β-溶血性病原体的检测的制作方法

本申请涉及并要求2016年2月26日提交的美国临时专利申请no.62/300,372的优先权。每个申请通过引用整体并入本文。发明背景本发明涉及诊断学领域且更具体地涉及β-溶血性病原体的检测。更具体地说，本发明涉及使用空间稳定的脂质体的β-溶血性病原体的快速且准确的检测。本文为阐明本发明背景使用的出版物和其他材料，并且特别是提供关于实践的附加细节的案例，通过引用并入，并且为方便，在下文中通过编号引用并通过编号在附加的参考书目中列出。众所周知，作为一般规律β-溶血性微生物是致病性的，并且是广谱的动物疾病的成因。常见的实例包括化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)(咽炎)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)(李斯特菌病)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)(气性坏疽)、诺维梭状芽胞杆菌(clostridiumnovyi)(黑羊病)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(一般感染)和蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)(食物中毒)。因为没有已知的非致病细菌也是β-溶血性的，β-溶血对于细菌病原体的检测具有高的阳性预测价值。因此，很少(如果有)假阳性的对β-溶血的检测是有信息量的。由于这个原因，1903年发明的红细胞(redbloodcell，rbc)琼脂平板仍然是鉴定β-溶血的黄金标准。然而，rbc琼脂培养具有一个主要瑕疵。在多数情况下，它们的结果花费很长时间才临床相关。漫长的孵育期的原因是细菌菌落必须穿过不透明的rbc创建可见的清除。然而，为达到这种视觉结果，菌落必须分泌相当量的溶血素，这意味着菌落必须生长到相对大的尺寸。两个例子说明这个问题的后果。只有5-10％喉咙痛感染是由细菌引起的，以a族β-溶血性链球菌为最常见的原因[1]。然而，血液琼脂在允许临床医生决定抗生素治疗是否合适的时间范围内无法识别β-溶血。由于这个原因，目前的测试基于与血液琼脂培养相比快速但不灵敏的抗原检测试剂盒。第二个例子是食品安全监测。对细菌病原体的现场快速测试的缺乏削弱食品公司应对其食品产品中细菌污染的能力。在两种情景下，对于β溶血的一个快速功能测试将为决策制定提供准确和及时的信息。尽管没有商业上可获得的对β-溶血的快速诊断测试，对于特定的β-溶血性物种检测的这种测试实际上确实存在。这些方法基于遗传或抗原决定簇的检测，且不是β-溶血。例子包括对于a族链球菌的快速抗原检测测试[2，3]和对于特定基因或核糖体rna的基于核酸的测定[4，5]。这些方法有益于在快速周转时间鉴定特定细菌，但当病原体是单细胞时，它们不灵敏且不可靠。进一步，需要集中测试设施来执行这些方法。这些限制强调对不仅检测β-溶血，而且在速度和可扩展性优于rbc琼脂的广泛测定的需求。最近，已经开发替代测试。在韩国专利申请公开号kr10-2007-0042294中描述一个例子。该测试设计用于选择性地检测溶血性细菌，如单核细胞增生李斯特氏菌、威氏李斯特菌(listeriawelshimeri)、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌h50157。所述测试在使用脂质体的方法中检测特定微生物的信号，所述脂质体含有微生物特异性检测试剂，如显色试剂和基于电化学的分析试剂。生物传感器用于选择性地检测溶血性细菌且包含标准微生物、含有微生物特异性检测试剂的脂质体、信号测量机器、多种反应溶液和缓冲溶液。尽管该测试快速且灵敏，它具有使用血液琼脂培养基并且对α-和γ-溶血性细菌非阴性的缺点，即，所述测试特异于β-溶血细菌，没有由α-和γ-溶血性细菌(如果有的话)引起的假阳性。在美国专利申请公开号us2010/0331211中描述另一个例子，其描述用于检测可能存在于样品中的至少一种靶微生物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)在容器中使样品、能够使靶微生物生长的培养基和能够被靶微生物裂解的细胞群(例如红细胞或脂质体)接触；(b)使全部经受促进靶微生物生长的温度；和(c)实时观察细胞群的裂解，例如，通过测量荧光的消失或颜色的出现，表明靶微生物的存在。尽管所述测试足够快，其具有可能使用血液琼脂培养基并且对α-和γ-溶血性细菌非阴性的缺点。另外，已描述脂质囊泡或脂质体的溶血用于在生物传感测试中区分金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)。参见thetetal.，biosensbioelectron41：538-544，2013。然而，这些脂质囊泡是专门为该测试设计的，并且没有公开它们能用于检测β-溶血性病原体，且该测试对于α-和γ-溶血性细菌是非阴性的。kimetal.，sensorsandactuatorsb：chemical119：143-149，2006描述了基于对脂质体的溶血作用的电化学传感器测试。该测试使用脂质体和中间物2,6-二氯苯酚吲哚并显示对溶血细菌，包括单核细胞增生李斯特菌的选择性。没有公开该测试对α-和γ-溶血性细菌是非阴性的。silbertetal.，applenvironmicrobiol72：7339-7344，2006描述了着色检测测试。该测试使用包含磷脂和着色聚物聚二乙炔的琼脂包埋的纳米颗粒，并且能够鉴定革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。没有公开它们能用于检测β-溶血性病原体和该测试对α-和γ-溶血性细菌是非阴性的。期望开发一种快速、可靠和通用的对β-溶血性病原体具有几乎没有或没有由α-和γ-溶血性病原体引起的假阳性的特异性的β-溶血性病原体检测方法。发明简述本发明涉及诊断领域，且更具体地涉及β-溶血性病原体的检测。更具体地，本发明涉及使用空间稳定的脂质体的快速且准确的β-溶血性病原体检测。本发明提供了一种检测样品中β-溶血性病原体的存在的方法。该方法包括：(a)添加疑似含有β-溶血性病原体的样品至含有空间稳定的脂质体的生长培养基中以形成测试测定混合物，所述脂质体包含包封的荧光团；(b)孵育所述测试测定混合物一段时间，所述一段时间足以使所述β-溶血性病原体(如果存在)形成测试细胞群并导致所述空间稳定的脂质体的裂解，从而释放所述荧光团到所述测定混合物中以同化进所述测试细胞群中；(c)检测所述测试细胞群的荧光；以及(d)比较所述测试细胞群的荧光量与对照细胞群的荧光量。在一些实施方式中，所述荧光团是能与病原体结合(assotiate)的dna结合染料。在一些实施方式中，所述荧光团被发荧光的β-溶血性病原体同化。在一些实施方式中，所述荧光团基于病原体对所述荧光团的透过性进行选择。在一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阳性细菌同化。在另一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阴性细菌同化。在一些实施方式中，所述荧光团是非膜透过性的荧光染料，其能够表现出自猝灭。在其他实施方式中，所述荧光团基于所述生长培养基的背景荧光进行选择。在一些实施方式中，所述生长培养基是固体培养基，并且所述测试细胞群形成一个或多个测试菌落。在一个实施方式中，所述固体培养基是基于琼脂的。在其他实施方式中，所述生长培养基是液体培养基。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体是通过聚乙二醇(peg)稳定的脂质体。在一个实施方式中，所述peg是peg2000。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体被β-溶血性病原体但不被α-和γ-溶血性病原体裂解。在其他实施方式中，所述病原体是细菌。在一个实施方式中，本发明提供了使用固体生长培养基检测样品中β-溶血性病原体的存在的方法。在一些实施方案中，该方法包括：(a)添加疑似含有β-溶血性病原体的样品至含有空间稳定的脂质体的固体生长培养基中以形成测定混合物，所述脂质体包含包封的荧光团；(b)孵育所述测定混合物一段时间，所述一段时间足以使所述β-溶血性病原体(如果存在)形成一个或多个测试菌落并导致所述空间稳定的脂质体的裂解，从而释放所述荧光团到所述测定混合物中以同化进所述一个或多个测试菌落中；(c)检测所述一个或多个测试菌落的荧光；以及(d)比较所述一个或多个测试菌落的荧光量与一个或多个对照菌落的荧光量。在其他实施方案中，所述方法进一步包括量化所述一个或多个测试菌落的菌落荧光的纹理分量(textualcomponent)和与所述一个或多个对照菌落相关的背景荧光。在一些实施方式中，所述荧光团是能与病原体结合的dna结合染料。在一些实施方式中，所述荧光团被发荧光的β-溶血性病原体同化。在一些实施方式中，所述荧光团基于病原体对所述荧光团的透过性进行选择。在一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阳性细菌同化。在另一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阴性细菌同化。在一些实施方式中，所述荧光团是非膜透过性荧光染料，其能够表现出自猝灭。在其他实施方式中，所述荧光团基于所述生长培养基的背景荧光进行选择。在一个实施方式中，所述固体培养基是基于琼脂的。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体是通过聚乙二醇(peg)稳定的脂质体。在一个实施方式中，所述peg是peg2000。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体被β-溶血性病原体但不被α-和γ-溶血性病原体裂解。在其他实施方式中，所述病原体是细菌。在另一个实施方式中，本发明提供了使用液体生长培养基检测样品中β-溶血性病原体存在的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(a)添加疑似含有β-溶血性病原体的样品至含有空间稳定的脂质体的液体生长培养基中以形成测定混合物，所述脂质体包含包封的荧光团；(b)孵育所述测定混合物一段时间，所述一段时间足以使所述β-溶血性病原体(如果存在)形成测试细胞群并导致所述空间稳定的脂质体的裂解，从而释放所述荧光团到所述测定混合物中以同化进所述测试细胞群中；(c)检测所述测试细胞群的荧光；以及(d)比较所述测试细胞群的荧光量与对照细胞群的荧光量。在其他实施方式中，所述方法进一步包括确定检测时间(time-to-detection，ttd)。