在食物中产生风味物的制作方法

本发明涉及产生风味物。具体地讲，本发明涉及用于使用氨酰基脯氨酸二肽酶在热处理食物产品中产生风味物的方法。本发明还涉及根据本发明的方法制备的热处理食物产品。

背景技术：

在食物中，美拉德反应导致产生风味物和褐变(参见bailey，m.e.(1994)maillardreactionsandmeatfiavourdevelopment，pages153-173，in：flavourofmeatandmeatproducts，ed.f.shahidi，academicpress；ames，j.m.(1992)themaillardreaction，pages99-153，in：biochemistryoffoodproteins，ed.b.j.f.hudson，elsevierapp.sci.london)。

就产生风味物而言，美拉德反应可分解成四个阶段。第一阶段涉及形成葡基胺。第二阶段涉及重排葡基胺以形成amadori和heyns重排产物(在文献中通常分别缩写为“arp”和“hrp”)。第三阶段涉及将amadori和heyns重排产物脱水和/或分裂为呋喃衍生物、还原酮和其它羰基化合物(其可能具有显著的感官特性)。这些“第三阶段产物”也可在不形成arp或hrp的情况下产生。第四阶段涉及将这些呋喃衍生物、还原酮和其它羰基化合物转化成有色的香味/风味化合物。因此，美拉德反应的第三阶段和第四阶段中存在的产物和反应物有助于香味/风味。

美拉德反应在食物中天然发生，但也已知使用美拉德反应产物来改善食料的风味和香味。

已结合美拉德反应体系中的还原糖对作为风味物前体的氨基酸进行了广泛的研究。hodge等人将脯氨酸描述为烘焙香味的关键氨基酸前体(1972，cerealscitoday17：34-40)。schieberle(1990，zlebensmuntersforsch191：206-209)进一步显示关键影响化合物2-乙酰基-1-吡咯啉由脯氨酸和鸟氨酸产生。根据us-a-3687692和us-a-3782973的报告，基于脯氨酸的反应混合物在与环酮加热时得到焦糖特性。us4,022,920公开了用脯氨酸和6-脱氧-己醛糖诸如鼠李糖在乙醇中回流之后进行干燥来产生amadori重排化合物。将干燥的混合物掺入到食物基质中，之后进行加热。已知由脯氨酸和鼠李糖产生的化合物包括4-羟基-2，5-二甲基-3(2h)-呋喃酮和若干2，3-二氢(1h)-吡咯里嗪(shawandho1989，thermalgenerationofaromas，eds.parliamentth，mcgorrinrj，hoc-t，americanchemicalsociety，washington，dc.；shawetal.1990，perfumer&flavorist15：60-66；tressletal.1985，jagricfoodchem33：919-923andjagricfoodchem33：924-928)。

wo2005/117595描述了使用脯氨酸特异性内切蛋白酶和外肽酶一起来改善烘焙谷物产品的风味。对于产生带有羧基端脯氨酸残基的肽链的脯氨酸特异性内切蛋白酶，wo2005/117595建议将内切蛋白酶与羧肽酶cpd-y或者得自黄单胞菌属(xanthomonas)或埃希菌属(escherichia)的脯氨酸特异性羧肽酶组合。然而，风味物的产生复杂而微妙，伴有副反应，这些副反应通常在获得的最终风味中发挥重要作用。酶的选择可影响所产生的风味物的特性，以及在不同食物基质和条件下的产生效率，即使采用的酶的主要作用类似。

wo2008/148737描述了具有改善的风味的烘焙食料，该烘焙食料通过将风味物前体(氨基酸和还原糖)直接添加到随后被烘焙以形成烘焙食料的成分中来获得。此类方法允许形成香味分子，即使烘焙持续时间较短也是如此。

