非尼和曲美替尼组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与达拉非尼和cobimetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与达拉非尼和binimetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与达拉非尼和selumetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与encorafenib和曲美替尼组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与encorafenib和cobimetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与encorafenib和binimetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与encorafenib和selumetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与索拉菲尼和曲美替尼组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与索拉菲尼和cobimetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与索拉菲尼和binimetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。在一个具体实施方案中，本发明提供包含结合至人axl的抗体的axl-adc，例如humax-axl-adc，用于与索拉菲尼和selumetinib组合治疗受试者的黑色素瘤。这些实施方案中的每一个都可以备选地表述为治疗受试者的黑色素瘤的方法，包括施用axl-adc与指定的抑制剂组合，通常为治疗有效量。如本文所用，术语“受试者”通常是向其施用axl-adc和一种或多种mapk途径抑制剂的人，通常是诊断为患有黑色素瘤或有风险发展黑色素瘤的人类患者。在一些实施方案中，受试者早先未经历用mapk途径抑制剂治疗黑色素瘤，例如用braf抑制剂、mek抑制剂或erk抑制剂。在其它实施方案中，受试者已经正在经历或早先经历用一种或多种mapk途径抑制剂治疗黑色素瘤，例如那些一种或多种mapk途径抑制剂，例如丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，用于与根据本发明的axl-adc组合。如本文所示，黑色素瘤中抗性的发展已经与axl的增加或从头表达相关(参见例如实施例17和21)。例如，对威罗菲尼、达拉菲尼和曲美替尼中的一种或多种的抗性可能与肿瘤细胞从头或增强的axl表达相关。因此，黑色素瘤适宜用这些和其它mapk途径抑制剂和axl特异性adc的组合进行治疗。根据已确定的黑色素瘤分级标准，黑色素瘤可以是i期、ii期、iii期或iv期黑色素瘤，这是本领域公知的。在一些实施方案中，根据本文的任何方面或实施方案待治疗的黑色素瘤是iv期黑色素瘤。在一些实施方案中，黑色素瘤在braf中具有突变，从而通过一种或多种braf抑制剂提供突变braf的激酶活性的抑制。人类癌症(例如黑色素瘤)中鉴定的braf突变通常位于n叶富含甘氨酸的p环和激酶区域内的激活区段和侧翼区域，通常导致表达突变braf激酶的肿瘤细胞中过度激活的mapk信号传导途径下游。在braf中，这种突变的特定残基包括但不限于v600(例如v600e、v600k、v600d、v600r)、残基l597(例如l597r)；和残基k601(k601e)。在一个实施方案中，突变是v600。在一个实施方案中，braf中的突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。在一个具体实施方案中，突变是v600e。鉴定此类braf突变的方法是本领域熟知的，参见例如实施例和colombino等人(2012年)。具有这种braf突变的黑色素瘤特别适用于本发明的任何方面或实施方案，其包括brafi，特别是mutbrafi，例如威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib及其任何类似物或衍生物。在一些实施方案中，黑色素瘤在nras中具有突变(uniprotkb-p01111(rasn_human))。这种突变在本领域中是众所周知的(参见例如colombino等人，2012)。例如，突变可以是组成型激活mapk途径的突变(本文称为“活化”突变)，其可以是致癌突变。非限制性突变包括氨基酸取代、缺失或插入；优选地，突变是氨基酸取代。这种突变的特定残基包括但不限于q61(例如q61r、q61k和q61l)、g12(例如g12d、g12s、g12c和g12v)和g13(g13d和g13r)。在一个实施方案中、黑色素瘤具有选自q61r、q61k、q61l、g12d、g12s、g12c、g12v、g13d和g13r的至少一个突变。鉴定此类nras突变的方法是本领域熟知的，参见例如实施例和colombino等人(2012年)。具有这种nras突变的黑色素瘤特别适用于本发明的任何方面或实施方案，其包括meki，特别是meki，例如曲美替尼、binimetinib、cobimetinib或selumetinib及其任何类似物或衍生物。任选地，该方面或实施方案不包括施用mutbrafi。在一些实施方案中，根据本文的任何方面或实施方案待治疗的黑色素瘤对一种或多种mapk途径的抑制剂例如对至少一种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂具有抗性。例如，黑色素瘤可对一种或多种braf抑制剂威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib和索拉菲尼，对一种或多种meki曲美替尼、cobimetinib、binimetinib和selumetinib，和/或对一种或多种erk抑制剂ulixertinib、ltt-462、vtx11e和sch772984具有抗性。如本文所用，受试者中关于一种或多种治疗剂的“抗性”、“治疗抗性”或“难治性”黑色素瘤是指黑色素瘤对用治疗剂治疗无响应。例如，黑色素瘤可具有“天然抗性”，因为它对治疗剂的治疗从治疗开始时没有响应(本文也称为“内在抗性”)。或者，黑色素瘤可具有“获得性抗性”，因为其最初响应于用治疗剂治疗，例如通过疾病的缓解或稳定，但在一段治疗时间后或黑色素瘤复发后，对治疗剂变得无响应或响应性较低，通常导致进行性疾病。其它抗性指标包括尽管用治疗剂治疗时黑色素瘤的复发或重现，肿瘤负荷的增加，新鉴定的转移等。本领域技术人员可以确定黑色素瘤是否对治疗剂具有抗性或者有风险变得对治疗剂具有抗性。例如，国家综合癌症网络(nccn,www.nccn.org)和欧洲医学肿瘤学会(esmo,www.esmo.org/guidelines)提供了评估特定癌症是否对治疗响应的指南。所以，在一些实施方案中，黑色素瘤早先未用任何mapk途径抑制剂治疗。在一些实施方案中，黑色素瘤早先未用根据本文的任何方面或实施方案的任何一种或多种mapk途径抑制剂治疗。例如，在具体实施方案中，黑色素瘤早先未用威罗菲尼、达布拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼、曲美替尼、binimetinib、cobimetinib和selumetinib中的任何一种或多种治疗。在一些实施方案中，黑色素瘤对至少一种mapk途径抑制剂具有抗性。在一些实施方案中，黑色素瘤对根据本文任何方面或实施方案的一种或多种mapk途径抑制剂中的至少一种具有抗性。例如，在具体实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼、曲美替尼、binimetinib、cobimetinib和selumetinib中的任何一种或多种具有抗性。在一些实施方案中，黑色素瘤对至少一种mapk途径抑制剂具有天然(内在)抗性。在一些实施方案中，黑色素瘤对根据本文任何方面或实施方案的一种或多种mapk途径抑制剂中的至少一种具有天然(内在)抗性。例如，在具体实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼、曲美替尼、binimetinib、cobimetinib和selumetinib中的任何一种或多种具有天然(内在)抗性。在一些实施方案中，黑色素瘤对一种或多种抑制剂中的至少一种具有获得性抗性。例如，黑色素瘤可正在经历或早先经历用根据本文任何方面或实施方案的一种或多种抑制剂中的至少一种进行治疗。任选地，黑色素瘤可以是重现性或复发性黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib和索拉菲尼中的至少一种具有抗性或难治性。例如，受试者可已经经历用威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib或索拉菲尼治疗至少2个月，例如至少3个月，例如至少7个月，例如至少9个月，例如至少至少12个月或更长的时间。在一个实施方案中，黑色素瘤对曲美替尼、cobimetinib、binimetinib和selumetinib中的至少一种具有抗性或难治性。例如，受试者可已经经历用曲美替尼、cobimetinib、binimetinib或selumetinib治疗至少2个月，例如至少3个月，例如至少7个月，例如至少9个月，例如至少12个月或更长的时间。在一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼或曲美替尼中的至少一种，任选两者都具有抗性或难治性。例如，受试者可已经经历用曲美替尼和达拉菲尼的组合治疗至少2个月，例如至少3个月，例如至少7个月，例如至少9个月，例如至少12个月或更长的时间。在一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼或曲美替尼中的至少一种，任选两者具有抗性或难治性。例如，受试者可已经经历用威罗菲尼和达拉菲尼的组合治疗至少2个月，例如至少3个月，例如至少7个月，例如至少9个月，例如至少12个月或更长的时间。在其它实施方案中，根据本文任何方面或实施方案待治疗的黑色素瘤对任何一种或多种抑制剂没有抗性。例如，黑色素瘤可能没有经历用根据本文任何方面或实施方案的一种或多种抑制剂中的任何一种的任何治疗。然而，黑色素瘤也可能正在经历用一种或多种这样的抑制剂治疗，或者已经用一种或多种抑制剂中的任何一种治疗，但是没有发生抗性。在这样的实施方案中，受试者可例如已经经历用威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼、曲美替尼、binimetinib、cobimetinib或selumetinib治疗至少2个月，例如至少3个月，例如至少7个月，例如至少9个月，例如至少12个月或更长的时间。在一个具体实施方案中，本公开内容提供的axl-adc用于治疗对黑色素瘤正在或已经被治疗的治疗剂具有抗性的表达axl的黑色素瘤，其中治疗剂是威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼或其任何治疗有效的类似物或衍生物，并且其中黑色素瘤在braf中表现出突变。特别地，黑色素瘤在braf中表现出突变，这使得braf对威罗菲尼、达布拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼或治疗有效的类似物或衍生物的抑制敏感。优选地，突变是氨基酸取代。这种突变的特定残基包括但不限于v600(例如v600e、v600k和v600d)，残基l597(例如l597r)；和残基k601(k601e)。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。在一个具体实施方案中，本公开内容提供的axl-adc用于治疗对黑色素瘤正在或已经被治疗的治疗剂具有抗性的表达axl的黑色素瘤，其中治疗剂是曲美替尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib或其任何治疗有效的类似物或衍生物。黑色素瘤可在nras中具有突变，例如活化突变。例如，nras可在q61(例如q61r、q61k和q61l)、g12(例如g12d、g12s、g12c和g12v)或g13(g13d和g13r)中具有突变。在一个实施方案中、黑色素瘤具有选自q61r、q61k、q61l、g12d、g12s、g12c、g12v、g13d和g13r的至少一个突变。在一个具体实施方案中，本公开内容提供的axl-adc用于治疗对黑色素瘤正在或已经被治疗的治疗剂具有抗性的表达axl的黑色素瘤，其中治疗剂是ltt-462、ulixertinib、vtxkiie或其任何治疗有效的类似物或衍生物。至于axl-adc，具备本领域普通技术水平的医生可容易地确定并开具所需药物组合物的有效量。鉴于此，当提及药物组合物时，应当理解为也原样包含组合物，或反之亦然。例如，对于在药物组合物中采用的axl-adc的剂量，医生可以低于达到所需治疗效果所要求的水平开始，并逐渐增加剂量直到达到所需效果。通常，合适的剂量将是根据具体剂量方案能有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。此类有效剂量通常将取决于上述因素。例如，治疗用的“有效量”可通过其稳定疾病进展的能力来测量。化合物抑制癌症的能力可例如在动物模型系统中进行评价，以预测在人类肿瘤中的功效。可替换地，化合物的性质可通过由技术人员已知的体外测定法检查所述化合物抑制细胞生长或诱导细胞毒性的能力来评价。治疗有效量的治疗化合物可减小肿瘤尺寸，或以其它方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于此类因素如受试者尺寸、受试者症状的严重程度以及所选择的具体组合物或施用途径来确定此类量。例如，如已经指出的，可以使用美国国家综合癌症网络(nccn,www.nccn.org)和欧洲医学肿瘤学会(esmo,www.esmo.org/guidelines)指南用于评价癌症治疗。本发明的axl-adc的治疗有效量的示例性、非限制性范围是0.02-100mg/kg，如约0.02-30mg/kg，如约0.05-10mg/kg，0.1-5mg/kg或0.1-3mg/kg，例如约0.5-3mg/kg或0.5-2mg/kg。施用可例如是静脉内、肌内、腹腔内或皮下，并且例如施用到靶标部位附近。调整以上治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可施用单次推注、可随时间推移施用若干个分剂量或可根据治疗情况的急切需要所指示按比例地减少或增加剂量。在一个实施方案中，通过降低特定毒性如例如通过降低药物-抗体比率(dar)和/或将axl-adc与未标记的抗axl抗体混合来优化功效-安全性窗口。在一个实施方案中，在治疗期间(例如在预定时间点)监测治疗的功效。用于测量功效的方法通常取决于特定类型的癌症并且是本领域技术人员熟知的。在一个实施方案中，可通过以下方式监测功效：通过使疾病区域可视化；或通过本文进一步描述的其它诊断方法，例如通过例如使用经标记的抗axl抗体、片段或源自axl-特异性抗体的迷你抗体进行一次或多次pet-ct扫描。如果需要，axl-adc的有效日剂量可以是在一整天中以适当的间隔分开施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个分剂量(任选地，以单位剂型)。在另一个实施方案中，通过长时段(如超过24小时)的缓慢连续输注施用所述axl-adc以最小化任何不期望的副作用。还可使用每周、每两周或每三周给药期来施用有效剂量的axl-adc。所述给药期可被限制为例如8周、12周或直到已经确立临床进展。在一个实施方案中，axl-adc每3周一次(1q3w)或经4周三次施用(3q4w)来施用，使得患者在三周或四周间隔接受16或12个周期的axl-adc，持续例如48周，根据需要延长或重复该方案。例如，在一个实施方案中，所述axl-adc可以以10至500mg/m2，如200至400mg/m2的周剂量通过输注施用。此类施用可重复例如1至8次，如3至5次。所述施用可在1至24小时，如1至12小时的时段内通过连续输注进行。在另一个实施方案中，所述axl-adc每三周以10至500mg/m2，如50-200mg/m2的剂量通过输注施用。此类施用可重复例如1至8次，如3至5次。所述施用可在1至24小时，如1至12小时的时段内通过连续输注进行。在一个实施方案中，axl-adc每周或每三周以约0.1-10mg/kg，如约1-3mg/kg的单次剂量施用，最多达十二次、最多达八次，或直到临床进展。所述施用可在1至24小时，如1至12小时的时段内通过连续输注进行。在一个实施方案中，axl-adc每1周(1q1w)、每2周(1q2w)或每3周(1q3w)或经4周三次施用(3q4w)以约0.02-100mg/kg，例如约0.02-30mg/kg，例如约0.05-10mg/kg的量施用。通常，患者可以三周或四周间隔接受16或12个周期的axl-adc，持续例如48周，由负责医生确定延长、缩短或重复该方案。所述施用可在1至24小时，如1至12小时的时段内通过连续输注进行。如果必要，此类方案可例如在6个月或12个月之后重复一次或多次。所述剂量可通过例如采集生物样品并使用靶向抗axl抗体的抗原结合区的抗独特型抗体通过测量施用后血液中本发明的化合物的量来确定或调整。在一个实施方案中，施用所述axl-adc作为维持治疗，如，例如，在六个月或更长时段内每周一次。如本文所用，“维持治疗”意指为了避免或延迟癌症的进展或复发的目的的治疗。通常，如果癌症在初始治疗后完全缓解，则可以使用维持治疗来避免或延迟癌症的复发。如果癌症是晚期的并且在初始治疗后没有达到完全缓解，则维持治疗可用于减缓癌症的生长，例如延长患者的生命。在其它非限制性实例中，根据本发明的治疗可提供如下日剂量的本发明的化合物：约0.1-100mg/kg，如约0.1-50mg/kg，如约0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/天，在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一者，或者可替换地，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一者，或其任何组合，每24、12、8、6、4或2小时或其任何组合使用单个剂量或分剂量。针对剂量的易施用性和均一性，可以剂量单位形式配制胃肠外组合物。如本文所用的剂量单位形式是指物理上离散的单位，其适合用作针对待治疗受试者的一体化剂型；每个单位含有经过计算的预定数量的活性化合物以结合所需药物载体产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格受限于并直接取决于：(a)活性化合物的独特性质和所要达到的特定治疗效果，以及(b)在复合此类活性化合物用于个体敏感性治疗上本领域固有的限制。如本文所述，axl-adc与一种或多种mapk途径抑制剂，例如一种或多种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，任选地黑色素瘤对其具有抗性的至少一种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂组合使用。axl-adc和一种或多种mapk途径抑制剂例如丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂可以同时、分开或顺序施用。例如，在一个实施方案中，该组合用于治疗未接受用抑制剂预先治疗的黑色素瘤患者，任选未接受用任何丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂预先治疗。在另一个实施方案中，该组合用于治疗先前用抑制剂，例如丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂治疗失败的黑色素瘤患者。axl-adc和抑制剂的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的黑色素瘤和患者，并且可以由本领域技术人员确定。在一个实施方案中，一种或多种mapk途径抑制剂(例如，与axl-adc结合使用的一种或多种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂)的剂量和剂量方案与通常用于用一种或多种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂治疗癌症例如黑色素瘤的那些相同或基本相似。威罗菲尼可以例如以约200-2000mg，500-1500mg，例如约1000mg/天的剂量口服施用，例如960mg以4×240mg片剂q12hr(分开约12小时)施用。达拉菲尼可以例如以约50-300mg，例如约100-200mg，例如约150mg，每天一次或两次或每2或3天的剂量口服施用于受试者。优选地，达拉菲尼以150mg每天两次口服施用，例如，在餐前至少1小时或在餐后至少2小时。encorafenib可以例如以600mg，例如400mg，例如300mg，例如200mg，例如100mg，每天一次或两次或每2、3或4天的总剂量口服施用，例如300mg每天一次(qd)。索拉菲尼可以例如以200-1600mg，例如1200mg，例如800mg，例如600mg，例如400mg，每天一次或两次或每2、3或4天的总剂量口服施用，例如两片200mg，每天两次(相当于总日剂量800mg)曲美替尼可以例如以约0.1至10mg，例如约0.5至5mg，例如约2mg，每天一次或两次或每2或3天的剂量口服施用于受试者。优选地，曲美替尼以2mg每天一次口服施用，例如，每天不伴随食物在相似时间，至少餐前1小时或餐后2小时。cobimetinib可以例如以每天约10至100mg，例如约30至80mg，例如约60mg/天的剂量，任选地分成2、3或4个分开的剂量口服施用于受试者。优选地，cobimetinib以28天周期每天60mg(3片20mg)的剂量施用，其中药物连续服用21天，然后中断7天。binimetinib可以例如以约10-200mg例如150mg，例如100mg，例如90mg，例如45mg，例如30mg，例如20mg，每天一次或两次或每2、3或4天的剂量口服施用于受试者，例如45mg，每天两次。selumetinib可以例如以约50-225mg，例如75mg，100mg，125mg，150mg，175mg，200mg或225mg每天一次或两次，例如每天两次的剂量口服施用，任选地以四周周期中给予三天然后中断四天的方案。在一个实施方案中，mapk途径抑制剂例如丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂的剂量比通常使用的剂量较低，但剂量方案在其它方面是相似的。在一个实施方案中，mapk途径抑制剂例如丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂的剂量与通常使用的剂量相似，但剂量方案调整为较少或较不频繁的施用。在一个实施方案中，丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂的剂量低于通常使用的剂量，并且剂量方案被调整为较少或较不频繁的施用。在一个方面，本发明涉及axl-adc在治疗有需要的受试者中的黑色素瘤的方法中的用途，包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，任选地humax-axl-adc，和(ii)一种或多种mapk途径抑制剂，例如丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，其中adc和至少一种抑制剂同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，一种或多种mapk途径的抑制剂包含braf抑制剂、mek抑制剂、erk抑制剂或其任何两种或更多种的组合或由其组成，例如braf抑制剂和mek抑制剂，braf抑制剂和erk抑制剂，或mek抑制剂和erk抑制剂。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤对一种或多种抑制剂中的至少一种具有抗性。在一个实施方案中，抑制剂是选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼或其治疗有效类似物或衍生物的braf抑制剂，并且黑色素瘤在braf中表现出突变，提供braf抑制剂对突变braf的激酶活性的抑制。在一个实施方案中，抑制剂是选自曲美替尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib的mek抑制剂或其治疗有效类似物或衍生物。axl-adc可以例如根据上文更详细描述的剂量方案以治疗有效量施用。例如，作为非限制性实例，axl-adc可以以约0.02-100mg/kg，例如约0.02-30mg/kg，例如约0.05-10mg/kg，每1周(1q1w)，每2周(1q2w)或每3周(1q3w)或经3周3次施用(3q4w)的量施用，以便患者以3周或4周的间隔接受16或12个周期的axl-adc，例如持续48周，由负责医生确定延长、缩短或重复方案。在一个方面，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，该方法包括施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib和索拉菲尼的braf抑制剂或其任何治疗有效的类似物或衍生物；(iii)选自曲美替尼、cobimetinib、binimetinib和selumetinib的mek抑制剂或其任何治疗有效的类似物或衍生物；其中黑色素瘤在braf中表现出突变，提供braf抑制剂对突变braf的激酶活性的抑制，并且其中adc、braf抑制剂和mek-抑制剂以治疗有效量同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，突变位于选自v600、l597和k601的braf残基中，例如选自v600e、v600k、v600d、l597r和k601e的突变，例如v600e。在一个具体实施方案中，黑色素瘤不具有活化的nras突变。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供威罗菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc和(ii)威罗菲尼或其治疗有效类似物或衍生物，其中(i)和(ii)同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼具有抗性。例如，黑色素瘤可早先用威罗菲尼治疗，或者可正在经历用威罗菲尼治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂治疗，例如达拉菲尼、encorafenib或索拉菲尼；或者可正在经历用另一种braf抑制剂治疗，例如达拉菲尼、encorafenib或索拉菲尼。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼没有抗性和/或早先未用威罗菲尼治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。根据合适的剂量方案，威罗菲尼通常以治疗有效量施用。例如，威罗菲尼可以以约200-2000mg，500-1500mg，例如约1000mg/天的剂量口服施用，例如960mg以4×240mg片剂q12hr(间隔约12小时)施用。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供达拉菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc和(ii)达拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物，其中(i)和(ii)同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼具有抗性。例如，黑色素瘤可早先用达拉菲尼治疗，或者可正在进行用达拉菲尼治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂治疗，例如威罗菲尼、encorafenib或索拉菲尼；或者可正在进行用另一种braf抑制剂治疗，例如威罗菲尼、encorafenib或索拉菲尼。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼没有抗性和/或之前未用达拉菲尼治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。达拉菲尼通常以治疗有效量并根据合适的剂量方案施用。例如，达拉菲尼可以以约50-300mg，例如约100-200mg，例如约150mg，每天一次或两次或每2或3天的剂量口服施用于受试者。优选地，达拉菲尼以150mg每天两次口服施用，例如，餐前至少1小时或餐后至少2小时。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供encorafenib对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc和(ii)encorafenib或其治疗有效的类似物或衍生物，其中(i)和(ii)同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib具有抗性。例如，黑色素瘤可早先用encorafenib治疗，或者可正在进行用encorafenib治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂治疗，例如威罗菲尼、达拉菲尼或索拉菲尼；或者可正在进行用另一种braf抑制剂治疗，例如威罗菲尼、达拉菲尼或索拉菲尼。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib没有抗性和/或之前未用encorafenib治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。encorafenib通常以治疗有效量并根据合适的剂量方案施用。例如，encorafenib可以以600mg，例如400mg，例如300mg，例如200mg，例如100mg，每天一次或两次或每2、3或4天的总剂量口服施用，例如300mg每天一次。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，任选其中黑色素瘤表现出braf突变，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc和(ii)索拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物，其中(i)和(ii)同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼具有抗性。例如，黑色素瘤可早先用索拉菲尼治疗，或者可正在进行用索拉菲尼治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂治疗，例如威罗菲尼、达拉菲尼或encorafenib；或者可以正在进行用另一种braf抑制剂治疗，例如威罗菲尼、达拉菲尼或encorafenib。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼没有抗性和/或之前未用索拉菲尼治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。索拉菲尼通常以治疗有效量并根据合适的剂量方案施用。例如，索拉菲尼可以以200-1600mg，例如1200mg，例如800mg，例如600mg，例如400mg，每天一次或两次或每2、3或4天的总剂量口服施用，例如两片200mg每天两次(相当于800mg总日剂量)。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc和(ii)曲美替尼或其治疗有效的类似物或衍生物，其中(i)和(ii)同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，黑色素瘤对曲美替尼具有抗性。例如，黑色素瘤可早先用曲美替尼治疗，或者可正在进行用曲美替尼治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种mek抑制剂治疗，例如binimetinib、cobimetinib或selumetinib；或者可以用另一种mek抑制剂治疗，例如binimetinib、cobimetinib或selumetinib。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对曲美替尼没有抗性和/或之前未用曲美替尼治疗。在一个实施方案中，黑色素瘤表现出nras突变，例如在选自q61、g12和g13的nras残基中，例如选自q61r、q61k、q61l、g12d、g12s、g12c、g12v、g13d和g13r的nras中的突变。曲美替尼通常以治疗有效量并根据合适的剂量方案施用。例如，达拉菲尼可以以约50-300mg，例如约100-200mg，例如约150mg，每天一次或两次或每2或3天的剂量口服施用于受试者。优选地，达拉菲尼以150mg每天两次口服施用，例如餐前至少1小时或餐后至少2小时。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc和(ii)cobimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物，其中(i)和(ii)同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，黑色素瘤对cobimetinib具有抗性。例如，黑色素瘤可早先用cobimetinib治疗，或者可正在进行用cobimetinib治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种mek抑制剂治疗，例如曲美替尼、binimetinib或selumetinib；或者可正在进行用另一种mek抑制剂治疗，例如曲美替尼、binimetinib或selumetinib。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对cobimetinib没有抗性和/或之前未用cobimetinib治疗。在一个实施方案中，黑色素瘤表现出nras突变，例如在选自q61、g12和g13的nras残基中，例如选自q61r、q61k、q61l、g12d、g12s、g12c、g12v、g13d和g13r的nras中的突变。cobimetinib通常以治疗有效量并根据合适的剂量方案施用。cobimetinib可以例如以每天约10至100mg，例如约30至80mg，例如约60mg/天的剂量，任选地分成2、3或4个分开的剂量口服施用于受试者。优选地，cobimetinib以28天周期每天60mg(3片20mg)的剂量施用，其中药物连续服用21天，然后中断7天。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc和(ii)binimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物，其中(i)和(ii)同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，黑色素瘤对binimetinib具有抗性。例如，黑色素瘤可早先用binimetinib治疗，或者可正在进行用binimetinib治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种mek抑制剂治疗，例如曲美替尼、cobimetinib或selumetinib；或者可正在进行用另一种mek抑制剂治疗，例如曲美替尼、cobimetinib或selumetinib。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对binimetinib没有抗性和/或之前未用binimetinib治疗。在一个实施方案中，黑色素瘤表现出nras突变，例如在选自q61、g12和g13的nras残基中，例如选自q61r、q61k、q61l、g12d、g12s、g12c、g12v、g13d和g13r的nras中的突变。binimetinib通常以治疗有效量并根据合适的剂量方案施用。binimetinib可以例如以约10-200mg例如150mg，例如100mg，例如90mg，例如45mg，例如30mg，例如20mg，每天一次或两次或每2、3或4天的剂量口服施用于受试者，例如45mg，每天两次。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc和(ii)selumetinib或其治疗有效的类似物或衍生物，其中(i)和(ii)同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，黑色素瘤对selumetinib具有抗性。例如，黑色素瘤可早先用selumetinib治疗，或者可正在进行用selumetinib治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种mek抑制剂治疗，例如曲美替尼、cobimetinib或binimetinib；或者可正在进行用另一种mek抑制剂治疗，例如曲美替尼、cobimetinib或binimetinib。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对selumetinib没有抗性和/或之前未用selumetinib治疗。在一个实施方案中，黑色素瘤表现出nras突变，例如在选自q61、g12和g13的nras残基中，例如选自q61r、q61k、q61l、g12d、g12s、g12c、g12v、g13d和g13r的nras中的突变。selumetinib通常以治疗有效量并根据合适的剂量方案施用。selumetinib可以例如以约50-225mg，例如75mg，100mg，125mg，150mg，175mg，200mg或225mg每天一次或两次，例如每天两次的剂量口服施用，任选地以四周周期中给予三天然后中断四天的方案。在axl-adc用于根据任一前述实施方案的方法的一个实施方案中，黑色素瘤表现出nras突变，例如活化的nras突变，例如在选自q61、g12和g13的nras残基中，例如选自q61r、q61k、q61l、g12d、g12s、g12c、g12v、g13d和g13r的nras中的突变。在一个方面，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc；(ii)braf抑制剂；(iii)mek抑制剂；其中adc，braf抑制剂和mek抑制剂以治疗有效量同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供达拉菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)达拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)曲美替尼或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼、曲美替尼或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用达拉菲尼、曲美替尼或两者治疗，或者可正在进行用达拉菲尼、曲美替尼或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼或曲美替尼没有抗性和/或之前未用达拉菲尼或曲美替尼治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，braf突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。达拉菲尼可以例如以约50-300mg，例如约100-200mg，例如约150mg，每天一次或两次或每2或3天的剂量口服施用于受试者。优选地，达拉菲尼以150mg每天两次口服施用，例如，在餐前至少1小时或在餐后至少2小时。曲美替尼可以例如以约0.5至5mg，例如约1至4mg，例如约2-3mg，例如约2mg，每天一次或两次，或每2、3或4天的剂量口服施用，例如每天一次。在一个实施方案中，本发明涉及在受试者中治疗对达拉菲尼、曲美替尼或两者具有抗性的黑色素瘤的方法，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供达拉菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)达拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)曲美替尼或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，癌症是表达axl的癌症。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。达拉菲尼可以例如以约50-300mg，例如约100-200mg，例如约150mg，每天一次或两次或每2或3天的剂量口服施用于受试者。