ttd定义为当时间系列的荧光以p＜0.005显著超过肺炎链球菌(s.pneumonia)的荧光的点。在一些实施方式中，所述荧光团是能与病原体结合的dna结合染料。在一些实施方式中，所述荧光团被发荧光的β-溶血性病原体同化。在一些实施方式中，所述荧光团基于病原体对所述荧光团的透过性进行选择。在一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阳性细菌同化。在另一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阴性细菌同化。在一些实施方式中，所述荧光团是非膜透过性荧光染料，其能够表现出自猝灭。在其他实施方式中，所述荧光团基于所述生长培养基的背景荧光进行选择。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体是通过聚乙二醇(peg)稳定的脂质体。在一个实施方式中，所述peg是peg2000。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体被β-溶血性病原体但不被α-和γ-溶血性病原体裂解。在其他实施方式中，所述病原体是细菌。本发明还提供了用于进行本文所述的用于检测β-溶血性病原体的方法或测定的试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒包括空间稳定的脂质体和荧光团。在一些实施方式中，所述荧光团包封在所述脂质体中。在其他实施方式中，所述荧光团与所述脂质体分开并在使用前包封到所述脂质体中。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含生长培养基。在一些实施方式中，所述生长培养基是固体培养基。在其他实施方式中，所述生长培养基是液体培养基。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括对照病原体。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于实施所述方法或测定的说明书。本发明还提供了本文所述的包含包封的荧光团的空间稳定的脂质体用于β-溶血性病原体的检测的用途。在一些实施方式中，所述病原体是细菌。本发明进一步提供了本文所述的用于β-溶血性病原体的检测的试剂盒的用途。在一些实施方案中，所述病原体是细菌。附图简述图1a-1e显示β-溶血性菌落由l-hoechst差异染色。细菌标记如下。bc：蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)，spy：化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)，sa：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，cp：产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)，lm：单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)，spn：肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)，ss：唾液链球菌(streptococcussalivarius)，so：口腔链球菌(streptococcusoralis)，se：表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)，ll：乳酸乳球菌(lactococcuslactis)，ec：大肠杆菌(escherichiacoli)。‘β+’和‘β-’分别指β-溶血性和非β-溶血性细菌。图1a：含l-hoechst脑心浸液(brainheartinfusion，bhi)琼脂培养基中的β-溶血性菌落在过夜孵育后强烈地发荧光。相比之下，α和γ-溶血性菌落显示很少至没有可见荧光。图1b：报告的菌落荧光值归一化至背景荧光。每种β-溶血性细菌的平均荧光显著高于具有最高荧光的对照细菌ll(p＜0.0001)。图1c：显示红细胞、细菌杆和脂质体的相对大小。图1d：在bhi琼脂中铺板后数小时，spy和bc菌落荧光水平变得可见并指数增加，在小于24小时内达到高水平。se和ec荧光仍然低。图1e：使用支持向量机(svm)作为分类器，由l-hoechst染色的强度(菌落荧光)和纹理(texture)(平均不相似度)线性分离β和非β溶血性细菌。比例尺，50μm。误差线，平均值±s.d.***p＜0.0001。图2显示生长培养基中的脂质体稳定性。从l-srb中省略dspe-peg2000显著增加来自脂质体的磺酰罗丹明b(sulforhodamineb，srb)渗漏的量。实验重复至少三次。数据的误差线总结是平均值±s.d.***p＜0.0001。图3a-3c显示对h33342的研究。图3a：革兰氏阳性菌落(bc，spy，sa，cp，lm，ss，so，se，ll，xl1)在与补充有h33342的bhi琼脂孵育过夜后能够摄取游离h33342染料。革兰氏阳性细胞比ec更好地摄取染料。图3b：l-h33342(其并入dspe-peg2000)在含胎牛血清(终浓度，10％)的bhi中稳定超过24小时，基础渗漏为1.4％。图3c：六偏磷酸钠，一种膜渗透剂增加ec的荧光摄取，不过在0.3％时它对spy是致死的。实验重复三次。数据的误差线总结是平均值±s.d.***p＜0.0001。图4a-4d显示β-溶血性菌落在琼脂共培养物中与α溶血性spn是可区分的。图4a：sa和spy各自与spn在bhi琼脂+l-hoechst中共培养过夜。sa，spy和spn的单独培养物作为对照。裂解l-hoechst的菌落发蓝色荧光，但这里人工显示为红色用于对比。由对spn特异的抗体免疫染色琼脂基质，spn菌落标记为绿色荧光。明场图像有助于定位菌落位置。使用l-hoechst可以阳性鉴定β-溶血性菌落，甚至在紧密贴近非β溶血性spn菌落的时候。图4b：使用绿色荧光的缺乏或存在作为用于识别spy/sa(n＝46)相对spn(n＝49)菌落的真实有效值(groundtruth)，两种菌落类别均随机划分成训练和测试集合。训练集合用于建立svm计算的一维超平面(显示为虚线)，以基于l-hoechst染色的菌落荧光和平均差异性来分离类别。测试集合用于验证训练的svm分类器的准确度。在这个典型的例子中，分类准确度为100％。图4c：使用10倍交叉验证框架重复(b)中的实验。报告平均svm概率(β-溶血的概率)和标准偏差。spy/sa显著不同于spn(p＜0.0001)。图4d：总结(c)的svm分类结果以表格形式显示。误差线，平均值±s.d.***p＜0.0001。图5a-5h显示β-溶血性细菌在含l-srb的肉汤培养基中可快速检测。图5a-5g：接种一组细菌(bc，spy，sa，cp，lm，spn，ss，se和ec)在含有bhi肉汤、胎牛血清和l-srb的384孔板中。图例中所述的所有指数指以cfu计的接种量。观察到β-溶血性细菌裂解l-srb并导致报告为％裂解的srb荧光的急剧增加。相反，α-溶血性(spn和ss)和γ-溶血性(se和dh5)细菌尽管混浊生长但没有显示出信号中明显的增加(图6a-6d；图7a-7d)。显示来自三个独立实验的每个时间系列，每个有四次重复。图5b：展示(a)的重新调整比例尺的版本。每个spy时间系列的检测时间(ttd)(p＜0.005)用*标志。ttd随接种量而单调性增加。图5h：测试的所有β-溶血性细菌的统一ttd与接种量(cfu对数)线性相关(r2＞0.96)。误差线，平均值±s.d.图5i显示β-溶血性细菌诺维梭状芽胞杆菌-nt(clostridiumnovyi-nt，cn)，一种极难分离和培养的严格厌氧菌，并且是食源性病原体肉毒杆菌(clostridiumbotulinum)的近亲，在含l-srb肉汤培养基中可快速检测到。接种cn在含有bhi肉汤、胎牛血清、oxyrasetm和l-srb的384孔板中。图例中所述的所有指数指以cfu计的接种量。观察到cn裂解l-srb并导致报告为％裂解的srb荧光的急剧增加。相反，α-溶血性(spn)细菌没有显示出信号中明显的增加。每个时间系列衍生自至少三次重复。误差线，平均值±s.d.图6a-6d显示在实验的过程中spy，sa，cp和lm的生长曲线。图6a-6d：(a)spy，(b)cp，(c)sa和(d)lm在15小时内通过od600测量的生长曲线显示所有接种量的混浊生长。spn，ss，se和ec绘制在相同的图上用于参考。较大的接种量与较早进入指数生长相关。spn细胞表现出典型的滞后和指数阶段，但在稳定期自溶，引起其生长曲线下沉。实验重复三次。数据的误差线总结是平均值±s.d.图7a-7dbc显示l-srb的介导裂解。图7a：此处显示由从活培养物接种的bc细胞对l-srb的％裂解。裂解动力学类似于从冷冻细菌库存接种的bc细胞。图7b：在单个cfu及以下的有限稀释下，bc的ttd仅受细胞的深度冷冻的轻微影响。图7c和7d：由od600测量的活的和冷冻bc细胞的生长曲线显示所有接种量的混浊生长。实验重复三次。数据的误差线总结是平均值±s.d.图8a-8d显示用于bcβ-溶血的肉汤中的ttd不受掺入高达100倍过量的α-溶血性spn影响。在384孔板中，bc单独孵育或与104个spn细胞共孵育超过12小时。该图中的所有值均基于每次具有4次重复的3次独立实验的平均值。图8a：在12小时终点处l-srb的裂解不受在100以上bc接种物的spn影响。图8b：掺入spn的bc的检测时间仅受bc的有限稀释的影响，但如果bc至少有10个cfu则不受影响。图8c和8d：对于不同cfu的bc，绘制在spn存在(c)或不存在(d)的情况下l-srb的bc裂解的动力学。当有至少10个cfu的bc时，两种条件之间的动力学是相当的。误差线，平均值±s.d.。图9显示超过12小时bc和spn的肉汤共培养物。显示掺入恒定的104cfu的spn的连续稀释的bc接种物的生长曲线。图例中所述的所有指数指以cfu计的接种量。高bc接种量(≥102cfu)的生长曲线不受spn影响。这些混合物样品类似于仅bc曲线。101cfu的bc和104cfu的spn的组合表现出双相生长阶段。在400分钟的下沉然后在600分钟的恢复可能分别由spn自溶和bc生长驱动。bc(10-1cfu)的有限稀释导致曲线类似于单独的spn。实验重复三次。数据的误差线总结是平均值±s.d.图10显示和bc的混合物中spn通过免疫荧光的可视化。在图9中描述的bc和spn的共培养后，稀释这些肉汤共培养物至标准光密度并用对spn特异的抗体染色。在106至104cfu的bc范围内观察到很少或没有spn细胞。绿色荧光spn细胞的比例随bc接种量的反比例增加。