即使上文描述的本发明在烘焙食料中生成风味物提供了优点，它们仍存在一些缺点。

为了在加热时产生香味而使用源于外部来源的风味物前体将向食物添加成分，这对消费者而言可能不熟悉或不期望该类型的食物。例如，风味物前体可能是消费者在自己制备食物时不会使用的成分。许多消费者高度认可从原料中直接生成风味物而不是从外部来源添加风味物前体，该原料可用作食物产品中的成分。此类原料应理想地具有良好的消费者接受度。

因此，在由可用作配方成分的原料直接制备烘焙食料的过程中产生此类风味物前体是有利的。

在常见原料的加工过程中产生风味物前体时，希望更好地选择性生成导致诱人的烘烤或烘焙风味的风味物前体，例如希望更好地选择性生成游离氨基酸诸如脯氨酸。高效生产目标风味物前体允许得到更快的风味物生成方法，更强烈的风味物产生，并且避免因生成非目标前体而产生不期望的风味物。还将有利的是提供产生风味物前体的已知酶的替代方案，从而允许形成不同的风味韵味并为产品创造新的风味特征。当此类风味特征与品牌食物产品相关联时，有时其被描述为“标志性风味”。甚至风味的微妙差异对产品的成功而言也可以是重要的。

当使用酶来转化原料时，例如在食品制备工艺期间转化时，希望这些酶及其添加的形式对消费者而言具有良好的接受性。优选使用来源于微生物的酶，其对于消费者而言具有良好的接受性，例如在食物中具有较长使用历史的微生物。许多消费者不希望经基因修饰的微生物与其食物制备相关联，因此有利的是在不使用经基因修饰的微生物的情况下产生风味物前体。

不能将本说明书中对现有技术文献中的任何参考视为承认此类现有技术为众所周知的技术或构成本领域普遍常识的一部分。如本说明书中所用，词语“包括”、“包含”和类似词语不应理解为具有排他性或穷举性的含义。换句话讲，这些词语旨在意指“包括但不限于”。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提高现有技术水平并提供克服至少一些上述不便的解决方案，或至少提供有用的替代方案。本发明的目的通过独立权利要求的主题实现。从属权利要求进一步拓展本发明的构想。

因此，在第一方面，本发明提供了用于产生风味物的方法，该方法包括：(a)使可食用含肽物质(ediblepeptide-containingmaterial)与氨酰基脯氨酸二肽酶接触以形成水解制备物，其中氨酰基脯氨酸二肽酶包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列；(b)将可得自步骤(a)的水解制备物掺入到至少包含还原糖的食物制备物中；或者，当水解制备物已至少包含还原糖时，水解制备物可以为食物制备物；以及(c)使食物制备物经受热处理以获得热处理食物产品。

在第二方面，本发明涉及可通过使可食用含肽物质与氨酰基脯氨酸二肽酶接触来获得的水解制备物，其中氨酰基脯氨酸二肽酶包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列。

本发明的第三方面涉及包含脯氨酰内肽酶、氨酰基脯氨酸二肽酶、作为游离氨基酸的脯氨酸以及作为游离氨基酸的鸟氨酸的食物制备物，其中氨酰基脯氨酸二肽酶包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列；并且，如果存在甲硫氨酸作为游离氨基酸，则脯氨酸与甲硫氨酸作为游离氨基酸的摩尔比大于18。

本发明的另外方面为可根据本发明的方法获得的热处理食物产品，以及包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列的氨酰基脯氨酸二肽酶用于改善热处理食物产品的风味的用途。

本发明人已令人惊喜地发现，通过使用包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列的氨酰基脯氨酸二肽酶来水解可食用含肽物质，随后与还原糖组合并施加热量，可获得特别好的烘焙风味物。具体地讲，通过将脯氨酰内肽酶和包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列的氨酰基脯氨酸二肽酶组合，可以高度有效的方式从食物蛋白质和食物多肽中选择性地释放脯氨酸。通过在包含还原糖的食物制备物中加热所得混合物以进行进一步处理时，产生具有烘焙和烘烤韵味的诱人风味。使用包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列的氨酰基脯氨酸二肽酶令人惊喜地提供非常诱人的风味特征。与脯氨酰内肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶cpd-y的组合相比，人们惊喜地观察到脯氨酸产量具有更高的特异性。