优选地，达拉菲尼以150mg每天两次口服施用，例如，在餐前至少1小时或在餐后至少2小时。曲美替尼可以例如以约0.5至5mg，例如约1至4mg，例如约2-3mg，例如约2mg，每天一次或两次，或每2、3或4天的剂量口服施用，例如每天一次。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供威罗菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)威罗菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)曲美替尼或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼、曲美替尼或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用威罗菲尼、曲美替尼或两者治疗，或者可正在进行用威罗菲尼、曲美替尼或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼或曲美替尼没有抗性和/或之前未用威罗菲尼或曲美替尼治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。威罗菲尼可以例如以约200-2000mg，500-1500mg，例如约1000mg/天的剂量口服施用，例如960mg以4×240mg片剂q12hr(分开约12小时)施用。曲美替尼可以例如以约0.5至5mg，例如约1至4mg，例如约2-3mg，例如约2mg，每天一次或两次，或每2、3或4天的剂量口服施用，例如每天一次。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供encorafenib对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)encorafenib或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)曲美替尼或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib、曲美替尼或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用encorafenib、曲美替尼或两者治疗，或者可正在进行用encorafenib、曲美替尼或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib或曲美替尼没有抗性和/或之前未用encorafenib或曲美替尼治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。encorafenib可以例如以600mg，例如400mg，例如300mg，例如200mg，例如100mg，每天一次或两次或每2、3或4天，例如每天一次(qd)的总剂量口服施用。曲美替尼可以例如以约0.5至5mg，例如约1至4mg，例如约2-3mg，例如约2mg，每天一次或两次，或每2、3或4天的剂量口服施用，例如每天一次。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，任选其中黑色素瘤表现出braf突变，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)索拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)曲美替尼或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼、曲美替尼或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用索拉菲尼、曲美替尼或两者治疗，或者可正在进行用索拉菲尼、曲美替尼或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼或曲美替尼没有抗性和/或之前未用索拉菲尼或曲美替尼治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。索拉菲尼可以例如以200-1600mg，例如1200mg，例如800mg，例如600mg，例如400mg，每天一次或两次或每2、3或4天的总剂量口服施用，例如两片200mg，每天两次(相当于总日剂量800mg)。曲美替尼可以例如以约0.5至5mg，例如约1至4mg，例如约2-3mg，例如约2mg，每天一次或两次，或每2、3或4天的剂量口服施用，例如每天一次。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供达拉菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)达拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)cobimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼、cobimetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用达拉菲尼、cobimetinib或两者治疗，或者可正在进行用达拉菲尼、cobimetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼或cobimetinib没有抗性和/或之前未用达拉菲尼或cobimetinib治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，braf突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。达拉菲尼可以例如以约50-300mg，例如约100-200mg，例如约150mg，每天一次或两次或每2或3天的剂量口服施用于受试者。优选地，达拉菲尼以150mg每天两次口服施用，例如，在餐前至少1小时或在餐后至少2小时。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供威罗菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)威罗菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)cobimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼、cobimetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用威罗菲尼、cobimetinib或两者治疗，或者可正在进行用威罗菲尼、cobimetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼或cobimetinib没有抗性和/或之前未用威罗菲尼或cobimetinib治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，braf突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。威罗菲尼可以例如以约200-2000mg，500-1500mg，例如约1000mg/天的剂量口服施用，例如960mg以4×240mg片剂q12hr(分开约12小时)施用。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供encorafenib对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)encorafenib或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)cobimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib、cobimetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用encorafenib、cobimetinib或两者治疗，或者可正在进行用encorafenib、cobimetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib或cobimetinib没有抗性和/或之前未用encorafenib或cobimetinib治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。encorafenib可以例如以600mg，例如400mg，例如300mg，例如200mg，例如100mg，每天一次或两次或每2、3或4天，例如每天一次(qd)的总剂量口服施用。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，任选其中黑色素瘤表现出braf突变，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)索拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)cobimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼、cobimetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用索拉菲尼、cobimetinib或两者治疗，或者可正在进行用索拉菲尼、cobimetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼或cobimetinib没有抗性和/或之前未用索拉菲尼或cobimetinib治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。索拉菲尼可以例如以200-1600mg，例如1200mg，例如800mg，例如600mg，例如400mg，每天一次或两次或每2、3或4天的总剂量口服施用，例如两片200mg，每天两次(相当于总日剂量800mg)。cobimetinib可以例如以每天约10至100mg，例如约30至80mg，例如约60mg/天的剂量，任选地分成2、3或4个分开的剂量口服施用于受试者。优选地，cobimetinib以28天周期每天60mg(3片20mg)的剂量施用，其中药物连续服用21天，然后中断7天。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供达拉菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)达拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)binimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼、binimetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用达拉菲尼、binimetinib或两者治疗，或者可正在进行用达拉菲尼、binimetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼或binimetinib没有抗性和/或之前未用达拉菲尼或binimetinib治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。达拉菲尼可以例如以约50-300mg，例如约100-200mg，例如约150mg，每天一次或两次或每2或3天的剂量口服施用于受试者。优选地，达拉菲尼以150mg每天两次口服施用，例如，在餐前至少1小时或在餐后至少2小时。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供威罗菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)威罗菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)binimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼、binimetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用威罗菲尼、binimetinib或两者治疗，或者可正在进行用威罗菲尼、binimetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼或binimetinib没有抗性和/或之前未用威罗菲尼或binimetinib治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。威罗菲尼可以例如以约200-2000mg，500-1500mg，例如约1000mg/天的剂量口服施用，例如960mg以4×240mg片剂q12hr(分开约12小时)施用。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供encorafenib对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)encorafenib或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)binimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib、binimetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用encorafenib、binimetinib或两者治疗，或者可正在进行用encorafenib、binimetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib或binimetinib没有抗性和/或之前未用encorafenib或binimetinib治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。encorafenib可以例如以600mg，例如400mg，例如300mg，例如200mg，例如100mg，每天一次或两次或每2、3或4天，例如每天一次(qd)的总剂量口服施用。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，任选其中黑色素瘤表现出braf突变，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)索拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)binimetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼、binimetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用索拉菲尼、binimetinib或两者治疗，或者可正在进行用索拉菲尼、binimetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼或binimetinib没有抗性和/或之前未用索拉菲尼或binimetinib治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，braf突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。索拉菲尼可以例如以200-1600mg，例如1200mg，例如800mg，例如600mg，例如400mg，每天一次或两次或每2、3或4天的总剂量口服施用，例如两片200mg，每天两次(相当于总日剂量800mg)。binimetinib可以例如以约10-200mg例如150mg，例如100mg，例如90mg，例如45mg，例如30mg，例如20mg，每天一次或两次或每2、3或4天的剂量口服施用于受试者，例如45mg，每天两次。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供达拉菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)达拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)selumetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼、selumetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用达拉菲尼、selumetinib或两者治疗，或者可正在进行用达拉菲尼、selumetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对达拉菲尼或selumetinib没有抗性和/或之前未用达拉菲尼或selumetinib治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。达拉菲尼可以例如以约50-300mg，例如约100-200mg，例如约150mg，每天一次或两次或每2或3天的剂量口服施用于受试者。优选地，达拉菲尼以150mg每天两次口服施用，例如，在餐前至少1小时或在餐后至少2小时。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供威罗菲尼对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)威罗菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)selumetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼、selumetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用威罗菲尼、selumetinib或两者治疗，或者可正在进行用威罗菲尼、selumetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对威罗菲尼或selumetinib没有抗性和/或之前未用威罗菲尼或selumetinib治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。威罗菲尼可以例如以约200-2000mg，500-1500mg，例如约1000mg/天的剂量口服施用，例如960mg以4×240mg片剂q12hr(分开约12小时)施用。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，其中黑色素瘤表现出braf突变并且所述突变提供encorafenib对突变braf的braf激酶活性的抑制，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)encorafenib或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)selumetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib、selumetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用encorafenib、selumetinib或两者治疗，或者可正在进行用encorafenib、selumetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对encorafenib或selumetinib没有抗性和/或之前未用encorafenib或selumetinib治疗。在一个实施方案中，braf突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。encorafenib可以例如以600mg，例如400mg，例如300mg，例如200mg，例如100mg，每天一次或两次或每2、3或4天，例如每天一次(qd)的总剂量口服施用。在一个实施方案中，本发明涉及axl-adc在治疗受试者的黑色素瘤的方法中的用途，任选其中黑色素瘤表现出braf突变，所述方法包括向受试者施用(i)包含结合至人axl的抗体的adc，(ii)索拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物和(iii)selumetinib或其治疗有效的类似物或衍生物。在一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼、selumetinib或两者都有抗性。例如，黑色素瘤可早先用索拉菲尼、selumetinib或两者治疗，或者可正在进行用索拉菲尼、selumetinib或两者治疗。或者，黑色素瘤可早先用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗，或可正在经历用另一种braf抑制剂、mek抑制剂或两者治疗。例如，黑色素瘤可以是复发的黑色素瘤。在一个实施方案中，黑色素瘤是表达axl的黑色素瘤。在另一个实施方案中，黑色素瘤对索拉菲尼或selumetinib没有抗性和/或之前未用索拉菲尼或selumetinib治疗。在一个实施方案中，突变是残基v600、l597和/或k601中的氨基酸取代。在一个实施方案中，突变选自v600e、v600d、v600k、l597r和k601e。索拉菲尼可以例如以200-1600mg，例如1200mg，例如800mg，例如600mg，例如400mg，每天一次或两次或每2、3或4天的总剂量口服施用，例如两片200mg，每天两次(相当于总日剂量800mg)。selumetinib可以例如以约50-225mg，例如75mg，100mg，125mg，150mg，175mg，200mg或225mg每天一次或两次，例如每天两次的剂量口服施用，任选地以四周周期中给予三天然后中断四天的方案。在axl-adc用于根据任一前述实施方案的方法的一个实施方案中，黑色素瘤不表现出nras突变，例如在选自q61、g12和g13的nras残基中，例如选自q61r、q61k、q61l、g12d、g12s、g12c、g12v、g13d和g13r的nras中的突变。在此类实施方案中，一种或多种mapk途径的抑制剂中的一种，例如丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，可包含brafi或由其组成，例如威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib或索拉菲尼。在前述方面的一个具体实施方案中，axl-adc与一种或多种mapk途径抑制剂例如至少一种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂组合使用，以治疗受试者的复发性黑色素瘤，其中黑色素瘤在用丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂初始治疗后复发。如果在用axl-adc初始治疗后癌症再次复发，则可以再次使用axl-adc与至少一种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂一起治疗复发性癌症。在一个方面，本发明涉及选择患有黑色素瘤的受试者用于用axl-adc和至少一种s/thki的组合进行治疗的方法，所述方法包括确定(a)受试者是否符合用s/thki治疗的标准；(b)黑色素瘤中的axl表达是否与对s/thki的抗性相关；和(c)选择符合用s/thki治疗的标准且患有axl表达与对s/thki的抗性相关的黑色素瘤的受试者。在一个方面，本发明涉及治疗诊断具有黑色素瘤的受试者的方法，所述黑色素瘤对威罗菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物具有抗性或具有产生抗性的高度倾向，所述方法包括施用治疗有效量的包含结合至人axl的抗体的adc和至少一种mapk途径抑制剂，例如丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。在一个方面，本发明涉及确定患有黑色素瘤的受试者是否适合用(i)brafi例如威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物，(ii)meki例如达拉菲尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib或其治疗有效的类似物或衍生物，和(iii)包含结合至人axl的抗体的adc的组合治疗，其中所述受试者正经历或经历过用brafi、meki或两者的治疗，并且被确定或怀疑对brafi、meki或两者具有抗性，因此确定受试者适合于所述治疗。在一个进一步方面，可以确定黑色素瘤是否表达axl。在一个实施方案中，待用抗axl-adc治疗的抗性黑色素瘤已经被确定为表达axl。在一个具体实施方案中，这通过检测取自患者的样品例如肿瘤样品例如活检样品中axl抗原的水平或在其细胞表面上表达axl的细胞水平来实现。例如，所述患者可以患有黑色素瘤或有风险发展黑色素瘤。待检测的axl抗原可以是可溶性axl抗原、细胞相关的axl抗原或两者。例如，待测试的样品可以在允许抗体与axl结合的条件下与抗axl抗体接触，任选地与对照样品和/或结合至无关抗原的对照抗体一起接触。然后可以检测抗体与axl的结合(例如，使用elisa)。当与测试样品一起使用对照样品时，分析了两种样品中抗axl抗体或抗axl抗体-axl复合物的水平，并且测试样品中在统计上显著更高的抗axl抗体或抗axl抗体-axl复合物水平显示测试样品中相比对照样品更高的axl水平，表明axl的更高表达。可用于此类目的的常规免疫测定法的实例包括但不限于：elisa、ria、facs测定法、等离子体共振测定法、色谱测定法、组织免疫组织化学、western印迹和/或免疫沉淀。组织样品可以取自已知或疑似含有axl抗原和/或表达axl的细胞的组织。例如，可通过从患者移取组织学标本如肿瘤活检样品或血液样品并在合适制备所述标本之后向此类标本提供抗axl抗体来实现对axl表达的原位检测。可通过将所述抗体施加至所述标本或通过将其覆盖在所述标本上来提供所述抗体，随后使用合适的方式进行检测。在以上测定法中，所述抗axl抗体可以用可检测物质标记以允许检测结合了axl的抗体。样品中细胞上表达的axl水平也可以根据实施例17中描述的方法测定，其中通过间接免疫荧光使用qifikit分析(dako，目录号k0078)使用单克隆抗axl抗体(此处：小鼠单克隆抗体ab89224；abcam,cambridge,uk)定量人肿瘤细胞系质膜上的axl表达。简而言之，制备单细胞悬浮液，并任选地洗涤。在冰上进行下一步骤。将细胞接种，例如以100,000个细胞/孔或管接种，且然后沉淀并以10μg/ml的浓度重新悬浮于50μl抗体样品中，任选地将对照抗体添加至平行样品。在4℃下孵育30分钟后，将细胞沉淀并重新悬浮于150μlfacs缓冲液中，并且通过facs分析使用例如结合至抗axl的第二fitc标记抗体和对照抗体测定axl的量。对于每种细胞系，使用axl抗体染色的细胞的平均荧光强度，基于如实施例23中所述的校正曲线的公式(从标准曲线内推未知量)计算抗体结合能力(abc)(在质膜上表达的axl分子数量的估计值)。在一个实施方案中，使用实施例23的方法，表达axl的细胞上的axl水平被估计为至少5000，如至少8000，如至少13000。在一个具体实施方案中，黑色素瘤中表达axl的细胞的存在或水平根据本领域已知的方法通过可检测标记的抗axl抗体的体内成像来评估。来自部位(如已知或可疑的黑色素瘤肿瘤部位)的信号显著高于背景或其他对照，表明axl在肿瘤中过表达。axl-adcs适用于本发明上下文中的adc可以由任何抗axl抗体制备，通常是结合至人axl细胞外区域的抗体。在一个实施方案中，axl抗体还结合食蟹猴axl的细胞外区域。优选的抗axl抗体的特征在于以下方面和实施方案中阐述的axl结合特性、可变或高变序列、或结合特性和序列特性的组合中的一种或多种。在一个具体方面，所述抗体结合至axl，但不与配体生长停滞特异性6(gas6)竞争axl结合。最优选的是表2中描述其序列的特定抗axl抗体，特别是标记为107的抗体和与抗体107共有一个或多个axl结合特性或cdr、vh和/或vl序列的抗体。因此，在任何前述方面或实施方案的一个具体实施方案中，抗axl抗体包含至少一个包含vh区和vl区的结合区，其中所述vh区包含seqidno.:36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列，且所述vl区包含seqidno.:39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列。在一个优选实施方案中，所述adc包含与细胞毒性剂连接的这种抗axl抗体，所述细胞毒性剂是澳瑞他汀或其功能性肽类似物或衍生物，如例如单甲基澳瑞他汀e，优选经由马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基-羰基(mc-vc-pab)接头连接。本文的方面和实施方案特别优选的是axl-adc，其中抗axl抗体是包含vh区和vl区的全长igg1抗体，其中vh区包含seqidno.:36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列，且vl区包含seqidno.:39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，任选地其中vh和vl区分别包含seqidno:1和seqidno:2，其经由马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基-羰基(mc-vc-pab)接头与单甲基澳瑞他汀e连接。此类axl-adc在本文中也可称为“humax-axl-adc”或“igg1-axl-107-vcmmae”。如本文所用，术语“抗体”，旨在是指免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段、或其任一的衍生物，其具有在典型的生理条件和/或肿瘤特异性条件下特异性结合抗原的能力，并具有显著时间段的半衰期，如至少约30分钟、至少约45分钟、至少约一小时、至少约两小时、至少约四小时、至少约8小时、至少约12小时、约24小时或以上、约48小时或以上、约3、4、5、6、7或更多天，等等，或任何其它相关功能上定义的时间段(如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体结合抗原相关的生理应答的时间和/或足以使抗体内化的时间)。与抗原相互作用的结合区(或可用于本文中的结合结构域，两者具有相同含义)包括免疫球蛋白分子的重链和轻链两者的可变区。抗体(ab)的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应子细胞)和补体系统的组分如c1q(其为补体活化的经典途径中的第一组分)。如上所述，如本文所用的术语抗体，除非另行说明或与上下文明显抵触，否则包括保持与抗原特异性相互作用(如结合)的能力的抗体片段。已经证明，抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段执行。涵盖在术语“抗体”内的结合片段的实例包括：(i)fab’或fab片段，其为由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段，或如wo2007/059782中所述的单价抗体；(ii)f(ab')2片段，其为包含在铰链区由二硫桥键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)fd片段，其主要由vh和ch1结构域组成；(iv)fv片段，其主要由抗体的单臂的vl和vh结构域组成；(v)dab片段(ward等人,1989)，其主要由vh结构域组成，并且也被称为结构域抗体(holt等人,2003)；(vi)骆驼抗体(camelid)或纳米抗体(revets等人,2005)以及(vii)分离的互补决定区(cdr)。此外，虽然fv片段的两个结构域vl和vh由分开的基因编码，但是可使用重组方法通过合成的接头将它们接合，所述接头使它们能够被制成单蛋白链，其中所述vl和vh区配对以形成单价分子(被称为单链抗体或单链fv(scfv)，参见例如bird等人(1988)和huston等人(1988))。除非另有说明或与上下文明显抵触，否则术语抗体涵盖了此类单链抗体。虽然此类片段通常被包括在抗体的含义内，但是它们总体上并且各自独立地是本发明的独有特征，具有不同的生物特性和效用。在本文中进一步讨论了这些以及其它可用于本发明的背景中的抗体片段。还应当理解，术语抗体，除非另外指明，否则还包括由任何已知技术(如酶裂解、肽合成和重组技术)提供的多克隆抗体、单克隆抗体(mab)、抗体样多肽(如嵌合抗体和人源化抗体)以及‘抗体片段’或‘其片段’，所述片段保持特异性结合抗原的能力(抗原结合片段)，并保持与毒素缀合的能力。所生成的抗体可以具有任何同种型。如本文所用，术语“免疫球蛋白重链”或“免疫球蛋白的重链”，旨在是指免疫球蛋白的重链之一。重链通常由重链可变区(在本文中缩写为vh)和重链恒定区(在本文中缩写为ch)构成，其定义免疫球蛋白的同种型。重链恒定区通常由三个结构域ch1、ch2和ch3构成。如本文所用，术语“免疫球蛋白”，旨在是指一类结构上相关的糖蛋白，其由两对多肽链组成的：一对轻(l)低分子量链和一对重(h)链，全部四条链均可能通过二硫键互相连接。免疫球蛋白的结构已经得到充分表征(参见例如fundamentalimmunologych.7(paul,w.,编,第2版ravenpress,n.y.(1989))。在免疫球蛋白的结构内，所述两条重链在所谓“铰链区”中经由二硫键互相连接。与重链一样，各轻链通常由若干区构成：轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区。所述轻链恒定区通常由一个结构域cl构成。此外，vh和vl区可被进一步细分为高变化性的区(或高变区，其可在序列和/或结构上限定的环形式上高度可变)，也被称为互补决定区(cdr)，散布在被称为框架区(fr)的更保守的区中。每个vh和vl均通常由三个cdr和四个fr构成，从氨基末端到羧基末端按以下次序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。cdr序列根据imgt定义(参见lefranc等人(1999)和brochet等人(2008))。如本文所用，术语“抗原结合区”或“结合区”，是指能够结合抗原的抗体的区。抗原可以是任何分子，如存在于例如细胞、细菌或病毒粒子中的多肽。除非与上下文相抵触，否则术语“抗原”和“靶标”在本发明的上下文中可互换使用。如本文所用，术语“结合”，是指抗体与预定的抗原或靶标结合，通常其以对应于如下kd的亲和力结合：约10-6m或更低，例如10-7m或更低，如约10-8m或更低，如约10-9m或更低，约10-10m或更低，或约10-11m或甚至更低(当通过例如表面等离子体共振(spr)技术在biacore3000仪器中使用所述抗原作为配体而所述蛋白作为被分析物测定时)，并且相比其结合不同于所述预定的抗原或紧密相关的抗原的非特异性抗原(例如，bsa、酪蛋白)的亲和力，其结合所述预定的抗原的亲和力所对应的kd低至少十倍，如低至少100倍，例如低至少1,000倍，如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍。kd所低于的量取决于抗体的kd，使得当抗体的kd极低时(即，所述抗体高度特异)，则针对抗原的亲和力低于针对非特异性抗原的亲和力的量可以是至少10,000倍。如本文所用，术语“kd”(m)，是指具体抗体－抗原相互作用的解离平衡常数，并且通过kd除以ka获得。如本文所用，术语亲和力与kd为反比关系，即，较高的亲和力意指较低的kd，而较低的亲和力意指较高的kd。如本文所用，术语“kd”(秒-1)，是指具体抗体－抗原相互作用的解离速率常数。所述值也被称为koff值或解离速率。如本文所用，术语“ka”(m-1x秒-1)，是指具体抗体－抗原相互作用的结合速率常数。所述值也被称为kon值或结合速率。如本文所用，术语“ka”(m-1)，是指具体抗体－抗原相互作用的结合平衡常数，并且通过ka除以kd获得。如本文所用，术语“axl”，是指名称为axl的蛋白，其也被称为ufo或jtk11，是含有894个氨基酸、分子量为104-140kda的蛋白，其为哺乳动物tam受体酪氨酸激酶(rtk)亚族的一部分。所述分子量可由于所述蛋白糖基化中的潜在差异而变化。axl蛋白由该蛋白n-末端的两个细胞外免疫球蛋白样(ig样)结构域、两个近膜细胞外纤维连接蛋白iii型(fniii)结构域、一个跨膜结构域和一个细胞内激酶结构域组成。当结合其配体gas6时，axl通过以下方式活化：通过axl的细胞外结构域之间独立于配体的嗜同种相互作用、通过在存在反应性氧物质的情况下的自磷酸化(korshunov等人,2012)、或通过经由egfr的反式活化(meyer等人,2013)，并且在若干肿瘤类型中异常表达。在人类中，axl蛋白由编码seqidno:130中所示的氨基酸序列的核酸序列编码(人axl蛋白：swissprotp30530；食蟹猴axl蛋白：genbank登录号hb387229.1(seqidno:147))。如本文所用，术语“独立于配体的嗜同种相互作用”，是指两个axl分子(在相邻细胞上表达)之间的缔合，其在不存在配体的情况下发生。如本文所用，术语“结合axl的抗体”，是指结合axl的细胞外部分上的表位的任何抗体。术语“表位”意指能够特异性结合抗体的蛋白决定簇。表位通常由分子(如氨基酸、糖基侧链或其组合)的表面组合组成，并通常具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。构象和非-构象表位的区别在于：在存在变性溶剂的情况下，与前者而非后者的结合丧失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基，如被特定抗原结合肽有效阻断或覆盖的氨基酸残基(换句话讲，该氨基酸残基位于所述特定抗原结合肽的覆盖区内)。如本文所用，术语“配体”，是指这样的物质，如激素、肽、离子、药物或蛋白，其特异性地并可逆地结合另一蛋白(如受体)以形成更大的复合物。结合至受体的配体可改变其化学构象，并决定其功能状态。例如，配体可用作激动剂或拮抗剂。如本文所用，术语“生长停滞特异性6”或“gas6”，是指含有721个氨基酸、分子量为75-80kda的蛋白，其用作tam受体家族(包括axl)的配体。gas6由含有多个γ-羧基谷氨酸残基(gla)的n-末端区构成，这些γ-羧基谷氨酸残基负责与带负电的磷脂膜的特异性相互作用。尽管该gla结构域对于gas6与axl的结合不是必要的，但其对于axl的活化是必需的。gas6还可被称为“axl的配体”。如本文所用，术语“单克隆抗体”、“单克隆ab”、“单克隆抗体组合物”、“mab”等，是指具有单分子组成的抗体分子制备物。单克隆抗体组合物针对特定表位显示出单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，其具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可由杂交瘤生产，所述杂交瘤包含得自转基因或转染色体的非-人动物(如转基因小鼠)的b细胞，其基因组包含人重链转基因和轻链转基因，并被融合至永生化细胞。在本发明的上下文中，术语“adc”是指抗体药物缀合物，其在本发明的上下文中是指偶联至治疗性部分、例如如本申请中所述的细胞毒性部分的抗axl抗体。其可以例如用接头偶联至半胱氨酸或用其他缀合方法与其他氨基酸偶联。该部分可以例如是药物或毒素等。如本文所用，“治疗部分”意指当施用于受试者时、特别是当作为如本文所述的adc递送时发挥治疗或预防效果的化合物。“细胞毒性”或“细胞抑制性”部分是对细胞有害(例如杀死)的化合物。用于adc中的一些细胞毒性或细胞抑制性部分是疏水性的，这意味着它们在水中不具有或仅具有有限的溶解度，例如1g/l或更少(非常微溶)，如0.8g/l或更少，如0.6g/l或更少，如0.4g/l或更少，如0.3g/l或更少，如0.2g/l或更少，如0.1g/l或更少(实际上不溶解)。示例性疏水细胞毒性或细胞抑制性部分包括，但不限于，某些微管蛋白抑制剂，如澳瑞他汀及其衍生物，例如mmaf和mmae，以及美登素及其衍生物，例如dm1。在一个实施方案中，所述抗体对axl的结合亲和力(kd)的范围在0.3x10-9至63x10-9m，并且其中所述结合亲和力使用生物膜层干涉技术使用可溶性axl细胞外结构域进行测量。所述结合亲和力可如实施例2中所述测定。因此，在一个实施方案中，所述抗体对抗原的结合亲和力为0.3x10-9至63x10-9m，其中所述结合亲和力通过包括以下步骤的方法测定：i)将抗axl抗体上样到抗人fc捕获生物传感器，并ii)通过生物膜层干涉技术在不同的浓度测定可溶性重组axl细胞外结构域的结合与解离。如本文所用，术语“可溶性重组axl细胞外结构域”，是指已经被重组表达的axl细胞外结构域，其对应于全长蛋白的氨基酸1-447(seqidno:130；参见实施例1)。由于不存在跨膜和细胞内结构域，重组axl细胞外结构域没有附接至例如细胞表面而是留在溶液中。