显微镜图像是来自三个实验的代表性图像。比例尺，5μm。图11a和11b显示分离和鉴定来自bc和spy的l-srb相互作用蛋白。图11a：离心bc、spy和培养基对照的过夜培养物以除去细菌细胞。悬浮l-srb在上清液(‘s/n’)中，并然后由超速离心回收。然后用pbs洗涤所得脂质体沉淀一次(‘洗涤’)以除去非特异性结合的蛋白质，并然后再次离心。然后由sds-page分析最终的脂质体沉淀(‘沉淀’)。然后从凝胶上切下选择的条带(编号为1至8)并送去质谱分析。图11b：此处显示来自(a)条带的lc-esi-ms分析结果。分别从bc和spy鉴定出众所周知的膜毒素，肺泡溶素(alveolysin)和链球菌溶血素o(streptolysino)。其他6个鉴定的条带已在文献中报道为膜相互作用蛋白。图12显示通过降低用于阳性β-溶血的p值阈值可以实现更快的ttd。显示使用spy为例的表格。所有斜体值均为以分钟计的ttd。图13显示由两类溶血性蛋白表现出对l-srb的不同效力。与分泌非酶成孔毒素的spy、sa和lm相比，膜降解酶如由bc和cp分泌的磷脂酶在15小时孵育结束时显示出显著更高的l-srb裂解。数据的误差线总结是平均值±s.d.。实验重复至少三次。***p＜0.0001发明详述本发明涉及诊断领域，且更具体地涉及β-溶血性病原体的检测。更具体地，本发明涉及使用空间稳定的脂质体快速且准确的β-溶血性病原体的检测。所有已知的β-溶血性细菌都是致病性的，并因此β-溶血的及时检测是病原体的非常有价值的阳性预测因子。然而，血液琼脂上溶血的评估需要很长时间才能影响临床决策。本发明显示β-溶血性细菌能够裂解和释放包封在空间稳定的脂质体中的荧光团，而α-和γ-溶血性细菌没有效果并因此能够被区分开。通过分析荧光动力学，在琼脂上培养的β-溶血性菌落能在6小时内以100％准确度被识别。此外，基于荧光强度和机器提取的纹理特征的静态分析以99％准确度区分β-溶血和共培养的对照菌落。在肉汤培养物中，β-溶血性细菌在一小时内能检测到，而对照细菌甚至在第二天仍为阴性。本发明显示以空间稳定的脂质体替换红细胞能快速检测β-溶血。本发明中利用的方法旨在消除使用红细胞测定中的问题。单个细菌，即使它能够裂解6倍其长度和130倍其体积的红细胞，也不会在一群不透明的血细胞中创建可测量的事件。相反，可以合理地预期相同的细菌裂解每个长度为其长度的十分之一和其体积的百分之一的多个脂质体，导致在透明培养基中可见的荧光信号(图1c)。本发明显示以聚乙二醇(peg)空间稳定的脂质体能被β-溶血性细菌而不是α-或γ-溶血性细菌裂解。首先，显示仅在琼脂中培养的β-溶血性菌落能裂解包封hoechst33342(h33342)的脂质体，并结果被释放的h33342染色。通过基于荧光强度和荧光质地(使用新型模式识别方法)分类菌落，我们能够区分β-溶血性菌落与α-和γ-溶血性菌落的区别，无论它们是否是纯培养物(100％准确度)或β-和α-溶血细菌的混合物(99％准确度)。本发明进一步显示，包封磺酰罗丹明b(srb)的脂质体能够在数小时内检测液体培养基中的β-溶血直至单个细菌。最后，本发明显示脂质体双层，尽管是聚乙二醇化的，能够与已知具有膜活性的化脓性链球菌和蜡状芽孢杆菌分泌的蛋白质物理结合，这一观察结果与脂质体作为溶血素的底物一致[6]。本发明提供了一种检测样品中β-溶血性病原体存在的方法。该方法包括：(a)添加疑似含有β-溶血性病原体的样品至含有空间稳定的脂质体的生长培养基中以形成测试测定混合物，所述脂质体包含包封的荧光团；(b)孵育所述测试测定混合物一段时间，所述一段时间足以使所述β-溶血性病原体(如果存在)形成测试细胞群并导致所述空间稳定的脂质体的裂解，从而释放所述荧光团到所述测定混合物中以同化进所述测试细胞群中；(c)检测所述测试细胞群的荧光；以及(d)比较所述测试细胞群的荧光量与对照细胞群的荧光量。在一些实施方式中，所述荧光团是能与病原体结合的dna结合染料。在一些实施方式中，所述荧光团被发荧光的β-溶血性病原体同化。在一些实施方式中，所述荧光团基于病原体对所述荧光团的透过性进行选择。在一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阳性细菌同化。在另一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阴性细菌同化。在一些实施方式中，细胞壁渗透剂用于增强由病原体的摄取。合适的细胞壁渗透剂是提供增加的荧光，但在提供增加荧光所必需的浓度下对病原体无毒的细胞壁渗透剂。细胞壁渗透剂的实例是本领域已知的。在其他实施方式中，所述荧光团基于所述生长培养基的背景荧光进行选择。在一些实施方式中，所述生长培养基是固体培养基，并且所述测试细胞群形成一个或多个测试菌落。在一个实施方式中，所述固体培养基是基于琼脂的。在其他实施方式中，所述生长培养基是液体培养基。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体是通过聚乙二醇(peg)稳定的脂质体。在一个实施方式中，所述peg是peg2000。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体被β-溶血性病原体但不被α-和γ-溶血性病原体裂解。在其他实施方式中，所述病原体是细菌。本发明的其他实施方案描述于本发明的实施方案和以下描述中并且被包括为本发明的实施方案。本发明的其他实施方案在下面的实施例中描述并被包括为本发明的实施方案。在一个实施方式中，本发明提供了使用固体生长培养基检测样品中β-溶血性病原体的存在的方法。在一些实施方案中，该方法包括：(a)添加疑似含有β-溶血性病原体的样品至含有空间稳定的脂质体的固体生长培养基中以形成测定混合物，所述脂质体包括包封的荧光团；(b)孵育所述测定混合物一段时间，所述一段时间足以使所述β-溶血性病原体(如果存在)形成一个或多个测试菌落并导致所述空间稳定的脂质体的裂解，从而释放所述荧光团到所述测定混合物中以同化进所述一个或多个测试菌落中；(c)检测所述一个或多个测试菌落的荧光；以及(d)比较所述一个或多个测试菌落的荧光量与一个或多个对照菌落的荧光量。在其他实施方案中，所述方法进一步包括量化所述一个或多个测试菌落的菌落荧光的纹理分量和与所述一个或多个对照菌落相关的背景荧光。在一些实施方式中，所述荧光团是能与病原体结合的dna结合染料。在一些实施方式中，所述荧光团被如本文所述发荧光的β-溶血性病原体同化。在一些实施方式中，所述荧光团基于病原体对所述荧光团的透过性进行选择。在一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阳性细菌同化。在另一个实施方式中，所述荧光团被革兰氏阴性细菌同化。在其他实施方式中，所述荧光团基于所述生长培养基的背景荧光进行选择。在一个实施方式中，所述固体培养基是基于琼脂的。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体是通过聚乙二醇(peg)稳定的脂质体。在一个实施方式中，所述peg是peg2000。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体被β-溶血性病原体但不被α-和γ-溶血性病原体裂解。在其他实施方式中，所述病原体是细菌。在一些实施方案中，所述固体生长培养基包括脑心浸液(brainheartinfusion，bhi)。在其他实施方案中，所述固体生长培养基还包括胎牛血清(fbs)。在一些实施方案中，所述固体生长培养基是基于琼脂的并含有琼脂糖。如本文所述，所述固体生长培养基进一步含有所述含有荧光团的空间稳定的脂质体。在一些实施方案中，所述固体生长培养基包括约0.2x至约1xbhi、0％至约10％fbs(v/v)、约0.5％至约2％琼脂糖(w/v)、和约1μl至约10μl含有荧光团的脂质体。在其他实施方案中，所述固体生长培养基包括约1xbhi、约10％fbs(v/v)、约1％琼脂糖(w/v)，和约4μl含有荧光团的脂质体。在一些实施方案中，所述含有荧光团的脂质体是如本文所述的含有h33342的脂质体。在其他实施方案中，所述固体培养基组分包含100μl用于进行测定，尽管能取决于底材(如显微镜载玻片)使用任何量。在一些实施方案中，使用bhi是因为它是复合的丰富培养基，其支持很多种细菌的生长。在所述固体培养基的其他实施方案中，bhi被其他脱水液体培养基取代，包括但不限于brucella肉汤、cookedmeat培养基、reinforcedclostridial培养基、lb肉汤、营养肉汤、巯基乙酸盐培养基、toddhewitt肉汤、terrific肉汤和trypticsoy肉汤。在其他实施方案中，bhi被现成配制的脱水固体培养基取代，包括但不限于brucella琼脂、bhi琼脂、lb琼脂、nutrient琼脂和trypticsoy琼脂。在一些实施方案中，选择性培养基用于富集所选定的靶细菌，在此情况下，bhi的替代物包括但不限于带抗微生物选择的甘露醇盐琼脂(mannitolsaltagar)(优选不含酚红)或弯曲杆菌琼脂(campylobacteragar)。在其他实施方案中，所述培养基直接补充有所选择的选择剂，包括但不限于抗生素、盐、胆汁盐、染料、亚碲酸盐和炭。在一些实施方案中，抗生素包括但不限于甲氧西林、万古霉素氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素、环丙沙星、红霉素、卡那霉素、利福平、四环素和甲氧苄啶。在其他些实施方式中，所述荧光团是能与病原体结合的dna结合染料。在一些实施方式中，所述荧光团被发荧光的β-溶血性病原体同化。在一些实施方式中，所述荧光团被革兰氏阳性细菌同化。在其他实施方式中，所述荧光团被革兰氏阴性细菌同化。在一些实施方式中，细胞壁渗透剂用于增强由病原体的摄取。合适的细胞壁渗透剂是提供增加的荧光，但在提供增加荧光所必需的浓度下对病原体无毒的细胞壁渗透剂。细胞壁渗透剂的实例是本领域已知的。在一些实施方案中，所述荧光团是hoechst33342(h33342)。在其他实施方案中，使用一般的dna/rna结合染料。在一些实施方案中，此类结合染料的实例包括但不限于：dapi、hoechst33258、34580、吖啶橙(acridineorange)、溴化乙锭(ethidiumbromide)、sybr染料家族、picogreen，syto-60、styo-62、syto-64、popo-3、toto-3、bobo-3、to-pro-3和sytoxorange，以及本文所述的那些。在一些实施方案中，使用用于空间稳定的peg化或其他缀合[7]和为降低膜渗透性与高胆固醇含量缀合的饱和磷脂酰胆碱[8]在纳米级配制所述空间稳定的脂质体。在其他实施方案中，所述饱和的磷脂酰胆碱被其他膜形成磷脂代替。在一些实施方案中，使用常规技术或本文描述的那些制备所述空间稳定的脂质体。