根据本发明的方法提供的优点是在热处理食物产品中递送风味韵味，而无需在过程中添加氨基酸作为风味物前体。

附图说明

图1是未反应的小麦谷蛋白(空白)、与脯氨酰内肽酶和酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)氨酰基脯氨酸二肽酶发生反应的小麦谷蛋白(b)以及仅仅是小麦谷蛋白和脯氨酰内肽酶(a)中的游离氨基酸量(μm)的图。氨基酸为丙氨酸(ala)、精氨酸(agr)、天冬酰胺(asn)、天冬氨酸(asp)、谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)、甘氨酸(gly)、组氨酸(his)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、赖氨酸(lys)、甲硫氨酸(met)、鸟氨酸(orn)、苯丙氨酸(phe)，脯氨酸(pro)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)、缬氨酸(val)。

图2为用脯氨酰内肽酶和cpd-y氨酰基脯氨酸二肽酶(c)或脯氨酰内肽酶和酿酒酵母氨酰基脯氨酸二肽酶(d)温育的小麦谷蛋白的游离氨基酸摩尔份数的图。

图3示出了表示在cp培养基中培养酿酒酵母细胞期间的温度特征的图，这是实施例3中所述实验的结果。

图4示出了在酪蛋白胨培养基中培养酿酒酵母细胞期间的残留葡萄糖，这是实施例3中所述实验的结果。

图5示出了在酪蛋白胨培养基中酿酒酵母细胞的活力(cfu/ml)与发酵时间(小时)的关系，这是实施例3中所述实验的结果。

图6示出了酿酒酵母在酪蛋白胨培养基中发酵期间所选游离氨基酸的释放情况[mm浓度]，这是实施例3中所述实验的结果。

图7示出了表示在发酵5天之后获得的游离氨基酸浓度[mm]的图，这是实施例3中所述实验的结果。氨基酸为丙氨酸(ala)、精氨酸(arg)、天冬酰胺(asn)、天冬氨酸(asp)、瓜氨酸(cit)、谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)、甘氨酸(gly)、组氨酸(his)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、赖氨酸(lys)、甲硫氨酸(met)、鸟氨酸(orn)、苯丙氨酸(phe)、脯氨酸(pro)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)、缬氨酸(val)。

具体实施方式

因此，本发明部分涉及用于(例如在热处理食物产品中)产生风味物的方法，包括：a)使可食用含肽物质与氨酰基脯氨酸二肽酶接触以形成水解制备物，其中氨酰基脯氨酸二肽酶包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列；b)将可得自(例如得自)步骤(a)的水解制备物掺入到至少包含还原糖的食物制备物中；或者，当水解制备物已至少包含还原糖时，水解制备物可以为食物制备物；以及(c)使食物制备物经受热处理以获得热处理食物产品。

本发明中使用术语风味物来指示味道和香味的组合。味道是指口中感知到的风味物的感觉，并且香味是指鼻子内部的感知。从化学角度来讲，“风味物”可为一种或多种味道活性分子、一种或多种香味分子或者这些物质的混合物。一些味道活性分子也是香味分子。

在本发明的上下文中，术语“热处理食物产品”是指已经受热处理的食物产品。食物产品是可用作或经制备而用作食物的物质。热处理技术的非限制性示例为：烘箱烘焙、辊筒式干燥、挤出、喷雾干燥。根据本发明的热处理食物产品的非限制示例为：饼干、薄脆饼、谷物(早餐谷物和婴儿谷物)、面包、蛋卷冰淇淋、乳粉、非乳制饮料奶精、披萨等。