如何重组表达蛋白是众所周知的，参见例如sambrook(1989)，因此，提供此类重组axl细胞外结构域是在技术人员的知识范围内的。在一个实施方案中，所述抗体对axl的解离速率为6.9x10-5s-1至9.7x10-3s-1，并且其中所述解离速率通过生物膜层干涉技术使用可溶性重组axl细胞外结构域进行测量。任选地，所述抗体对axl的解离速率为9.7x10-5s-1至4.4x10-3s-1，并且其中所述解离速率通过生物膜层干涉技术使用可溶性重组axl细胞外结构域进行测量。所述结合亲和力可如上(以及在实施例2中)所述测定。因此，在一个实施方案中，所述抗体对axl的解离速率为6.9x10-5s-1至9.7x10-3s-1，并且其中所述解离速率通过包括以下步骤的方法测量：i)将抗axl抗体上样到抗人fc捕获生物传感器，并ii)通过生物膜层干涉技术在不同的浓度测定重组axl细胞外结构域的结合与解离。如本文所用，术语“解离速率”，是指结合至其抗原的抗原特异性抗体从该抗原解离的速率，并被表示为s-1。因此，在结合axl的抗体的上下文中，术语“解离速率”，是指所述结合axl的抗体从重组的axl细胞外结构域解离，并被表示为s-1。在一个方面，用于本发明的用途的adc包含这样的抗体部分，其结合至axl细胞外结构域而不与gas6竞争结合axl或干扰gas6结合axl。在具体的实施方案中，所述抗体结合至细胞外结构域ig1结构域而不与gas6竞争结合axl或干扰gas6结合axl。在一个实施方案中，所述抗体结合至ig1细胞外结构域并且表现出gas6与axl的最大结合的降低不超过20%。在一个实施方案中，所述抗体表现出gas6与axl的最大结合的降低不超过15%。在一个实施方案中，所述抗体表现出gas6与axl的最大结合的降低不超过10%。在一个实施方案中，所述抗体表现出gas6与axl的最大结合的降低不超过5%。在一个实施方案中，所述抗体表现出gas6与axl的最大结合的降低不超过4%。在一个实施方案中，所述抗体表现出gas6与axl的最大结合的降低不超过2%。在一个实施方案中，所述抗体表现出gas6的最大结合的降低不超过1%。在一个实施方案中，所述抗体结合至axl细胞外结构域中的ig2样结构域而不与gas6竞争结合axl或干扰gas6结合axl。在一个实施方案中，所述抗体结合至axl细胞外结构域中的ig2结构域并且表现出gas6与axl的最大结合的降低不超过20%，如不超过15%，如不超过10%，如不超过5%，如不超过4%，如不超过2%，如不超过1%。此类实施方案的与gas6竞争结合或减少gas6结合的能力可如实施例2或实施例12中所公开的进行测定。在一个实施方案中，所述抗体结合至axl细胞外结构域中的ig2结构域而不与gas6竞争结合axl或干扰gas6与axl的最大结合。在一个实施方案中，在存在gas6的情况下的最大抗体结合为在不存在gas6的情况下的结合的至少90%，如至少95%，如至少97%，如至少99%，如至少100%，如通过竞争测定所测定的，其中所述结合至人axl的抗体和所述gas6之间的竞争在与gas6和不与gas6预孵育的a431细胞上确定。抗axl和配体gas6之间对axl的竞争可如实施例2中标题“gas6结合对抗axl结合的干扰”下所述测定。因此，在一个实施方案中，所述抗体不与配体gas6竞争结合axl，其中所述竞争结合是在包括以下步骤的测定法中测定的：i)将表达axl的细胞与gas6一起孵育，ii)加入待测试的抗axl抗体，iii)加入检测抗axl抗体的经荧光标记的二级试剂，并iv)通过facs分析所述细胞。在另一个实施方案中，所述抗体不与配体gas6竞争结合，其中所述竞争结合是在包括以下步骤的测定法中测定的：i)将表达axl的细胞与抗axl抗体一起孵育，ii)加入gas6，iii)加入检测gas6的经荧光标记的二级试剂，并iv)通过facs分析所述细胞。在一个实施方案中，当所述细胞与所述抗体接触时，所述抗体调节表达axl的细胞中的axl相关的信号传导。在一个实施方案中，当所述细胞与所述抗体接触时，所述抗体不调节表达axl的细胞中的axl相关的信号传导。axl相关信号传导的调节的非限制性实例包括细胞内信号传导途径如pi3k/akt、丝裂原活化的蛋白激酶(mapk)、stat或nf-κb级联的调节。在一个实施方案中，所述抗axl抗体或axl-adc与包含选自以下的可变重(vh)区和可变轻(vl)区的抗体竞争结合至axl：(a)包含seqidno:1的vh区和包含seqidno:2的vl区[107]；(b)包含seqidno:5的vh区和包含seqidno:6的vl区[148]；(c)包含seqidno:34的vh区和包含seqidno:35的vl区[733](d)包含seqidno:7的vh区和包含seqidno:9的vl区[154]；(e)包含seqidno:10的vh区和包含seqidno:11的vl区[171]；(f)包含seqidno:16的vh区和包含seqidno:18的vl区[183]；(g)包含seqidno:25的vh区和包含seqidno:26的vl区[613]；(h)包含seqidno:31的vh区和包含seqidno:33的vl区[726]；(i)包含seqidno:3的vh区和包含seqidno:4的vl区[140]；(j)包含seqidno:8的vh区和包含seqidno:9的vl区[154-m103l]；(k)包含seqidno:12的vh区和包含seqidno:13的vl区[172]；(l)包含seqidno:14的vh区和包含seqidno:15的vl区[181]；(m)包含seqidno:17的vh区和包含seqidno:18的vl区[183-n52q]；(n)包含seqidno:19的vh区和包含seqidno:20的vl区[187]；(o)包含seqidno:21的vh区和包含seqidno:22的vl区[608-01]；(p)包含seqidno:23的vh区和包含seqidno:24的vl区[610-01]；(q)包含seqidno:27的vh区和包含seqidno:28的vl区[613-08]；(r)包含seqidno:29的vh区和包含seqidno:30的vl区[620-06]；和(s)包含seqidno:32的vh区和包含seqidno:33的vl区[726-m101l]。当在本文中在抗体和gas6配体的上下文中或在两种或更多种抗体的情况下使用时，术语“与...竞争”或“与...交叉竞争”表明所述抗体分别与配体或另一种抗体(例如，“参照”抗体)竞争与抗原的结合。实施例2描述了如何测试抗axl抗体与axl-配体gas6的竞争的实例。用于两种抗体之间的交叉竞争的优选参照抗体是包含结合区的那些，所述结合区包含本文称为107、148、733、154、171、183、613、726、140、154-m103l、172、181、183-n52q、187、608-01、610-01、613-08、620-06或726-m101l的抗体的vh区和vl区，如表4中所示。特别优选的参照抗体是标记为107的抗体。在一个实施方案中，所述抗axl抗体与根据上述实施方案的任何一种或多种抗体结合axl上的相同表位，如通过其vh和vl序列所定义，例如包含seqidno:1的vh区和包含seqidno:2的vl区[107]。确定抗体所结合的表位的方法是本领域熟知的。因此，技术人员将知道如何确定此类表位。然而，确定抗体是否结合本文描述的任何表位的一个实例将是通过将点突变引入axl细胞外结构域的细胞外结构域，例如用于鉴定参与抗体与抗原结合的氨基酸的目的。在axl细胞外结构域中引入点突变并测试经点突变的axl细胞外结构域的抗体结合是在技术人员的知识范围内的，因为预期点突变对总体3d结构的影响是最小的。实施例3中使用一种替代方法，其中axl结构域特异性通过如下作图：制备人-小鼠嵌合axl突变体组，其中人ig1、ig2、fn1或fn2结构域已被其鼠类似物置换，和确定哪种突变体与抗axl抗体结合。该方法基于这些人axl特异性抗体识别人、而不是小鼠axl的原理。因此，在单独和具体的实施方案中，所述抗体结合至axl的ig1结构域、axl的ig2结构域、axl的fn1结构域或axl的fn2结构域。本实施例中也使用更高分辨率的表位作图方法，其鉴定参与抗体结合的axl细胞外结构域氨基酸。具体地，该方法分析了抗axl抗体与axl序列变体文库的结合，所述axl序列变体文库通过重组衍生自物种的与细胞外结构域中的人axl序列(seqidno:130)具有可变水平同源性的axl序列而产生。该方法基于这些人axl特异性抗体识别人axl、而不是来自该实例中使用的任何其他物种的axl的原理。因此，在一个实施方案中，所述抗体结合至axl的ig1结构域内的表位，且抗体结合取决于对应于人axl的位置l121至q129的一个或多个或所有氨基酸或t112至q124中的一个或多个或全部，其中氨基酸残基的编号是指它们在人axl(seqidno:130)中的相应位置。在一个实施方案中，所述抗体结合至axl的ig1结构域内的表位，且抗体结合取决于对应于人axl的位置l121至q129或t112至q124的氨基酸。在一个优选实施方案中，抗体结合取决于位置l121、g122、h123、q124、t125、f126、v127、s128和q129中的一个或多个或所有氨基酸，其对应于参与本文称为107的抗体的结合的氨基酸。在一个实施方案中，抗体结合取决于位置t112、g113、q114、y115、q116、c117、l118,v119、f120、l121、g122、h123和q124中的一个或多个或所有氨基酸。在另一个实施方案中，所述抗体结合至axl的ig2结构域内的表位，且抗体结合取决于对应于人axl的位置d170或d179的组合的一个或多个或所有氨基酸或位置t182至r190中的一个或多个或所有氨基酸。在一个实施方案中，抗体结合取决于位置t182、a183、p183、g184、h185、g186、p187、q189和r190中的氨基酸。在另一个实施方案中，所述抗体结合至人axl的fn1结构域，且抗体结合取决于对应于人axl的位置q272至a287和g297至p301的一个或多个或所有氨基酸。在一个实施方案中，抗体结合取决于对应于人axl的位置q272至a287和g297至p301的氨基酸。在另一个实施方案中，所述抗体结合至人axl的fn2结构域，且抗体结合取决于对应于人axl的位置a359、r386和q436至k439的一个或多个或所有氨基酸。在又另一个实施方案中，所述抗体结合至axl的ig1结构域内的表位，且该表位包含或需要对应于人axl的位置l121至q129的一个或多个或所有氨基酸或t112至q124中的一个或多个或全部，其中氨基酸残基的编号是指它们在人axl(seqidno:130)中的相应位置。在一个实施方案中，所述抗体结合至axl的ig1结构域内的表位，且该表位包含或需要对应于人axl的位置l121至q129或t112至q124的氨基酸。在一个优选实施方案中，该表位包含位置l121、g122、h123、q124、t125、f126、v127、s128和q129中的一个或多个或所有氨基酸，其对应于参与本文称为107的抗体的结合的氨基酸。在一个实施方案中，该表位包含位置t112、g113、q114、y115、q116、c117、l118,v119、f120、l121、g122、h123和q124中的一个或多个或所有氨基酸。在另一个实施方案中，所述抗体结合至axl的ig2结构域内的表位，且该表位包含或需要对应于人axl的位置d170或d179的组合的一个或多个或所有氨基酸或位置t182至r190中的一个或多个或所有氨基酸。在一个实施方案中，该表位包含或需要位置t182、a183、p183、g184、h185、g186、p187、q189和r190中的氨基酸。在另一个实施方案中，所述抗体结合至人axl的fn1结构域内的表位，所述表位包含或要求对应于人axl的位置q272至a287和g297至p301的一个或多个或所有氨基酸。在一个实施方案中，该表位包含或需要对应于人axl的位置q272至a287和g297至p301的氨基酸。在另一个实施方案中，所述抗体结合至人axl的fn2结构域内的表位，所述表位包含或要求对应于人axl的位置a359、r386和q436至k439的一个或多个或所有氨基酸。在一个实施方案中，所述抗体结合至人axl的fn1样结构域内的表位。在一个实施方案中，所述抗体结合至axl上的表位，所述表位由以下定义的抗体中的任一者识别：a)vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；b)vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；c)vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；d)vh区，其包含分别为seqidno：51、52和53的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154]；e)vh区，其包含分别为seqidno：51、52和54的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154-m103l]；f)vh区，其包含分别为seqidno：57、58和59的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：60、gas和61的cdr1、cdr2和cdr3序列，[171]；g)vh区，其包含分别为seqidno：62、63和64的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：65、gas和66的cdr1、cdr2和cdr3序列，[172]；h)vh区，其包含分别为seqidno：67、68和69的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：70、gas和71的cdr1、cdr2和cdr3序列，[181]；i)vh区，其包含分别为seqidno：72、73和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183]；j)vh区，其包含分别为seqidno：72、74和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183-n52q]；k)vh区，其包含分别为seqidno：78、79和80的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：81、aas和82的cdr1、cdr2和cdr3序列，[187]；l)vh区，其包含分别为seqidno：83、84和85的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：86、gas和87的cdr1、cdr2和cdr3序列，[608-01]；m)vh区，其包含分别为seqidno：88、89和90的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：91、gas和92的cdr1、cdr2和cdr3序列，[610-01]；n)vh区，其包含分别为seqidno：93、94和95的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：96、gas和97的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613]；o)vh区，其包含分别为seqidno：98、99和100的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：10、das和102的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613-08]；p)vh区，其包含分别为seqidno：103、104和105的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：106、gas和107的cdr1、cdr2和cdr3序列，[620-06]；q)vh区，其包含分别为seqidno：108、109和110的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726]；r)vh区，其包含分别为seqidno：108、109和111的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726-m101l]；s)vh区，其包含分别为seqidno：41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：44、aas和45的cdr1、cdr2和cdr3序列，[140]；t)vh区，其包含分别为seqidno：93、94和95的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：128、xas(其中x是d或g)和129的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613/613-08]；u)vh区，其包含分别为seqidno：46、119和120的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148/140]；v)vh区，其包含分别为seqidno：123、124和125的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：60、gas和61的cdr1、cdr2和cdr3序列，[171/172/181]；以及w)vh区，其包含分别为seqidno：121、109和122的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726/187]；以及x)vh区，其包含分别为seqidno：93、126和127的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：96、gas和97的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613/608-01/610-01/620-06]。在一个具体实施方案中，所述抗体结合至axl上的表位，所述表位被任何一种抗体识别，所述抗体通过含有包含选自本文称为107、061、137、148、154-m103l、171、183-n52q、511、613、726-m102l和733的抗体的抗体的vh和vl序列的结合区来定义。如实施例16中所示，这些抗axl抗体内化，且因此适用于adc方法。在一个实施方案中，所述抗体包含至少一个结合区，所述结合区包含选自以下的vh区和vl区：(a)vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；(b)vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；(c)vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；(d)vh区，其包含分别为seqidno：51、52和53的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154]；(e)vh区，其包含分别为seqidno：51、52和54的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154-m103l]；(f)vh区，其包含分别为seqidno：57、58和59的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：60、gas和61的cdr1、cdr2和cdr3序列，[171]；(g)vh区，其包含分别为seqidno：62、63和64的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：65、gas和66的cdr1、cdr2和cdr3序列，[172]；(h)vh区，其包含分别为seqidno：67、68和69的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：70、gas和71的cdr1、cdr2和cdr3序列，[181]；(i)vh区，其包含分别为seqidno：72、73和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183]；(j)vh区，其包含分别为seqidno：72、74和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183-n52q]；(k)vh区，其包含分别为seqidno：78、79和80的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：81、aas和82的cdr1、cdr2和cdr3序列，[187]；(l)vh区，其包含分别为seqidno：83、84和85的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：86、gas和87的cdr1、cdr2和cdr3序列，[608-01]；(m)vh区，其包含分别为seqidno：88、89和90的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：91、gas和92的cdr1、cdr2和cdr3序列，[610-01]；(n)vh区，其包含分别为seqidno：93、94和95的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：96、gas和97的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613]；(o)vh区，其包含分别为seqidno：98、99和100的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：101、das和102的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613-08]；(p)vh区，其包含分别为seqidno：103、104和105的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：106、gas和107的cdr1、cdr2和cdr3序列，[620-06]；(q)vh区，其包含分别为seqidno：108、109和110的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726]；(r)vh区，其包含分别为seqidno：108、109和111的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726-m101l]；(s)vh区，其包含分别为seqidno：41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：44、aas和45的cdr1、cdr2和cdr3序列，[140]；(t)vh区，其包含分别为seqidno：93、94和95的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：128、xas(其中x是d或g)和129的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613/613-08]；(u)vh区，其包含分别为seqidno：46、119和120的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148/140]；(v)vh区，其包含分别为seqidno：123、124和125的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：60、gas和61的cdr1、cdr2和cdr3序列，[171/172/181]；以及(w)vh区，其包含分别为seqidno：121、109和122的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726/187]；以及(x)vh区，其包含分别为seqidno：93、126和127的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：96、gas和97的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613/608-01/610-01/620-06]。在一个实施方案中，所述抗体包含至少一个结合区，所述结合区包含选自以下的vh区和vl区：(a)包含seqidno:1的vh区和包含seqidno:2的vl区[107]；(b)包含seqidno:5的vh区和包含seqidno:6的vl区[148]；(c)包含seqidno:34的vh区和包含seqidno:35的vl区[733](d)包含seqidno:7的vh区和包含seqidno:9的vl区[154]；(e)包含seqidno:10的vh区和包含seqidno:11的vl区[171]；(f)包含seqidno:16的vh区和包含seqidno:18的vl区[183]；(g)包含seqidno:25的vh区和包含seqidno:26的vl区[613]；(h)包含seqidno:31的vh区和包含seqidno:33的vl区[726]；(i)包含seqidno:3的vh区和包含seqidno:4的vl区[140]；(j)包含seqidno:8的vh区和包含seqidno:9的vl区[154-m103l]；(k)包含seqidno:12的vh区和包含seqidno:13的vl区[172]；(l)包含seqidno:14的vh区和包含seqidno:15的vl区[181]；(m)包含seqidno:17的vh区和包含seqidno:18的vl区[183-n52q]；(n)包含seqidno:19的vh区和包含seqidno:20的vl区[187]；(o)包含seqidno:21的vh区和包含seqidno:22的vl区[608-01]；(p)包含seqidno:23的vh区和包含seqidno:24的vl区[610-01]；(q)包含seqidno:27的vh区和包含seqidno:28的vl区[613-08]；(r)包含seqidno:29的vh区和包含seqidno:30的vl区[620-06]；和(s)包含seqidno:32的vh区和包含seqidno:33的vl区[726-m101l]。本发明还提供了这样的抗体，其包含上面提及的抗体的vl区、vh区或一个或多个cdr的功能性变体。在axl抗体的上下文中所用的vl、vh或cdr的功能性变体仍然允许抗体保持至少相当大比例的(至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或以上)亲代抗体的亲和力/亲合力和/或特异性/选择性，并且在一些情况下，此类axl抗体可具有大于亲代抗体的亲和力、选择性和/或特异性。此类功能性变体通常与亲代抗体保持显著的序列同一性。两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享的相同位置的数量的函数(即，%同源性=相同位置数/总位置数x100)，并同时考虑到空位的数量以及每个空位的长度，需要引入所述空位以用于所述两个序列的最佳比对。比较序列并确定两个序列之间的百分比同一性可以使用本领域熟知的数学算法完成。两个氨基酸序列之间的序列同一性可以例如使用如在emboss包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice等人,2000,trendsgenet.16:276-277)、优选版本5.0.0或更晚版本的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)进行测定。使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版本)置换矩阵。needle标记为“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)用作百分比同一性，并且如下计算：(相同的残基x100)/(比对的长度–比对中的空位的总数)。变体的vh、vl和/或cdr序列可大多通过保守置换而不同于亲代抗体序列的那些；例如，变体置换中的至少约35%、约50%或以上、约60%或以上、约70%或以上、约75%或以上、约80%或以上、约85%或以上、约90%或以上(例如，约65-95%，如约92%、93%或94%)是保守氨基酸残基替换。变体的vh、vl和/或cdr序列可大多通过保守置换而不同于亲代抗体序列的那些；例如，变体置换中的10或更少，如9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、2或更少或1个是保守氨基酸残基替换。还提供了实施方案，其中在前述实施方案的可变重链和/或可变轻链的三个cdr序列中允许最多达五个突变或置换的突变或置换。所述最多达五个突变或置换可分布在可变重链的三个cdr序列和可变轻链的三个cdr序列中。所述最多达五个突变或置换可分布在结合区的六个cdr序列中。所述突变或置换可以是保守、物理或功能氨基酸的突变或置换，使得突变或置换不改变表位或优选地对表位的结合亲和力的改变不超过30%，如不超过20%或如不超过10%。所述保守、物理或功能氨基酸选自发现的20种天然氨基酸，即arg、his、lys、asp、glu、ser、thr、asn、gln、cys、gly、pro、ala、ile、leu、met、phe、trp、tyr和val。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含至少一个结合区，所述结合区包含vh区和vl区，所述vh区和vl区选自与以下具有至少90％、如至少95％、如至少97％、如至少99%同一性的vh和vl序列：(a)包含seqidno:1的vh区和包含seqidno:2的vl区[107]；(b)包含seqidno:5的vh区和包含seqidno:6的vl区[148]；(c)包含seqidno:34的vh区和包含seqidno:35的vl区[733](d)包含seqidno:7的vh区和包含seqidno:9的vl区[154]；(e)包含seqidno:10的vh区和包含seqidno:11的vl区[171]；(f)包含seqidno:16的vh区和包含seqidno:18的vl区[183]；(g)包含seqidno:25的vh区和包含seqidno:26的vl区[613]；(h)包含seqidno:31的vh区和包含seqidno:33的vl区[726]；(i)包含seqidno:3的vh区和包含seqidno:4的vl区[140]；(j)包含seqidno:8的vh区和包含seqidno:9的vl区[154-m103l]；(k)包含seqidno:12的vh区和包含seqidno:13的vl区[172]；(l)包含seqidno:14的vh区和包含seqidno:15的vl区[181]；(m)包含seqidno:17的vh区和包含seqidno:18的vl区[183-n52q]；(n)包含seqidno:19的vh区和包含seqidno:20的vl区[187]；(o)包含seqidno:21的vh区和包含seqidno:22的vl区[608-01]；(p)包含seqidno:23的vh区和包含seqidno:24的vl区[610-01]；(q)包含seqidno:27的vh区和包含seqidno:28的vl区[613-08]；(r)包含seqidno:29的vh区和包含seqidno:30的vl区[620-06]；和(s)包含seqidno:32的vh区和包含seqidno:33的vl区[726-m101l]。本发明还提供了这样的抗体，其包含所述实例的抗体的vl区、vh区或一个或多个cdr的功能性变体。在axl抗体的上下文中所用的vl、vh或cdr的功能性变体仍然允许抗体保留至少相当大比例(至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或以上)的亲代抗体的亲和力/亲合力和/或特异性/选择性，并且在一些情况下，此类axl抗体可以与比亲代抗体更大的亲和力、选择性和/或特异性相关。此类功能性变体通常保留与亲代抗体显著的序列同一性。两个序列之间的百分比同一性是所述序列共享的相同位置的数量的函数(即，%同源性=相同位置数/总位置数x100)，其考虑空位的数量以及每个空位的长度，其需要引入以用于所述两个序列的最佳比对。比较序列和确定两个序列之间的百分比同一性可以使用本领域熟知的数学算法完成。变体的vh、vl和/或cdr序列可以主要通过保守置换而不同于亲代抗体序列的那些；例如，变体置换中的至少约35%、约50%或以上、约60%或以上、约70%或以上、约75%或以上、约80%或以上、约85%或以上、约90%或以上(例如，约65-95%，如约92%、93%或94%)是保守氨基酸残基替换。变体的vh、vl和/或cdr序列可以主要通过保守置换而不同于亲代抗体序列的那些；例如，变体中的置换中的10或更少，如9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、2或更少或1个是保守氨基酸残基替换。还提供了实施方案，其中在前述实施方案的可变重链和/或可变轻链的三个cdr序列中允许最多达五个突变或置换的突变或置换。所述最多达五个突变或置换可分布在可变重链的三个cdr序列和可变轻链的三个cdr序列中。所述最多达五个突变或置换可分布在结合区的六个cdr序列中。所述突变或置换可以是保守、物理或功能氨基酸的突变或置换，使得突变或置换不改变表位或优选地对表位的结合亲和力的改变不超过30%，如不超过20%或如不超过10%。所述保守、物理或功能氨基酸选自发现的20种天然氨基酸，即arg、his、lys、asp、glu、ser、thr、asn、gln、cys、gly、pro、ala、ile、leu、met、phe、trp、tyr和val。在一个实施方案中，所述抗体包含至少一个结合区，所述结合区包含vh区和vl区，所述vh区和vl区选自与以下具有至少90％、如至少95％、如至少97％、如至少99%同一性的vh和vl序列：(t)包含seqidno:1的vh区和包含seqidno:2的vl区[107]；(u)包含seqidno:5的vh区和包含seqidno:6的vl区[148]；(v)包含seqidno:34的vh区和包含seqidno:35的vl区[733](w)包含seqidno:7的vh区和包含seqidno:9的vl区[154]；(x)包含seqidno:10的vh区和包含seqidno:11的vl区[171]；(y)包含seqidno:16的vh区和包含seqidno:18的vl区[183]；(z)包含seqidno:25的vh区和包含seqidno:26的vl区[613]；(aa)包含seqidno:31的vh区和包含seqidno:33的vl区[726]；(bb)包含seqidno:3的vh区和包含seqidno:4的vl区[140]；(cc)包含seqidno:8的vh区和包含seqidno:9的vl区[154-m103l]；(dd)包含seqidno:12的vh区和包含seqidno:13的vl区[172]；(ee)包含seqidno:14的vh区和包含seqidno:15的vl区[181]；(ff)包含seqidno:17的vh区和包含seqidno:18的vl区[183-n52q]；(gg)包含seqidno:19的vh区和包含seqidno:20的vl区[187]；(hh)包含seqidno:21的vh区和包含seqidno:22的vl区[608-01]；(ii)包含seqidno:23的vh区和包含seqidno:24的vl区[610-01]；(jj)包含seqidno:27的vh区和包含seqidno:28的vl区[613-08]；(kk)包含seqidno:29的vh区和包含seqidno:30的vl区[620-06]；和(ll)包含seqidno:32的vh区和包含seqidno:33的vl区[726-m101l]。在一个实施方案中，所述抗体包含至少一个结合区，所述结合区包含本领域已知的抗axl抗体、例如以下任一者中所述的抗体的vh和vlcdr1、cdr2和cdr3序列：leconet等人(2013)、li等人(2009)、ye等人(2010)、iida等人(2014)、wo2012/175691(inserm)、wo2012/175692(inserm)、wo2013/064685(pierrefabrémedicaments)、wo2013/090776(inserm)、wo2009/063965(chugaipharmaceuticals)、wo2010/131733、wo2011/159980(genentech)、wo09062690(u3pharma)、wo2010130751(u3pharma)、wo2014093707(stanforduniversity)和ep2228392a1(chugai)，其全部都以其整体通过引用并入。在一个具体实施方案中，所述抗体是鼠抗体1613f12或wo2014174111(pierrefabrémedicament)中描述的其嵌合或人源化变体，其中小鼠抗体1613f12的vh和vl序列分别作为seqid:8和seqid:7呈现。1613f12的人源化抗体变体的vh序列选自本文作为seqidno:29至49和seqidno:82中公开的序列，并且1613f12的人源化抗体变体的vl序列选自本文作为seqidno:17至28和seqid:81中公开的序列。一种特定抗体包含其中分别作为seqidno:29和17公开的vh和vl序列。小鼠、嵌合和人源化1613f12的vhcdr1、cdr2和cdr3序列分别为seqidno:4、5和6，且小鼠和人源化1613f12的vlcdr1、cdr2和cdr3序列在其中分别作为seqidno:1、2和3公开。在一个具体实施方案中，所述抗体是在wo2011159980(hoffman-laroche)中描述的抗体，其以其整体通过引用并入，特别是第[0127]至[0229]段(第28-52页)。例如，所述抗体可以包含抗体yw327.6s2的vh和vl高变区(hvr)或vh和vl区，其在本文中公开为seqidno:7、8和9(分别为vhhvr1、2和3)、seqidno:10、11和12(分别为vlhvr1、2和3)和seqidno:103和104(分别为vh和vl序列)。在一个实施方案中，所述抗体介导抗体介导的细胞表面axl分子的交联或聚集(例如，由于axl结合的抗体的fc区结合至表达fcr的细胞)，其可以导致所述细胞的凋亡。在一个实施方案中，所述抗体在效应子细胞存在的情况下axl特异性抗体结合至表达axl的细胞的质膜后诱导针对表达axl的细胞的fc依赖性细胞应答，如adcc或adcp。在此类实施方案中，所述抗体的抗体部分通常是全长的并且具有导致adcc或adcp应答的同种型如例如igg1,κ同种型。在一个实施方案中，在补体蛋白、如存在于正常人血清中的补体蛋白(其可以被活化)存在的情况下，axl特异性抗体结合至表达axl的细胞的质膜后，所述抗体诱导针对表达axl的细胞的cdc应答。在此类实施方案中，所述抗体通常是全长的并且具有能够诱导补体系统活化的同种型如例如igg1,κ同种型。所述抗体和/或adc可以进一步通过结合至axl后的内化来表征。因此，在一个实施方案中，将所述抗体和/或adc内化并运输至溶酶体，用于抗axl抗体-接头-药物复合物的特异性(即可切割接头)或非特异性(不可切割接头)蛋白水解切割。在一个实施方案中，所述抗体干扰axl介导的先天或适应性免疫应答的调节，如通过抗体与表达axl的巨噬细胞、树突细胞或nk细胞的结合。在一个实施方案中，adc的治疗性部分经由接头与抗体部分连接，一旦adc内化，例如通过改变ph或还原性条件，其允许释放药物。合适的接头技术是本领域已知的，如本文所述。在一个实施方案中，所述抗体包含选自igg1、igg2、igg3和igg4的同种型的重链。在一个进一步实施方案中，所述抗体包含选自人igg1、igg2、igg3和igg4的同种型的重链。如本文所用，术语“同种型”，是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm)或其任何同种异型如igg1m(za)和igg1m(f)。另外，各重链同种型均可以与κ(κ)或λ(λ)轻链组合。在一个实施方案中，所述同种型是igg1，如人igg1，任选地是同种异型igg1m(f)。在一个实施方案中，所述抗体是全长单克隆抗体，任选地是全长人单克隆igg1,κ抗体。术语“全长抗体”，当用于本文中时，是指这样的抗体(例如，亲代或变异抗体)，其含有对应于通常存在于该同种型的野生型抗体中的那些的所有重链和轻链恒定结构域和可变结构域。根据本发明的全长抗体可通过包括以下步骤的方法生产：(i)将cdr序列克隆到合适的载体中，所述载体包含完整的重链序列和完整的轻链序列，并且(ii)在合适的表达系统中表达所述完整的重链和轻链序列。从cdr序列或完整可变区序列开始生产全长抗体是在技术人员的知识范围内的。因此，技术人员将知道如何生成根据本发明的全长抗体。在一个实施方案中，所述抗体是人抗体。如本文所用，术语“人抗体”，旨在包括这样的抗体，其具有源自人类种系免疫球蛋白序列的可变区和框架区以及人免疫球蛋白恒定结构域。本发明的人抗体可包括不是由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸(例如，由体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变、插入或缺失)。然而，如本文所用，术语“人抗体”，不旨在包括这样的抗体，其中源自另一非人物种(如小鼠)种系的cdr序列已经被嫁接到人框架序列上。