在一些实施方案中，所述膜形成磷脂是饱和的磷脂酰胆碱(pc)、带饱和脂肪酸尾的任何合成的磷脂酰胆碱(pc)、或膜形成脂质。在一些实施方案中，合成的pc是二肉豆蔻酰基-磷脂酰胆碱、二棕榈酰基-磷脂酰胆碱或二硬脂酰基-磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，所述饱和的磷脂酰胆碱(pc)是氢化蛋黄磷脂酰胆碱(hydrogenatedeggyolkphophatidylcholine，hepc)。在其他实施方案中，所述膜形成脂质是饱和的鞘磷脂、饱和的磷脂酰乙醇胺、饱和的磷脂酰甘油、饱和的磷脂酰肌醇或饱和的磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，所述缀合物是聚乙二醇、聚丙二醇、聚丁二醇、或聚亚烷基二醇的共聚物(如聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物)、葡聚糖、支链淀粉、聚蔗糖、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐交替共聚物、直链淀粉、支链淀粉、壳聚糖、甘露聚糖、环糊精、果胶或角叉菜胶。在一些实施方案中，聚乙二醇(peg)用作缀合物(c-peg)。在一些实施方案中，所述peg具有分子量范围为约500至约10,000，优选约1,000至约5,000，更优选约2,000。在一些实施方案中，peg或其它缀合物缀合二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰甘油(dsg)、二肉豆蔻酰甘油(dmg)、胆甾醇化-缀合物(cholesterylated-conjugate)、硬脂酰(str)缀合物、c8神经酰胺-缀合物或c16神经酰胺-缀合物。在一些实施方案中，所述缀合物是peg2000并且所述缀合物是dspe-peg2000、dppe-peg2000、dmpe-peg2000、dsg-peg2000、dmg-peg2000、胆甾醇化-peg2000、str-peg2000、c8神经酰胺-peg2000或c16神经酰胺-peg2000。在一些实施方案中，所述空间稳定的脂质体由pc∶胆固醇∶c-peg的制备混合物制备，其中pc∶胆固醇的摩尔比通常在2∶1至1∶l的范围内而c-peg通常以5％(mol/mol)存在。在一个实施方案中，所述pc∶胆固醇∶c-peg的制备混合物具有50∶45∶5的摩尔比。在一个实施方案中，所述制备混合物是hepc∶胆固醇∶dspe-peg2000。在其他实施方案中，通过将本文所述的所述制备混合物溶解在氯仿中来制备所述具有掺入的荧光团的空间稳定的脂质体。该溶液在旋转蒸发下干燥成薄膜，并然后在真空下过夜。用包括300mm(nh4)2so4的水合缓冲液将所述膜水合并浸没在70℃的水浴超声波仪中约5分钟至20分钟，优选约5分钟至约15分钟，更优选约10分钟，以形成多层囊泡(multi-lamellarvesicle)。通过用探针超声波仪对所述溶液声处理来进一步减小这些囊泡的尺寸以提供澄清的溶液(在一些实施方案中：2分钟，3-5循环，其间间歇1分钟)。在整个声处理过程中保持所述混合物在冰上以防止悬浮液的过热。为了形成h+质子梯度以装载h33342，所述脂质体溶液在2和4小时对2次盐水溶液(如0.15mnacl)透析，并然后在4℃透析过夜。所述荧光团(如h33342)溶于盐水中，并以约5∶1至约20∶1，优选约10∶1至约15∶1，更优选约10∶1(mol脂质∶mol荧光团(如h33342))的比例加入所述脂质体溶液中，并在70℃的烘箱中孵育2小时。所述脂质体溶液通过具有pbs的hitrap脱盐柱以除去未包封的(未掺入的)荧光团(如h33342)。信号/背景比＞100的部分合并在一起并在4℃下储存。在一些实施方案中，添加疑似含有β-溶血性病原体的样品至本文所述的所述固体生长培养基中以形成测定混合物。在一些实施方案中，所述样品是人或兽医临床样品(如咽拭子、尿液、粪便、血清、血浆)、食物样品(如来自食物加工设施)或环境样品(如土壤)。在其他实施方案中，所述测定混合物短暂涡旋并旋转以重新形成所述混合物。在一些实施方案中，所述测定混合物置于凹面显微镜载玻片上并在其上放置盖玻片。在其他实施方案中，使用不同形式的显微镜载玻片，只要它们能容纳所述生长底物和试剂即可。例如，带有反应孔的显微镜载玻片。除了载玻片形式之外，还使用培养皿、多孔板(或其他透明培养容器)。在一些实施方案中，所述测定混合物孵育足够长的时间以使β-溶血性细菌(如果存在的话)形成测试菌落。在其他实施方案中，所述测定混合物在加湿室中在约10℃至约50℃的温度下孵育约2至约24小时或过夜，以形成测试细胞。在一些实施方案中，所述孵育温度为37℃。在一些实施方案中，所述测定混合物孵育约5至约18小时。在其他实施方案中，所述测定混合物孵育约6至约15小时。在一些实施方案中，所述测定混合物孵育约6至约10小时。在一些实施方案中，例如通过使用常规技术的可视化和量化然后来检测所述荧光。在一些实施方案中，以多种方式包括灯、激光或led光源，实现用于荧光激发的照明。在一些实施方案中，所述荧光团是h33342，并且所述测试菌落在365nm被激发并且在395nm的发射被捕获。在一些实施例中，以合适的相机(例如ccd相机)捕获所述发射。在一些实施例中，所述图像存储在计算机媒介上或云存储中。在一些实施例中，所述图像的分析在本地(如现场)进行。在其他实施方案中，所述图像的分析远程进行(如不在进行测定的现场进行)。在一些实施方案中，所述远程分析在与进行测定的不同国家进行。在一些实施方案中，使用fiji进行荧光图像的量化分析[22]。在一些实施方案中，首先所述图像堆叠在一起并在菌落中定义固定区域以测量强度的平均值。在一些实施方案中，通过使用相同的定义大小获得背景读数以测量菌落外的荧光强度。在一些实施方案中，通过将菌落中的区域的平均强度除以背景的平均强度计算信号/背景比。在一些实施方案中，类似地孵育对照菌落并通过可视化和量化检测。在一些实施方案中，比较所述测试菌落和对照菌落的所述量化荧光以检测β-溶血性病原体(如细菌)的存在。在其他实施方案中，与所述一种或多种对照菌落相比，一种或多种测试菌落中荧光的显著增加证实样品中β-溶血性病原体(如细菌)的存在。在一些实施方案中，所述方法进一步包括量化所述一种或多种测试菌落的所述菌落荧光的纹理分量和与所述一种或多种对照菌落相关的背景荧光。这些实施方案基于与β-溶血相关的所述菌落荧光定性地不同于与对照细菌相关的背景荧光的观察结果。具体地，前者看起来是均匀的，而后者具有粒状纹理。在一些实施方案中，通过使用所述荧光菌落的灰度共生矩阵(greylevelco-occurrencematrix，glcm)计算不相似度参数来量化所述纹理分量。glcm在本领域中公知并且在实施例中说明。发现β-溶血与不相似度成反比，因此创建第二互补轴以将β-溶血从对照分开。本发明的其他实施方案描述于本发明的实施方案和以下描述中并且被包括为本发明的实施方案。本发明的其他实施方案在下面的实施例中描述并被包括为本发明的实施方案。在另一个实施方式中，本发明提供了使用液体生长培养基检测样品中β-溶血性病原体存在的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(a)添加疑似含有β-溶血性病原体的样品至含有空间稳定的脂质体的液体生长培养基中以形成测定混合物，所述脂质体包括包封的荧光团；(b)孵育所述测定混合物一段时间，所述一段时间足以使所述β-溶血性病原体(如果存在)形成测试细胞群并导致所述空间稳定的脂质体的裂解，从而释放所述荧光团到所述测定混合物中以同化进所述测试细胞群中；(c)检测所述测试细胞群的荧光；以及(d)比较所述测试细胞群的荧光量与对照细胞群的荧光量。在其他实施方式中，所述方法进一步包括确定检测时间(time-to-detection，ttd)。ttd定义为当一个时间系列的荧光显著(p＜0.005)超过肺炎链球菌(s.pneumonia)的荧光的点。在一些实施方式中，所述荧光团是能与病原体结合的dna结合染料。在一些实施方式中，所述荧光团被如本文所述发荧光的β-溶血性病原体同化。在其他实施方式中，所述空间稳定的脂质体是通过聚乙二醇(peg)稳定的脂质体。在一个实施方式中，所述peg是peg2000。在一些实施方式中，所述空间稳定的脂质体被β-溶血性病原体但不被α-和γ-溶血性病原体裂解。在其他实施方式中，所述病原体是细菌。在一些实施方案中，所述液体生长培养基包括brainheartinfusion(bhi)。在其他实施方案中，所述液体生长培养基包括胎牛血清(fbs)。在一些实施方案中，所述固体生长培养基包括约0.2x至约1xbhi、0％至约10％fbs(v/v)、和约1μl至约10μl含有荧光团的脂质体。在其他实施方案中，所述固体生长培养基包括约1xbhi、约10％fbs(v/v)和约4μl含有荧光团的脂质体。在一些实施方案中，所述含有荧光团的脂质体是如本文所述的含有srb的脂质体。在其他实施方案中，所述液体培养基组分包括50μl用于进行测定，尽管能取决于底物(如微孔)使用任何量。在一些实施方案中，所述液体生长培养基进一步包括抗氧化剂以创建用于检测厌氧β-溶血性病原体的缺氧环境。在一些实施方案中，使用bhi是因为它是复合的丰富培养基，其支持很多种细菌的生长。在所述液体培养基的其他实施方案中，bhi被其他脱水液体培养培养基取代，包括但不限于brucella肉汤、cookedmeat培养基、reinforcedclostridial培养基、lb肉汤、营养肉汤、巯基乙酸盐培养基、toddhewitt肉汤、terrific肉汤和trypticsoy肉汤。在一些实施方案中，选择性培养基用于富集所选的靶细菌，在此情况下，bhi的替代物包括但不限于带抗微生物选择的甘露醇盐琼脂(mannitolsaltagar)(优选地。在一些实施方案中，所述培养基直接补充有所选的选择剂，包括但不限于抗生素、盐、胆汁盐、染料、亚碲酸盐和炭。在一些实施方案中，抗生素包括但不限于甲氧西林、万古霉素氨苄青霉素、头孢噻吩、氯霉素、环丙沙星、红霉素、卡那霉素、利福平、四环素和甲氧苄啶。在一些实施方案中，所述液体生长培养基进一步包括抗氧化剂以创建用于检测厌氧β-溶血性病原体的缺氧环境。在一些实施方案中，所述抗氧化剂是从液体除去溶解氧的酶系统。在一些实施方案中，所述酶系统是抗氧化酶系统。在其他实施方案中，所述荧光团是能与病原体结合的dna结合染料。在一些实施方案中，所述荧光团被发荧光的β-溶血性病原体同化。在一些实施方案中，所述荧光团被革兰氏阳性细菌同化。在其他实施方案中，所述荧光团被革兰氏阴性细菌同化。在一些实施方案中，细胞壁渗透剂用于增强由病原体的摄取。合适的细胞壁渗透剂是提供增加的荧光，但在提供增加荧光所必需的浓度下对病原体无毒的细胞壁渗透剂。细胞壁渗透剂的实例是本领域已知的。在一些实施方案中，所述荧光团是非膜透过性的荧光染料，其能够表现出自猝灭。