本发明的上下文中使用的术语“可食用”是指可安全食用的物质。虽然本发明不限于在任何特定司法范围内允许食用的物质，但可食用组合物可例如包括由美国食品药品监督管理局(u.s.foodanddrugadministration)批准的供人食用的物质。

根据本发明的含肽物质可包含多肽。根据本发明的含肽物质可包含脯氨酸。含肽物质可包含蛋白质。蛋白质由以生物学功能方式排列的一种或多种多肽组成。优选地，含肽物质包含具有10个以上氨基酸的多肽。含肽物质可为蛋白胨，其为由部分水解的蛋白质形成的多肽和氨基酸的水溶性混合物。

氨酰基脯氨酸二肽酶是催化氨基酸与脯氨酸或羟脯氨酸之间的肽键的水解的酶。在本发明的上下文中，氨酰基脯氨酸二肽酶可为脯氨酸二肽酶，但它还可催化较大的肽(诸如将脯氨酸用作末端氨基酸的三肽或四肽)的肽键的水解。

氨酰基脯氨酸二肽酶可包含与seqidno：1具有至少97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。氨酰基脯氨酸二肽酶可具有seqidno：1所示的氨基酸序列。

在本发明的上下文中，术语“水解制备物”是指基于可食用含肽物质并且包含通过存在的酶对可食用含肽物质进行蛋白水解作用产生的任何物质的组合物。如果酶是原位生成的，例如通过微生物活动生成，则水解制备物可包含微生物和/或其残余物。在本发明的上下文中，术语“微生物”是指为细菌、丝状真菌或酵母的单细胞生物体。根据本发明的水解制备物可包含脯氨酸作为游离氨基酸。

在本发明的上下文中，术语“食物制备物”是指当经受热处理时旨在递送“热处理食物产品”的成分的混合物。“食物制备物”的非限制性示例为：面糊、生面团、包含谷物和乳粉的混合物、包含乳粉和面粉的混合物等。在本发明的上下文中，术语“面团”或“面糊”是指如上定义的主要是基于不同比例的谷物粉和水的食物成分混合物。此类面团或面糊也可包含另外的成分，诸如例如脂肪、盐、糖、鸡蛋、乳等。

在本发明的上下文中，术语“还原糖”是指具有醛基或能够通过异构化在溶液中形成酮的任何糖，此类醛基使得糖能够用作还原剂。本发明中的还原糖可为单糖或低聚糖，例如单糖至四糖。还原糖可选自c5和c6单糖。还原糖可选自果糖、葡萄糖、木糖、塔格糖、鼠李糖、麦芽糖、乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖以及它们的混合物。还原糖可选自果糖、葡萄糖或鼠李糖。还原糖可为鼠李糖。

根据本发明的方法的氨酰基脯氨酸二肽酶可得自(例如得自)酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。酵母由于其漫长的使用历史而在食品加工中具有良好的消费者接受度。根据本发明的方法的氨酰基脯氨酸二肽酶可包含在酵母制备物中，例如含酿酒酵母的裂解细胞的酵母制备物。根据本发明的方法的氨酰基脯氨酸二肽酶可得自(例如得自)酿酒酵母的修饰菌株。根据本发明的方法的氨酰基脯氨酸二肽酶可得自(例如得自)酿酒酵母cncmi-4003或cncmi-4006。氨酰基脯氨酸二肽酶可为得自具有uniprotkbp43616的酿酒酵母的氨酰基脯氨酸二肽酶。该酶具有seqidno：1所示的氨基酸序列。

酿酒酵母cncmi-4003于2008年6月12日保藏在法国巴黎巴斯德研究院(institutpasteur，25ruedudocteurroux，f-75724pariscedex15，france)的国立微生物培养物保藏中心(cncm)，并且保藏号为i-4003。酿酒酵母cncmi-4006于2008年6月12日保藏在法国巴黎巴斯德研究院(institutpasteur，25ruedudocteurroux，f-75724pariscedex15，france)的国立微生物培养物保藏中心(cncm)，并且保藏号为i-4006。