如本文所用，人抗体是“源自”特定种系序列，如果所述抗体得自使用人免疫球蛋白序列的系统，例如通过免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或通过筛选人免疫球蛋白基因文库，并且其中所选定的人抗体在氨基酸序列上与由所述种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%，如至少95%，例如至少96%，如至少97%，例如至少98%，或如至少99%相同。通常，在重链cdr3之外，源自特定人类种系序列的人抗体将显示出与由所述种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过20个氨基酸的差异，例如，不超过10个氨基酸的差异，如不超过9、8、7、6或5，例如不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。根据本发明的抗体可在免疫球蛋白重链和/或轻链中包含氨基酸修饰。在具体的实施方案中，所述抗体的fc区中的氨基酸可被修饰。如本文所用，术语“fc区”，是指这样的区，其在抗体的n-至c-末端的方向上包含至少铰链区、ch2区和ch3区。抗体的fc区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应子细胞)和补体系统的组分。如本文所用，术语“铰链区”，是指免疫球蛋白重链的铰链区。因此，例如，人igg1抗体的铰链区对应于氨基酸216-230(根据如kabat中所示的eu编号)kabat等人(1991)。然而，所述铰链区也可以是如本文所述的任何其它亚型。如本文所用，术语“ch1区”或“ch1结构域”，是指免疫球蛋白重链的ch1区。因此，例如，人igg1抗体的ch1区对应于氨基酸118-215(根据如kabat中所示的eu编号)kabat等人(1991)。然而，所述ch1区也可以是如本文所述的任何其它亚型。如本文所用，术语“ch2区”或“ch2结构域”，是指免疫球蛋白重链的ch2区。因此，例如，人igg1抗体的ch2区对应于氨基酸231-340(根据如kabat中所示的eu编号)kabat等人(1991)。然而，所述ch2区也可以是如本文所述的任何其它亚型。如本文所用，术语“ch3区”或“ch3结构域”，是指免疫球蛋白重链的ch3区。因此，例如，人igg1抗体的ch3区对应于氨基酸341-447(根据如kabat中所示的eu编号)kabat等人(1991)。然而，所述ch3区也可以是如本文所述的任何其它亚型。在另一个实施方案中，所述抗体是效应子功能缺陷型抗体、稳定igg4抗体或单价抗体。在一个具体的实施方案中，所述重链已经过修饰使得整个铰链区已经缺失。在一个实施方案中，所述抗体序列已经过修饰使得其不包含任何n-连接糖基化的受体位点。在一个实施方案中，所述抗体是单链抗体。在另外的方面，本发明涉及多特异性抗体，其包含至少根据本文所述的任何方面或实施方案的抗体的第一结合区，和结合不同于所述第一结合区的靶标或表位的第二结合区。如本文所用，术语“多特异性抗体”，是指这样的抗体，其中结合区结合至少两种(如至少三种)不同抗原或相同抗原上的至少两种(如至少三种)不同表位。在一个实施方案中，本发明涉及使用包含双特异性抗体的adc，所述双特异性抗体包含根据本文所述的任何方面或实施方案的抗体的第一结合区，和结合不同于所述第一结合区的靶标或表位的第二结合区。如本文所用，术语“双特异性”，是指结合分子，如这样的抗体，其中所述结合分子的结合区结合两种不同抗原或相同抗原上的两种不同表位。术语“双特异性抗体”是指对至少两种不同的(通常不重叠的)表位具有特异性的抗体。此类表位可以是在相同或不同靶标上。如果所述表位在不同靶标上，则此类靶标可以是在相同细胞或不同细胞、细胞类型或结构(如细胞外组织)上。如本文所用，术语“不同靶标”，是指不同于axl或axl片段的另一蛋白、分子等。可用于本发明的双特异性抗体分子的实例包括：(i)单抗体，其具有包含不同的抗原结合区的两条臂；(ii)单链抗体，其对两种不同的表位具有特异性，例如，经由通过另外的肽接头串联连接的两个scfv；(iii)双可变结构域抗体(dvd-igtm)，其中各轻链和重链均含有通过短的肽键串联的两个可变结构域(wu等人,2010)；(iv)化学连接的双特异性(fab’)2片段；(v)tandab®，其为融合两个单链双抗体而得到的四价双特异性抗体，其针对每种靶抗原各具有两个结合位点；(vi)flexibody，其为scfv与双抗体组合而得到的多价分子；(vii)所谓的“对接并锁定”分子(dock-and-lock®)，基于蛋白激酶a中的“二聚化和对接结构域”，当其应用于fab时，可以得到由连接至不同的fab片段的两个相同的fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(viii)所谓的scorpion分子，包含例如融合至人fab臂的两末端的两个scfv；以及(ix)双抗体。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是双抗体、交叉抗体(cross-body)如crossmab，或经由受控fab臂交换(如wo2011/131746,genmaba/s中所述)得到的双特异性抗体。不同类别的双特异性抗体的实例包括但不限于：(i)igg样分子，其具有互补ch3结构域以迫使异二聚化；(ii)重组igg样双靶向分子，其中所述分子的两侧各自含有至少两种不同抗体的fab片段或fab片段的部分；(iii)igg融合分子，其中全长igg抗体被融合至额外的fab片段或fab片段的部分；(iv)fc融合分子，其中单链fv分子或稳定双抗体被融合至重链恒定结构域、fc区或其部分；(v)fab融合分子，其中不同的fab片段被融合在一起，被融合至重链恒定结构域、fc区或其部分；以及(vi)基于scfv的抗体和基于双抗体的抗体以及重链抗体(例如，结构域抗体、nanobodies®)，其中不同的单链fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，结构域抗体、nanobodies®)相互融合或被融合至另一蛋白或载体分子，被融合至重链恒定结构域、fc区或其部分。具有互补的ch3结构域分子的igg样分子的实例包括但不限于triomab®(trionpharma/freseniusbiotech,wo/2002/020039)、knobs-into-holes(genentech、wo9850431)、crossmabs(roche、wo2009/080251、wo2009/080252、wo2009/080253)、静电匹配的fc-异源二聚分子(amgen、ep1870459和wo2009089004；chugai、us201000155133；oncomed、wo2010129304)、luz-y(genentech)、dig-体、pig-体和tig-体(pharmabcine)、链交换工程改造的结构域体(seedbody)(emdserono、wo2007110205)、双特异性igg1和igg2(pfizer/rinat、wo11143545)、不对称支架(zymeworks/merck、wo2012058768)、mab-fv(xencor、wo2011028952)、xmab(xencor)、二价双特异性抗体(roche、wo2009/080254)、双特异性igg(elililly)、duobody®分子(genmaba/s、wo2011/131746)、duetmab(medimmune、us2014/0348839)、biclonics(merus、wo2013/157953)、novimmune(κλbodies、wo2012/023053)、fcδadp(regeneron、wo2010/151792)、(dt)-ig(gsk/domantis)、二合一抗体或双重作用fabs(genentech、adimab)、mab2(f-star、wo2008003116)、zybodies™(zyngenia)、covx-体(covx/pfizer)、fynomabs(covagen/janssencilag)、dutamab(dutalys/roche)、imab(medimmune)、双重可变结构域(dvd)-igtm(abbott、us7,612,18)、双重结构域双头抗体(unilever；sanofiaventis、wo20100226923)、ts2ab(medimmune/az)、bsab(zymogenetics)、hercules(biogenidec、us007951918)、scfv-融合体(genentech/roche、novartis、immunomedics、changzhouadambiotechinc、cn102250246)、tvab(roche、wo2012025525、wo2012025530)、scfv/fc融合体、scorpion(emergentbiosolutions/trubion、zymogenetics/bms)、interceptor(emergent)、双重亲和力重新靶向技术(fc-darttm)(macrogenics、wo2008/157379、wo2010/080538)、beat(glenmark)、二-双体(imclone/elililly)和化学交联的mabs(karmanoscancercenter)以及共价融合的mabs(aimmtherapeutics)。重组igg样双靶向分子的实例包括但不限于：双靶向(dt)-ig(gsk/domantis)、二合一抗体(genentech)、交联mab(karmanoscancercenter)、mab2(f-star,wo2008003116)、zybodiestm(zyngenia)、采用相同轻链的方法(crucell/merus,us7,262,028)、κλbodies(novimmune)以及covx-body(covx/pfizer)。igg融合分子的实例包括但不限于：双可变结构域(dvd)-igtm(abbott,us7,612,181)、双结构域双头抗体(unilever；sanofiaventis,wo20100226923)、igg样双特异性(imclone/elililly)、ts2ab(medimmune/az)和bsab(zymogenetics)、hercules(biogenidec,us7,951,918)、scfv融合(novartis)、scfv融合(changzhouadambiotechinc,cn102250246)以及tvab(roche,wo2012025525、wo2012025530)。fc融合分子的实例包括但不限于：scfv/fc融合(academicinstitution)、scorpion(emergentbiosolutions/trubion,zymogenetics/bms)、双亲和力再靶向技术(fc-darttm)(macrogenics,wo2008157379和wo2010080538)以及双(scfv)2-fab(nationalresearchcenterforantibodymedicine–china)。fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于：f(ab)2(medarex/amgen)、双功能或双fab(genentech)、dock-and-lock®(dnl)(immunomedics)、二价双特异性(biotecnol)以及fab-fv(ucb-celltech)。基于scfv的抗体、基于双抗体的抗体和结构域抗体的实例包括但不限于：双特异性t细胞接合子(bite®)(micromet,tandemdiabody(tandabtm)(affimed)、双亲和力再靶向技术(dart)(macrogenics)、单链双抗体(academic)、tcr样抗体(ait,receptorlogics)、人血清白蛋白scfv融合(merrimack)以及combody(epigenbiotech)、双靶向nanobodies®(ablynx)、双靶向的仅含重链的结构域抗体。根据本发明的用作adc的双特异性抗体可通过在所述抗体的恒定区中引入修饰而生成。在一个具体的实施方案中，所述双特异性抗体包含第一和第二重链，所述第一和第二重链中的每一者均包含至少铰链区、ch2和ch3区，其中在所述第一重链中，在对应于人igg1重链中选自以下位置的位置中的氨基酸中的至少一个已经被置换：k409、t366、l368、k370、d399、f405和y407，并且在所述第二重链中，在对应于人igg1重链中选自以下位置的位置中的氨基酸中的至少一个已经被置换：f405、t366、l368、k370、d399、y407和k409，并且其中所述第一和所述第二重链不在相同位置发生置换。在一个实施方案中，在所述第一重链中，在对应于人igg1重链的k409的位置中的氨基酸不是k、l或m，而任选地在对应于人igg1重链的f405的位置中的氨基酸是f，并且在所述第二重链中，在对应于人igg1重链的f405的位置中的氨基酸不是f，而在对应于人igg1重链的k409的位置中的氨基酸是k。在一个实施方案中，在所述第一重链中，在对应于人igg1重链的f405的位置中的氨基酸不是f、r和g，并且在所述第二重链中，在对应于人igg1重链中选自以下位置的位置中的氨基酸已经被置换：t366、l368、k370、d399、y407和k409。在一个实施方案中，在所述第一重链中，在对应于人igg1重链的k409的位置中的氨基酸不是k、l或m，并且在所述第二重链中，在对应于人igg1重链的f405的位置中的氨基酸不是f，而任选地在对应于人igg1重链的k409的位置中的氨基酸是k。在一个实施方案中，在所述第一重链中，在对应于人igg1重链的f405的位置中的氨基酸是l，并且在所述第二重链中，在对应于人igg1重链的k409的位置中的氨基酸是r，或反之亦然。因此，在一个实施方案中，在所述第一重链中，在对应于人igg1重链的k409的位置中的氨基酸是r，并且在所述第二重链中，在对应于人igg1重链的f405的位置中的氨基酸是l。除非另行说明或与上下文相抵触，否则所述恒定区序列的氨基酸在本文中根据eu编号索引进行编号(在kabat,1991中有述)。术语“eu编号索引”和“如kabat中所示的eu编号”可以互换使用并具有相同的含义和目的。因此，一个序列中的氨基酸或节段“对应于”另一序列中的氨基酸或节段，是指使用标准序列比对程序(如align、clustalw之类)通常在默认设置下其与另一氨基酸或节段对齐，并与人igg1重链具有至少50%、至少80%、至少90%或至少95%的同一性。如何比对序列或序列中的节段并从而确定根据本发明的氨基酸位置在序列中的对应位置，这是本领域熟知的。如本文所用，术语“对应于位置的氨基酸”，是指人igg1重链中的氨基酸位置编号。术语“氨基酸”和“氨基酸残基”在本文中可互换使用，并且不应当理解为限制性的。在本发明的上下文中，氨基酸可被定义为保守或非保守氨基酸，并且可据此进行分类。氨基酸残基还可被划分成由可替换的物理和功能特性定义的类别。因此，氨基酸的类别可反映在以下列表之一或两者中：保守类氨基酸残基酸性残基：d和e碱性残基：k、r和h亲水性不带电残基：s、t、n和q脂族不带电残基：g、a、v、l和i非极性不带电残基：c、m和p芳族残基：f、y和w可替换的物理和功能类氨基酸残基含醇残基：s和t脂族残基：i、l、v和m环烯基相关残基：f、h、w和y疏水性残基：a、c、f、g、h、i、l、m、r、t、v、w和y带负电残基：d和e极性残基：c、d、e、h、k、n、q、r、s和t带正电残基：h、k和r小型残基：a、c、d、g、n、p、s、t和v超小型残基：a、g和s涉及转角形成的残基：a、c、d、e、g、h、k、n、q、r、s、p和t柔性残基：q、t、k、s、g、p、d、e和r在本发明的上下文中，抗体中的置换被表示为：原始氨基酸–位置–置换氨基酸；参见公认的氨基酸命名法，使用三字母代码或单字母代码(包括代码“xaa”或“x”)表示任何氨基酸残基。因此，xaa或x可通常表示20种天然存在的氨基酸中的任一种。如本文所用，术语“天然存在的”，是指下列氨基酸残基中的任一者：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸。因此，符号“k409r”或“lys409arg”意指抗体在氨基酸位置409包含精氨酸对赖氨酸的置换。将给定位置的氨基酸置换成任何其它氨基酸被称为：原始氨基酸–位置；或例如“k409”对于其中原始氨基酸和/或置换氨基酸可包含不止一个但并非全部氨基酸的修饰，所述不止一个氨基酸可由“，”或“/”分隔。例如，位置409的赖氨酸被精氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸置换是：“lys409arg，ala，phe”或“lys409arg/ala/phe”或“k409r，a，f”或“k409r/a/f”或“k409至r，a或f”。此类标号在本发明的上下文中可互换使用但具有相同含义和目的。此外，术语“置换”包括置换成其它十九种天然氨基酸中的任一种，或置换成其它氨基酸如非天然氨基酸。例如，位置409的氨基酸k的置换包括下列置换中的每一者：409a、409c、409d、409e、409f、409g、409h、409i、409l、409m、409n、409q、409r、409s、409t、409v、409w、409p和409y。顺便一提，这等同于标号409x，其中x代表不同于原始氨基酸的任何氨基酸。这些置换还可标记为k409a、k409c等，或k409a，c等，或k409a/c/等。这同样适用于本文提及的每个及所有位置，以在本文中特别包括此类置换中的任一者。根据本发明的抗体还可包含氨基酸残基的缺失。此类缺失可记作“del”，并包括例如写作k409del。因此，在此类实施方案中，位置409的赖氨酸已经从氨基酸序列中缺失。在一个实施方案中，所述双特异性抗体的第一和第二结合区均结合axl。然而，所述第一结合区包含不同于所述第二结合区的一组cdr序列。因此，在一个具体实施方案中，所述双特异性抗体包含第一和第二结合区以及第一和第二重链，其中所述第一结合区和所述第二结合区各自包含选自以下的vh和vl区：a)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；b)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；c)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：44、aas和45的cdr1、cdr2和cdr3序列，[140]；d)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：51、52和55的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154]；e)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：51、52和54的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154-m103l]；f)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：57、58和59的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：60、gas和61的cdr1、cdr2和cdr3序列，[171]；g)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：62、63和64的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：65、gas和66的cdr1、cdr2和cdr3序列，[172]；h)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：67、68和69的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：70、gas和71的cdr1、cdr2和cdr3序列，[181]；i)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：72、73和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183]；j)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：72、74和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183-n52q]；k)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：78、79和80的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：81、aas和82的cdr1、cdr2和cdr3序列，[187]；l)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：83、84和85的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：86、gas和87的cdr1、cdr2和cdr3序列，[608-01]；m)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：88、89和90的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：91、gas和92的cdr1、cdr2和cdr3序列，[610-01]；n)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：94、95和95的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：96、gas和97的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613]；o)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：98、99和100的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：101、das和102的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613-08]；p)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：103、104和105的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：106、gas和107的cdr1、cdr2和cdr3序列，[620-06]；q)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：108、109和110的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726]；r)第一vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：108、109和111的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726-m101l]；s)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；t)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：44、aas和45的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；u)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：51、52和55的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154]；v)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：51、52和54的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154-m103l]；w)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：57、58和59的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：60、gas和61的cdr1、cdr2和cdr3序列，[171]；x)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：62、63和64的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：65、gas和66的cdr1、cdr2和cdr3序列，[172]；y)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：67、68和69的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：70、gas和71的cdr1、cdr2和cdr3序列，[181]；z)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：72、73和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183]；aa)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：72、74和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183-n52q]；bb)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：78、79和80的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：81、aas和82的cdr1、cdr2和cdr3序列，[187]；cc)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：83、84和85的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：86、gas和87的cdr1、cdr2和cdr3序列，[608-01]；dd)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：88、89和90的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：91、gas和92的cdr1、cdr2和cdr3序列，[610-01]；ee)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：94、95和95的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：96、gas和97的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613]；ff)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：98、99和100的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：101、das和102的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613-08]；gg)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：103、104和105的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：106、gas和107的cdr1、cdr2和cdr3序列，[620-06]；hh)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：108、109和110的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726]；ii)第一vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：108、109和111的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726-m101l]；jj)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：44、aas和45的cdr1、cdr2和cdr3序列，[140]；kk)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：51、52和55的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154]；ll)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：51、52和54的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154-m103l]；mm)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：57、58和59的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：60、gas和61的cdr1、cdr2和cdr3序列，[171]；nn)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：62、63和64的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：65、gas和66的cdr1、cdr2和cdr3序列，[172]；oo)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：67、68和69的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：70、gas和71的cdr1、cdr2和cdr3序列，[181]；pp)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：72、73和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183]；qq)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：72、74和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183-n52q]；rr)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：78、79和80的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：81、aas和82的cdr1、cdr2和cdr3序列，[187]；ss)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：83、84和85的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：86、gas和87的cdr1、cdr2和cdr3序列，[608-01]；tt)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：88、89和90的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：91、gas和92的cdr1、cdr2和cdr3序列，[610-01]；uu)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：94、95和95的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：96、gas和97的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613]；vv)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：98、99和100的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：101、das和102的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613-08]；ww)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：103、104和105的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：106、gas和107的cdr1、cdr2和cdr3序列，[620-06]；xx)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：108、109和110的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726]；以及yy)第一vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第一vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；以及第二vh区，其包含分别为seqidno：108、109和111的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及第二vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726-m101l]；缀合至细胞毒性剂、药物等的抗体也被称为抗体－药物缀合物(adc)。adc可具有这样长时间的半衰期，其足以使抗体-药物缀合物内化、降解，并通过所释放的毒素诱导细胞杀伤。因此，adc可以包含抗axl抗体或双特异性抗体和治疗部分，如细胞毒性剂、化疗药物等。所述细胞毒性剂、化疗药物等可经由接头缀合至所述抗体或所述双特异性抗体。adc经常被设计成使得当缀合至抗体时，细胞毒性有效载荷失活。细胞毒性有效载荷可在adc结合至细胞质膜后而内化时或响应于肿瘤微环境中的蛋白水解活性，而细胞内释放。如本文所用，术语“内化的”或“内化”，是指这样的生物学过程，其中分子(如axl-adc)被细胞膜包住并卷入细胞内部。其也被称为“内吞作用”。因此，在一些情况下，可能需要使用发生内化的抗体。此类具有良好内化特性的抗体可适于缀合至细胞毒性剂、药物等，任选地经由接头，所述接头被设计为细胞内裂解。一旦内化，在大多数情况下，adc可被递送至溶酶体，其中有效药物释放利用了这些细胞器内的分解代谢环境。通常由接头连接抗体与细胞毒性剂。因此，已经设计了专用的接头，其仅在靶标肿瘤细胞内或其上存在的特定微环境中或在肿瘤微环境中被裂解。实例包括由酸性条件、还原条件或特定蛋白酶裂解的接头。抗体-接头-药物在循环中的稳定性很重要，因为这允许抗体介导的针对特定靶细胞的药物递送。另外，adc的长循环半衰期在注射后提供若干天至数周的暴露。通过不可裂解的接头和可蛋白酶裂解的接头缀合的药物通常在循环中比二硫接头和腙接头更稳定，但是后两种接头的稳定性可以通过改变相邻化学结构而调节(alley等人,2010)。在一个实施方案中，所述治疗部分是细胞毒性剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的(例如，杀死)任何试剂。适用于形成用于本发明中的adc的细胞毒性剂包括：紫杉醇、tubulysins、duostatins、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、tenoposide、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基二酮炭疽、美登素或其类似物或衍生物、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素；卡奇霉素或其类似物或衍生物；抗代谢药物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨、克拉屈滨)、烷化剂(如氮芥、噻替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)、洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、达卡巴嗪(dtic)、甲基苄肼、丝裂霉素c、顺铂及其它铂衍生物如卡波铂；以及多卡霉素a、多卡霉素sa、cc-1065(又名rachelmycin)或cc-1065的类似物或衍生物)、多拉司他汀、澳瑞他汀(auristatin)、吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮杂䓬类药物(pdb)、吲哚并苯二氮杂䓬(ign)或其类似物；抗生素(如更生霉素(原名放线菌素)、博来霉素、柔比星(原名柔红霉素)、多柔比星、依达比星、光辉霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、氨茴霉素(amc))；抗有丝分裂剂(例如，微管素靶向剂)，如白喉毒素及相关分子(如白喉a链及其活性片段和杂交分子)；蓖麻毒素(如蓖麻毒素a或去糖基化的蓖麻毒素a链毒素)、霍乱毒素，志贺样毒素(slt-i、slt-ii、slt-iiv)、lt毒素、c3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆bowman-birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、alorin、皂素、蒴莲根毒素、gelanin、相思子毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-帚曲霉素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥阜草抑制剂、白树毒素、丝裂蛋白(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素和依诺霉素毒素。其它合适的缀合分子包括：抗微生物/裂解肽，如clip、magainin2、蜂毒肽、天蚕抗菌肽和p18；核糖核酸酶(rnase)、dnasei、葡萄球菌肠毒素-a、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素和假单胞菌内毒素。参见，例如，pastan等人，cell47,641(1986)和goldenberg,calif.acancerjournalforclinicians44,43(1994)。可与如本文中他处所述的根据本发明使用的抗axl抗体或抗体-药物缀合物组合施用的治疗剂，如，例如，抗癌细胞因子或趋化因子，也是可用于与根据本发明使用中公开的抗体缀合的治疗部分的候选者。如本文所用，术语“细胞毒性剂”，是指对细胞有害的(例如，杀死)任何试剂。关于本领域熟知的这些类别的药物及其作用机制的说明，参见goodman等人(1990)。与制备抗体免疫毒素相关的另外的技术在例如vitetta等人(1993)和us5,194,594中提供。在一个实施方案中，所述细胞毒性剂通过可裂解接头连接至所述抗体或其片段，所述接头如4-(2-吡啶二硫代)-戊酸n-琥珀酰亚胺酯(ssp)、马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄氧基羰基(mc-vc-pab)或av-1k-lock缬氨酸-瓜氨酸。如本文所用，术语“可裂解的接头”，是指接头的子集，其由靶细胞中或肿瘤微环境中的特定蛋白酶催化，导致细胞毒性剂释放。可裂解接头的实例是基于化学基序(包括二硫化物、腙或肽)的接头。另一子集的可裂解接头，在细胞毒性剂与主要接头之间添加额外的接头基序，即，将接头－药物组合附接至抗体的位点。在一些实施方案中，所述额外的接头基序可由存在于细胞内环境中(例如，溶酶体或内涵体或小凹内)的裂解剂裂解。所述接头可以是，例如，由细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体蛋白酶或内涵体蛋白酶)裂解的肽接头。在一些实施方案中，所述肽接头的长度为至少两个氨基酸或至少三个氨基酸。裂解剂可以包括组织蛋白酶b和d以及纤溶酶，已知其均水解二肽药物衍生物，导致活性药物在靶细胞内部释放(参见，例如，dubowchik和walker,1999,pharm.therapeutics83:67-123)。在特定的实施方案中，所述可由细胞内蛋白酶裂解的肽接头是val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)接头或phe-lys(苯丙氨酸-赖氨酸)接头(参见，例如，us6214345，其描述了含有val-cit接头的多柔比星的合成)。