这些染料包括但不限于荧光素、荧光素类似物如5,6-羧基荧光素、罗丹明、罗丹明类似物、dapi、hoechst33258、hoechst34580、吖啶橙、sybr染料、syto-60、，styo-62、syto-64、popo-3、toto-3、bobo-3、to-pro-3和sytoxorange。在一些实施方案中，所述染料是磺酰罗丹明(sr)。在一个实施方案中，所述磺酰罗丹明是磺酰罗丹明b(srb)在一些实施方案中，如本文所述配制所述空间稳定的脂质体。在一些实施方案中，通过将本文所述的所述制备混合物溶解在氯仿中来制备所述具有掺入的荧光团的空间稳定的脂质体。该溶液在旋转蒸发下干燥成薄膜，并然后在真空下过夜。用包括荧光团(如srb)和磷酸盐缓冲盐水(pbs)的水合缓冲液水合所述膜。在一些实施方案中，选择染料的量以向背景提供合适的更高信号。在一些实施方案中，猝灭在50mm以上srb开始有效。然而，更高的浓度引起更大的猝灭和去猝灭，并因此引起背景的更高信号。在一些实施方案中，所述水合缓冲液包括pbs中的100mmsrb，ph8.0-8.5。将水合膜浸没在70℃的水浴超声波仪中约5分钟至20分钟，优选约5分钟至约15分钟，更优选约10分钟，以形成多层囊泡。通过用探针超声波仪对所述溶液声处理来进一步减小这些囊泡的尺寸以提供澄清的溶液(在一些实施方案中：2分钟，3-5个循环，其间间歇1分钟)。在整个声处理过程中保持所述混合物在冰上以防止悬浮液过热。最后，所述脂质体悬浮液通过具有pbs的hitrap脱盐柱以除去未包封的(未掺入的)荧光团(如srb)。信号/背景比＞50的部分合并在一起并在4℃下储存。在一些实施方案中，添加疑似含有β-溶血性病原体的样品至本文所述的所述液体生长培养基中以形成测定混合物。在一些实施方案中，所述样品是人或兽医临床样品(如咽拭子、尿液、粪便、血清、血浆)、食物样品(如来自食物加工设施)或环境样品(如土壤)。在其他实施方案中，所述测定混合物短暂涡旋并旋转以重新形成所述混合物。在一些实施方案中，所述测定混合物置于孔板的孔中。在一些实施方案中，所述孔板是384孔板。在其他实施方案中，使用与荧光相容的任何透明流体容器。实例包括但不限于任何形式的多孔板、试管、比色皿和具有孔以容纳所述测试试剂的载玻片。除了荧光多孔板读取器之外，使用能够分析荧光信号的任何仪器。例如，在ccd相机上适当的滤光器结合照射样品的led激发源能起作用。在一些实施方案中，所述测定混合物孵育足够长的时间以使β-溶血性细菌(如果存在的话)形成测试细胞群。在其他实施方案中，在约10℃至约50℃下可以或可以不加湿的室中孵育所述测定混合物约5分钟至约30分钟或约20分钟至约15小时以形成测试细胞。在一些实施方案中，在37℃下进行所述孵育以形成测试细胞。在一些实施方案中，例如然后通过使用常规技术的可视化和量化来检测所述荧光。在一些实施方案中，使用荧光多孔板读数器或能够分析荧光信号的任何仪器。例如，使用在ccd相机上适当的滤光器结合照射样品的led激发源捕获荧光图像。在一些实施方案中，所述荧光团是hoechst33342，并且所述细胞在365nm被激发并且在395nm的发射被捕获。在一些实施例中，以合适的相机(例如ccd相机)捕获所述发射。在一些实施方案中，来自孔板的孔的细胞群收集、洗涤、归一化至固定数量并热固定至显微镜载玻片。在一些实施方案中，所述荧光团是srb，并且所述细胞在526nm被激发并且在584nm的增益为70的发射被捕获。在一些实施例中，以合适的相机(例如ccd相机)捕获所述发射。在一些实施例中，所述图像存储在计算机媒介上或云存储中。在一些实施例中，所述图像的分析在本地(如现场)进行。在其他实施方案中，所述图像的分析远程进行(如不在进行测定的现场进行)。在一些实施方案中，所述远程分析在与进行测定的不同国家进行。在一些实施方案中，使用如本文所述的fiji[22]进行荧光图像的量化分析。在一些实施方案中，通过可视化和量化类似地孵育和检测对照细胞群。在一些实施方案中，比较所述测试细胞群和对照细胞群的量化荧光以检测β-溶血性病原体(如细菌)的存在。在其他实施方案中，检测孔板的测试孔中的荧光并与孔板中的对照孔的荧光比较。在一些实施方案中，所述对照孔含有α-或γ-溶血性病原体的对照群，例如α-或γ-溶血性细菌。选择α-或γ-溶血性细菌，因为当归一化至100％脂质体裂解的荧光信号时，它仅裂解最多0.5％的脂质体。在一些实施方案中，所述对照病原体是肺炎链球菌或viridans链球菌(如唾液链球菌(streptococcussalivariu)、轻型链球菌(streptococcusmitis)或变形链球菌(streptococcusmutans))。在一些实施方案中，所述测试孔中的所述β-溶血性细胞群裂解约10％至约65％的所述脂质体，这导致信号水平比所述对照细胞群高26-125倍。在一些实施方案中，所述荧光团是srb，并且检测所述孔中的所述细胞的荧光在526nm被激发并且测量在584nm的增益为70的发射。在其他实施方案中，与所述对照孔相比，所述测试孔中的荧光的显著增加确认样品中β-溶血性病原体(如细菌)的存在。在其他实施例中，所述方法进一步包括确定检测时间(ttd)。ttd定义为当时间系列的荧光显著超过(p＜0.005)肺炎链球菌(s.pneumonia)的荧光的点。在一些实施方案中，所述测试孔和对照孔的所述荧光如本文所述在所述孔板高达15小时的孵育期间每10分钟测定一次，直到所述测试孔中的所述荧光显著超过肺炎链球菌的荧光。该测定在单细胞水平上灵敏，检测限为1-10cfu。对于统计严格性p＜0.001，104cfu的化脓性链球菌的最快检测时间是50分钟，并且单个cfu的金黄色葡萄球菌的最慢检测时间是14.3小时(仍然在一天内)。在一些实施方案中，统计学严格性从p＜0.001降低至p＜0.05允许更快的检测。例如，使用该阈值在18分钟内检测到104cfu的化脓性链球菌。本发明的其他实施方案描述于本发明的实施方案和以下描述中并且被包括为本发明的实施方案。本发明的其他实施方案在下面的实施例中描述并被包括为本发明的实施方案。本发明还提供了用于进行本文所述的用于检测β-溶血性病原体的方法或测定的试剂盒。在一些实施方案中，所述病原体是细菌。在一些实施方式中，所述试剂盒包括所描述的空间稳定的脂质体和荧光团。所述空间稳定的脂质体被β-溶血性病原体但不被α-和v-溶血性病原体裂解。在一些实施方式中，所述荧光团如本文所述包封在所述脂质体中。在其他实施方式中，所述荧光团与所述脂质体如本文所述分开并在使用前包封到所述脂质体中。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含生长培养基。在一些实施方式中，所述生长培养基是如本文所述的固体培养基。在其他实施方式中，所述生长培养基是如本文所述的液体培养基。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括如本文所述的对照病原体。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于实施所述方法或测定的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒组分包装在一个或多个合适的容器中。本发明还提供了本文所述的包括包封的荧光团的空间稳定的脂质体在用于β-溶血性病原体的检测中的用途。在一些实施方式中，所述病原体是细菌。本发明进一步提供了本文所述的用于β-溶血性病原体的检测的试剂盒的用途。在一些实施方案中，所述病原体是细菌。红血琼脂平板在对低至单个细胞的敏感性方面和具有低假阳性的特异性方面强健。然而，它们有几个不利之处。首先，它们需要长的孵育时间。在临床背景下，来自红血琼脂平板的信息不足以及时影响临床决策。其次，所述培养皿的大的规格限制这种测试规模放大的程度，并且就进入板中的材料而言是浪费资源。第三，来自马和绵羊血液产品的需求是人畜共患疾病传播的潜在风险(临床或食品安全测试中特别相关的考虑)。本发明显示解决这些问题的一种方法是通过以脂质体染料直接替换红细胞。以溶血素扰乱脂质囊泡的想法本身并不新颖[16-18]。例如，thet等人创建一种基于脂质体的测定，以通过改变胆固醇和可聚合的两亲物10，12-三十二碳二炔酸的浓度来区分金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。然而，之前未描述的是通过peg空间稳定的脂质体是足够稳定的以区分β-溶血与α-溶血和γ-溶血的总体原理。本文证明，这种脂质体确实是能以高精度区分β-溶血性细菌和α-溶血性细菌和γ-溶血性细菌的生物传感器。脂质体区分β-溶血性细菌与α-溶血性细菌和γ-溶血性细菌的能力在两部分证明：琼脂上β-溶血性菌落的直接显微镜可视化以及肉汤中β-溶血素的快速和间接检测。当悬浮在丰富生长液体培养基和琼脂中时，证实peg空间稳定的脂质体是稳定的(图2；图4b)。琼脂中菌落的可视化提出要求释放的染料由β-溶血性细菌菌落同化而非自由扩散开的额外的挑战。在第一部分中，显示β-溶血性菌落在过夜孵育后在琼脂上裂解l-hoechst，在该过程中变为发荧光。非溶血性菌落具有来自痕量h33342摄取的低基线荧光。尽管h33342不被革兰氏阴性细菌吸收，但如果使用被革兰氏阴性细菌同化的合适染料，则所述原理同样适用于革兰氏阴性细菌。如果需要，从琼脂中分离单个菌落用于进一步的下游表征。使用来自glcm的不相似度参数创建第二维，其在评估β-溶血中补充整合的菌落荧光强度。当沿两个轴绘制时，所有β-溶血性菌落与对照线性分离。这包括通常是众所周知的耗时的单核细胞增生李斯特菌，其需要以总试验时间为5-7天在选择性培养基上富集24-48小时[19]。当在绵羊血液琼脂上培养时，经常观察到溶血不会延伸到菌落边缘之外，有时需要移除菌落以观察清除区。相比之下，本发明使用通用生长培养基鉴定单核细胞增生李斯特菌β-溶血，并且仅孵育过夜(图1a和1b)。这种技术也很好作用于细菌混合物。在临床环境中，人类病原体如化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌经常与共生的肺炎链球菌混杂。通过以alexa-fluor488抗体标记肺炎链球菌，本发明显示化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌都清楚地与肺炎链球菌分开(图4a-4d)。在第二部分中，使用384孔板形式在肉汤中检测到β-溶血。在此，观察到β-溶血性细菌产生比基线高至少26倍的荧光信号(图5g)。选择肺炎链球菌作为基线，因为它具有强烈的α-溶血性和普遍的共生性。使用其荧光时间系列作为零假设，测量所测试的五种β-溶血性细菌当它们的荧光以统计学显著的方式超过肺炎链球菌时的时间点。这些称为检测时间(ttd)的时间点与接种量线性相关(图5h)。所述测定在单细胞水平是灵敏的，对所有5种细菌的检测限范围为1-10cfu。