根据本发明的方法的氨酰基脯氨酸二肽酶可得自(例如得自)酿酒酵母的裂解。可通过升高发酵液体培养基(包含酿酒酵母的温度敏感菌株诸如cncmi-4006)的温度来诱导裂解，将营养糖诸如葡萄糖添加到发酵液体培养基中可能伴随温度升高。例如，氨酰基脯氨酸二肽酶的获得方式可为：使酿酒酵母的温度敏感菌株(例如cncmi-4006)在含蛋白质的培养基中于许可条件下达到每ml含蛋白质的培养基中至少1000万活细胞的浓度，然后将含蛋白质的培养基的温度升高至32℃至45℃的值足够时间，以使得酿酒酵母可以至少部分裂解。在本发明的上下文中，用于微生物生长的术语“许可条件”是指适合特定微生物生长的温度和大气条件，例如不导致其甚至是部分裂解。例如，对于酿酒酵母而言，许可条件可为20℃至30℃。含蛋白质的培养基的所有组分为食品级时，培养基和裂解的酿酒酵母细胞可掺入到本发明的方法的水解制备物中。实际上，通过酿酒酵母裂解而释放氨酰基脯氨酸二肽酶可直接地为食物产品生产过程的一部分，即所谓的酶的“过程中”产生。

就食物产品而言，可能有利的是将酵母而不是纯酶引入食品生产工艺。包括在温度升高时经历裂解的酵母带来的操作优势在于，在水解制备物中，氨酰基脯氨酸二肽酶是自发地递送并且氨基酸风味物前体的产生不需要对培养基进行任何外部干预。因此，可能只需将此类水解制备物掺入到食物制备物(例如面糊或面团)中，以用于其标准的进一步加工。此外，由于热处理食物产品的结构在产生风味活性分子的同时形成，因此风味活性分子被捕集在食物基质内并且所期望的韵味在成品食料中十分浓烈。

在本发明的上下文中，用于微生物生长的术语“适宜条件”是指适合特定微生物生长的温度和大气条件。在本发明的上下文中，术语“含蛋白质的培养基”是指包含微量营养素、氮源和碳源的微生物生长培养基。如果不是已经由上述氮源提供，则培养基还包含氨基酸源，诸如蛋白质、肽或蛋白质水解产物。

用于产生风味物的方法可包括：a)使温度敏感微生物(例如酿酒酵母)在许可温度和含蛋白质的培养基中生长，该微生物在约32℃至45℃的温度范围内将至少部分裂解；b)在到达每ml含蛋白质的培养基中至少1000万活细胞的浓度之后，将含蛋白质的培养基的温度升高到32℃至45℃的值足够时间，以使得微生物能够至少部分裂解；c)在执行步骤b)时任选地添加含蛋白质的培养基中初始包含但在步骤a)期间耗尽的任何营养物质；d)将含蛋白质的培养基保持在与步骤b)相同的条件下一段时期，该时期为温度升高之后1小时至10天；b)将可得自步骤d)的发酵制备物掺入到至少包含还原糖的食物制备物中；f)使食物制备物经受热处理以获得热处理食蝴产品。

在本发明的方法的一个实施方案中，除氨酰基脯氨酸二肽酶之外，可食用含肽物质还与脯氨酰内肽酶接触。例如，可食用含肽物质可在与氨酰基脯氨酸二肽酶接触之前或与之接触的同时接触脯氨酰内肽酶。脯氨酰内肽酶可为产生具有羧基末端脯氨酸残基的肽链的脯氨酸特异性内切蛋白酶。脯氨酰内肽酶可为得自黑曲霉(aspergillusniger)的脯氨酸特异性内切蛋白酶，例如，脯氨酰内肽酶可为得自dsm的maxipropsp或maxiproxf。