使用细胞内蛋白水解释放治疗剂的优点在于所述试剂在缀合时通常经过减毒，并且该缀合物的血清稳定性通常较高。在另一个实施方案中，所述细胞毒性剂通过不可裂解的接头连接至所述抗体或其片段，所述不可裂解的接头如4(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酸亚胺酯(mcc)或马来酰亚胺基己酰基(mc)。如本文所用，术语“不可裂解的接头”，是指接头的子集，与可裂解接头相反，其不包含由细胞内或细胞外蛋白酶特异性并预测性识别的基序。因此，基于不可裂解接头的adc不会从抗体释放或裂解，直到整个抗体-接头-药物复合物在溶酶体腔中被降解。不可裂解接头的实例是硫醚。在又另一个实施方案中，所述接头单元不可裂解，并且所述药物通过抗体降解而释放(参见us2005/0238649)。通常，此类接头基本上对细胞外环境不敏感。如本文所用，“基本上对细胞外环境不敏感”在接头的上下文中意指，当抗体药物缀合化合物存在于细胞外环境(例如血浆)中时，在所述抗体药物缀合化合物的样品中不超过20%，通常不超过约15%，更通常不超过约10%，并且甚至更通常不超过约5%，不超过约3%，或不超过约1%的接头被裂解。接头是否基本上对细胞外环境不敏感可以例如通过如下方式来测定：将抗体药物缀合化合物与血浆孵育预定的时间(例如，2、4、8、16或24小时)，并随后对存在于血浆中的游离药物的量进行定量。在一个实施方案中，细胞毒性剂选自：dna靶向剂，例如，dna烷化剂和交联剂，如卡奇霉素、多卡霉素、rachelmycin(cc-1065)、吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮杂䓬(pbd)和吲哚并苯二氮杂䓬(ign)；微管靶向剂，如duostatin如duostatin-3、澳瑞他汀如单甲基澳瑞他汀e(mmae)和单甲基澳瑞他汀f(mmaf)、多拉司他汀、美登素、n(2’)-脱乙酰基-n(2’)-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(dm1)和tubulysin；以及核苷类似物；或其类似物、衍生物或前药。在一个实施方案中，所述axl-adc包含以下组合：i)可裂解接头和具有旁观者杀伤能力的细胞毒性剂；ii)可裂解接头和不具有旁观者杀伤能力的细胞毒性剂；iii)不可裂解接头和具有旁观者杀伤能力的细胞毒性剂；或iv)不可裂解接头和不具有旁观者杀伤能力的细胞毒性剂。如本文所用，术语“旁观者杀伤效应”、“旁观者杀伤”、“旁观者杀伤能力”或“旁观者细胞毒性”，是指这样的效应，其中通过可裂解或不可裂解接头缀合至抗体的细胞毒性剂在从抗体释放后有能力扩散穿过细胞膜，并从而引起对相邻细胞的杀伤。当细胞毒性剂通过可裂解或不可裂解接头缀合时，其可为具有旁观者杀伤能力的仅细胞毒性剂或含有所述接头的一部分的细胞毒性剂。扩散穿过细胞膜的能力与细胞毒性剂或细胞毒性剂和接头的组合的疏水性有关。此类细胞毒性剂可有利地是可透过膜的毒素，如已经通过蛋白酶从抗体释放的mmae。尤其是在具有异质靶表达的肿瘤和其中抗体穿透可能受限的实体瘤中，旁观者杀伤效应可能是期望的。如本文所用，术语“无旁观者杀伤能力”、“无旁观者杀伤效应”、“无旁观者杀伤”或“无旁观者细胞毒性”，是指这样的效应，其中通过可裂解或不可裂解接头缀合至抗体的细胞毒性剂在从抗体释放后没有能力扩散穿过细胞膜。因此，此类细胞毒性剂或细胞毒性剂与接头的组合当从抗体释放后将无法杀伤相邻细胞。据信，不受理论的约束，细胞毒性剂与可裂解或不可裂解接头的此类组合将仅杀伤表达抗体所结合的靶标的细胞。抗体与细胞毒性剂之间的稳定连接是adc的重要因素。可裂解和不可裂解类型的接头均已经在临床前和临床试验中被证明是安全的。在一个实施方案中，所述细胞毒性剂选自微管靶向剂，如澳瑞他汀和美登素生物碱。如本文所用，术语“微管靶向剂”，是指抑制有丝分裂(细胞分裂)的试剂或药物。微管是对于细胞分裂期间dna的正确分离而言必不可少的结构，并且微管的功能关键取决于‘动态不稳定性’，即，微管结构被不断拉长和缩短的过程。微管靶向剂破坏或稳定微管，其阻止有丝分裂纺锤体的形成，导致有丝分裂停滞和细胞凋亡。所述微管靶向剂可以源自例如天然物质如植物碱，并通过破坏或稳定微管聚合来阻止细胞发生有丝分裂，因此阻止有丝分裂纺锤体的形成以及后续的细胞分裂，导致对癌生长的抑制。微管靶向剂的实例是：紫杉醇、多西他赛、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、duostatins、澳瑞他汀、美登素生物碱、tubulysins和多拉司他汀。在一个实施方案中，所述细胞毒性剂是澳瑞他汀或澳瑞他汀肽类似物和衍生物(us5,635,483;us5,780,588)。已经证明，澳瑞他汀干扰微管动力学、gtp水解以及细胞核和细胞分裂(woyke等人,2001)，并且具有抗癌(us5,663,149)和抗真菌活性(pettit,1998)。澳瑞他汀药物部分可经由接头通过肽药物部分的n(氨基)末端或c(羧基)末端被附接至抗体。示例性澳瑞他汀实施方案包括n-末端连接的单甲基澳瑞他汀药物部分de和df，在senter等人(2004)中公开并在us2005/0238649中有述。在具体的实施方案中，所述细胞毒性剂是单甲基澳瑞他汀e(mmae)；其中抗体通过合适的接头被连接至mmae的以上化学结构的左手侧的氮(n)。在一个实施方案中，所述细胞毒性剂单甲基澳瑞他汀e(mmae)经由缬氨酸-瓜氨酸(vc)接头被连接至抗体。在另一个实施方案中，所述细胞毒性剂单甲基澳瑞他汀e(mmae)经由缬氨酸-瓜氨酸(vc)接头和马来酰亚胺基己酰基(mc)接头被连接至抗体，其中所述细胞毒性剂与所述接头的组合具有化学结构；其中mab是抗体。在一个实施方案中，所述细胞毒性剂是单甲基澳瑞他汀f(mmaf)；其中抗体通过合适的接头被连接至mmaf的以上化学结构的左手侧的氮(n)。在一个实施方案中，所述细胞毒性剂单甲基澳瑞他汀f(mmaf)经由马来酰亚胺基己酰基(mc)接头被连接至抗体，其中所述细胞毒性剂与接头的组合具有化学结构；其中mab是抗体。在一个实施方案中，所述细胞毒性剂是duostatin3。在另一个具体的实施方案中，所述细胞毒性剂是dna靶向剂。如本文所用，术语“dna靶向剂”，是指特定类别的细胞毒性剂，其能够烷基化和/或交联dna。此类dna作用试剂的实例是包含吲哚并苯二氮杂䓬二聚体和吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮杂䓬(pbd)的ign试剂，由于其烷基化和交联dna的能力而高度有效。另一个实例是包含吲哚并苯二氮杂䓬二聚体的ign试剂，由于其仅烷基化dna的能力而高度有效。多卡霉素是另一类dna作用试剂。多卡霉素是小分子、合成的dna小沟结合烷化剂。这些化合物适于靶向实体瘤以及血液肿瘤。在一个实施方案中，所述axl-adc包含两到四个细胞毒性分子/抗体。取决于毒素和接头-毒素组合的化学性质，两到四个细胞毒性分子/抗体可优于更大载荷的缀合物(其相比更低载荷的缀合物，被更迅速地从循环中清除)。细胞毒性剂载荷由p表示，并且是分子中细胞毒性剂部分/抗体的平均数(也被称为药物抗体比率，dar)。细胞毒性剂载荷的范围在1至20个药物部分/抗体，并且可存在于含有用的官能团(如但不限于氨基或巯基)的氨基酸(如赖氨酸或半胱氨酸)上。在一个实施方案中，细胞毒性剂/抗体的数量为1至8，如2至7，如2至6，如2至5，如2至4，以及如2至3。在另一个实施方案中，所述axl-adc包含四到八个细胞毒性分子/抗体。在另一个实施方案中，所述axl-adc包含六到十个细胞毒性分子/抗体。在又另一个实施方案中，所述axl-adc包含10到30，如15到25，如20个细胞毒性分子/抗体。取决于缀合方式，p可受限于抗体上的附接位点的数量，例如当附接是半胱氨酸巯基或赖氨酸时。通常，抗体不含许多游离且有反应性的半胱氨酸巯基，这些基团可如抗体中的大多数半胱氨酸巯基残基一样作为二硫桥键被连接至药物部分。因此，在这些实施方案中，当细胞毒性剂经由半胱氨酸巯基缀合时，所述抗体可在部分或完全还原条件下被还原剂(如二硫苏糖醇(dtt)或三羰基乙基膦(tcep))还原，以生成反应性半胱氨酸巯基。在某些实施方案中，本发明的adc的药物载荷范围在1至约8，因为在抗体(部分)还原后将有最多8个游离半胱氨酸巯基变得可用(有8个半胱氨酸参与链间二硫键合)。在一个实施方案中，所述药物接头部分是vcmmae。vcmmae药物接头部分和缀合方法在wo2004/010957；us7,659,241；us7,829,531；和us7,851,437(seattlegenetics；其各自通过引用并入本文中)中公开。vcmmae通过将接头mc-vc-pab与细胞毒性部分mmae缀合而形成，并且使用与文献中所公开的那些类似的方法将vcmmae药物接头部分结合至抗axl抗体的半胱氨酸残基处，如实施例8中所述。在一个实施方案中，所述药物接头部分是mcmmaf。mcmmaf药物接头部分和缀合方法在us7,498,298；us7,994,135和wo2005/081711(seattlegenetics；其通过引用并入本文中)中公开，并且使用与文献中所公开的那些类似的方法将mcmmaf药物接头部分结合至抗axl抗体的半胱氨酸残基处。在一个实施方案中，所述细胞毒性剂通过如wo2013/173391,wo2013/173392和wo2013/173393(concortisbiosystems)中所述的k-locktm缀合而被连接至抗体氨基酸序列内的1或2个赖氨酸。也可以使用与文献中所公开的那些类似的方法将duostatin3(也称为duo3)结合至抗axl抗体的赖氨酸残基处。其它接头技术可用于根据本发明使用的抗axl抗体药物缀合物中，如包含羟基的接头。在一个实施方案中，所述接头连接至通过(部分)还原抗axl抗体获得的抗axl抗体的游离半胱氨酸残基。在一个具体实施方案中，所述接头是mc-vc-pab且所述细胞毒性剂是mmae；或所述接头是ssp且所述细胞毒性剂是dm1。在一个具体实施方案中，所述接头是mmc且所述细胞毒性剂是dm1；或所述接头是mc且所述细胞毒性剂是mmaf。在一个具体实施方案中，所述接头是可切割的接头av1-k锁且所述细胞毒性剂是duostatin3。在一个实施方案中，所述axl-adc包含接头mc-vc-pab、细胞毒性剂mmae和抗体，其中所述至少一个结合区包含选自以下的vh区和vl区；在一个实施方案中，所述抗体包含至少一个结合区，所述结合区包含选自以下的vh区和vl区：(a)vh区，其包含分别为seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列，[107]；(b)vh区，其包含分别为seqidno：46、47和48的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148]；(c)vh区，其包含分别为seqidno：114、115和116的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：117、das和118的cdr1、cdr2和cdr3序列，[733]；(d)vh区，其包含分别为seqidno：51、52和53的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154]；(e)vh区，其包含分别为seqidno：51、52和54的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：55、gas和56的cdr1、cdr2和cdr3序列，[154-m103l]；(f)vh区，其包含分别为seqidno：57、58和59的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：60、gas和61的cdr1、cdr2和cdr3序列，[171]；(g)vh区，其包含分别为seqidno：62、63和64的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：65、gas和66的cdr1、cdr2和cdr3序列，[172]；(h)vh区，其包含分别为seqidno：67、68和69的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：70、gas和71的cdr1、cdr2和cdr3序列，[181]；(i)vh区，其包含分别为seqidno：72、73和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183]；(j)vh区，其包含分别为seqidno：72、74和75的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：76、ats和77的cdr1、cdr2和cdr3序列，[183-n52q]；(k)vh区，其包含分别为seqidno：78、79和80的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：81、aas和82的cdr1、cdr2和cdr3序列，[187]；(l)vh区，其包含分别为seqidno：83、84和85的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：86、gas和87的cdr1、cdr2和cdr3序列，[608-01]；(m)vh区，其包含分别为seqidno：88、89和90的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：91、gas和92的cdr1、cdr2和cdr3序列，[610-01]；(n)vh区，其包含分别为seqidno：93、94和95的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：96、gas和97的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613]；(o)vh区，其包含分别为seqidno：98、99和100的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：101、das和102的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613-08]；(p)vh区，其包含分别为seqidno：103、104和105的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：106、gas和107的cdr1、cdr2和cdr3序列，[620-06]；(q)vh区，其包含分别为seqidno：108、109和110的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726]；(r)vh区，其包含分别为seqidno：108、109和111的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726-m101l]；(s)vh区，其包含分别为seqidno：41、42和43的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：44、aas和45的cdr1、cdr2和cdr3序列，[140]；(t)vh区，其包含分别为seqidno：93、94和95的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：128、xas(其中x是d或g)和129的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613/613-08]；(u)vh区，其包含分别为seqidno：46、119和120的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：49、aas和50的cdr1、cdr2和cdr3序列，[148/140]；(v)vh区，其包含分别为seqidno：123、124和125的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：60、gas和61的cdr1、cdr2和cdr3序列，[171/172/181]；以及(w)vh区，其包含分别为seqidno：121、109和122的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：112、aas和113的cdr1、cdr2和cdr3序列，[726/187]；以及(x)vh区，其包含分别为seqidno：93、126和127的cdr1、cdr2和cdr3序列；以及vl区，其包含分别为seqidno：96、gas和97的cdr1、cdr2和cdr3序列，[613/608-01/610-01/620-06]。在另一个可替换的实施方案中，抗axl抗体药物缀合物包含缀合的核酸或核酸相关分子。在一个此类实施方案中，所述缀合的核酸是：细胞毒性核糖核酸酶、反义核酸、抑制性rna分子(例如，sirna分子)或免疫刺激性核酸(例如，含有免疫刺激性cpg基序的dna分子)。在另一个可替换的实施方案中，抗axl抗体被缀合至适体或核酶或其功能性肽类似物或衍生物。在另一个可替换的实施方案中，提供了包含一种或多种放射性标记的氨基酸的抗axl抗体药物缀合物。放射性标记的抗axl抗体可同时用于诊断和治疗目的(缀合至放射性标记的分子是另一个可能的特征)。用于多肽的标记的非限制性实例包括：3h、14c、15n、35s、90y、99tc以及125i、131i和186re。用于制备放射性标记的氨基酸及相关肽衍生物的方法是本领域已知的(参见例如junghans等人(1996)；us4,681,581；us4,735,210；us5,101,827；us5,102,990；us5,648,471;和us5,697,902)。例如，卤素放射性同位素可通过氯胺t法缀合。在一个实施方案中，所述抗体缀合至放射性同位素或含有放射性同位素的螯合物。例如，所述抗体可以缀合至螯合剂接头，例如dota、dtpa或tiuxetan，其允许所述抗体与放射性同位素复合。所述抗体还可能或可替换地包含或缀合至一种或多种放射性标记的氨基酸或其它放射性标记的分子。放射性标记的抗axl抗体可同时用于诊断和治疗目的。放射性同位素的非限制性实例包括：3h、14c、15n、35s、90y、99tc、125i、111in、131i、186re、213bs、225ac和227th。抗axl抗体还可通过共价缀合至聚合物而进行化学修饰以例如延长其循环半衰期。示例性聚合物以及将其附接至肽的方法在例如us4,766,106；us4,179,337；us4,495,285和us4,609,546中说明。另外的聚合物包括聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(peg)(例如，分子量在约1,000至约40,000之间，如约2,000至约20,000之间的peg)。这可例如用于如果抗axl抗体是片段的情况。可采用本领域已知的任何用于将根据抗axl抗体缀合至缀合分子(如以上所述的那些)的方法，包括由hunter等人(1974),pain等人(1981)andnygren(1982)所述的方法。此类抗体可通过将其它部分化学缀合至抗axl抗体(例如，抗axl抗体h或l链)的n-末端侧或c-末端侧来生产(参见，例如，kanemitsu,1994)。在适当情况下，此类缀合的抗体衍生物还可通过在以下部分缀合而生成：内部残基或糖类、或已经被引入到抗体恒定结构域中的非天然存在的氨基酸或另外的氨基酸。试剂可直接或间接偶联至抗axl抗体。间接连接第二试剂的一个实例是经由间隔部分连接至抗体中的半胱氨酸或赖氨酸残基。在一个实施方案中，抗axl抗体经由间隔或接头缀合至前药分子(其可以经体内活化而成为治疗药物)。施用后，所述间隔或接头通过肿瘤细胞相关的酶或其它肿瘤特异性条件被裂解，由此形成活性药物。此类前药技术和接头的实例在wo2002/083180,wo2004/043493,wo2007/018431,wo2007/089149,wo2009/017394和wo2010/62171(syngentabv；其各自通过引用并入本文中)中有述。合适的抗体-前药技术和多卡霉素类似物也可见于us6,989,452(medarex；通过引用并入本文中)中。在一个实施方案中，抗axl抗体被附接至螯合剂接头，例如tiuxetan，其允许抗体缀合至放射性同位素。在一个方面，本发明涉及包含结合至人axl的抗体的adc，其用于与braf抑制剂、mek抑制剂或braf抑制剂和mek抑制剂的组合组合治疗受试者的黑色素瘤，其中adc包含抗体，所述抗体包含至少一个结合区，所述结合区含有包含分别seqidno：36、37和38的cdr1、cdr2和cdr3序列的vh区；以及包含分别seqidno：39、gas和40的cdr1、cdr2和cdr3序列的vl区，[107]，adc通过mc-vc-pab接头与mmae连接，以及axl-adc和所述至少一种抑制剂同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，所述至少一个结合区包含含有seqidno：1的vh区和含有seqidno：2的vl区。任选地，抗体的同种型是igg1，例如同种异型igg1m(f)。抗体可以是全长单克隆抗体，例如全长单克隆igg1,κ抗体。在一个实施方案中，braf抑制剂选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib和索拉菲尼，并且黑色素瘤在选自v600、l597和k601的braf残基中表现出突变，例如选自v600e、v600k、v600d、l597r和k601e的braf突变。在一个实施方案中，braf抑制剂是威罗菲尼。在一个实施方案中，braf抑制剂是达拉菲尼。在一个实施方案中，braf抑制剂是encorafenib。在一个实施方案中，braf抑制剂是索拉菲尼。在一个实施方案中，黑色素瘤在nras中表现出突变，例如在选自q61、g12和g13的nras残基中，例如选自q61r、q61k、q61l、g12d、g12s、g12c、g12v、g13d和g13r的nras中的突变。在一个实施方案中，mek抑制剂选自曲美替尼、cobimetinib、binimetinib和selumetinib。在一个实施方案中，mek抑制剂是曲美替尼。在一个实施方案中，mek抑制剂是cobimetinib。在一个实施方案中，mek抑制剂是binimetinib。在一个实施方案中，mek抑制剂是selumetinib。在一个实施方案中，axl-adc与选自(a)至(p)的braf抑制剂和mek抑制剂组合使用：(a)威罗菲尼和曲美替尼；(b)威罗菲尼和cobimetinib；(c)威罗菲尼和binimetinib；(d)威罗菲尼和selumetinib；(e)达拉非尼和曲美替尼；(f)达拉非尼和cobimetinib；(g)达拉非尼和binimetinib；(h)达拉非尼和selumetinib；(i)encorafenib和曲美替尼；(j)encorafenib和cobimetinib；(k)encorafenib和binimetinib；(l)encorafenib和selumetinib；(m)索拉菲尼和曲美替尼；(n)索拉菲尼和cobimetinib；(o)索拉菲尼和binimetinib；和(p)索拉菲尼和selumetinib。组合物和试剂盒根据本发明使用的axl-adc可以以组合物的形式施用。在一个方面，所述组合物是包含axl-adc和药物载体的药物组合物。在一个实施方案中，根据任何前述方面或实施方案，axl-adc或包含axl-adc的药物组合物用于与至少一种mapk途径抑制剂组合治疗黑色素瘤，所述mapk途径抑制剂例如至少一种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。通常，组合的axl-adc和抑制剂分开施用并配制成分开的药物组合物。然而，在一个实施方案中，包含axl-adc的药物组合物还包含至少一种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如braf抑制剂、mek抑制剂或其组合，其中肿瘤正在或已经用所述丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂治疗。根据本发明使用的axl-adc与至少一种丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂组合也可以以试剂盒的形式提供，用于同时、分开或顺序施用，其中所述试剂盒可以进一步包含使用说明。在一个实施方案中，组合、组合物或试剂盒中的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂选自威罗菲尼、达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼、plx4720、曲美替尼、cobimetinib、binimetinib、selumetinib、vtx11e和ltt-4620。在一个实施方案中，组合、组合物或试剂盒中的braf抑制剂是威罗菲尼或其治疗有效的类似物或衍生物，例如达拉菲尼、encorafenib、索拉菲尼或plx4720。在一个实施方案中，braf抑制剂是威罗菲尼。在一个实施方案中，braf抑制剂是达拉菲尼。在一个实施方案中，braf抑制剂是encorafenib。在一个实施方案中，braf-抑制剂是索拉菲尼。在一个实施方案中，组合、组合物或试剂盒中的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂包含至少一种braf抑制剂和至少一种mek-抑制剂，其中所述至少一种braf-抑制剂选自威罗菲尼、达拉菲尼及其组合，并且其中mek抑制剂选自selumetinib(azd6244)和曲美替尼，及其组合。例如，组合、组合物或试剂盒可包含达拉菲尼和曲美替尼；威罗菲尼和曲美替尼；达拉菲尼、威罗菲尼和曲美替尼；达拉菲尼和selumetinib；或威罗菲尼和selumetinib。或者，组合、组合物或试剂盒可包含(a)威罗菲尼和曲美替尼；(b)威罗菲尼和cobimetinib；(c)威罗菲尼和binimetinib；(d)威罗菲尼和selumetinib；(e)达拉非尼和曲美替尼；(f)达拉非尼和cobimetinib；(g)达拉非尼和binimetinib；(h)达拉非尼和selumetinib；(i)encorafenib和曲美替尼；(j)encorafenib和cobimetinib；(k)encorafenib和binimetinib；(l)encorafenib和selumetinib；(m)索拉菲尼和曲美替尼；(n)索拉菲尼和cobimetinib；(o)索拉菲尼和binimetinib；或(p)索拉菲尼和selumetinib。如果需要，所述试剂盒可以进一步包括各种常规药物试剂盒组分中的一种或多种，如例如具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、额外的容器等，这对于本领域技术人员是显而易见的。所述试剂盒中也可以包括作为插页或标签的印刷说明，其说明待施用的组分的量、施用指南和/或混合组分的指南。所述药物组合物可与药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知佐剂和赋形剂根据常规技术(如remington：thescienceandpracticeofpharmacy(1995)中所公开的那些)一起配制。所述药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知佐剂和赋形剂应当适用于axl-adc以及所选择的施用模式。载体及药物组合物的其它组分的适用性是基于对所选择的化合物或药物组合物的所需生物学特性缺乏显著负面影响(例如，在抗原结合后没有实质性影响(10%或更少的相对抑制、5%或更少的相对抑制，等))而确定的。药物组合物还可包含稀释剂、填充剂、盐类、缓冲剂、洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂，如tween-20或tween-80)、稳定剂(例如，糖类或不含蛋白的氨基酸)、防腐剂、组织固定剂、增溶剂和/或适合包含在药物组合物中的其它材料。药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，从而获得活性成分的量，所述量有效实现具体患者、组合物和施用模式的所需治疗应答，而对该患者没有毒性。所选剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括：具体组合物的活性、施用途径、施用时间、所采用的具体化合物的排泄率、治疗持续时间、与所采用的具体组合物联合使用的其它药物、化合物和/或材料、接受治疗的患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和既往病史等医学领域熟知的因素。所述药物组合物可通过任何合适途径和模式施用。体内和体外施用本发明的化合物的合适途径是本领域熟知的，并且可由本领域普通技术人员选择。在一个实施方案中，所述药物组合物经胃肠外施用。如本文所用，术语“胃肠外施用”和“经胃肠外施用”，是指除肠内和局部施用之外的施用模式，通常是通过注射，并且包括：表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔内、腱内、经气管、皮下、表皮下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下腔、椎管内、颅内、胸内、硬膜外以及膜内注射和输注。在一个实施方案中，所述药物组合物通过静脉内或皮下注射或输注施用。药学上可接受的载体包括与用于根据本发明使用的axl-adc或治疗剂在生理上相容的任何及所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、抗氧化剂和吸收延迟剂等。可用于药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括：水、盐水、磷酸盐-缓冲盐水、乙醇、葡萄糖、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物；植物油，如橄榄油、玉米油、花生油、棉籽油和芝麻油；羧甲基纤维素胶体溶液、黄蓍胶和可注射有机酯如油酸乙酯，和/或各种缓冲液。其它载体是药学领域熟知的。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或用于无菌注射溶液或分散剂的临时制备的分散剂和无菌粉末。对药物活性物质使用此类介质和试剂是本领域已知的。除非该常规介质或试剂与所述活性化合物不相容，否则设想了其在药物组合物中的使用。可例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、通过在分散的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂例如：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(bha)、丁基化羟基甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。药物组合物还可在组合物中包含等渗剂，如糖类、多元醇(如甘露醇、山梨醇、甘油)或氯化钠。药物组合物还可含有一种或多种适用于所选施用途径的佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、防腐剂或缓冲剂，其可提高所述药物组合物的保质期或有效性。用于本发明的用途的axl-adc或治疗剂可与载体一起制备成如受控释放制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊化递送系统，所述载体将保护所述化合物免于迅速释放。此类载体可包括：明胶、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、可生物降解的生物相容性聚合物(如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚-原酸酯和聚乳酸)本身或与蜡一起，或本领域熟知的其它材料。制备此类制剂的方法对于本领域技术人员是众所周知的。参见例如robinbson：sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems(1978)。在一个实施方案中，化合物可经配制以确保正确的体内分布。用于胃肠外施用的药学上可接受的载体包括无菌水溶液或用于无菌注射溶液或分散剂的临时制备的分散剂和无菌粉末。对药物活性物质使用此类介质和试剂是本领域已知的。除非该常规介质或试剂与所述活性化合物不相容，否则设想了其在药物组合物中的使用。也可将其它活性或治疗性化合物掺入到所述组合物中。用于注射的药物组合物通常必须是无菌的并且在生产和存储条件下是稳定的。所述组合物可被配制成溶液、微乳液、脂质体、或适合高药物浓度的其它有序结构。载体可以是水性或非水性溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物；植物油，如橄榄油；以及可注射有机酯，如油酸乙酯。可例如通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，将优选在组合物中包含等渗剂，例如，糖类、多元醇(如甘油、甘露醇、山梨醇)或氯化钠。可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸盐和明胶)带来注射组合物的延长吸收。无菌注射溶液可通过如下制备：将适当的溶剂中的所需量的活性化合物与例如以上列举的成分之一或其组合相结合，按照需要，后接灭菌微过滤。通常，通过将活性化合物掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和所需的例如来自以上列举的那些的其它成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法的实例是真空-干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分的粉末加上任何另外的所需成分。无菌注射溶液可通过如下制备：将适当的溶剂中的所需量的活性化合物与以上列举的成分之一或其组合相结合，按照需要，后接灭菌微过滤。通常，通过将活性化合物掺入到无菌媒介物中来制备分散剂，所述无菌媒介物含有基础分散介质和所需的来自以上列举的那些的其它成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末而言，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，所述方法从其先前无菌过滤的溶液中得到活性成分的粉末加上任何另外的所需成分。抗axl抗体的生产根据本发明用作adc的抗体可以在宿主细胞中使用核酸构建体通常以一种或多种表达载体的形式重组制备。在一个实施方案中，所述核酸构建体编码表1中列出的一个或多个序列。在另外的实施方案中，所述表达载体还包含核酸序列，所述核酸序列编码抗体(例如，人igg1,κ单克隆抗体)的轻链、重链或轻链和重链两者的恒定区。所表达的抗axl抗体可随后被缀合至如本文所述的部分。在另一个实施方案中，所述抗axl抗体可随后被用于在缀合之前生成如本文所述的双特异性抗体。表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体的、非染色体的以及合成的核酸载体(包含合适的表达控制元件组的核酸序列)。此类载体的实例包括：sv40的衍生物、细菌质粒、噬菌体dna、杆状病毒、酵母质粒、源自质粒和噬菌体dna的组合的载体、以及病毒核酸(rna或dna)载体。在一个实施方案中，编码抗axl抗体的核酸被包含在裸dna或rna载体中，包括例如：线性表达元件(如例如sykes和johnson(1997)中所述)、致密核酸载体(如例如us6,077,835和/或wo00/70087中所述)、质粒载体如pbr322、puc19/18或puc118/119、“侏儒(midge)”尺寸最小化的核酸载体(如例如schakowski等人(2001)中所述)，或作为沉淀核酸载体构建体，如磷酸钙沉淀构建体(如例如wo00/46147；benvenistyandreshef,1986；wigler等人,1978；和coraroandpearson,1981)中所述)。此类核酸载体及其用法是本领域熟知的(参见例如us5,589,466和us5,973,972)。在一个实施方案中，所述载体适用于在细菌细胞中表达抗axl抗体。此类载体的实例包括表达载体如bluescript(stratagene)、pin载体((vanheeke和schuster,1989)，pet载体(novagen,madisonwi)等)。表达载体还可能或可选地是适用于在酵母系统中表达的载体。可采用适用于在酵母系统中表达的任何载体。合适的载体包括，例如，包含组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和pgh)的载体(在ausubel等人,1987和grant等人,1987中有综述)。核酸构建体和/或载体还可包含编码分泌/定位序列的核酸序列，其可以将多肽(如新生多肽链)靶向至周质空间或进入细胞培养基。此类序列是本领域已知的，并且包括：分泌前导或信号肽、细胞器靶向序列(例如，细胞核定位序列、er驻留信号、线粒体转运序列、叶绿体转运序列)、膜定位/锚定序列(例如，停止转移序列、gpi锚定序列)等。在本表达载体中，编码抗axl抗体的核酸可包含任何合适的启动子、增强子以及其它有助于表达的元件，或与之相关。此类元件的实例包括：强表达启动子(例如，人cmvie启动子/增强子以及rsv、sv40、sl3-3、mmtv和hivltr启动子)、有效的聚(a)终止序列、大肠杆菌中质粒产物的复制起点、作为选择标志物的抗生素抗性基因和/或便利的克隆位点(例如，聚合接头)。核酸还可包含与组成型启动子相对的诱导型启动子，如cmvie(技术人员将认识到此类术语是对特定条件下基因表达程度的实际说明)。在一个实施方案中，所述编码抗axl抗体的表达载体可经由病毒载体而被定位到并且/或者被递送至宿主细胞或宿主动物。宿主细胞可以是重组真核或原核宿主细胞，如转染瘤，其生产如本文定义的本发明的抗axl抗体或如本文定义的本发明的双特异性分子。宿主细胞的实例包括酵母、细菌和哺乳动物细胞，如cho或hek细胞或其衍生物。例如，在一个实施方案中，所述细胞包含稳定整合到细胞基因组中的核酸，所述核酸包含编码表达抗axl抗体的序列。在另一个实施方案中，所述细胞包含非整合核酸(如质粒、粘粒、噬粒或线性表达元件)，所述核酸包含编码表达抗axl抗体的序列。如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)，旨在是指其中已经引入了表达载体的细胞。应该理解，此类术语旨在不仅是指具体所讨论的细胞，还是指此类细胞的子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而出现在后续世代中，所以此类子代可能事实上与亲代细胞不同，但仍然被包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。重组宿主细胞包括例如：转染瘤，如cho细胞、hek-293细胞、per.c6、ns0细胞；和淋巴细胞；以及原核细胞如大肠杆菌和其它真核宿主如植物细胞和真菌。如本文所用，术语“转染瘤”，包括表达抗体或靶抗原的重组真核宿主细胞，如cho细胞、per.c6、ns0细胞、hek-293细胞、植物细胞或真菌，包括酵母细胞。所述抗体可以可选地产生自从小鼠脾b细胞制备的杂交瘤，所述小鼠脾b细胞得自用目标抗原免疫的小鼠，例如以在表面表达所述抗原的细胞或编码axl的细胞外区域的核酸的形式。单克隆抗体还可得自杂交瘤，其源自经免疫的人类或非人哺乳动物如兔子、大鼠、狗、灵长类等的表达抗体的细胞。人抗体可使用转基因或转染色体小鼠生成，例如humab小鼠，其携带人类免疫系统而非小鼠系统的部分。所述humab小鼠含有人类免疫球蛋白基因迷你位点，其编码未重排人类(μ和γ)重链和κ轻链免疫球蛋白序列，以及使内源性µ和κ链位点失活的所靶向突变(lonberg等人,1994a)。因此，所述小鼠在免疫后产生免疫抗体应答，所引入的人类重链和轻链转基因发生类别变换和体细胞突变以生成高亲和力的人类igg,κ单克隆抗体(lonberg等人,1994b；lonberg和huszar,1995；harding和lonberg,1995)。humab小鼠的制备在taylor等人,1992；chen等人,1993；tuaillon等人,1994；和fishwild等人,1996中有详细描述。还参见us5,545,806；us5,569,825；us5,625,126；us5,633,425；us5,789,650；us5,877,397；us5,661,016；us5,814,318；us5,874,299；us5,770,429；us5,545,807；wo98/024884；wo94/025585；wo93/001227；wo92/022645；wo92/003918；和wo01/009187。来自这些转基因小鼠的脾细胞可被用于根据众所周知的技术来生成杂交瘤，其分泌人类单克隆抗体。另外，可以从转基因小鼠或大鼠产生人抗体以产生人-大鼠嵌合抗体，其可以用作完全人单克隆抗体的重组生产的来源。另外，人抗体可通过展示型技术识别，包括但不限于：噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖体展示、哺乳动物展示、酵母展示以及本领域已知的其它技术，并且所得分子可经受额外的成熟，如亲和力成熟，此类技术是本领域熟知的。表2–序列本发明通过下列实施例进一步说明，这些实施例不应被理解为进一步限制性的。