104cfu的化脓性链球菌的最快检测时间是50分钟，并且单个cfu的金黄色葡萄球菌的最慢检测时间是14.3小时(仍然在一天内)。统计学严格性从p＜0.001降低至p＜0.05允许更快的检测。例如，使用该阈值在18分钟内检测到104cfu的化脓性链球菌(图12)。蜡状芽孢杆菌、化脓性链球菌、产气荚膜梭菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的感染剂量分别为105、103、107、105和103[19-21]，这完全在用于试验的接种量的跨度内。对蜡状芽孢杆菌和肺炎链球菌的掺入实验证明，即使存在压倒性过量的肺炎链球菌，甚至单个cfu的蜡状芽孢杆菌(远低于其感染剂量)仍然是能检测的。发现一个感兴趣的观察结果是与均分泌成孔溶血素的化脓性链球菌、化脓性链球菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌相比，均分泌磷酸酶的蜡状芽孢杆菌和产气荚膜梭菌过夜孵育后具有更高的信号(图13)。尽管这种不同，所有细菌的ttd相差不超过一个数量级，并且最快的ttd是化脓性链球菌的104cfu，这表明溶血素类别不是ttd的决定因素。据推测，与磷脂酶相比，成孔毒素的渐近信号减少是由于这些蛋白质怎样与膜相互作用的差异。一旦在双层内组装，成孔蛋白不易转变成其他完整脂质体的双层。另一方面磷脂酶在其寿命期间具有持续的活性。在最后的实验中，分离与用蜡状芽孢杆菌或化脓性链球菌的生长条件化的培养基孵育的脂质体，以观察是否能够分离膜相互作用的溶血素。从化脓性链球菌条件化的培养基中分离出链球菌溶血素(该细菌中的主要溶血素)。有趣的是，当用蜡状芽孢杆菌重复该实验时，分离出三种明确定义的膜相互作用蛋白，肺泡溶素、肠毒素和肠毒素b，但未分离出作为主要溶血素的磷脂酶c(图11a和11b)。这与早先的推测一致，即与磷脂酶相比，成孔蛋白对双层具有更高亲和力。脂质体被peg化的事实不削弱蛋白质结合，证明peg化脂质体用于研究蛋白质-双层相互作用的效用。即时β-溶血性病原体测定的一或多个方面可以定制以创建专门的应用。例如，改变脂质体组合物以用于底物特异性溶血素(如鞘磷脂酶)的测定。脂质体组分的高稳定性意味着长保质期并且与一锅法(one-pot)或主混合物(mastermix)形式中其他测定组分相容。此外，通过使用选定的多种荧光染料、多种荧光激发源(例如led)、照相机、电动载物台和用于全自动监测的图像分析软件的自动化，所述测定易于适应高通量。如果紧迫性是最重要的，那么通过使用实时图像处理和模式识别算法来检测初期β-溶血的第一时刻进一步最小化检测时间。总之，本发明证明了一种基于脂质体技术的检测溶血的新手段，其具有将多种β-溶血性病原体的诊断缩短至不到一天的潜力，从而能够做出用于食物安全应用和可能威胁生命的病原体的检测的更快速和更有信心的决策。实施例通过参考以下实施例描述本发明，其以举例说明的方式提供，并不意图以任何方式限制本发明。这些实施例代表以上详细描述中描述的本发明的进一步实施方案。使用本领域熟知的标准技术或下面具体描述的技术。实施例1：材料和方法材料和细菌菌株：氢化卵磷脂酰胆碱(527600)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000]、钠盐(dspe-peg2000，58882)购自瑞士的lipoidag。胎牛血清(f7524)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes，83264)、胆固醇(c8667)和bhi(脑心浸液，53283，fluka)购自sigma-aldrich。hoechst33342(h33342，h1399)购自lifetechnologies。本研究中使用的细菌菌株是蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)(atcc10987)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)(atcc13124)、诺维梭状芽胞杆菌-nt(来自约翰霍普金斯的ludwig中心的赠与)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)(mbl.0129e3-crm，microbiologicsatcc13932)、唾液链球菌(streptococcussalivarius)(atcc13419)、口腔链球菌(streptococcusoralis)(atcc9811)和乳酸乳球菌亚种乳球菌(lactococcuslactissubsp.lactis)(atcc11454)。化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)和肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)(由国立大学医院慷慨提供)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)(来自新加坡国立大学生物科学系的赠与)、实验室大肠杆菌菌株xl1-blue和dh5α。(参见表1)。所有用这些细菌的工作均由淡马锡生命科学实验室机构生物安全委员会(参考编号#ibc-050413-15-ic)检查和批准。表1细菌菌株从上述来源获得的细菌菌株在绵羊血液琼脂上划线以检查溶血活性。然后单菌落接种到3ml无菌bhi(237500，bdbacto)中并在37℃下不振荡孵育过夜。然后过夜培养物以1∶100进一步稀释到5ml新鲜bhi培养基中并允许生长至od600为0.35-0.6。这些早期指数期培养物在30％甘油中1∶1稀释并等分储存在-80℃。单核细胞增生李斯特菌和实验室大肠杆菌菌株xl1-blue和dh5α除以180rpm振荡外以相同的方式生长。这些冷冻储存物用于后续实验。srb被动包封到脂质体中：hepc∶胆固醇∶dspe-peg2000的摩尔比为50∶45∶5的混合物溶解在氯仿中。该溶液在旋转蒸发下干燥成薄膜，并然后在真空下干燥过夜。在使用前新鲜制备水合缓冲液。如下制备磺酰罗丹明b(srb，s1402，sigma-aldrich)水合缓冲液：srb溶解在加入naoh以帮助溶解的pbs中，以得到100mmsrb，pbsph8.0-8.5的最终溶液。膜用水合缓冲液水合并浸没在70℃的elmas30h水浴声波仪中10分钟以形成多层囊泡。通过用qsonicamisonix探针声波仪声处理溶液来进一步减小这些囊泡的尺寸以提供澄清的溶液(2分钟，3-5循环，其间间歇1分钟)。在整个声处理期间混合物保持在冰上以防止悬浮液过热。最后，脂质体悬浮液通过具有pbs的hitrap脱盐柱(g13/17-1408-01，gehealthcare)以除去未包封的染料。信号/背景比＞50的级分合并在一起并在4℃下储存。h33342染料远程装载到脂质体中：根据haran等人描述的方法将分子远程装载到脂质体中[10]。简而言之，如上所述制备脂质体混悬液，不同的是使用300mm(nh4)2so4(168356，merck)溶液作为水合缓冲液。为了形成h+质子梯度以装载h33342，脂质体溶液在2和4小时对2次盐水溶液(0.15mnacl)透析，并然后在4℃下透析过夜。h33342溶解在盐水中并且以10∶1(mol脂质∶molh33342)的比例加入脂质体溶液中，并在70℃的烘箱中孵育2小时。脂质体溶液通过具有pbs的hitrap脱盐柱以除去未包封的h33342。信号/背景比＞100的级分合并在一起并在4℃下储存。溶血性菌落的可视化：以下列量以终体积为100μl混合bhi、胎牛血清(fbs)、琼脂糖和纯化的h33342脂质体制备测定培养基：1xbhi、10％fbs(v/v)、1％(w/v)琼脂糖、4ulh33342脂质体。向该测定培养基中添加解冻的培养物(102-103cfu)，并然后该混合物短暂涡旋并旋转以重新形成该混合物。70μl该混合物移液到凹面载玻片上，并在其上放置盖玻片。然后样品在37℃的加湿室中孵育过夜。在zeissaxiovert200m显微镜上以10x放大率可视化菌落。对于荧光可视化，用uv光(365nm)激发菌落，并用coolsnaphqccd相机捕获发射(lp在395nm)。使用fiji[22]进行图1d中荧光图像的量化分析。首先堆叠图像在一起，并在菌落中定义固定区域以测量强度的平均值。通过使用相同的定义尺寸以获得背景读数，以测量菌落外的荧光强度。通过将菌落中的区域的平均强度除以背景的平均强度来计算信号/背景比例。从每个实验中选择四个菌落。对于相关的时间推移实验中的每个时间点进行这些步骤。对于与α-溶血性肺炎链球菌菌落共培养的β-溶血性化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌的可视化，除以抗肺炎链球菌抗体标记菌落以鉴定肺炎链球菌菌落外，程序与上述相似。简而言之，在孵育后，除去盖玻片，并用1xpbsph7.4洗涤凝胶一次。接下来，用5％牛血清白蛋白(bsa，a4503，sigma-aldrich)封闭凝胶3小时，并用小鼠抗-肺炎链球菌(1∶50，8437-5208，abdserotec)标记过夜。除去抗体，用一小时以1xpbsph7.4洗涤三次，并然后用alexafluor488缀合的山羊抗小鼠抗体(1∶200，a11029，lifetechnologies)再次标记过夜。除去第二抗体并用1小时以1xpbsph7.4洗涤三次。所有洗涤和标记步骤在室温下的加湿室中完成。在zeissaxiovert200m显微镜上用5倍放大透镜可视化菌落。对于荧光可视化，以uv或蓝光(365nm或488nm)激发菌落，并使用coolsnaphqccd相机捕获发射(bp445/50nm，bp525/50nm)。以关于实验相同的暴露时间实施以上所有实验，并重复三次。图像处理和模式识别：为了检测图像中的菌落，我们应用顶帽变换用于背景减除然后使用otsu方法阈值处理。在阈值处理后，使用形态学开运算(morphologicalopening)去除小斑点。接下来，采用标记控制的分水岭算法(marker-controlledwatershedalgorithm)来分离图像中的重叠对象。最后，利用连通分量标记算法(connectedcomponentlabellingalgorithm)以提取前景对象和背景像素。为了构建用于分类目的的特征数据集，我们从菌落的质心测量固定圆形区域(半径：20像素)的荧光强度。如果菌落太小而不能容纳20像素的半径，替代使用半径为5。这些强度的平均值在正文中称为“菌落荧光”。此外，背景强度是指背景像素的平均值。还通过提取灰度共生矩阵(gray-levelco-occurrencematrix，glcm)进行纹理分析。共生矩阵提供具有强度值i的像素与另一个强度值j的像素出现在预定距离和方向上的概率。