实施例实施例1–axl抗体和axladcs的产生第一组axl特异性抗体第一组axl特异性单克隆抗体(抗体igg1-axl-061,igg1-axl-107,igg1-axl-183,igg1-axl-613,igg1-axl-726,igg1-axl-511,igg1-axl-137,igg1-axl-148,igg1-axl-154,igg1-axl-171,igg1-axl-733)通过用如下所述的axl蛋白构建体或细胞免疫转基因小鼠产生。关于纯化抗体的免疫程序、杂交瘤产生和质谱的详细信息，参见wo2016/005593a1的实施例1.axl的表达构建体生成了用于表达各种全长axl变体的下列密码子优化的构建体：人(智人)axl(genbank登录号np_068713.2)、人-食蟹猴嵌合axl，其中人细胞外结构域(ecd)被食蟹猴(macacafascicularis)axl的ecd替换(genbank登录hb387229.1的翻译；aa1-447)、人-小鼠嵌合axl，其中人ecd被小鼠(小家鼠)axl的ecd替换(genbank登录np_033491.2；aa1-441)、人-小鼠嵌合axl，其中人ig样结构域i(aa1-134,在本文中也称为“ig1结构域”)被小鼠axl的ig样结构域i替换、人-小鼠嵌合axl，其中人ig样结构域ii(aa148-194,在本文中也称为“ig2结构域”)被小鼠axl的ig样结构域ii替换、人-小鼠嵌合axl，其中人fniii样结构域i(aa227-329,在本文中也称为“fn1结构域”)被小鼠axl的fniii样结构域i替换、人-小鼠嵌合axl，其中人fniii样结构域ii(aa340-444,在本文中也称为“fn2结构域”)被小鼠axl的fniii样结构域ii替换。另外，生成了各种axlecd变体的下列密码子优化的构建体：人axl的细胞外结构域(ecd)(aa1-447)，其具有c-末端his标签(axlecdhis)、人axl的fniii样结构域ii(aa327-447)，其具有n-末端信号肽和c-末端his标签(axl-fn2ecdhis)、以及人axl的ig1和ig2结构域(aa1-227)，其具有c-末端his标签(axl-ig12ecdhis)。所述构建体含有适用于克隆的限制性位点和最佳kozak(gccgccacc)序列(kozak等人,1999)。所述构建体被克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.3(invitrogen)中。el4细胞中的axl表达用含有完全人axl编码序列的pcdna3.3载体稳定转染el4细胞，并在用抗生素试剂g418(geneticin)选择后选出稳定克隆。纯化经his标签的axl在hek-293f细胞中表达axlecdhis、axl-fn2ecdhis和axl-ig12ecdhis。his标签使得能够用固定化金属亲和层析法纯化。在此方法中，用co2+阳离子使固定在层析树脂上的螯合剂带电。将含有经his标签的蛋白的上清液与所述树脂以成批模式(即溶液)孵育。所述经his标签的蛋白强力结合至树脂珠粒，而相比所述经his标签的蛋白，存在于培养上清液中的其它蛋白不结合或弱结合。孵育后，从上清液中回收珠粒并填装到柱中。洗涤该柱以移除弱结合的蛋白。然后用含有咪唑(其与his竞争结合co2+)的缓冲液洗脱强力结合的经his标签的蛋白。通过在除盐柱上的缓冲液交换从蛋白中移除洗脱液。同种抗原特异性筛选测定经免疫小鼠的血清或humab(人单克隆抗体)杂交瘤或转染瘤的培养上清液中抗axl抗体的存在通过同种抗原特异性筛选测定使用荧光微量测定技术(fmat；appliedbiosystems,fostercity,ca,usa)确定。为此，使用了具有基于4或8细胞测定的组合的两种不同的测试设计。基于4细胞的测定测试设计用于测试来自经免疫小鼠的血清，并且用作杂交瘤或转染瘤培养上清液的初筛测试。在4测定测试设计中，分别分析了样品中人抗体与a431(dsmz)和mda-mb-231细胞(均在细胞表面表达axl)的结合以及与th1021-axl(瞬时表达全长人axl的hek-293f细胞；如上所述产生)和hek293野生型细胞(阴性对照，其不表达axl)的结合。杂交瘤或转染瘤培养上清液样品另外经受基于8细胞测定的测试设计。在8测定测试设计中，分别分析了样品中人抗体与th1021-haxl(瞬时表达人axl的hek-293f细胞)、th1021-caxl(瞬时表达人-食蟹猴axl嵌合体的hek-293f细胞，在所述嵌合体中，人ecd已经被食蟹猴axl的ecd替换)、th1021-maxl(瞬时表达人-小鼠axl嵌合体的hek-293f细胞，在所述嵌合体中，人ecd已经被小鼠axl的ecd替换)、th1021-mig1(瞬时表达人axl的hek-293f细胞，在所述人axl中，ig样结构域i被小鼠axl的ig样结构域i替换)、th1021-mig2(瞬时表达人axl的hek-293f细胞，在所述人axl中，ig样结构域ii被小鼠axl的ig样结构域ii替换)、th1021-mfn1(瞬时表达人axl的hek-293f细胞，在所述人axl中，fniii样结构域i被小鼠axl的fniii样结构域i替换)、th1021-mfn2(瞬时表达人axl的hek-293f细胞，在所述人axl中，fniii样结构域ii被小鼠axl的fniii样结构域ii替换)以及hek293野生型细胞(阴性对照，其不表达axl)的结合。将样品加入到细胞中以允许结合至axl。随后，使用荧光缀合物(山羊抗人iggfcγ-dylight649；jacksonimmunoresearch)检测humab的结合。axl特异性人源化小鼠抗体a0704p(在hek-293f细胞中产生)被用作阳性对照，而humab-小鼠汇集的血清和chrompure人igg、全分子(jacksonimmunoresearch)分别被用作阴性对照。使用appliedbiosystems8200细胞检测系统(8200cds)扫描样品并将平均荧光用作数据读出。当计数高于50并且计数x荧光高于阴性对照至少三倍时，样品被认为呈阳性。axl抗体可变结构域的序列分析以及克隆至表达载体中从0.2至5x106个杂交瘤细胞中制备总rna，并根据制造商说明，使用smartracecdna扩增试剂盒(clontech)从100ng总rna中制备5’-race-互补dna(cdna)。通过pcr扩增vh和vl克隆区，并通过无连接酶克隆在框架内被直接克隆至pg1f和pkappa表达载体中(aslanidis,c.和p.j.dejong,nucleicacidsres1990;18(20)：6069-74)。对于每种抗体，对12个vl克隆和12个vh克隆进行了测序。所得序列示于表2中。cdr序列根据imgt定义(lefranc等人,1999andbrochet,2008)。选择具有正确的开放阅读框(orf)的克隆用于进一步研究和表达。所发现的所有重链和轻链组合的载体均在freestyletm293-f细胞中使用293fectin瞬时共表达。对于抗体igg1-axl-154、igg1-axl-183和igg1-axl-726，生成了下列在可变结构域中具有点突变的变体：igg1-axl-154-m103l、igg1-axl-183-n52q和igg1-axl-726-m101l。使用quickchangeii诱变试剂盒(stratagene)通过定点诱变生成突变体。axl对照抗体在一些实施例中，使用了针对axl的比较抗体(igg1-yw327.6s2)，其已经在之前有过描述(ep2220131,u3pharma；wo2011/159980,genentech)。这些axl特异性抗体的vh和vl序列被克隆到pg1f和pkappa表达载体中。b12抗体在一些实施例中，抗体b12(一种gp120特异性抗体(barbas,1993))被用作阴性对照。表达抗体被表达为igg1,κ。基本上如制造商所述，使用293fectin(invitrogen,us)将同时编码抗体重链和轻链的质粒dna混合物瞬时转染到freestylehek293f细胞(invitrogen,us)中。抗体的纯化将培养上清液通过0.2µm终端过滤器过滤，上样到5mlmabselectsure柱(gehealthcare)并用0.1m柠檬酸钠-naoh,ph3洗脱。将洗脱物立即用2mtris-hcl,ph9中和并过夜透析至12.6mmnah2po4、140mmnacl，ph7.4(b.braun)中。可替换地，在纯化后，将洗脱物上样到hiprep脱盐柱并将抗体交换到12.6mmnah2po4、140mmnacl，ph7.4(b.braun)缓冲液中。透析或缓冲液交换后，将样品通过0.2µm终端过滤器灭菌过滤。通过sds-page确定纯度，并使用octet(fortebio,menlopark,usa)测量igg浓度。将经纯化的抗体保存在4℃。axl特异性抗体511使用下述选择程序，通过如下所述用axl蛋白构建体或细胞免疫转基因小鼠来产生抗体igg1-axl-511。关于免疫程序，杂交瘤产生，从脾细胞中分离rna，引物序列，leepcr以及hc和lc序列的确定和选择的细节，参见wo2016/005593a1。axl的表达构建体生成了用于表达各种全长axl变体的下列密码子优化的构建体：人(智人)axl(genbank登录号np_068713.2)、人-食蟹猴嵌合axl，其中人细胞外结构域(ecd)被食蟹猴(macacafascicularis)axl的ecd替换(genbank登录hb387229.1的翻译；aa1-447)、人-小鼠嵌合axl，其中人ecd被小鼠(小家鼠)axl的ecd替换(genbank登录np_033491.2；aa1-441)、人-小鼠嵌合axl，其中人ig样结构域i(aa1-147,在本文中也称为“ig1结构域”)被小鼠axl的ig样结构域i替换、人-小鼠嵌合axl，其中人ig样结构域ii(aa148-227,在本文中也称为“ig2结构域”)被小鼠axl的ig样结构域ii替换、人-小鼠嵌合axl，其中人fniii样结构域i(aa228-326,在本文中也称为“fn1结构域”)被小鼠axl的fniii样结构域i替换、人-小鼠嵌合axl，其中人fniii样结构域ii(aa327-447,在本文中也称为“fn2结构域”)被小鼠axl的fniii样结构域ii替换。另外，生成了各种axlecd变体的下列密码子优化的构建体：人axl的细胞外结构域(ecd)(aa1-447)，其具有c-末端his标签(axlecdhis)、人axl的fniii样结构域ii(aa327-447)，其具有n-末端信号肽和c-末端his标签(axl-fn2ecdhis)、以及人axl的ig1和ig2结构域(aa1-227)，其具有c-末端his标签(axl-ig12ecdhis)。所述构建体含有适用于克隆的限制性位点和最佳kozak(gccgccacc)序列(kozak等人(1999)gene234：187-208)。所述构建体被克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.3(invitrogen)中。el4细胞中的axl表达用含有全长人axl编码序列的pcdna3.3载体稳定转染el4细胞，并在用抗生素试剂g418(geneticin)选择后选出稳定克隆。纯化经his标签的axl在hek293f细胞中表达axlecdhis、axl-fn2ecdhis和axl-ig12ecdhis，并用固定化金属亲和层析法纯化。hek-293细胞中的瞬时表达抗体被表示为igg1,κ。使用293fectin(lifetechnologies)将同时编码抗体重链和轻链的质粒dna混合物瞬时转染到freestyle293-f(hek293f)细胞(lifetechnologies,usa)中，基本上如vink,t.,等人(2014)所述('asimple,robustandhighlyefficienttransientexpressionsystemforproducingantibodies',methods,65(1),5-10)。对于ab的lee表达，混合1µl的hcleepcr反应混合物、1µl的lcpcr反应混合物和1µl的30ng/µl如vink,t.,等人(2014)中所述的增强复合物(其含有3种表达增强质粒的混合物)，并根据制造商(lifetechnologies)说明，使用293fectin作为转染试剂，以100µl的总体积转染到hek293f细胞中，使用96孔平板作为容器，基本上同上所述。axlecdhiselisa用在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中的0.5µg/mlaxlecdhis以100µl/孔涂布elisa平板(greiner,netherlands)，并在室温(rt)下孵育16小时。移除涂层溶液并通过加入150µlpbstc(含有0.1%tween-20和2%鸡血清的pbs)/孔阻断这些孔并在rt下孵育1小时。将平板用300µlpbst(含有0.1%tween-20的pbs)/孔洗涤三次并加入100µl的测试溶液，然后在rt下孵育1小时。在用300µl的pbst/孔洗涤三次后，加入100µl偶接了辣根过氧化物酶的抗体山羊抗人igg(稀释度1/3000)并在rt下孵育1小时。在用300µl的pbst/孔洗涤三次后，加入100µl的abts(1mg/ml)溶液并在rt下孵育直到观察到足够的信号，并通过加入100µl的2%草酸溶液停止反应。在elisa读出器上于405nm测量96孔平板。多样性筛选分别分析了样品中抗体与th1021-haxl(瞬时表达人axl的hek293f细胞)、th1021-caxl(瞬时表达人-食蟹猴axl嵌合体的hek293f细胞，在所述嵌合体中，人ecd已经被食蟹猴axl的ecd替换)、th1021-maxl(瞬时表达人-小鼠axl嵌合体的hek293f细胞，在所述嵌合体中，人ecd已经被小鼠axl的ecd替换)、th1021-mig1(瞬时表达人axl的hek293f细胞，在所述人axl中，ig样结构域i被小鼠axl的ig样结构域i替换)、th1021-mig2(瞬时表达人axl的hek293f细胞，在所述人axl中，ig样结构域ii被小鼠axl的ig样结构域ii替换)、th1021-mfn1(瞬时表达人axl的hek293f细胞，在所述人axl中，fniii样结构域i被小鼠axl的fniii样结构域i替换)、th1021-mfn2(瞬时表达人axl的hek293f细胞，在所述人axl中，fniii样结构域ii被小鼠axl的fniii样结构域ii替换)以及hek293f细胞(阴性对照，其不表达axl)的结合。将来自lee表达的样品加入到这些细胞中以允许结合至各种axl构建体。随后，使用荧光缀合物(山羊抗人iggfcγ-dylight649；jacksonimmunoresearch)检测抗体的结合。使用appliedbiosystems8200细胞检测系统(8200cds)扫描样品并将平均荧光用作数据读出。当计数高于50并且计数x荧光高于阴性对照至少三倍时，样品被认为呈阳性。抗体511的结合亲和力测定了一种抗axl抗体(克隆511)的亲和力。使用生物膜层干涉技术在fortebiooctetred384上测定亲和力。用higg(1µg/ml)为抗人fc捕获(ahc)生物传感器(fortebio,portsmouth,uk；目录号18-5064)上样150s，目标为加载响应1nm。在基线(150s)后，测定axlecdhis的结合(1000s)与解离(2000s)(如实施例1中所述)，采用2倍稀释步骤，使用10µg/ml–0.16µg/ml(218nm–3nm)的浓度范围。对于计算而言，使用了基于氨基酸序列的axlecdhis的理论分子质量，即46kda。实验在octetred384上进行，并同时在30℃以1000rpm摇动。每一抗体均在三次独立实验中进行了测试。用fortebio数据分析软件v7.0.3.1分析数据，除非另行说明，否则使用1:1模式和全局整体拟合，其中结合时间1000s且解离时间1000s。之所以使用1000s的解离时间(而非采集到的2000s解离时间)，是因为这得到了更好的拟合。通过减去参照曲线(不含axlecdhis的抗体)校正数据轨迹，使y-轴对齐基线的最后5s，并运用了级间校正以及savitzky-golay过滤进行处理。克隆511对axl的亲和力(kd)为23*10-9m(kon1.7*1051/ms和kdis3.9*10-31/s)。duostatin-3合成制备化合物3：向30mlboc-l-苯丙氨酸1(5.36g等,20.2mmol)的二氯甲烷(dcm)溶液中加入羰基二咪唑(cdi,4.26g,26.3mmol)并搅拌1小时。然后加入15ml2(3.67g,30.3mmol)和2,4-二氨基丁酸(dbu,4.5ml,30mmol)的dcm溶液。将混合物在40℃加热16小时。将混合物用60ml的dcm和40ml的水稀释，然后用浓hcl中和至ph7。收集dcm提取物，用0.2mhcl(60ml)然后是盐水(60ml)洗涤，在na2so4上干燥，并蒸发以得到7.47g的boc保护的磺酰胺。将此材料悬浮于40ml的甲醇中，然后加入200ml的6nhcl/异丙醇，并搅拌混合物2小时。在真空下蒸发溶剂，然后加入100ml的醚。通过过滤收集沉淀物并干燥以得到化合物3的hcl盐(5.93g,96%)；msm/z269.1(m+h)。制备化合物5：向10ml化合物4(1.09g,1.6mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶液中依次加入2-(1h-7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铀(hatu,0.61g,1.6mmol)、二异丙基乙胺(diea,0.56ml)和化合物3(0.49g,1.6mmol)。将混合物搅拌1小时并用100ml的水和4ml的乙酸稀释。通过过滤收集沉淀物，在真空下干燥并加入到10ml的4mhcl/二氧杂环己烷中。30min等后，加入200ml的醚并收集不溶的沉淀物并通过hplc纯化以得到化合物5的四氢呋喃盐(tfa,1.3g,88%)；msm/z835.5(m+h)。在整个手稿中，化合物5被称为duostatin-3。制备化合物7：向5ml化合物5(500mg,0.527mmol)的dmf溶液中加入化合物6(483mg,0.631mmol)、n-羟基苯并三唑(hobt,40mg,0.296mmol)和diea(0.27ml)。将混合物搅拌16小时，之后加入0.4ml的哌啶。1小时后，将混合物用100ml的醚稀释并收集沉淀物并干燥以得到化合物7的hcl盐(640mg,95%)；msm/z1240.7(m+h)。制备化合物9：向5ml化合物8(219mg,0.62mmol)的dmf溶液中分别加入hatu(236mg,0.62mmol)、diea(0.15ml)和化合物7(316mg,1.6mmol)。1小时后，加入0.2ml的哌啶并搅拌混合物30min，然后通过hplc纯化以得到化合物9的tfa盐(235mg,64%)；msm/z1353.8(m+h)。制备化合物11：向化合物9(235mg,0.16mmol)的2ml甲醇和1ml水的溶液中加入二醛10(0.3m，在1.6ml的iproh中)和nacnbh3(180mg,2.85mmol)的溶液。将混合物在rt下搅拌2小时，并随后通过hplc纯化得到化合物11的tfa盐(126mg,50%)；msm/z1465.8(m+h)。生成axl特异性抗体-药物缀合物(adc)经纯化的axl抗体igg1-axl-148、igg1-axl-183和igg1-axl-726以及阴性对照抗体igg1-b12由concortisbiosystems,inc.(sandiego,ca)通过共价缀合使用k-lockav1-缬氨酸-瓜氨酸(vc)接头与duostatin-3缀合(concortisbiosystems的wo2013/173391,wo2013/173392和wo2013/173393)。随后分析了所述抗axl抗体药物缀合物的浓度(通过在280nm的吸光度)、药物抗体比率(‘dar’)(通过反相色谱法(rp-hplc)和疏水相互作用色谱法(hic))、未缀合药物的量(通过反相色谱法)、聚集百分比(通过尺寸排阻色谱法，sec-hplc)和内毒素水平(通过lal)。结果如下(表3)：表3igg1-axl-148-vcduostatin3igg1-axl-183-vcduostatin3igg1-axl-726-vcduostatin3igg1-b12-vcduostatin3浓度(mg/ml)6.573.405.933.36dar(通过hic-hplc)1.711.791.772.05%未缀合的药物6.674.165.384.19%聚集体(通过sec-hplc)3.71%3.353.421.75实施例2-axl抗体的结合特性axl抗体的结合亲和力测定了一组9种抗axl抗体以及3种这些抗体的变体(其在可变结构域中具有单个氨基酸突变)(igg1-axl-154-m103l、igg1-axl-183-n52q、igg1-axl-726-m101l)的亲和力。使用生物膜层干涉技术在fortebiooctetred384上测定亲和力。用higg(1µg/ml)为抗人fc捕获(ahc)生物传感器(fortebio,portsmouth,uk；目录号18-5064)上样150s，目标为加载响应1nm。在基线(150s)后，测定axlecdhis的结合(1000s)与解离(2000s)(如实施例1中所述)，采用2倍稀释步骤，使用10µg/ml–0.16µg/ml(218nm–3nm)的浓度范围。对于计算而言，使用了基于氨基酸序列的axlecdhis的理论分子质量，即46kda。实验在octetred384上进行，并同时在30℃以1000rpm摇动。每一抗体均在三次独立实验中进行了测试。用fortebio数据分析软件v7.0.3.1分析数据，除非另行说明，否则使用1:1模式和全局整体拟合，其中结合时间1000s且解离时间1000s。之所以使用1000s的解离时间(而非采集到的2000s解离时间)，是因为这得到了更好的拟合。对于抗体igg1-axl-154和igg1-axl-154-m103l，使用了500s的解离时间。对于igg1-axl-012和igg1-axl-094，使用了200s的解离时间。通过减去参照曲线(不含axlecdhis的抗体)校正数据轨迹，使y-轴对齐基线的最后5s，并运用了级间校正以及savitzky-golay过滤进行处理。抗axl抗体的亲和力(kd)的范围在0.3*10-9m至63*10-9m(表4)。对于突变体igg1-axl-183-n52q而言，其kd低于野生型igg1-axl-183，这是由于高大约2.5倍的解离速率。所观察到的其它两种突变体的动力学与野生型igg的动力学相似。表4axl抗体与人、小鼠和食蟹猴axl的结合用全长人axl、具有食蟹猴细胞外结构域(ecd)的人axl或具有小鼠ecd的人axl的表达构建体瞬时转染hek293t细胞(参见实施例1)。通过流式细胞术评价了humab-axl抗体与这些细胞的结合。将转染的hek293细胞与axl-抗体的系列稀释液(最终浓度范围为0.0024-10µg/ml)在4℃孵育30分钟。在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤三次后，将细胞与以1/100稀释于pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中的r-藻红蛋白(pe)缀合的山羊抗人iggf(ab’)2(jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.,westgrove,pa；目录号109-116-098)(最终体积为100µl)孵育。接下来，将细胞在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤两次，重新悬浮于120μlpbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中并在facscantoll(bdbiosciences)上分析。使用graphpadprismv5.04软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s型剂量-反应)分析结合曲线。图1a显示，humab-axl抗体与表达人axl-ecd的hek293细胞具有剂量依赖性结合。此外，humab-axl抗体识别具有食蟹猴ecd的axl，其ec50值在与完全人axl相同的范围内(图1b)。相比之下，humab与具有小鼠ecd的axl的结合较低(igg1-axl-107、igg1-axl-154、igg1-axl-154-m103l、igg1-axl-733、igg1-axl-183、igg1-axl-183-n52q)或无法检测到(igg1-axl-171、igg1-axl-613、igg1-axl-726、igg1-axl-726-m101l、igg1-axl-148；图1c)。正如所预期的，阴性对照抗体igg1-b12不与表达任何axl变体的细胞结合(图1)。表5示出了抗axl抗体与人axl或具有食蟹猴axlecd的人axl的结合的ec50值和标准偏差(在至少3次实验中测定)。与具有小鼠axlecd的人axl的结合的ec50值由于极低或缺乏结合而无法测定。表5axl抗体与gas6竞争结合axl测试了axl配体gas6是否干扰axl抗体与axl的结合。因此，将axl阳性a431细胞与10µg/ml重组人gas6(r&dsystems,abingdon,uk；目录号885-gs)在4℃孵育15分钟。随后，制备axl抗体的系列稀释液(最终浓度范围为0.014-10µg/ml)，加入到细胞中并在4℃孵育30分钟。在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤三次后，将细胞在100μl中与第二抗体在4℃避光孵育30min。将以1/100稀释于pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中的r-藻红蛋白(pe)缀合的山羊抗人iggf(ab’)2(jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.,westgrove,pa；目录号109-116-098)用作结合fc区的第二抗体。接下来，将细胞在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤两次，重新悬浮于120μlpbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中并在facscantoll(bdbiosciences)上分析。可替换地，将a431细胞与10µg/mlaxl抗体预孵育(15分钟，4℃)以评估在存在axl抗体的情况下axl配体gas6是否仍然可以结合。在抗体预孵育后，将重组人gas6(r&dsystems,abingdon,uk；目录号885-gs)的系列稀释液以0.001-20µg/ml的最终浓度加入到细胞中并在4℃孵育30分钟。在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤三次后，将细胞与小鼠抗-gas6igg2a(r&dsystems；catno.mab885)在4℃孵育30min。在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤三次后，将细胞与fitc标记的山羊抗小鼠igg(dako,heverlee,belgium；目录号f049702)在4℃避光孵育30min。接下来，将细胞在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤两次，重新悬浮于120μlpbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中并在facscantoll(bdbiosciences)上分析。使用graphpadprismv5.04软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s型剂量-反应)分析结合曲线。在其中将a431细胞与gas6预孵育的实验中(n=3)，抗axl抗体的最大结合值与在不存在gas6的情况下的抗体结合相当(gas6预孵育后的最大结合是没有gas6预孵育的结合的90-108%)(表6)。有或没有gas6预孵育的axl抗体结合的ec50值处于相同范围内，或在gas6预孵育后稍有提高(表6)。在存在gas6的情况下，对照axl抗体yw327.6s2与a431细胞的结合相比没有gas的结合大大降低。在存在gas6的情况下，yw327.6s2的最大结合是没有gas6的结合的19%，而当细胞已经与gas6预孵育后，与a431细胞结合的ec50值高21倍。在其中a431细胞与抗axl抗体预孵育的实验中，评价了gas6结合(n=3)。gas6与a431细胞的结合在有或没有与humab-axl抗体预孵育的情况下是相似的。当细胞与humab预孵育时，gas6结合的平均ec50浓度(0.34-0.83µg/ml)以及最大gas6结合与在存在阴性对照抗体b12的情况下的gas6结合是相似的(ec50浓度：0.40µg/ml；在存在b12对照抗体的情况下的gas6结合的95-115%)。相比与b12预孵育，在存在对照axl抗体yw327.6s2的情况下，gas6与a431细胞的结合大大降低(ec50浓度高14倍)。在存在对照抗体yw327.6s2的情况下，gas6的最大结合是在存在阴性对照抗体b12的情况下的结合的17%。表6实施例3–抗axl抗体组的表位定位研究使用人-小鼠axl嵌合分子测定axl结构域特异性使用一组人-小鼠嵌合axl突变体测定了axl抗体的axl结构域特异性。生成了五种不同的嵌合axl分子，其中人ig样结构域i(ig1)、ig样结构域ii(ig2)、人fniii样结构域i(fn1)或人fniii样结构域ii(fn2)被其小鼠同系物替换。生成了下列经密码子优化的用于表达axl人-小鼠嵌合体的构建体并在hek293f细胞中表达，如实施例1中所述：智人axl(p33-hahs-axl):(seqidno:148)mawrcprmgrvplawclalcgwacmypydvpdyaaprgtqaeespfvgnpgnitgargltgtlrcqlqvqgeppevhwlrdgqileladstqtqvplgedeqddwivvsqlritslqlsdtgqyqclvflghqtfvsqpgyvgleglpyfleepedrtvaantpfnlscqaqgppepvdllwlqdavplatapghgpqrslhvpglnktssfsceahnakgvttsrtatitvlpqqprnlhlvsrqptelevawtpglsgiyplthctlqavlsndgmgiqagepdppeepltsqasvpphqlrlgslhphtpyhirvactssqgpsswthwlpvetpegvplgppenisatrngsqafvhwqepraplqgtllgyrlayqgqdtpevlmdiglrqevtlelqgdgsvsnltvcvaaytaagdgpwslpvpleawrpgqaqpvhqlvkepstpafswpwwyvllgavvaaacvlilalflvhrrkketrygevfeptvergelvvryrvrksysrrtteatlnslgiseelkeklrdvmvdrhkvalgktlgegefgavmegqlnqddsilkvavktmkiaictrseledflseavcmkefdhpnvmrligvcfqgseresfpapvvilpfmkhgdlhsfllysrlgdqpvylptqmlvkfmadiasgmeylstkrfihrdlaarncmlnenmsvcvadfglskkiyngdyyrqgriakmpvkwiaiesladrvytsksdvwsfgvtmweiatrgqtpypgvenseiydylrqgnrlkqpadcldglyalmsrcwelnpqdrpsftelredlentlkalppaqepdeilyvnmdegggypeppgaaggadpptqpdpkdscscltaaevhpagryvlcpsttpspaqpadrgspaapgqedga小家鼠axl(p33-hamm-axl):(seqidno:149)mawrcprmgrvplawclalcgwacmypydvpdyaahkdtqteagspfvgnpgnitgargltgtlrcelqvqgeppevvwlrdgqileladntqtqvplgedwqdewkvvsqlrisalqlsdageyqcmvhlegrtfvsqpgfvgleglpyfleepedkavpantpfnlscqaqgppepvtllwlqdavplapvtghssqhslqtpglnktssfsceahnakgvttsrtatitvlpqrphhlhvvsrqptelevawtpglsgiyplthcnlqavlsddgvgiwlgksdppedpltlqvsvpphqlrlekllphtpyhiriscsssqgpspwthwlpvettegvplgppenvsamrngsqvlvrwqeprvplqgtllgyrlayrgqdtpevlmdigltrevtlelrgdrpvanltvsvtaytsagdgpwslpvplepwrpgqgqplhhlvseppprafswpwwyvllgavvaaacvlilalflvhrrkketrygevfeptvergelvvryrvrksysrrtteatlnslgiseelkeklrdvmvdrhkvalgktlgegefgavmegqlnqddsilkvavktmkiaictrseledflseavcmkefdhpnvmrligvcfqgseresfpapvvilpfmkhgdlhsfllysrlgdqpvylptqmlvkfmadiasgmeylstkrfihrdlaarncmlnenmsvcvadfglskkiyngdyyrqgriakmpvkwiaiesladrvytsksdvwsfgvtmweiatrgqtpypgvenseiydylrqgnrlkqpadcldglyalmsrcwelnpqdrpsftelredlentlkalppaqepdeilyvnmdegggypeppgaaggadpptqpdpkdscscltaaevhpagryvlcpsttpspaqpadrgspaapgqedga智人axl–小家鼠ig1结构域(p33-axl-mig1):(seqidno:150)mgrvplawwlalccwgcaahkdtqteagspfvgnpgnitgargltgtlrcelqvqgeppevvwlrdgqileladntqtqvplgedwqdewkvvsqlrisalqlsdageyqcmvhlegrtfvsqpgfvgleglpyfleepedrtvaantpfnlscqaqgppepvdllwlqdavplatapghgpqrslhvpglnktssfsceahnakgvttsrtatitvlpqqprnlhlvsrqptelevawtpglsgiyplthctlqavlsddgmgiqagepdppeepltsqasvpphqlrlgslhphtpyhirvactssqgpsswthwlpvetpegvplgppenisatrngsqafvhwqepraplqgtllgyrlayqgqdtpevlmdiglrqevtlelqgdgsvsnltvcvaaytaagdgpwslpvpleawrpgqaqpvhqlvkepstpafswpwwyvllgavvaaacvlilalflvhrrkketrygevfeptvergelvvryrvrksysrrtteatlnslgiseelkeklrdvmvdrhkvalgktlgegefgavmegqlnqddsilkvavktmkiaictrseledflseavcmkefdhpnvmrligvcfqgseresfpapvvilpfmkhgdlhsfllysrlgdqpvylptqmlvkfmadiasgmeylstkrfihrdlaarncmlnenmsvcvadfglskkiyngdyyrqgriakmpvkwiaiesladrvytsksdvwsfgvtmweiatrgqtpypgvenseiydylrqgnrlkqpadcldglyalmsrcwelnpqdrpsftelredlentlkalppaqepdeilyvnmdegggypeppgaaggadpptqpdpkdscscltaaevhpagryvlcpsttpspaqpadrgspaapgqedga智人axl–小家鼠ig2结构域(p33-axl-mig2):(seqidno:151)mawrcprmgrvplawclalcgwacmaprgtqaeespfvgnpgnitgargltgtlrcqlqvqgeppevhwlrdgqileladstqtqvplgedeqddwivvsqlritslqlsdtgqyqclvflghqtfvsqpgyvgleglpyfleepedkavpantpfnlscqaqgppepvtllwlqdavplapvtghssqhslqtpglnktssfsceahnakgvttsrtatitvlpqqprnlhlvsrqptelevawtpglsgiyplthctlqavlsddgmgiqagepdppeepltsqasvpphqlrlgslhphtpyhirvactssqgpsswthwlpvetpegvplgppenisatrngsqafvhwqepraplqgtllgyrlayqgqdtpevlmdiglrqevtlelqgdgsvsnltvcvaaytaagdgpwslpvpleawrpgqaqpvhqlvkepstpafswpwwyvllgavvaaacvlilalflvhrrkketrygevfeptvergelvvryrvrksysrrtteatlnslgiseelkeklrdvmvdrhkvalgktlgegefgavmegqlnqddsilkvavktmkiaictrseledflseavcmkefdhpnvmrligvcfqgseresfpapvvilpfmkhgdlhsfllysrlgdqpvylptqmlvkfmadiasgmeylstkrfihrdlaarncmlnenmsvcvadfglskkiyngdyyrqgriakmpvkwiaiesladrvytsksdvwsfgvtmweiatrgqtpypgvenseiydylrqgnrlkqpadcldglyalmsrcwelnpqdrpsftelredlentlkalppaqepdeilyvnmdegggypeppgaaggadpptqpdpkdscscltaaevhpagryvlcpsttpspaqpadrgspaapgqedga智人axl–小家鼠fn1结构域(p33-axl-mfn1):(seqidno:152)mawrcprmgrvplawclalcgwacmaprgtqaeespfvgnpgnitgargltgtlrcqlqvqgeppevhwlrdgqileladstqtqvplgedeqddwivvsqlritslqlsdtgqyqclvflghqtfvsqpgyvgleglpyfleepedrtvaantpfnlscqaqgppepvdllwlqdavplatapghgpqrslhvpglnktssfsceahnakgvttsrtatitvlpqrphhlhvvsrqptelevawtpglsgiyplthcnlqavlsddgvgiwlgksdppedpltlqvsvpphqlrlekllphtpyhiriscsssqgpspwthwlpvettegvplgppenisatrngsqafvhwqepraplqgtllgyrlayqgqdtpevlmdiglrqevtlelqgdgsvsnltvcvaaytaagdgpwslpvpleawrpgqaqpvhqlvkepstpafswpwwyvllgavvaaacvlilalflvhrrkketrygevfeptvergelvvryrvrksysrrtteatlnslgiseelkeklrdvmvdrhkvalgktlgegefgavmegqlnqddsilkvavktmkiaictrseledflseavcmkefdhpnvmrligvcfqgseresfpapvvilpfmkhgdlhsfllysrlgdqpvylptqmlvkfmadiasgmeylstkrfihrdlaarncmlnenmsvcvadfglskkiyngdyyrqgriakmpvkwiaiesladrvytsksdvwsfgvtmweiatrgqtpypgvenseiydylrqgnrlkqpadcldglyalmsrcwelnpqdrpsftelredlentlkalppaqepdeilyvnmdegggypeppgaaggadpptqpdpkdscscltaaevhpagryvlcpsttpspaqpadrgspaapgqedga智人axl–小家鼠fn2结构域(p33-axl-mfn2):(seqidno:153)mawrcprmgrvplawclalcgwacmaprgtqaeespfvgnpgnitgargltgtlrcqlqvqgeppevhwlrdgqileladstqtqvplgedeqddwivvsqlritslqlsdtgqyqclvflghqtfvsqpgyvgleglpyfleepedrtvaantpfnlscqaqgppepvdllwlqdavplatapghgpqrslhvpglnktssfsceahnakgvttsrtatitvlpqqprnlhlvsrqptelevawtpglsgiyplthctlqavlsddgmgiqagepdppeepltsqasvpphqlrlgslhphtpyhirvactssqgpsswthwlpvetpegvplgppenvsamrngsqvlvrwqeprvplqgtllgyrlayrgqdtpevlmdigltrevtlelrgdrpvanltvsvtaytsagdgpwslpvplepwrpgqgqplhhlvseppprafswpwwyvllgavvaaacvlilalflvhrrkketrygevfeptvergelvvryrvrksysrrtteatlnslgiseelkeklrdvmvdrhkvalgktlgegefgavmegqlnqddsilkvavktmkiaictrseledflseavcmkefdhpnvmrligvcfqgseresfpapvvilpfmkhgdlhsfllysrlgdqpvylptqmlvkfmadiasgmeylstkrfihrdlaarncmlnenmsvcvadfglskkiyngdyyrqgriakmpvkwiaiesladrvytsksdvwsfgvtmweiatrgqtpypgvenseiydylrqgnrlkqpadcldglyalmsrcwelnpqdrpsftelredlentlkalppaqepdeilyvnmdegggypeppgaaggadpptqpdpkdscscltaaevhpagryvlcpsttpspaqpadrgspaapgqedga通过流式细胞术测定了1µg/ml抗axl抗体与人-小鼠axl嵌合体的结合，如实施例2中所述。包括了igg1-b12作为同种型对照igg1。所有抗axl抗体均结合至人axl(图2a)，而当人axlecd被其小鼠同系物替换后，结合被消除或大大降低(图2b)。包括了人-小鼠交叉反应性单克隆axl抗体yw327.6s2以确认hsaxl-mmecd的表达。抗axl抗体107和613与hsaxl-mmig1的结合大大降低(图2c)，表明对axlig1结构域中表位的识别。igg1-axl-148和igg1-axl-171与hsaxl-mmig2的结合大大降低(图2d)，表明对axlig2结构域中表位的识别。igg1-axl-154、igg1-axl-183和igg1-axl-733与hsaxl-mmfn1的结合大大降低(图2e)，表明对axlfn1结构域中表位的识别。最后，igg1-axl-726与hsaxl-mmfn2的结合丧失(图2f)，表明对fn2结构域内表位的识别。全部抗axl抗体的axl结构域特异性汇总于表7中。表7抗体axl结构域特异性参与结合的axlaaigg1-axl-107ig1l121-q129igg1-axl-148ig2d170-r190igg1-axl-154fn1q272-a287,g297-p301igg1-axl-154-m103ln.d.an.d.igg1-axl-171ig2p170,t182-r190igg1-axl-183fn1未解析igg1-axl-183-n52qn.d.n.d.igg1-axl-613ig1t112-q124igg1-axl-726fn2a359,r386,q436-k439igg1-axl-726-m101ln.d.n.d.igg1-axl-733fn1未解析igg1-axl-061ig1i97-q124igg1-axl-137ig1q57,e92-t105yw327.6s2ig1g39-d59an.d.，无法确定。高分辨率表位定位以识别axl细胞外结构域中参与axl抗体结合的氨基酸为了识别axl细胞外结构域中参与抗axl抗体结合的氨基酸，通过在细胞外结构域中重组源自具有可变的同源性水平的物种的axl序列与人axl序列而生成了axl序列变体文库。简而言之，将编码人axl(hs)的表达质粒与编码小家鼠(mm)、短尾负鼠(md；负鼠)、安乐蜥(ac；蜥蜴)和金娃娃(tn；河豚)axl同系物的克隆质粒混合，或反之亦然。使用了特异于所述克隆载体或所述表达载体的两种引物的组合以进行axl细胞外结构域(ecd)的pcr扩增，在pcr循环中采用缩简的延伸时间，迫使新生的dna复制链解链并重退火。使用巢式pcr(同样地，特异于含有源自两种载体的末端的重组产物)扩增全长ecd。将所得axlecdpcr产物克隆到生成全长axl的表达载体中，并对所得质粒进行测序，根据与模板载体的最大差别进行排序，并选择以生成具有最大分辨能力的最小集合。根据制造商(lifetechnologies)提供的说明书，将编码来自hs、mm、md、ac和tn的axl同系物的质粒、编码具有小鼠ig1、ig2、fn1或fn2结构域的hsaxl的四种人/小鼠嵌合质粒、以及来自重组文库的十六种最区分化质粒转染到hek293-f细胞中。通过评分/氨基酸(如果突变与(+1)或不与(-1)结合丧失相关)将使用1µg/ml抗axl抗体的facs结合数据解卷积，之后应用基线校正并标准化至-5到+5的尺度，得到整个ecd上的影响分数/氨基酸。解卷积的结合数据以参与结合的氨基酸的形式而汇总于表7中。由于在结合位点附近缺少重组事件而造成其结合位点无法以高分辨率定位的抗体被标示为尚不清楚。实施例4–fc介导的效应子功能抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)如下所述测定了抗axl抗体诱导a431表皮样癌细胞的adcc的能力。使用来自健康志愿者(umcutrecht,thenetherlands)的外周血单核细胞作为效应子细胞。标记靶细胞将a431细胞(5x106个细胞)收集在培养基(补充有10%胎牛血清(fsc)的rpmi1640培养基)中,其中已加入100µci51cr(chromium-51；amershambioscienceseuropegmbh,roosendaal,thenetherlands)，并将混合物在37℃水浴中摇动孵育1小时(hr)。在洗涤细胞(两次，在pbs中，1200rpm，5min)后，将细胞重新悬浮于rpmi1640/10%fsc中并通过台盼蓝拒染法计数。将细胞稀释至1x105个细胞/ml的密度。制备效应子细胞根据制造商说明，通过ficoll(biowhittaker；淋巴细胞分离培养基,目录号17-829e)从45ml的新鲜抽取的肝素血分离外周血单核细胞(健康志愿者,umcutrecht,utrecht,thenetherlands)。在将细胞重新悬浮于rpmi1640/10%fsc中之后，通过台盼蓝拒染法对细胞计数并稀释至1x107个细胞/ml的密度。adcc设置将50µl的51cr标记的靶细胞移取至96孔平板中，并加入50µl的抗体，稀释于rpmi1640/10%fsc中(以0.01-10µg/ml的最终浓度范围3倍稀释)。孵育细胞(室温(rt),15min)，并加入50µl效应子细胞，得到100:1的效应子对靶标比率(为了测定最大裂解，加入100µl5%triton-x100而非效应子细胞；为了测定自发裂解，使用50µl靶细胞和100µlrpmi1640/10%fsc)。将细胞在37℃和5%co2中孵育过夜。在将细胞离心(1200rpm,10min)后，收获70µl的上清液到微细管中，并在γ计数器中计数。特异性裂解的百分比计算如下：%特异性裂解=(cpm样品-cpm仅靶细胞)/(cpm最大裂解-cpm仅靶细胞)其中cpm是计数/分钟。igg1-axl-183-n52q和igg1-axl-733以10µg/ml的浓度在a431细胞中诱导15至21%adcc(图3)。igg1-axl-148、igg1-axl-726-m101l、igg1-axl-171、igg1-axl-613、igg1-axl-107和igg1-axl-154-m103l以最高达10µg/ml的浓度无法在a431细胞中诱导显著的adcc(图3)。实施例5–axl抗体-药物缀合物(axl-adc)的结合特性用全长人axl的表达构建体瞬时转染hek293t细胞(参见实施例1)。通过流式细胞术评价了抗axl抗体和axl-adc与这些细胞的结合。将瞬时转染的hek293细胞与抗axl抗体或axl-adc的系列稀释液(4倍稀释；最终浓度范围为0.003-10µg/ml)在4℃孵育30分钟。在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤三次后，将细胞在100μl中与第二抗体在4℃避光孵育30min。将以1/100稀释于pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中的r-藻红蛋白(pe)缀合的山羊抗人iggf(ab’)2(jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.,westgrove,pa；目录号109-116-098)用作第二抗体。接下来，将细胞在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤两次，重新悬浮于120μlpbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中并在facscantoll(bdbiosciences)上分析。使用graphpadprismv5.04软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s型剂量-反应)分析结合曲线。图4显示，抗axl抗体与表达人axl-ecd的hek293细胞的结合类似于axl-adc的结合。实施例6–由axl特异性抗体药物缀合物诱导的体外细胞毒性将lclc-103h细胞(人大细胞肺癌)在补充有10%(vol/vol)热失活加强型小牛血清(perbio；目录号sh30087.03)、2mml-谷氨酰胺(cambrex；目录号us17-905c)、50iu/ml青霉素和50μg/ml链霉素(cambrex；目录号de17-603e)的含l-谷氨酰胺的rpmi1640(cambrex；目录号be12-115f)中培养。将mda-mb-231细胞(人乳腺癌)在补充有10%(vol/vol)热失活加强型小牛血清(perbio；目录号sh30087.03)、1mm丙酮酸钠(cambrex；目录号be13-115e)、2mml-谷氨酰胺(cambrex；目录号us17-905c)、100µmmemneaa(invitrogen；目录号11140)、50iu/ml青霉素和50μg/ml链霉素(cambrex；目录号de17-603e)的dmem(cambrex；目录号be12-709f)中培养。将这些细胞系保持在37℃、5%(vol/vol)co2、潮湿的培养箱中。将lclc-103h和mda-mb-231培养至近于汇合，之后细胞经胰蛋白酶处理，重新悬浮于培养基中并通过细胞过滤器(bdfalcon,目录号352340)以获得单细胞悬液。在96孔培养板的每个孔中接种1x103个细胞，并将细胞在室温下孵育30min，并随后在37℃、5%co2孵育5小时以允许贴板。在培养基中制备axl抗体药物缀合物(axl-adc；参见实施例1)的系列稀释液(4倍；最终浓度范围为0.00015至10µg/ml)并加入到平板中。将与1µm星形孢菌素(#s6942-200,sigma)孵育的细胞用作100%肿瘤杀伤的参照。将未经处理的细胞用作0%肿瘤细胞杀伤的参照。将平板在37℃、5%co2孵育5天。接下来，向孔中加入celltiter-glo试剂(promega；目录号g7571)(20µl/孔)，并将平板在37℃、5%co2孵育1.5小时。随后，以180µl/孔转移到白色96孔optiplate™平板(perkinelmer,waltham,ma；目录号6005299)上，在室温下孵育30min。最后，在envision多平板读出器(envision,perkinelmer)上测量发光。axl-adcigg1-axl-148-vcduo3、igg1-axl-183-vcduo3和igg1-axl-726-vcduo3在lclc-103h细胞中诱导细胞毒性，其中ic50值为0.01至0.06µg/ml，如图5a中所示。类似地，图5b显示，这些axl-adc诱导mda-mb-231细胞的细胞毒性，其中ic50值为0.005至0.015µg/ml。实施例7–允许结合axl的抗体vh和vl变体比对了抗axl抗体组(实施例1中所述)的vh和vl区的蛋白序列并比较了axl结合以识别vh或vl区中关键的或可允许的氨基酸残基变化。因此，将具有相同vh或vl区的抗体归类并分别比较与人axl的结合以及vl或vh序列中的差异。在如实施例1中所述的同种抗原特异性筛选测定中评估了与由hek-293f细胞瞬时表达的人axl的结合。在本实施例中所完成的比对的氨基酸位置的编号基于图6中所示的序列完成，即，所示序列中的第一个氨基酸被编号为位置‘1’，第二个为位置‘2’，等等。首先，将具有相同vl序列的抗体归类。据发现，igg1-axl-148和igg1-axl-140具有相同的vl序列，并在hccdr3区中具有1个氨基酸的差异(在氨基酸位置109处，f替换了i；图6a)。两种抗体均结合至人axl(表8)，表明位置109处的氨基酸对于抗体结合不是必需的，其中假设在cdr2区中识别出的突变(在氨基酸位置56处，g替换了a)不补偿结合的丧失(图6a)。据发现，igg1-axl-726和igg1-axl-187具有相同的vl序列，并且两种抗体均结合至人axl(表8)。在hccdr3区中允许两个氨基酸残基的变化(在位置97处r替换了s以及在位置105处a替换了t；图6b)而不丧失结合，其中假设在cdr1区(在位置32处y替换了h)和/或框架区(p3q、v24i、y25d、t86a和t117a)中识别出的突变不补偿结合的丧失(图6b)。据发现，igg1-axl-171、igg1-axl-172和igg1-axl-181具有相同的vl序列，并且全部抗体均结合至人axl(表8)。这三种抗体的cdr3区是相同的，但在hccdr1区(在位置31处s替换了n)或框架区(在位置82处h替换了q)中允许一个氨基酸残基的变化而不丧失结合(图6c)。据发现，igg1-axl-613、igg1-axl-608-01、igg1-axl-610-01和igg1-axl-620-06具有相同的vl序列，并在hccdr3区中具有一个氨基酸的差异(在氨基酸位置101处，n替换了d；图6d)。全部抗体均结合至人axl(表8)，表明位置101处的氨基酸不是必需的，其中假设在hccdr2区(在氨基酸位置58处，v替换了a)和/或框架区(n35s、m37v、a61v、l70i、s88a)中识别出的突变不补偿结合的丧失(图6d)。接下来，将具有相同vh序列的抗体归类。据发现，igg1-axl-613和igg1-axl-613-08具有相同的vh序列，并在lc的cdr3区中具有五个氨基酸的差异(在位置92至96处，rsnwl替换了ygssy；图6e)。两种抗体均结合至人axl(表8)，表明位置92至96处的氨基酸变化是允许的并且不会影响抗体结合，其中假设在cdr1区(在位置30处缺失s)、cdr2区(g51d)和/或框架区(g9a、s54n、r78s、q100g、l104v)中识别出的突变不补偿结合的丧失(图6e)。表8抗体ec50(µg/ml)最大结合(任意单位)igg1-axl-1400.00262889igg1-axl-1480.00363499igg1-axl-1710.0032575igg1-axl-1720.00555378igg1-axl-1810.0083598igg1-axl-1870.00652563igg1-axl-608-010.00353318igg1-axl-610-010.00232947igg1-axl-6130.00725211igg1-axl-613-080.02422209igg1-axl-620-060.00344352igg1-axl-7260.04713154实施例8–mmae与抗axl抗体的缀合以及由mmae缀合的axl抗体诱导的体外细胞毒性mmae与抗axl抗体的缀合抗axl抗体根据标准程序通过a蛋白层析纯化并缀合至vcmmae。根据文献中描述的程序，将药物-接头vcmmae烷基化至还原态抗体的半胱氨酸(参见sun等人,2005；mcdonagh等人,2006；和alley等人,2008)。通过加入过量的n-乙酰半胱氨酸使反应猝灭。通过纯化移除任何残余未缀合的药物，并在pbs中配制最终的抗axl抗体药物缀合物。随后分析了所述抗axl抗体药物缀合物的浓度(通过在280nm的吸光度)、药物抗体比率(dar)(通过反相色谱法(rp-hplc)和疏水相互作用色谱法(hic))、未缀合药物的量(通过反相色谱法)、聚集百分比(通过尺寸排阻色谱法，sec-hplc)和内毒素水平(通过lal)。结果示于下表9中。表9-抗体-药物缀合物的不同特性的概述。细胞培养将lclc-103h细胞(人大细胞肺癌)和a431细胞(dmsz,braunschweig,germany)在补充有10%(vol/vol)热失活加强型小牛血清(perbio；目录号sh30087.03)、2mml-谷氨酰胺(cambrex；目录号us17-905c)、50iu/ml青霉素和50μg/ml链霉素(cambrex；目录号de17-603e)的含l-谷氨酰胺的rpmi1640(cambrex；目录号be12-115f)中培养。将mda-mb231细胞在含有高葡萄糖和hepes(lonza#be12-709f)、含铁的供体牛血清(lifetechnologies#10371-029)、2mml-谷氨酰胺(lonza#be17-605e)、1mm丙酮酸钠(lonza#be13-115e)和mem非必需氨基酸溶液(lifetechnologies#11140)的dmem中培养。将这些细胞系保持在37℃、5%(vol/vol)co2、潮湿的培养箱中。将lclc-103h、a431和mda-mb231细胞培养至近于汇合，之后细胞经胰蛋白酶处理，重新悬浮于培养基中并通过细胞过滤器(bdfalcon,目录号352340)以获得单细胞悬液。在96孔培养板的每个孔中接种1x103个细胞，并将细胞在室温下孵育30min，并随后在37℃、5%co2孵育5小时以允许贴板。细胞毒性测定在培养基中制备mmae缀合的axl抗体的系列稀释液(最终浓度范围为0.00015至10µg/ml)并加入到平板中。将与1µm星形孢菌素(#s6942-200,sigma)孵育的细胞用作100%肿瘤杀伤的参照。将未经处理的细胞用作100%细胞生长的参照。将平板在37℃、5%co2孵育5天。接下来，向孔中加入celltiter-glo试剂(promega；目录号g7571)(20µl/孔)，并将平板在37℃、5%co2孵育1.5小时。随后，以180µl/孔转移到白色96孔optiplate™平板(perkinelmer,waltham,ma；目录号6005299)上，在室温下孵育30min。最后，在envision多平板读出器(envision,perkinelmer)上测量发光。mmae缀合的axl抗体在lclc-103h细胞中以0.004至0.219µg/ml的浓度诱导了50%细胞杀伤，如表10和图7中所示。类似地，axl-adc在a431细胞(表11和图15a)和mda-mb231细胞(表11和图15b)中有效地诱导了细胞毒性。表10–mmae缀合的axl抗体在lclc-103h细胞中的细胞毒性(ec50值)。adcec50(µg/ml)igg1-axl-613-vcmmae0.004igg1-axl-148-vcmmae0.012igg1-axl-171-vcmmae0.018igg1-axl-726-m101l-vcmmae0.018igg1-axl-107-vcmmae0.022igg1-axl-511-vcmmae0.032igg1-axl-154-m103l-vcmmae0.044igg1-axl-183-n52q-vcmmae0.113igg1-axl-733-vcmmae0.219表11：mmae缀合的axl抗体在a431和mda-mb-231细胞中的细胞毒性(ec50值)。实施例9–用mmae缀合的抗axl抗体在scid小鼠中lclc-103h肿瘤异种移植的治疗性处理在scid小鼠中建立的皮下(sc)lclc-103h异种移植肿瘤中测定mmae缀合的抗axl抗体的体内功效。将在200μlpbs中的5x106lclc-103h(大细胞肺癌)肿瘤细胞(得自leibniz-institutdsmz-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh(dsmz))皮下注射到雌性scid小鼠的右侧。从肿瘤细胞接种后14-21天开始，当平均肿瘤尺寸为>100-200mm3并且观察到明显肿瘤生长时，腹腔内单次注射1mg/kg(20µg/小鼠)igg1-axl-vcmmae抗体(如补充实施例1中所述)或对照(未缀合的igg1-b12)(100μl/小鼠)。每周至少两次测定肿瘤体积。从卡尺(plexx)测量结果计算肿瘤体积(mm3)如下：0.52x(长度)x(宽度)2。抗axl-vcmmae抗体组在建立的sclclc-103h肿瘤中显示出广泛的抗肿瘤活性(图8)。克隆igg1-axl-733-vcmmae、igg1-axl-107-vcmmae和igg1-axl-148-vcmmae诱导肿瘤消退；克隆axl-171-vcmmae、igg1-axl-511-vcmmae和igg1-axl-613-vcmmae诱导肿瘤生长抑制；而克隆igg1-axl-154-m103l-vcmmae、igg1-axl-183-n52q-vcmmae和igg1-axl-726-m101l-vcmmae未显示出或仅显示出轻微的肿瘤生长抑制。使用单因素anova(dunnett的多重比较检验相对于对照igg1-b12)的在所有组均完整的最后一天(第30天)的统计分析表明，在igg1-b12相对于igg1-axl-733-vcmmae、igg1-axl-107-vcmmae和igg1-axl-148-vcmmae之间的肿瘤体积上存在高度显著的差异(p<0.0001)。使用这些克隆治疗导致这些组内的一些小鼠的肿瘤完全消除。相比igg1-b12，使用克隆igg1-axl-171-vcmmae、igg1-axl-511-vcmmae和igg1-axl-613-vcmmae治疗还显示出显著的肿瘤生长抑制，但该差异较不明显(p<0.05至p<0.001)。相比igg1-b12对照，用克隆igg1-axl-154-m103l-vcmmae、igg1-axl-183-n52q-vcmmae和igg1-axl-726-m101l-vcmmae治疗的小鼠的肿瘤生长未受显著影响。在多种其它体内肿瘤模型中也观察到了抗axl-vcmmae抗体的抗肿瘤活性。在两种细胞系来源的异种移植模型(a431；表皮样腺癌，和mda-mb-231；乳腺癌)中，抗axl-vcmmae抗体诱导肿瘤生长抑制，并且抗axl-vcmmae抗体在两种患者来源的异种移植模型(来自患有胰腺癌和宫颈癌的患者)中诱导了肿瘤消退。实施例10–axl-adc在具有异种靶标表达的胰腺癌患者来源的异种移植(pdx)模型中的抗肿瘤功效在paxf1657胰腺癌pdx模型中测定了igg1-axl-107-vcmmae、igg1-axl-148-vcmmae和igg1-axl-733-vcmmae的抗肿瘤活性(实验由oncotest,freiburg,germany进行)。将人胰腺肿瘤组织皮下植入到5-7周龄的雌性nmrinu/nu小鼠的左侧。动物的随机化如下进行：将携带体积为50-250mm3，优选80-200mm3的肿瘤的动物分散到7个实验组中(8只动物/组)，考虑到具有可比性的组肿瘤体积的中值和平均值。在随机化的当天(第0天)，以4mg/kg或2mg/kg静脉(i.v.)施用3种adc，而对照组接收单剂量的igg1-b12(4mg/kg)。每周两次监测肿瘤体积(mm3)并从卡尺(plexx)测量结果计算如下：0.52x(长度)x(宽度)2。采用标准免疫组织化学技术进行paxf1657肿瘤的染色。简而言之，将冷冻组织用丙酮固定10分钟并使用过氧化氢酶耗尽内源性过氧化物酶。随后，用正常小鼠血清封闭组织切片并通过与5µg/ml的5种igg1-axl抗体(igg1-axl-061、igg1-axl-137、igg1-axl-148、igg1-axl-183、igg1-axl-726)的集合孵育来进行染色。在与第二、辣根过氧化物酶(hrp)缀合的抗体孵育后，用氨基乙基咔唑(aec；得到红色)使hrp可视化。将每块玻片用苏木精(蓝色)复染以识别细胞核，并在甘油胶中封片。在手动zeiss显微镜上以10x和40x的放大率将免疫染色的组织切片数字化。图9示出了paxf1657肿瘤中的异种axl表达。鉴于在一些肿瘤细胞中观察到强烈的axl染色，其它细胞不显示axl染色。在黑白照片中，axl染色呈深灰色。苏木精染色(细胞核)呈浅灰色。图10a显示，相比对照组，用2mg/kgigg1-axl-107-vcmmae、igg1-axl-148-vcmmae和igg1-axl-733-vcmmae治疗小鼠显著减少了paxf1657肿瘤的生长。以4mg/kg的剂量，igg1-axl-107-vcmmae、igg1-axl-148-vcmmae和igg1-axl-733-vcmmae诱导paxf1657肿瘤的肿瘤消退。在治疗后14天，已经用2mg/kg或4mg/kgigg1-axl-107-mmae、igg1-axl-148-mmae或igg1-axl-733-mmae治疗的小鼠中的平均肿瘤尺寸显著小于已经用同种型对照igg(igg1-b12)治疗的小鼠(p<0.001；tukey的多重比较检验)。用未缀合的igg1-axl-148治疗小鼠未在paxf1657模型中导致抗肿瘤活性(图10b)。然而，缀合的igg1-axl-148-vcmmae在此模型中诱导了剂量依赖性抗肿瘤活性(图10b)，表明axl-adc的治疗能力依赖于mmae的细胞毒性活性。此外，用未靶向的adcigg1-b12-vcmmae治疗小鼠未在paxf1657模型中显示出抗肿瘤活性(图10c)，表明axl-adc的治疗能力还依赖于特异性靶标结合。实施例11-结合至ig1结构域的axl抗体使用一组人-小鼠嵌合axl突变体测定了axl抗体igg1-axl-061、igg1-axl-107、igg1-axl-137和igg1-axl-613的axl结构域特异性。包括了人-小鼠交叉反应性单克隆axl抗体yw327.6s2以确认hsaxl-mmecd的表达。包括了igg1-b12作为同种型对照抗体。生成了五种不同的嵌合axl分子并如实施例3中所述在hek293f中表达。简而言之，人ig样结构域i(ig1)、ig样结构域ii(ig2)、人fniii样结构域i(fn1)或人fniii样结构域ii(fn2)被其小鼠同系物替换。通过流式细胞术测定了1µg/ml抗axl抗体与人-小鼠axl嵌合体的结合，如实施例2中所述。所有抗axl抗体均结合至人axl(图11a)，而当人axlecd被其小鼠同系物替换后，结合被消除(图11b)。正如所预期的，人-小鼠交叉反应性单克隆axl抗体yw327.6s2结合至hsaxl-mmecd，确认了hsaxl-mmecd的正确表达。axl抗体igg1-axl-061、igg1-axl-107、igg1-axl-137和igg1-axl-613与hsaxl-mmig1的结合大大降低(图11c)，表明对axlig1结构域中表位的识别。与此一致的是，igg1-axl-061、igg1-axl-107、igg1-axl-137和igg1-axl-613与hsaxl-mmig2(图11d)、hsaxl-mmfn1(图11e)或hsaxl-mmfn2(图11f)的结合未受影响。人-小鼠交叉反应性单克隆axl抗体yw327.6s2显示结合至所有的嵌合axl变体，确认了这些蛋白的正确表达。实施例12-axl抗体igg1-axl-107和igg1-axl-613结合至ig1结构域但不与gas6竞争结合测试了axl抗体igg1-axl-061、igg1-axl-107、igg1-axl-137或igg1-axl-613的结合是否干扰axl配体gas6与axl的结合。因此，如实施例2中所述测试了gas6与已经与10µg/mlaxl抗体预孵育的a431细胞的结合。将yw327.6s2与axl抗体预孵育被描述为与gas6竞争结合axl，包括了igg1-b12(同种型对照)或培养基(阴性对照)作为对照。使用graphpadprismv5.04软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s型剂量-反应)分析结合曲线。图12和表12显示，gas6与已经与igg1-axl-107和igg1-axl-613抗体预孵育的a431细胞的结合类似于igg1-b12和培养基对照。这说明，igg1-axl-107和igg1-axl-613与axl的结合不干扰gas6结合，如实施例2中所示。相比igg1-b12和培养基对照，在存在igg1-axl-061、igg1-axl-137和对照axl抗体yw327.6s2的情况下，gas6与a431细胞的结合大大降低。在其中将a431细胞与gas6预孵育的实验中，igg1-axl-107和igg1-axl-613的最大结合值与在不存在gas6的情况下的抗体结合相当(gas6预孵育后的最大结合是没有gas6预孵育的结合的91-108%)(表12)。有或没有gas6预孵育的igg1-axl-107和igg1-axl-613结合的ec50值处于相同范围内，或在gas6预孵育后稍有提高(表12)，表明igg1-axl-107和igg1-axl-613不与gas6竞争结合。类似于对照抗体yw327.6s2，相比没有gas6的结合，在存在gas6的情况下，igg1-axl-061和igg1-axl-137与a431细胞的结合大大降低(gas6预孵育后的最大结合是没有gas6预孵育的结合的40-43%；表12)。在gas6预孵育后，无法正确测定igg1-axl-061和igg1-axl-137的ec50值(表12)。这表明，igg1-axl-061和igg1-axl-137与gas6竞争结合axl。这些数据证明，结合至axlig1结构域的抗体对gas6结合具有差异化效应。表12an.a.，不适用*ec50值由于低结合而不太准确。实施例13–axl-adc在具有和不具有自分泌(内源性)gas6生产的异种移植模型中的体内抗肿瘤功效a431和lclc-103h肿瘤细胞的gas6生产测试了a431细胞和lclc-103h细胞是否生产gas6。因此，使细胞在完全培养基中生长3天。根据制造商说明，使用quantikine人gas6elisa(r&dsystems,minneapolis,mn)测定了上清液中的gas6水平。此测定使用定量夹心elisa技术。特异于人gas6的单克隆ab已经被预涂布在微孔板上。将标准品和样品移取到孔中，并通过固定化的ab结合存在的任何人gas6。在洗掉任何未结合的物质之后，向孔中加入特异于人gas6的酶联多克隆ab。在经洗涤移除任何未结合的ab-酶试剂后，向孔中加入底物并按在初始步骤中所结合的人gas6数量的比例进行显色。终止显色并测量颜色的强度。据发现，a431细胞条件细胞培养基含有2576ng/mlgas6，而lclc-103h细胞条件培养基中gas6的浓度则少不止20倍(表13)。表13-肿瘤细胞条件培养基中的gas6生产细胞系上清液中的gas6(ng/ml)lclc-103h126a4312576axl-adc的体内抗肿瘤活性在产生高水平gas6的a431(表皮样癌)肿瘤模型和产生低水平gas6的lclc-103h(大细胞肺癌)肿瘤模型中测定了igg1-axl-061-vcmmae(ig1结合剂)、igg1-axl-107-vcmmae(ig1结合剂)、igg1-axl-137-vcmmae(ig1结合剂)、igg1-axl-148-vcmmae(ig2结合剂)、igg1-axl-183-vcmmae(fn1结合剂)和igg1-axl-726-vcmmae(fn2结合剂)的体内抗肿瘤活性。通过在雌性scid小鼠的右侧皮下注射在200μlpbs中的5x106a431或lclc-103h肿瘤细胞(两者均得自leibniz-institut-deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh(dsmz))进行肿瘤诱导。在肿瘤细胞接种后14-21天，当平均肿瘤尺寸为>100-200mm3并且观察到明显的肿瘤生长时，开始治疗。小鼠接收单次注射或每两周总计4次腹腔内注射igg1-axl-vcmmaeadc或对照抗体(未缀合的igg1-b12)，如所指出的那样。每周至少两次测定肿瘤体积。从卡尺(plexx)测量结果计算肿瘤体积(mm3)如下：0.52x(长度)x(宽度)2。图13a显示，用3mg/kgigg1-axl-107-vcmmae、igg1-axl-148-vcmmae和igg1-axl-733-vcmmae治疗小鼠诱导了a431肿瘤的生长抑制。图13b显示，用3mg/kgigg1-axl-148-vcmmae、igg1-axl-183-vcmmae(fn1结合剂)和igg1-axl-726-vcmmae(fn2结合剂)治疗小鼠诱导了a431肿瘤的生长抑制。相比之下，克隆igg1-axl-061-vcmmae和igg1-axl-137-vcmmae在a431异种移植模型中未显示出抗肿瘤活性。图14a显示，用3mg/kgigg1-axl-061-vcmmae、igg1-axl-137-vcmmae、igg1-axl-148-vcmmae、igg1-axl-183-vcmmae和igg1-axl-726-vcmmae治疗小鼠在lclc-103h异种移植模型中诱导了肿瘤消退。类似地，用1mg/kgigg1-axl-107-vcmmae或1mg/kgigg1-axl-613-vcmmae治疗小鼠诱导了lclc-103h肿瘤消退(图14b)。归纳起来，全部的axl-adc在产生低水平gas6的lclc-103h异种移植模型中均显示出抗肿瘤活性。在产生高水平gas6的a431异种移植模型中，仅在不与axl配体gas6竞争的那些axl-adc中观察到抗肿瘤活性。实施例14–在不同的肿瘤适应症中的axl表达在包含来自患有甲状腺癌、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌或子宫内膜癌或恶性黑色素瘤的患者的组织核心的新鲜切割的石蜡包埋且福尔马林固定的(ffpe)肿瘤组织微阵列(tma)中评价了axl的表达。tma得自usbiomax。ffpe肿瘤阵列玻片经过脱去石蜡并经受抗原修复(ph6)，并且通过与0.1%h2o2在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液中孵育而耗尽内源性过氧化物酶。为了检测axl表达，将tma与兔-抗axl(santacruz,目录号：sc-20741)以1µg/ml的浓度孵育60min(室温(rt))。为了识别上皮来源的(肿瘤)细胞，将tma与兔-抗-细胞角蛋白(abcam,目录号ab9377)以1:50的稀释度孵育60min(rt)。在洗涤步骤后，将tma与过氧化物酶缀合的抗兔igg葡聚糖聚合物(immunologic,目录号dpvr55hrp)孵育以检测兔抗axl与兔抗细胞角蛋白抗体的结合。最后，采用二氨基联苯胺(dab；棕色；dako,目录号k346811)使抗兔igg葡聚糖聚合物的结合可视化。在含有恶性黑色素瘤组织核心的tma中，采用氨基乙基咔唑(aec；红色；vector,sk4200)使抗兔igg葡聚糖聚合物的结合可视化。tma中的细胞核采用苏木精(蓝色)可视化。axl和细胞角蛋白免疫染色的tma采用aperio玻片扫描仪以20×放大率数字化，并用组织图像分析软件(definienstissuestudio软件,版本3.6.1)使用基于细胞的算法对免疫染色进行定量。该算法经设计以识别并定量活检中axl阳性或细胞角蛋白阳性细胞的百分比(范围0–100%)，并且定量各肿瘤核心中axl阳性肿瘤细胞中的axl染色强度(光密度(od)；范围0–3)。当axlod为至少0.1时，将肿瘤细胞评为axl阳性。通过用序列肿瘤核心中的axl阳性细胞总数除以细胞角蛋白阳性细胞总数来计算axl阳性肿瘤细胞的百分比/肿瘤核心(范围0-100%)。通过用全部axl阳性肿瘤细胞的axlod的总合除以axl阳性肿瘤细胞的数量来计算各肿瘤核心中的平均axl染色强度(od)。对来自患有恶性黑色素瘤的患者的肿瘤阵列进行手动评分。axl染色强度被评为弱(1+)、中等(2+)或强(3+)，而axl阳性黑色素瘤细胞的百分比以10%的区间评分(范围0–100%)。图16提供了甲状腺癌、食道癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌和子宫内膜癌的肿瘤核心中axl表达的图示。表14示出了对于各适应症，在超过10%的肿瘤细胞中具有axl表达的肿瘤核心的百分比。图17示出了对于各适应症，针对axl免疫染色的组织核心的代表性实例。这些图表说明了肿瘤组织中axl的异种表达。表14所用缩写：nsclc，非小细胞肺癌；slcl，小细胞肺癌；tnbc，三阴性乳腺癌。实施例15–axl抗体特异性结合axl而非其它tam受体家族成员。在hek-293f细胞中表达人axl、mer和tyro3生成了下列用于表达各种全长蛋白的经密码子优化的构建体：人(智人)axl(genbank登录号np_068713.2)、人mer(genbank登录号eaw52096.1)和人tyro3(genbank登录号q06418.1)。所述构建体含有适用于克隆的限制性位点和最佳kozak(gccgccacc)序列(kozak等人,1999)。所述构建体被克隆到哺乳动物表达载体pcdna3.3(invitrogen)中。freestyletm293-f(适应悬浮生长和化学成分确定的freestyle培养基的hek-293亚克隆(hek-293f))细胞得自invitrogen，并根据制造商说明，使用293fectin(invitrogen)用表达质粒转染，并生长24-48小时。axl抗体与人axl、人mer或人tyro3的结合研究通过流式细胞术评价了经全长人axl、mer或tyro3的表达构建体瞬时转染的hek-293f细胞的humab-axl抗体结合。将转染的hek-293f细胞与axl-抗体的系列稀释液(4倍稀释；最终浓度范围为0.002-10µg/ml)在4℃孵育30分钟。在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤三次后，将细胞与以1/100稀释于pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中的r-藻红蛋白(pe)缀合的山羊抗人iggf(ab’)2(jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.,westgrove,pa；目录号109-116-098)(最终体积为100µl)孵育。接下来，将细胞在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤两次，重新悬浮于120μlpbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中并在facscantoll(bdbiosciences)上分析。包括了采用小鼠抗人mer(r&dsystems,目录号mab8912)和小鼠抗人tyro3(dtk)(r&dsystems,目录号mab859)的染色作为表达对照，包括了igg1-b12作为非结合同种型对照抗体。使用graphpadprismv5.04软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s型剂量-反应)分析结合曲线。图18a显示，humab-axl抗体与表达人axl的hek293细胞具有剂量依赖性结合。相比之下，未观察到humab-axl抗体与表达mer(图18b)或tyro3(图18c)的细胞或与未转染的hek293细胞(图18d)的结合。采用mer特异性抗体和tyro3特异性抗体的染色分别确认了经转染的细胞显示出正确的mer表达(图18f)或tyro3表达(图18g)。实施例16–细胞表面结合的axl抗体的内化通过流式细胞术评价细胞表面结合的humab-axl的内化。通过流式细胞术评价了细胞表面结合的humab-axl抗体内化入mda-mb-231和calu-1细胞(人肺癌细胞系；atcc,目录号htb-54)。将50,000个细胞接种到96孔组织培养平板中并任其在37℃附接6小时。将平板在4℃孵育30分钟，随后与axl抗体的系列稀释液(最终浓度范围为0.0032-10µg/ml)在4℃孵育1小时。随后，用不含抗体的组织培养基替换培养基，并将细胞在37℃或4℃孵育过夜(16-18小时)。随后，用40µl温热的胰蛋白酶溶液使细胞分离，用冰冷的pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物洗涤，并与以1/100稀释于pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中的r-藻红蛋白(pe)缀合的山羊抗人iggf(ab’)2(jacksonimmunoresearchlaboratories,inc.,westgrove,pa；目录号109-116-098)(最终体积100µl)在4℃孵育30分钟，以检测细胞表面上的axl抗体。最后，将细胞在pbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中洗涤两次，重新悬浮于120μlpbs/0.1%bsa/0.02%叠氮化物中并在facscantoll(bdbiosciences)上分析。使用graphpadprismv5.04软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)，使用非线性回归(具有可变斜率的s型剂量-反应)分析结合曲线。图19显示，对于所测试的所有axlhumab抗体以及所有的浓度，在抗体结合后，相比已经在37℃孵育的细胞，在已经在4℃孵育的细胞的质膜上检测到更多抗体。这说明，在37℃，axl抗体在结合至质膜时即被内化。fab-tamra/qsy7内化和细胞内降解测定在fab-tamra/qsy7内化测定中评估了axl抗体的内化。此测定使用了荧光团(tamra)和猝灭剂(qsy7)对。在贴近的情况下，例如，当缀合至相同蛋白时，tamra荧光被qsy7猝灭。在此实施例中，山羊抗人iggfab片段(jacksonimmunoresearch)与tamra/qsy7(fab-tamra/qsy7)缀合，如所述(ogawa等人molpharm2009;6(2):386-395)，而axlhumab(1.5μg/ml)与fab-tamra/qsy7(12μg/ml；30min,4℃)预孵育。