该联合概率密度函数pd，θ(i，j)用于提取图像纹理特征。在这项工作中，我们估计在水平、垂直和对角线方向(0，45，90和135)的距离为d＝1像素的共生矩阵。使用8比特量化图像中的20个像素的计算窗口大小来获得这些矩阵。四个共生矩阵的平均值导致非定向glcm。我们使用这种非定向glcm来提取不相似度纹理特征，这与对比度类似但是权重线性增加。它给定为：其中n指的是为量化特定的水平数。具有线性核的支持向量机(supportvectormachine，svm)分类器用于从混合物样品中分类β-溶血性和非β-溶血性生物体。进行十倍分层交叉验证以确定分类性能。该算法在python2.7.3中执行。使用scikit-image0.10.0模块实施用于菌落检测和图像特征的计算(强度和不相似度)的形态学操作。使用在scikit-learn0.15.0模块中执行的svm。细菌摄取游离h33342：通过重复上述实验研究游离h33342的摄取，但用游离h33342染料(终浓度，160nm)替换脂质体h33342。为了膜透过实验添加六偏磷酸钠(305553，sigma-aldrich)至浓度高达0.3％。脂质体下拉测定：冷冻的化脓性链球菌和蜡状芽孢杆菌培养物接种到25mlbhi培养基中并在37℃下孵育过夜。然后样品以3,900g离心10分钟。收集20ml上清液并通过在离心柱中以3,900g离心10分钟浓缩。重复一次。接下来，对于两个样品添加磷酸盐缓冲盐水(pbs)至浓缩物中至1.5ml最终体积。添加40μlsrb脂质体至900μl浓缩物中，并在37℃下连续颠倒1小时。然后该溶液在16000g下离心30分钟，用1ml1xpbs洗涤并再次以相同速度离心。然后除去960μl上清液，并通过轻微涡旋在剩余的洗涤溶液中溶解沉淀。通过在1xmops缓冲液(np0001，lifetechnologies)中运行的10％bistris凝胶1.0mm×12孔(np0302-box，lifetechnologies)分开样品。为了可视化蛋白质条带，根据colloidalcoomassie方案[23]染色凝胶。简而言之，凝胶在30％乙醇+2％磷酸中固定1小时并振荡染色过夜。然后处置染色，并将凝胶在超纯水中洗涤三次，每次持续10分钟。条带用手术刀切除。根据制造商的说明，以montagein-gel消化ziptip试剂盒(lskgdzt96，millipore)进行凝胶内还原、烷基化和消化。纳米lc-esi-ms：消化肽的分开在trapelute配置中的eksigentnanolcultra和chiplc-nanoflex(eksigent，dublin，ca)上实施。体积为5-10μl的样品上样到200μm×0.5mm的捕集柱上，并在分析的75μm×150mm柱上洗脱。捕集和分析柱均由chromxpc18-cl，3μm(eksigent，德国)制成。通过由2％乙腈(acetonitrile，acn)、0.1％甲酸(formicacid，fa)(流动相a)和98％acn、0.1％fa(流动相b)(5％-12％的流动相b(20分钟)、12％-30％的流动相b(90分钟)、30％-90％的流动相b(2分钟)、90％的流动相b(5分钟)、90％-5％的流动相b(3分钟)、和5％-5％的流动相b(13分钟)，流速为300nl/min)形成的梯度分开肽。ms分析在信息依赖模式下在tripletof5600系统(absciex，fostercity，ca，usa)上进行。使用analyst1.6软件(absciex)在400-1250m/z的质量范围内以高分辨率模式(＞30000)每个谱的累积时间为250ms获得ms谱。每个循环选择来自每个ms谱的最多20个前体用于片段化，每个前体的最小累积时间为100ms以及以电荷状态在2到4之间的动态排除15s。串联质谱以高灵敏度模式(分辨率＞15000)记录。以proteinpilottm软件鉴定蛋白质：lc-ms/ms数据(.wiff和.scan文件)转移到proteinpilottm4.0(absciex)用于处理和数据库搜索。使用的数据库取自化脓性链球菌和蜡状芽孢杆菌中所有蛋白质的unitprot数据库。使用的搜索参数设定如下：以mmts半胱氨酸烷基化；胰蛋白酶消化；tripletof5600；生物学修饰fproteinpilottm搜索引擎中可用的所有蛋白质修饰都考虑在内，其中包括大多数(如果不是全部)已知的蛋白质修饰)。通过使用软件中的progroup算法对已鉴定的蛋白质分组来消除冗余。诱饵数据库搜索策略用于确定蛋白质鉴定的错误发现率(fdr)。使用proteinpilottm软件4.5中的proteomicssystemperformanceevaluationpipeline特征生成相应的随机数据库。应用1％全局fdr的临界阈值用于蛋白质鉴定。h33342脂质体渗漏测定：添加h33342脂质体到培养基(1xbhi中的10％fbs)中并在37℃下孵育。在特定时间点将混合物移液到384孔黑色板中。加入tritonx-100(终浓度0.2％)以裂解脂质体，以找到孔中h33342的最大荧光(f100％)值。脂质体在时间t的稳定性由下式定义：其中ft是特定时间点的荧光读数，f0％是当脂质体首次加入混合物时在t0的读数，f100％是当tritonx-100加入混合物时在t0的读数。实验进行三次并每个时间点一式三份。荧光板读数测定：在384孔黑色板(781091，greiner)中以总体积为50μl的srb脂质体、bhi(bdbacto)和fbs接种pbs中冷冻细菌储存物的稀释液。粘性透明塑料密封件(z369667，sigma-aldrich)置于板上以防止在实验过程中蒸发。测定在tecanm200pro读板器(tecangroupltd)中实施。激发和发射设定为526/584，以增益为70。还监测吸光度读数(od600)用于孔中的细菌生长的确认。每隔10分钟在37℃连续测量该板15小时。通过铺板测定中使用的稀释液并计数过夜孵育后形成的菌落数来确定菌落形成单位(cfu)。通过以下公式计算l-srb裂解：其中ft是特定时间点的荧光读数，f0％是填充培养基+l-srb但没有tritonx-100和细菌的四个空白孔的平均值，以及f100％是以tritonx-100添加的四个空白孔的平均值。实验进行三次，并且每个时间点四次重复。除了在12小时时停止实验之外，以与上述类似的方式进行混合物实验。384孔板中细胞的免疫荧光标记：收集来自四个孔的细胞，在1xpbsph7.4中洗涤一次，并在玻璃载玻片上热固定之前归一化至固定数。细胞再次以10％中性缓冲福尔马林(ht501128，sigma-aldrich)固定10分钟，并在1xpbsph7.4中洗涤三次。接下来，以pbs中的5％bsa封闭固定的细胞1小时，在1xpbsph7.4中洗涤三次，并以fitc缀合的小鼠抗-肺炎链球菌抗体标记(1∶50，ab35165，abcam)1小时。细胞再次在1xpbsph7.4中洗涤，并以fluoromount(f4680，sigma-aldrich)封固。使用zeissaxiovert200m显微镜在同一天对细胞成像。对于荧光可视化，用蓝光(488nm)激发细胞，并在coolsnaphqccd照相机上捕获发射(bp525/50nm)。统计分析：我们使用双尾mannwhitney检验来比较graphpadprism5中的非参数独立样品。单尾t检验用于比较溶血性细菌与α-溶血性肺炎链球菌。这些值在microsoftexcel2007中计算并用于生成ttd曲线。实施例2：脂质体作为血液替代品rbc琼脂表现出围绕β-溶血性菌落的清除。已知这种由菌落周围的rbc裂解导致的清除是由微生物分泌的磷脂酶和成孔剂介导。由于脂质体传统上用作膜研究的模型，我们假设裂解红细胞的β-溶血性细菌也能够裂解脂质体。实质上，测试脂质体将直接替代rbc琼脂中红细胞的假设。用于rbc的脂质体替代物必须是光学透明的、生产成本地、当悬浮在丰富生长培养基中时稳定、对α-溶血具有抗性并且在裂解时易于检测。为了满足这些标准，使用用于空间稳定的peg化[7]和用于降低膜透过性与高胆固醇含量缀合的饱和磷脂酰胆碱[8]在纳米级配制空间稳定的脂质体。至于检测，当在内部水性脂质体区间内以高浓度包封时荧光染料表现出自猝灭。利用这种现象创建两种类型的脂质体；脂质体hoechst33342(l-hoechst)和脂质体磺酰罗丹明b(l-srb)。在通过物理或化学方法破坏脂质体时，这些染料通过释放而去猝灭，产生比其包封的荧光高出许多倍的信号。强调peg对稳定性的重要性，发现peg化的l-srb脂质体在16.7小时内泄漏0.2％的内容物而非peg化的形式在同一时期内泄漏高过该量的5.8倍(图2)。实施例3：脂质体h33342检测琼脂中的β-溶血性微菌落磺酰罗丹明b和hoechst33342(h33342)均具有非常不同的物理化学性质。在生理ph下，srb对于溶血性细菌菌落的可视化是无效的，因为它是亲水的并因此不能穿透细菌细胞膜。相比之下，h33342是一种两亲性的、膜可透过的核染料，其假设对于菌落可视化是理想的。首先，通过在含非致死浓度的160nmh33342的bhi琼脂上培养多种细菌来测试细菌菌落与h33342结合的能力(图3a)。有趣的是，观察到革兰氏阳性细菌而非革兰氏阴性细菌发蓝色荧光。一方面，该结果显示h33342一旦从其高度稳定的包囊形式释放(图3b)，被革兰氏阳性β-溶血性菌落同化以创建非扩散性信号(图3b)。另一方面，结果还表明h33342不是用于β-溶血性革兰氏阴性菌落的合适的指示。一种可能的解释是革兰氏阴性细菌特别具有对h33342的有限透过性[9]。我们决定测试六甲基磷酸钠(一种细胞壁渗透剂)改善革兰氏阴性菌对h33342的透过性的想法。我们观察到细胞壁透化确实增加大肠杆菌的菌落荧光，但是增加大肠杆菌菌落荧光仅仅80％所需的六偏磷酸钠浓度对革兰氏阳性细菌化脓性链球菌结果是致命的(图3c)。出于这个原因，l-hoechst实验集中在革兰氏阳性细菌上，仅使用革兰氏阴性大肠杆菌作为菌落荧光的对照。由于其穿过双层的能力，为了保留h33342，脂质体内部相对于外部酸化[10]，使得扩散到脂质体中的h33342优先带电并因此被脂质体捕捉。该原理用于以高浓度染料远程装载l-hoescht。然后多种细菌菌株(表1)接种在掺入有l-hoescht的脑心浸液(bhi)琼脂培养基中，并在凹孔载玻片上孵育用于显微镜可视化。在孵育过夜后，测试的所有五种β-溶血性细菌(蜡状芽孢杆菌，化脓性链球菌，金黄色葡萄球菌，产气荚膜梭菌和单核细胞增生李斯特菌)的菌落变为发荧光。相反，用作对照的α-或γ-溶血性细菌的菌落保持低荧光(图1a)。量化菌落荧光作为β-溶血活性量度能够完全分开β-溶血与对照(图1b)。在最坏的情况比较中，来自单核细胞增生李斯特菌的最弱的β-溶血比乳酸乳球菌的最高背景信号高2倍。在最好的情况下，来自化脓性链球菌的最强的β-溶血比具有最低背景荧光的大肠杆菌xl1高30倍。通常描述为“隐约地(subtly)”溶血并且难以在常规血液琼脂上鉴定的单核细胞增生李斯特菌在脂质体测定中易于与对照微生物区分。有趣的是，注意到与β-溶血相关的菌落荧光定性地不同于与对照细菌相关的背景荧光。具体地，前者看起来是均匀的，而后者具有粒状纹理。为了量化该纹理分量，计算使用荧光微菌落的灰度共生矩阵(glcm)的不相似度参数。与视觉直觉一致，发现β-溶血与不相似度成反比，因此创建第二互补轴以将β-溶血与对照分开(图1e)。为了研究β-溶血活性的动力学，以15分钟的间隔对蜡状芽孢杆菌、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌dh5α的单个菌落成像。蜡状芽孢杆菌和化脓性链球菌菌落的荧光均在5小时滞后后表现出急剧的指数增加，24小时后达到相似的荧光水平(图1d)。非溶血性菌落也在基础水平获得荧光，可能是由于痕量未包封的h33342的摄取。当它们菌落大小达到稳定时，所有细菌菌落达到最大荧光。实施例4：β-溶血性菌落可以在混合物中被区分真实世界情景涉及共存的细菌群。我们很想知道是否常见的β-溶血性人类病原体的化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌能与肺炎链球菌(通常与它们掺杂在一起的强α-溶血性共生菌)区分开。在含l-hoechst在bhi琼脂上共培养后，以绿色荧光对肺炎链球菌菌落免疫染色，允许我们将它们与化脓性链球菌或金黄色葡萄球菌区分开来。如所预期的，化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌从l-hoechst的裂解中荧光标记为蓝色，而肺炎链球菌未显示裂解(图4a)。与我们使用glcm的先前实验类似，我们发现不相似度参数也适用于混合物，并且能用于在bhi琼脂共培养物中将化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌与肺炎链球菌区分开(图4b-4d)。实施例5：384孔板中溶血性细菌的检测想知道在肉汤中能否类似地检测β-溶血性细菌，将多种细菌的纯群体接种到含l-srb的bhi肉汤中。使用l-srb代替l-hoechst，因为来自bhi培养基的自发荧光与h33342的发射范围一致。当归一化至来自100％裂解的l-srb的荧光信号时，尽管高度混浊生长，α-和γ-溶血性细菌仅裂解至多0.5％的l-srb(图5g；图6a-6d)。相反，β-溶血性细菌裂解10-65％的l-srb，导致信号水平比肺炎链球菌高26-125倍。重要的是，当添加oxyrase以创建缺氧环境时，稳健地检测到产气荚膜梭菌的l-srb裂解，证明l-srb能检测β-溶血性专性厌氧菌。为了查明检测限，以每种细菌的连续稀释液重复上述实验。如所预期的，当每种细菌达到指数生长时的拐点随着接种的cfu数量单调增加(图5a-5f和图5i)。重要的是，检测β-溶血在具有1-10cfu的孔中检测到，显示该测定在有限稀释时是灵敏的。检测时间(ttd)定义为当时间系列的荧光显著超过(p＜0.005)肺炎链球菌(s.pneumonia)的荧光的点。该原理针对化脓性链球菌来说明，其中每个时间系列的ttd用星号标记f图5b)。我们还观察到所有β-溶血性细菌的ttd和接种量之间的强烈的线性相关性(r2＞0.9)(图5h)，显示如果已知细菌身份，ttd是接种量的量化指标。发现ttd的范围为对于104个细胞约1-5小时以及对于单个细胞8-15小时。ttd并不受到细胞状态的显著影响；除低浓度的蜡状芽孢杆菌细胞外，冷冻和活的bc细胞具有相似的ttd(图7a-7d)。在许多情景下，β-溶血性细菌的数量远远超过α-和γ-溶血性共生细菌。为了研究检测限如何受到掺入影响，一起接种可变量的蜡状芽孢杆菌和固定量(104cfu)的肺炎链球菌。只要有至少10cfu的蜡状芽孢杆菌，ttd几乎没有差异(图8a)。ttd仅在含接近极限稀释的1-10个蜡状芽孢杆菌cfu的孔中受影响(图8b)。在这些稀释液中，肺炎链球菌更早进入指数生长，因此超出蜡状芽孢杆菌生长(图9和10)。实施例6：细菌膜相互作用蛋白与脂质体共纯化期望测试β-溶血剂直接作用于脂质体双层以裂解和释放其内容物的想法。证实这一假设的一种方法是检查与用β-溶血性微生物生长条件化的培养基孵育的脂质体是否会物理结合并因此富集β-溶血素。首先，脂质体在化脓性链球菌条件化的培养基中孵育。发现通过超速离心纯化的脂质体与β-溶血素的典型实例链溶解素o共同沉淀(图5a和5b)。还鉴定四种其他蛋白质，寡肽结合蛋白、atp合酶、延伸因子tu和推定的分泌蛋白。已知这些蛋白质结合或定位于膜[11-13]。我们使用蜡状芽孢杆菌条件化的培养基重复实验，并类似的发现脂质体与充分表征的膜相互作用蛋白alveolysin[14]、溶血性肠毒素和肠毒素b共同纯化[15]。这些观察结果支持脂质体由细菌分泌的溶血素直接裂解的想法，并因此是用于检测β-溶血的合适物质。在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一”和“一个”和“所述”以及类似的指示物应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应被解释为开放式术语(即，意味着“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独的值如同其在本文中单独引用一样并入本说明书中。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。除非另外声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“例如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。本文描述了本发明的实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳方式。在阅读前面的描述后，这些实施例的变化对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。发明人期望本领域技术人员适当地采用这些变化，并且发明人希望本发明以不同于本文具体描述的方式实施。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述要素的所有可能变型的任何组合。参考文献1.pichichero，m.e.groupastreptococcaltonsillopharyngitis：cost-effectivediagnosisandtreatment.annalsofemergencymedicine25，390-403(1995).2.gerber，m.a.&shulman，s.t.rapiddiagnosisofpharyngitiscausedbygroupastreptococci.clinicalmicrobiologyreviews17，571-580(2004).3.needham，c.a.，mcpherson，k.a.&webb，k.h.streptococcalpharyngitis：impactofahigh-sensitivityantigentestonphysicianoutcome.journalofclinicalmicrobiology36，3468-3473(1998).4.chen，c.c.，teng，l.j.&chang，t.c.identificationofclinicallyrelevantviridansgroupstreptococcibysequenceanalysisofthe16s-23sribosomaldnaspacerregion.journalofclinicalmicrobiology42，2651-2657(2004).5.suo，b.etal.developmentofanoligonucleotide-basedmicroarraytodetectmultiplefoodbornepathogens.molecularandcellularprobes24，77-86(2010).6.henry，b.d.etal.engineeredliposomessequesterbacterialexotoxinsandprotectfromsevereinvasiveinfectionsinmice.naturebiotechnology33，81-88(2015).7.g.，f.m.&alonso，a.poly(ethyleneglycol)-lipidconjugatesinhibitphospholipasec-inducedlipidhydrolysis，liposomeaggregationandfusionthroughindependentmechanisms.febsletters411，281-286(1997).8.degier，j.，mandersloot，j.&vandeenen，l.lipidcompositionandpermeabilityofliposomes.biochimicaetbiophysicaacta(bba)-biomembranes150，666-675(1968).9.vaara，m.agentsthatincreasethepermeabilityoftheoutermembrane.microbiologicalreviews56，395-411(1992).10.haran，g.，cohen，r.，bar，l.k.&barenholz，y.transmembraneammoniumsulfategradientsinliposomesproduceefficientandstableentrapmentofamphipathicweakbases.biochimicaetbiophysicaacta(bba)-biomembranes1151，201-215(1993).11.monnet，v.bacterialoligopeptide-bindingproteins.cellularandmolecularlifesciencescmls60，2100-2114(2003).12.severin，a.etal.proteomicanalysisandidentificationofstreptococcuspyogenessurface-associatedproteins.journalofbacteriology189，1514-1522(2007).13.yoshida，m.，muneyuki，e.&hisabori，t.atpsynthase-amarvellousrotaryen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