随后将复合物加入到lclc-103h细胞中并在摇动条件下(200rpm,37℃)避光孵育24h。humab-fab-tamra/qsy7复合物的内化以及在内涵体和溶酶体中的细胞内降解造成tamra/qsy7的解离，导致tamra的去猝灭。在facscanto-ii(bdbiosciences)上测量已经与经fab-tamra/qsy7复合的axl抗体孵育的lclc-103h细胞的tamra荧光。如图20中所示，相比igg1-b12-fab-tamra/qsy7或单独的fab-tamra/qsy7，在与axl抗体-fab-tamra/qsy7复合物孵育后，lclc-103h细胞的荧光强度得到增强。这说明，axl抗体在结合至lclc-103h细胞时即被内化。实施例17–在体外和体内对braf抑制剂plx4720的抗性与上调的axl蛋白表达和对igg1-axl-107-vcmmae的增强的敏感性相关在一组确立的人黑色素瘤细胞系(cdx)和患者来源的低传代黑色素瘤细胞系(pdx)中，通过用braf抑制剂plx4720(一种临床批准的braf抑制剂威罗菲尼的类似物)治疗，针对其对生长抑制的内在或获得性抗性评估axl蛋白表达水平。此外，在体外和体内评估黑色素瘤细胞对用igg1-axl-107-vcmmae治疗的敏感性。细胞培养skmel147获得自荷兰癌症研究所的reuvenagami的实验室。a875获得自thermofischer，colo679获得自sigma，skmel28和a375细胞获得自atcc。将黑色素瘤细胞系在补充有10％胎牛血清(sigma)、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(都是gibco)的dmem中培养。细胞系在37℃下保持在5%(vol/vol)co2潮湿培养箱中。plx4720抗性细胞系的产生在最高达3μm的增加浓度的braf抑制剂plx4720(selleckchemicals,houston,tx,usa,company：selleckchemicals,houston,tx,usa,目录号:s1152,)存在的情况下培养braf抑制剂敏感细胞系(skmel28和a375)以建立对应的plx4720抗性的skmel28r和a375r。所有耐药细胞系都在3μmplx4720存在的情况下永久培养。患者来源的低传代(pdx)黑色素瘤细胞系的产生荷兰癌症研究所的antonivanleeuwenhoek医院的医学伦理委员会已批准收集和使用人组织。动物实验由研究所的动物实验委员会批准，并根据适用的规章制度进行。在手术期间，或者通过使用14号针头从恶性黑色素瘤患者取肿瘤活检组织，获得人类肿瘤材料。~5mm3的肿瘤片段用于在nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj小鼠中皮下植入，其在麻醉下进行。用卡尺每周两次测量肿瘤生长。在达到1000mm3的肿瘤尺寸之前，处死小鼠，移取肿瘤并将肿瘤碎片解离成单细胞悬浮液，铺在10cm培养皿上并在dmem+10%fbs(sigma)+100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(都是gibco)中作为原代细胞培养物生长。western印迹分析使用western印迹分析测定axl和mitf的表达。将细胞裂解物中的蛋白在4-12%sds-page凝胶上分离并转移至pvdf膜，所述pvdf膜随后在5%bsa/pbs-tween中用对axl特异性的抗体(sc-1096santacruz)染色，或者转移至硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜在5％脱脂奶粉/pbs-tween中用mitf(ab12039abcam)染色。为了设置凝胶上样的对照，使用针对粘着斑蛋白或β-肌动蛋白的抗体。黑色素瘤细胞系的质膜上的axl表达的定量通过间接免疫荧光使用qifikit分析(dako，目录号k0078)定量人肿瘤细胞系的质膜上的axl表达。使用小鼠单克隆抗体ab89224(abcam,cambridge,uk)检测axl。将贴壁细胞胰蛋白酶消化并通过细胞过滤器以获得单细胞悬浮液。将细胞通过以1,200rpm离心5分钟来沉淀，用pbs洗涤并以1x106个细胞/ml的浓度重新悬浮。在冰上进行下一步骤。将100μl单细胞悬浮液(100,000个细胞/孔)接种在聚苯乙烯96孔圆底板(greinerbio‐one,目录号650101)中。将细胞通过以300xg离心3分钟来沉淀，并以10μg/ml的浓度重新悬浮于50μl抗体样品或小鼠igg1同种型对照样品(目录号qf2040741，批号ma1-10406，pierce)中。在4℃下孵育30分钟后，将细胞沉淀并重新悬浮于150μlfacs缓冲液(含有0.1%bsa的pbs)中。根据制造商的说明将设置和校准珠粒加入到平板中。将细胞和珠粒用150μlfacs缓冲液平行洗涤两次以上，并重新悬浮于50μlfitc缀合的山羊抗小鼠igg(1/50；dako,目录号k0078)中。将第二抗体在4℃避光孵育30分钟。细胞和珠粒用150μlfacs缓冲液洗涤两次并重新悬浮于100μlfacs缓冲液中。在facscalibur(bdbiosciences)上通过在活细胞的门内记录10,000个事件来测量免疫荧光。使用校准珠粒的平均荧光强度来使用graphpadprism软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)计算校准曲线。对于每种细胞系，使用axl抗体染色的细胞的平均荧光强度，基于校准曲线的方程计算抗体结合能力(abc)，即质膜上表达的axl分子数量的估计值(使用graphpad软件从标准曲线插入未知值)。体外细胞毒性将细胞培养至接近汇合，其后将细胞用胰蛋白酶消化，重新悬浮于培养基中并通过细胞过滤器(bdfalcon，目录号352340)以获得单细胞悬浮液。使用以下接种密度以96孔形式接种细胞：用于建立的细胞系，2000个细胞/孔，用于pdx衍生的细胞系，4000个细胞/孔。接种后4小时加入igg1-axl-107-vcmmae。在培养基中制备igg1-axl-107-vcmmae的系列稀释液(10倍；范围从0.0001至10μg/ml的终浓度)并加入平板中。在37℃、5%co2下孵育5天(对于cd样品)或8天(pdx样品)后，将celltiter‐glo试剂(promega；目录号g7571)加入到孔中并根据制造商的方案进行发光细胞活力测定(promega,madison,wi)。通过infinitem200微孔板读数仪(tecan)测量发光，并且如下计算活力：％活力=(目标发光样品-发光pao)/(对照媒介物处理的发光pao的平均发光)，其中pao代表用于100％细胞杀死的5μm苯基氧化砷。skmel147黑色素瘤异种移植模型在nmri裸鼠中的皮下黑色素瘤模型skmel147中评估igg1-axl-107-vcmmae的抗肿瘤活性。向小鼠左侧腹中皮下注射2.5x105个skmel147黑色素瘤细胞，其表达高水平的axl(参见图21和表15)，将其1:1重新悬浮于基质胶中，总体积为100μl。每周三次用卡尺测量肿瘤，并且当肿瘤为100mm3时，将动物在以下治疗组中随机化：igg1-b12(4mg/kg)，igg1-b12-vcmmae(4mg/kg)，igg1-107(4mg/kg)，igg1-107-vcmmae(2mg/kg)，和igg1-107-vcmmae(4mg/kg)。在肿瘤细胞注射后的第12天和第19天(随机化的第1天和第8天)，将测试化合物注射到动物的尾静脉中，总体积为100μl。当肿瘤的尺寸超过1000mm3时，将动物处死。skmel28野生型细胞和对plx4720抗性的skmel28细胞的混合群体用axl-adc、braf抑制剂和/或mek抑制剂处理将skmel28野生型细胞和对plx4720抗性的skmel28细胞(skmel28-r)用荧光团mcherry(红色)或gfp(绿色)的表达载体分别转染。随后，将细胞以1:1比率接种，在6孔板中每种细胞系具有50,000个细胞(总共100，000个细胞/孔)。3小时后，将以下化合物加入到孔中：igg1-axl-107-vcmmae(1µg/ml)，igg1-b12-mmae(1µg/ml；同种型对照adc)，plx4720(10µm；braf抑制剂)，达拉菲尼(1µm；braf抑制剂)和/或曲美替尼(0.1µm；mek抑制剂)。4天后，将细胞胰蛋白酶化，在pbs+1%bsa中洗涤一次并通过流式细胞术分析。免疫组织化学在新鲜切割的石蜡包埋和福尔马林固定(ffpe)的具有恶性黑色素瘤的整个组织(wt)中评估axl的表达。在sequenzaslideracks(tedpellainc.,redding,ca,usa；目录号36105)中手动进行染色。在染色前，在室温下，将ffpe组织载片在100％二甲苯(sigma-aldrich，目录号16446；三次，5分钟)中脱石蜡并在96％乙醇(sigmaaldrich，目录号32294；两次，5分钟)中脱水。其后，进行抗原修复。将ihc载片在柠檬酸盐缓冲液(ph6；dako；目录号s2369)中孵育5分钟，并在室温下在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(0.43m柠檬酸，0.35mna2hpo4.2h2o；ph5.8)中封闭内源性过氧化物酶15分钟。在与第一抗体孵育前，将载片在pbs中的10％正常人血清(clb/sanquin，目录号k1146)中孵育。通过在补充有2％正常人血清的pbs中与3μg/ml兔多克隆抗人axl抗体h-124在室温下孵育60分钟来确定axl表达。用补充有0.1%tween-20的pbs中洗涤载片(两次，3分钟)，并用未稀释的brightvision多聚-hrp-抗兔igg检测对axl特异性的兔抗体的结合。用3-氨基-9-乙基咔唑(aec)发色团(红色；sigma，目录号a6926-100tab)使hrp可视化；苏木精(dako，目录号s3309)复染核。由荷兰癌症研究所(nki,amsterdam,thenetherlands)的认证病理学家分析载片，该病理学家对每个样品中axl染色的强度和定位进行评分。实施例显示于图27中。结果axl表达在一组建立的黑色素瘤细胞系(表15)和低传代原代黑色素瘤细胞系(pdx，表16)中评估axl表达。如通过western印迹所确定的axl表达(图21)与建立的细胞系(图21a)以及临床患者来源的样品(图21b)中的mitf表达负相关。在建立的细胞系组中，axl表达也通过定量流式细胞术确定。axl阴性和阳性细胞系的实例显示于图22中。所有细胞系的axl表达水平(表示为abc)与细胞系的braf突变状态一起列于表15中。axl-adc体外细胞毒性接下来，在活力测定中评估建立的黑色素瘤细胞系和pdx组对igg1-axl-107-vcmmae的敏感性。细胞暴露于增加浓度的igg1-axl-107-vcmmae(范围1x10-4至10µg/ml)持续5天，其后测定细胞活力。结果概述于表15和16中，剂量-应答曲线显示于图23和24中。图23显示所有4种表达axl的细胞系(skmel147、a875、a375r、skmel28r)(其中三种对plx4720具有抗性)是对用igg1-axl-107-vcmmae治疗敏感。两种axl阴性细胞系colo679和skmel28在用igg1-axl-107-vcmmae处理后没有显示活力的变化。在用igg1-axl-107-vcmmae进行的活力测定中测试三种plx4720抗性pdx样品。图24显示两种axl高表达pdx培养物mo16和mo19r对用igg1-axl-107-vcmmae处理敏感，而axl低表达pdx培养物m082没有显示出与用igg1-b12-vcmmae对照处理所见不同的应答。表15.黑色素瘤细胞系组的特征*blq=低于定量限值(<3300，校准珠粒的最低abc值)。表16.患者来源的黑色素瘤培养物的特征。体内用axl-adc治疗在skmel147黑色素瘤异种移植模型中，用igg1-b12、igg1-b12-vcmmae或igg1-axl-107处理的小鼠未显示肿瘤生长抑制。igg1-axl-107-vcmmae以2mg/kg诱导肿瘤生长抑制，并且在4mg/kg的剂量，igg1-axl-107-vcmmae诱导强烈的肿瘤消退，其持续直至约第50天(图25a)。因此，4mg/kg剂量的humax-axl-adc显示出显著的抗肿瘤作用，但在第50天后肿瘤开始再次生长。在用4mg/kgigg1-axl-107-vcmmae的最初肿瘤消退后显示出肿瘤再次生长的四只小鼠在第55天用4mg/kgigg1-axl-107-vcmmae的单剂量再次处理，而为了比较，观察另外两只小鼠。用4mg/kgigg1-axl-107-vcmmae再次处理在所有四只小鼠中导致肿瘤消退，而观察的2只小鼠显示出肿瘤生长(图25b)。四只再次处理的小鼠中的两只显示至少保持直至第80天的肿瘤消退，而在另外两只再次处理的小鼠中在约第70天观察到肿瘤再次生长(图25b)。组合治疗在skmel28wt细胞和skmel28plx4720抗性细胞的混合群体中，与未处理对照相比，当用igg1-axl-107-vcmmae、plx4720或达拉菲尼处理细胞混合物时，总细胞数量减少74-62％(图26a)。用igg1-axl-107-vcmmae和plx4720、igg1-axl-107-vcmmae和达拉菲尼、达拉菲尼和曲美替尼或达拉菲尼、曲美替尼和igg1-axl-107-vcmmae的组合处理细胞混合物诱导总细胞数量与未处理的细胞相比81-92％减少(图26a)。为了评估是否根除特定细胞群体，测定绿色(gfp-阳性skmel28-r细胞)和红色(mcherry-阳性skmel28细胞)的比率。如所预期，未处理和igg1-b12-vcmmae处理不影响gfp/mcherry比率，因为总细胞数量也未受影响(图26b)。用igg1-axl-107-vcmmae处理导致gfp/mcherry比率显著降低(图26b)，表明skmel28-r细胞的特异性杀伤。相反，用braf抑制剂plx4720或达拉菲尼处理增加了gfp/mcherry比率(图26b)，表明skmel28细胞的特异性杀伤。igg1-axl-107-vcmmae和plx4720、达拉菲尼和曲美替尼或达拉菲尼、曲美替尼和igg1-axl-107-vcmmae的组合显示接近于1的比率(图26b)，表明两种细胞类型以相似的功效被杀死。用igg1-axl-107-vcmmae和达拉菲尼的组合导致gfp/mcherry比率显著降低(图26b)，表明skmel28-r细胞在所用浓度下更有效的杀死。免疫组织化学总共分析了45个样品，其中3个样品不含任何肿瘤物质，因此被排除在分析之外。此外，包括来自相同患者的7个匹配的威罗菲尼治疗前和治疗后样品，以及1个匹配的达拉菲尼/曲美替尼治疗前和治疗后样品。在41/42样品中，在黑色素瘤区域的亚群中检测到axl表达。每个患者肿瘤的染色强度不同(表17)。此外，在4/7匹配的威罗菲尼治疗前和治疗后样品中观察到axl表达的上调(如通过病理学家的染色强度的增加所测量)(表17)。表17.来自黑色素瘤患者的肿瘤组织中的axl染色病例编号治疗治疗前/后匹配的样品axl染色肿瘤细胞a评价1威罗菲尼后na部分+2威罗菲尼后17微弱+至+3达拉菲尼/曲美替尼后na++至+++4威罗菲尼后na局灶地+5威罗菲尼后na部分微弱+6达拉菲尼/曲美替尼后40na严重坏死的7达拉菲尼/曲美替尼前16零星的+8威罗菲尼后38零星的+在肿瘤边缘的弱阳性细胞可能是染色伪影的结果9威罗菲尼后na-10威罗菲尼后na部分微弱+11威罗菲尼后na微弱+许多噬黑色素细胞+12威罗菲尼后na局部微弱+一些噬黑色素细胞+13威罗菲尼后na++至+++14威罗菲尼后39微弱+许多噬黑色素细胞+15威罗菲尼后24微弱+16达拉菲尼/曲美替尼后7微弱+17威罗菲尼前2部分+18威罗菲尼治疗后疾病稳定18天na微弱+19威罗菲尼后na局部+至++20威罗菲尼治疗后疾病稳定20天na微弱+21威罗菲尼后na微弱+22威罗菲尼后na部分+许多噬黑色素细胞+23威罗菲尼后na+至++24威罗菲尼前15零星的+25威罗菲尼后na零星的+26威罗菲尼前44微弱+许多噬黑色素细胞+27威罗菲尼后na部分且微弱+28威罗菲尼治疗后疾病稳定28天na微弱+存在有限量的肿瘤细胞29威罗菲尼后na部分且微弱+30威罗菲尼后na部分+31威罗菲尼后na部分+32威罗菲尼后na+少量具有黑色素的肿瘤细胞/噬黑色素细胞33威罗菲尼后na局部微弱+34威罗菲尼后na微弱+至+35威罗菲尼后na微弱+36威罗菲尼后na微弱+许多噬黑色素细胞+37威罗菲尼后na部分微弱+38威罗菲尼前8微弱+至+39威罗菲尼前14+阳性细胞存在于淋巴结窦中。由于这些细胞含有相当丰富的细胞质，因此不确定它们是肿瘤细胞还是巨噬细胞40达拉菲尼/曲美替尼前6na没有遇到肿瘤性病变41威罗菲尼后nana没有遇到肿瘤性病变42威罗菲尼后na部分+部分阴性区域可能是由于染色伪影43威罗菲尼后na微弱+至+44威罗菲尼后26+至++45威罗菲尼后na部分微弱+a-：阴性；阳性染色强度：微弱+<+<++<+++；阳性染色区域：零星<局灶<局部<部分；na：不可用。实施例18-pdx来源的braf突变黑色素瘤模型的生成和表征患者来源的低传代(pdx)黑色素瘤细胞培养物的产生荷兰癌症研究所的antonivanleeuwenhoek医院的医学伦理委员会已批准收集和使用人组织。动物实验由研究所的动物实验委员会批准，并根据适用的规章制度进行。在手术期间，或者通过使用14号针头从恶性黑色素瘤患者取肿瘤活检组织，获得人类肿瘤材料。~5mm3的肿瘤片段用于在nod.cg-prkdcscidil2rgtm1wjl/szj小鼠中皮下植入，其在麻醉下进行。用卡尺每周两次测量肿瘤生长。在达到1000mm3的肿瘤尺寸之前，处死小鼠，移取肿瘤并将肿瘤碎片解离成单细胞悬浮液，铺在10cm培养皿上并在dmem+10%fbs(sigma)+100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(都是gibco)中作为原代细胞培养物生长。m019r细胞培养物来源于黑色素瘤患者的肿瘤材料，含有对威罗菲尼具有内在抗性的brafv600e突变。黑色素瘤细胞系的质膜上的axl表达的定量通过间接免疫荧光使用qifikit分析(dako，目录号k0078)定量人肿瘤细胞系的质膜上的axl表达。使用小鼠单克隆抗体ab89224(abcam,cambridge,uk)检测axl。将贴壁细胞胰蛋白酶消化并通过细胞过滤器以获得单细胞悬浮液。将细胞通过以1,200rpm离心5分钟来沉淀，用pbs洗涤并以1x106个细胞/ml的浓度重新悬浮。在冰上进行接下来的步骤。将100μl单细胞悬浮液(100,000个细胞/孔)接种在聚苯乙烯96孔圆底板(greinerbio‐one,目录号650101)中。将细胞通过以300xg离心3分钟来沉淀，并以10μg/ml的浓度重新悬浮于50μl抗体样品或小鼠igg1同种型对照样品(目录号qf2040741，批号ma1-10406，pierce)中。在4℃下孵育30分钟后，将细胞沉淀并重新悬浮于150μlfacs缓冲液(含有0.1%bsa的pbs)中。根据制造商的说明将设置和校准珠粒加入到平板中。将细胞和珠粒用150μlfacs缓冲液平行洗涤两次以上，并重新悬浮于50μlfitc缀合的山羊抗小鼠igg(1/50；dako,目录号k0078)中。将第二抗体在4℃避光孵育30分钟。细胞和珠粒用150μlfacs缓冲液洗涤两次并重新悬浮于100μlfacs缓冲液中。在facscalibur(bdbiosciences)上通过在活细胞的门内记录10,000个事件来测量免疫荧光。使用校准珠粒的平均荧光强度来使用graphpadprism软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)计算校准曲线。对于每种细胞系，使用axl抗体染色的细胞的平均荧光强度，基于校准曲线的方程计算抗体结合能力(abc)，即质膜上表达的axl分子数量的估计值(使用graphpad软件从标准曲线插入未知值)。体外细胞毒性将细胞培养至接近汇合，然后用胰蛋白酶消化细胞，重悬于培养基中并通过细胞过滤器(bdfalcon，目录号352340)至获得单细胞悬浮液。将pdx衍生的细胞培养物以96孔形式铺板，密度为4000个细胞/孔。接种后4小时加入igg1-axl-107-vcmmae,plx4720(selleckchemicals,houston,tx,usa;目录号:s1152)或曲美替尼(selleckchemicals;目录号:s2673)。在培养基中制备系列稀释的测试试剂并加入到板中。在37℃，5％co2下孵育8天后，将celltiter-glo试剂(promega;目录号g7571)加入孔中，并根据制造商的方案进行发光细胞活力测定(promega，madison，wi)。通过infinitem200微孔板读数仪(tecan)测量发光，并且如下计算活力：％活力=(目标发光样品-发光pao)/(对照媒介物处理的发光pao的平均发光)，其中pao代表用于100％细胞杀死的5μm苯基氧化砷。结果如上所述获得pdx来源的黑色素瘤细胞培养物m019r和m009r，并表征axl表达水平，braf和nras突变状态，以及对plx4720、曲美替尼或igg1-axl-107-vcmmae的体外敏感性。结果总结在表18中。m009r中的axl表达水平是异质的，这意味着通过流式细胞术评估，仅细胞亚群具有可检测水平的ax1。表18.braf突变黑色素瘤细胞培养物的特征使用的缩写:facs,荧光激活细胞分选;abc,抗体结合能力;wt,野生型;n.a.a不敏感细胞系在浓度为3µmplx4720或0.1µm曲美替尼时没有显示显著的细胞死亡。b在1µg/mligg1-axl-107-vcmmae浓度下，不敏感细胞系没有显示显著的细胞死亡或显示与igg1-b12-vcmmae相当的细胞死亡。实施例19-体内抗性braf突变黑色素瘤模型(m019r)中igg1-axl-107-vcmmae单独和与brafi/meki组合的抗肿瘤活性来源于恶性黑色素瘤患者的braf突变m019r异种移植模型igg1-axl-107-vcmmae的抗肿瘤活性在nmri裸鼠的皮下黑色素瘤模型m019r中评估。在左侧皮下向小鼠皮下注射2.5×105个m019r黑色素瘤细胞，其已经以1：1重悬于基质胶中，总体积为100μl。用卡尺每周测量肿瘤两次，并且在肿瘤细胞接种后第62天肿瘤为100mm3时，将动物随机分配到以下3个治疗组(每组7或8只小鼠)：igg1-b12-vcmmae('对照adc';4mg/kg，iv)，igg1-axl-107-vcmmae(4mg/kg，iv)和braf抑制剂达拉菲尼(30mg/kg，口服强饲法)加mek抑制剂曲美替尼(0.1mg/kg，口服强饲法)。在随机化后第0天和第7天，将adc以100μl的总体积注射到动物的尾静脉中。从随机化当天开始，每天口服达拉菲尼和曲美替尼直至第二次随机化。当肿瘤尺寸超过1000mm3时处死动物。在第一次随机化后第30天，用达拉菲尼和曲美替尼联合治疗的小鼠分为三个治疗组：达拉非尼加曲美替尼(n=3)，igg1-axl-107-vcmmae(n=5)，或达拉非尼、曲美替尼和igg1-axl-107-vcmmae的三重组合(n=5)。在随机化后第0天和第7天，将adc以100μl的总体积注射到动物的尾静脉中。接受达拉菲尼和曲美替尼的组从随机化当天开始每天治疗直至研究结束。当肿瘤尺寸超过1000mm3时处死动物。用graphpadprism软件使用900mm3的肿瘤尺寸截止值分析存活。使用mantel-cox检验分析组间存活的差异。结果体外数据显示braf突变的pdx来源的细胞培养物m019r在细胞表面上表达axl(实施例17)并且对braf抑制剂plx4720具有抗性，这与该模型来源的患者的威罗菲尼的临床抗性一致。此外，igg1-axl-107-vcmmae在体外有效诱导m019r细胞的杀伤(实施例17)。将m019r细胞移植到裸鼠中并评估igg1-axl-107-vcmmae的抗肿瘤功效。用igg1-b12-vcmmae或达拉菲尼加曲美替尼(组合)的对照治疗在该模型中没有导致显著的肿瘤生长抑制(图28)。然而，igg1-axl-107-vcmmae(4mg/kg)诱导肿瘤消退，并且在中断治疗后25天(随机化后第39天)未观察到肿瘤生长(图28)。使用在第33天进行的mann-whitney检验，显示在igg1-axl-107-vcmmae和igg1-b12-vcmmae治疗(p=0.0005)之间以及igg1-axl-107-vcmmae和达拉菲尼/曲美替尼治疗之间(p<0.0001)肿瘤尺寸的差异具有高度显著性。与用达拉菲尼、曲美替尼和igg1-axl-107-vcmmae的三重组合治疗相比，接受达拉菲尼加曲美替尼起始治疗并继续接受达拉菲尼加曲美替尼治疗或单独用igg1-axl-107-vcmmae治疗的小鼠显示存活明显较短(分别为p=0.0042和p=0.0403；图28c)。此外，与继续用达拉菲尼加曲美替尼治疗的小鼠相比，用达拉菲尼加曲美替尼初始治疗后用igg1-axl-107-vcmmae治疗的小鼠也显示出显著更长的存活(p=0.0462；图28c)。实施例20-体内抗性braf突变黑色素瘤模型(m009r)中igg1-axl-107-vcmmae与brafi/meki组合的抗肿瘤活性来源于恶性黑色素瘤患者的braf突变m009r异种移植模型igg1-axl-107-vcmmae的抗肿瘤活性在nmri裸鼠的皮下黑色素瘤模型m009r中评估。如实施例18中所述获得m009rpdx来源的细胞培养物，其来源于具有brafv600e突变的黑色素瘤患者的肿瘤材料，其最初显示对威罗菲尼的反应，但获得对威罗菲尼的抗性。小鼠在左侧皮下注射2.5×105个m009r黑色素瘤细胞，将其以1：1重悬于基质胶中，总体积为100μl。用卡尺每周测量肿瘤两次，并且在肿瘤细胞接种后第62天肿瘤为100mm3时，将动物随机化到以下4个治疗组(每组7或8只小鼠)：igg1-b12-vcmmae(‘对照adc’;4mg/kg,i.v.),igg1-axl-107-vcmmae(4mg/kg,i.v.),braf-抑制剂达拉非尼(30mg/kg,口服强饲法)加mek-抑制剂曲美替尼(0.1mg/kg,口服强饲法)加igg1-b12-vcmmae(‘对照adc’;4mg/kg,i.v.),和达拉非尼(30mg/kg,口服强饲法)加曲美替尼(0.1mg/kg,口服强饲法)加igg1-axl-107-vcmmae(4mg/kg,i.v.)。在随机化后第0天和第7天，将adc以100μl的总体积注射到动物的尾静脉中。从随机化当天开始，每天口服给予达拉菲尼和曲美替尼直至研究结束。当肿瘤尺寸超过1000mm3时处死动物。结果m009r细胞显示异源axl表达(实施例18)，与该模型来源的患者的临床抗性一致。此外，igg1-axl-107-vcmmae在体外浓度为1μg/ml时不诱导m009r细胞的杀伤。将m009r细胞皮下移植到裸鼠，评估igg1-axl-107-vcmmae单独或与达拉菲尼加曲美替尼组合的抗肿瘤功效。在该模型中用对照adc(igg1-b12-vcmmae,4mg/kg)或igg1-axl-107-vcmmae(4mg/kg)治疗没有导致显著的肿瘤生长抑制(图29a)。用对照adc联合达拉菲尼加曲美替尼(组合)治疗诱导肿瘤生长抑制，而igg1-axl-107-vcmmae联合达拉菲尼加曲美替尼诱导部分肿瘤消退(图29a)。使用在第14天进行的mann-whitney检验，显示用igg1-axl-107-vcmmae与达拉菲尼加曲美替尼的组合治疗的小鼠的平均肿瘤尺寸显著小于用对照adc(p=0.003)、igg1-axl-107-vcmmae(p=0.0002)、对照adc与达拉菲尼加曲美替尼的组合(p=0.0034;图29b)治疗的小鼠。实施例21-igg1-axl-107-vcmmae诱导nras突变的meki抗性肿瘤细胞系的细胞毒性细胞培养skmel2、fm6和blm细胞系，它们都具有nras密码子61中的突变(表19)，从thermofischer或atcc获得。在补充有10％胎牛血清(sigma)、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素(均为gibco)的dmem中培养黑色素瘤细胞系。将细胞系在5％(体积/体积)co2加湿培养箱中在37℃维持。曲美替尼抗性细胞系的产生mek抑制剂敏感细胞系skmel2在递增浓度的mek抑制剂曲美替尼存在时，以高达0.1μm的浓度，培养2至3个月(selleckchemicals;目录号：s2673)，以建立相应的曲美替尼抗性skmel2r细胞系。黑色素瘤细胞系的质膜上的axl表达的定量通过间接免疫荧光使用qifikit分析(dako，目录号k0078)定量人肿瘤细胞系的质膜上的axl表达。使用小鼠单克隆抗体ab89224(abcam,cambridge,uk)检测axl。将贴壁细胞胰蛋白酶消化并通过细胞过滤器以获得单细胞悬浮液。将细胞通过以1,200rpm离心5分钟来沉淀，用pbs洗涤并以1x106个细胞/ml的浓度重新悬浮。在冰上进行下一步骤。将100μl单细胞悬浮液(100,000个细胞/孔)接种在聚苯乙烯96孔圆底板(greinerbio‐one,目录号650101)中。将细胞通过以300xg离心3分钟来沉淀，并以10μg/ml的浓度重新悬浮于50μl抗体样品或小鼠igg1同种型对照样品(目录号qf2040741，批号ma1-10406，pierce)中。在4℃下孵育30分钟后，将细胞沉淀并重新悬浮于150μlfacs缓冲液(含有0.1%bsa的pbs)中。根据制造商的说明将设置和校准珠粒加入到平板中。将细胞和珠粒用150μlfacs缓冲液平行洗涤两次以上，并重新悬浮于50μlfitc缀合的山羊抗小鼠igg(1/50；dako,目录号k0078)中。将第二抗体在4℃避光孵育30分钟。细胞和珠粒用150μlfacs缓冲液洗涤两次并重新悬浮于100μlfacs缓冲液中。在facscalibur(bdbiosciences)上通过在活细胞的门内记录10,000个事件来测量免疫荧光。使用校准珠粒的平均荧光强度来使用graphpadprism软件(graphpadsoftware,sandiego,ca,usa)计算校准曲线。对于每种细胞系，使用axl抗体染色的细胞的平均荧光强度，基于校准曲线的方程计算抗体结合能力(abc)，即质膜上表达的axl分子数量的估计值(使用graphpad软件从标准曲线插入未知值)。体外细胞毒性将细胞培养至接近汇合，其后将细胞用胰蛋白酶消化，重新悬浮于培养基中并通过细胞过滤器(bdfalcon，目录号352340)以获得单细胞悬浮液。将细胞以96孔形式以2000个细胞/孔铺板，接种后4小时加入igg1-axl-107-vcmmae。在培养基中制备igg1-axl-107-vcmmae的系列稀释液(10倍；范围从0.0001至10μg/ml的终浓度)并加入平板中。在37℃、5%co2下孵育5天后，将celltiter‐glo试剂(promega；目录号g7571)加入到孔中并根据制造商的方案进行发光细胞活力测定(promega,madison,wi)。通过infinitem200微孔板读数仪(tecan)测量发光，并且如下计算活力：％活力=(目标发光样品-发光pao)/(对照媒介物处理的发光pao的平均发光)，其中pao代表用5μm苯基氧化砷处理用于100％细胞杀死。结果通过western印迹或流式细胞术测定的ax1表达在3种nras突变细胞系中的2种中被记录(表19)。有趣的是，第四种细胞系(skmel2r)是通过在体外连续暴露于mek抑制剂曲美替尼而从skmel2细胞系衍生的。获得对曲美替尼的抗性的skmel2r细胞系显示出强的axl表达，而对曲美替尼敏感的亲本skmel2细胞在细胞表面上不表达可检测水平的axl(表19)。图30显示igg1-axl-107-vcmmae诱导具有高axl表达的黑色素瘤细胞系，skmel2r、fm6和blm的特异性杀伤，而缺乏axl表达的skmel2细胞对用igg1-axl-107-vcmmae治疗不敏感。因此，在nras突变的恶性黑色素瘤细胞系中观察到axl表达，包括获得对mek抑制剂曲美替尼的抗性的细胞系。此外，igg1-axl-107-vcmmae在表达axl的nras突变黑色素瘤细胞系中诱导细胞毒性，证明这些细胞中的axl表达水平足以允许在体外用igg1-axl-107-vcmmae诱导细胞毒性。表19.nras突变的黑色素瘤细胞系的特征使用的缩写:facs,荧光激活细胞分选;abc,抗体结合能力;blq,低于定量限(<3300,校准珠的最低abc值);wt,野生型;n.a.,未评估a不敏感细胞系在浓度为3µmplx4720或0.1µm曲美替尼时没有显示显著的细胞死亡b在1µg/mligg1-axl-107-vcmmae浓度下，不敏感细胞系没有显示显著的细胞死亡或显示与igg1-b12-vcmmae相当的细胞死亡。实施例22-晚期恶性黑色素瘤组织中axl表达的ihc分析免疫组织化学在新切割的石蜡包埋和福尔马林固定(ffpe)全组织切片中评估axl的表达，所述组织切片从含有nras突变的晚期恶性黑色素瘤患者中获得(n=10)。在sequenzaslideracks(tedpellainc.,redding,ca,usa;目录号36105)中手动进行染色。在染色之前，在室温下将ffpe组织切片在100％二甲苯(sigma-aldrich，目录号16446;三次，5分钟)中脱蜡，并在96％乙醇中脱水(sigmaaldrich，目录号32294;两次，5分钟)。此后，进行抗原修复。将ihc载玻片在柠檬酸盐缓冲液(ph6;dako;目录号s2369)中孵育5分钟；并在室温下在柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(0.43m柠檬酸,0.35mna2hpo4.2h2o;ph5.8)中的内源性过氧化物酶中封闭15分钟。在与第一抗体孵育之前，将载玻片在pbs中的10％正常人血清(clb/sanquin，目录号k1146)中孵育。通过在室温下用补充有2％正常人血清的pbs中的3μg/ml兔多克隆抗人axl抗体h-124孵育60分钟来确定axl表达。将载玻片在补充有0.1％tween-20的pbs中洗涤(两次，3分钟)，并用未稀释的brightvisionpoly-hrp-抗兔igg检测对axl特异性的兔抗体的结合。用3-氨基-9-乙基咔唑(aec)发色团(红色;sigma，目录号a6926-100tab)显示hrp；细胞核用苏木精(dako，目录号s3309)复染。由经认证的病理学家以盲法分析载玻片，其对每个样品中axl阳性肿瘤细胞的百分比和axl阳性肿瘤细胞的染色强度(1+，2+，3+)评分。对于各组织，根据以下等式计算h评分：h-评分=(1+细胞的％x1)+(2+细胞的％×2)+(3+细胞的％×3)结果在9/10的晚期nras突变黑色素瘤组织中在至少一部分肿瘤细胞中检测到ax1表达(表20；图31)。患者之间的染色强度和axl阳性肿瘤细胞的百分比不同。表20.一组晚期nras突变黑色素瘤组织样品中的axl表达样品%axl1+%axl2+%axl3+axlh-评分b2701010120b35010070b40000b6601010110b73001060b880200120b9600060b121010030b15601010110b16500050参考文献列表bahadoranetal.,jclinoncol;2013jul1;31(19):e324-e326bansaletal.,oncotarget.2015jun20;6(17):15321-31blakelyetal.,cancerdiscov.2012oct;2(10):872-5bleekeretal.,jimmunol.2004oct1;173(7):4699-707.bollagetal.,natrevdrugdiscov2012nov;11(11):873-86brandetal.,clincancerres.2015jun1;21(11):2601-12colombinoetal.,jclinoncol2012;30(20):2522-9dahlmanetal.,cancerdiscov.2012sep;2(9):791-7.epub2012jul13.debruyneetal.,oncogene.2015nov30.doi:10.1038/onc.2015.434dufiesetal.,oncotarget.2011nov;2(11):874-85elkabetsetal.,cancercell.2015apr13;27(4):533-46greigetal.,drugs,2016feb;76(2):263-73.herbstetal.,expertopininvestigdrugs.2007feb;16(2):239-49hilgeretal.,intjclinpharmacolther.2002dec;40(12):567-8.hongetal.,cancerlett.2008sep18;268(2):314-24.hongetal.,cancerres.2013jan1;73(1):331-40.hongetal.,clincancerres.2012apr15;18(8):2326-35.huangetal.,cancerres.2010sep15;70(18):7221-31.doi:10.1158/0008-5472.can-10-0391kimetal.,curropinmolther.2004feb;6(1):96-103.kimetal.,moloncol.2013dec;7(6):1093-102.konieczkowskietal.,2014,cancerdiscov4:816-827.lietal.,oncogene.2008aug7;27(34):4702-11.lietal.,cancerlett.2016jan28;370(2):332-44.liuetal.,cancerres.2009sep1;69(17):6871-8mahadevanetal.,oncotarget.2015feb10;6(4):1954-66mordantetal.,molcancerther.2010feb;9(2):358-68mülleretal.,natcommun.2014dec15;5:5712parketal.,leukemia.2015dec;29(12):2382-9pettazzonietal.,cancerresearch2015;75:1091-1101.pollacketal.,jpharmacolexpther.1999nov;291(2):739-48prewettetal.,jimmunotheremphasistumorimmunol.1996nov;19(6):419-27.sirotnaketal.,clincancerres.2000dec;6(12):4885-92.talaveraetal.,cancerres.2009jul15;69(14):5851-9tanetal.,lungcancer.2012may;76(2):177-82.wilsonetal.,cancerres.2014oct15;74(20):5878-90wongetal.,jpharmacolexpther.2009apr;329(1):360-7.xiaetal.,oncogene.2002sep12;21(41):6255-63.yangetal.,critrevoncolhematol.2001apr;38(1):17-23.zhangetal.,natgenet.2012jul1;44(8):852-60zhouetal.,oncogene.2016may;35(21):2687-97wo2014/174111;pierrefabrémedicamentandspirogensarlwo09/062690;u3pharmawo2010/130751;u3pharmawo2014/093707;stanforduniversityep2228392a1;chugaiyangetal.,eortcmeeting2013,poster493(2013a)yangetal.,int.j.cancer:132,e74–e84(2013b)paccezetal.,int.j.cancer:134,1024-1033(2014)(epub2013jun4)leconetetal.,oncogene,1-10(2013)lingeretal.,expertopin.ther.targets,14(10):1073-1090(2010)lietal.,oncogene,28,3442-3455(2009)yeetal.,oncogene,1-11(2010)alleyetal.,currentopinioninchem.bio.,4,529-537(2010)iidaetal.,anticancerresearch,34:1821-1828(2014)tschuchetal.,aacr-eortcmeeting2015,postera10(2015)kingetal.,cancerres.2006dec1;66(23):11100-5.montagutetal.,j.cancerres.2008jun15;68(12):4853-61.sequistetal.,nengljmed.2015aug6;373(6):578-9lietal.,structure.2008feb;16(2):216-27pedersenetal.,cancerres.2010jan15;70(2):588-97.mishimaetal.,cancerres.2001jul15;61(14):5349-54lynetteetal.,jchembiol(2009)2:131–151)uitdehaagetal.,brjpharmacol.2012jun;166(3):858–876.tsaietal.(procnatlacadsciusa.2008feb26;105(8):304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