在一个实施方案中，本发明的方法产生包含若干游离氨基酸的混合物的水解制备物。例如，根据本发明产生的若干游离氨基酸的混合物可包含脯氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸和鸟氨酸。根据本发明的水解制备物中产生的若干游离氨基酸的混合物可包含脯氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸和鸟氨酸。根据本发明产生的游离氨基酸的混合物可包含脯氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和苯丙氨酸，其中脯氨酸是此类混合物中具有最高摩尔份数的游离氨基酸。在一个实施方案中，在根据本发明的水解制备物中产生的游离氨基酸的混合物中，可能基本上不存在天冬酰胺。在一个实施方案中，根据本发明的水解制备物中产生的游离氨基酸的混合物可包含游离氨基酸的混合物，其中脯氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺和苯丙氨酸分别以大于1mm的浓度存在(例如，分别大于2mm)。根据本发明的水解制备物中产生的游离氨基酸的混合物可包含游离氨基酸的混合物，其中脯氨酸以大于5mm的浓度存在。

根据本发明的方法的食物制备物可包含面粉。在一个实施方案中，基于100份面粉，根据本发明的方法的食物制备物中的单种游离氨基酸的量在0.001重量份至1重量份的范围内。例如，基于100份面粉，根据本发明的方法的食物制备物中的游离氨基酸的量可在0.005重量份至0.1重量份的范围内。基于面粉的重量，根据本发明的方法的食物制备物中的游离氨基酸的量可在0.05重量份至0.1重量份的范围内。

在一个实施方案中，术语“热处理食物产品”是指基于面团或基于面糊的产品。所述面糊或面团可包含：

面粉：100份

水：5份至200份

盐：0.1份至5份

脂肪：0.1份至100份

蛋类：0份至100份

糖：0份至100份

例如，所述面糊或面团可包含：

面粉：100份

水：100份至180份

盐：0份至5份

脂肪：0.5份至2份

糖：0份至5份

尤其是当使用纯酶时，根据本发明的方法的水解制备物可至少包含还原糖并且为食物制备物。例如，可将脯氨酰内肽酶和包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列的氨酰基脯氨酸二肽酶直接添加到如上所述包含还原糖的面糊组合物中。使用由微生物原位产生的酶时，可能优选的是独立于主要成分来产生水解制备物，例如以更好地控制微生物的生长条件。在一个实施方案中，基于100份面粉，根据本发明的水解制备物可按干重计以0.05份至5份的量掺入到食物制备物中。例如，基于100份面粉，根据本发明的水解制备物可按干重计以0.1份至3份的量掺入到食物制备物中。

根据本发明的方法的水解制备物可以食物制备物的0.01重量份至5重量份的量掺入到食物制备物中。在还原糖的存在下，这样的含量适于良好地产生风味物。

在一个实施方案中，本发明的方法提供包含以下风味特性中的至少一种的热处理食物产品：饼干味、黄油味、水果味、坚果味、焦糖味、黄糖浆味、蜂蜜味、烘烤味、烘烤面包味以及烘焙味。例如，本发明的方法可提供包含饼干风味的热处理食物产品。在一个实施方案中，本发明的方法提供一种热处理食物产品，其中热处理食物产品包含谷物粉(例如，小麦粉)。

根据本发明的方法的热处理食物产品可选自饼干、挤出谷物(例如，早餐谷物)、披萨(例如，披萨坯)、饮料粉末和焦糖。

饼干可为薄脆饼。薄脆饼是由薄脆饼面糊制成并且具有脆性、脆弱性和易碎一致性的烘焙产品。它们较薄，总厚度通常为＜1和4mm之间，并且典型产品密度在0.1g/cm³至0.3g/cm³的范围内。薄脆饼的表面是按照它们在其间被烘焙的板的表面形状精确形成。所述板往往在一个或两个表面上带有图案。薄脆饼也可通过挤出制备。k.f.tiefenbacher在“encyclopaediaoffoodscience，foodtechnologyandnutritionp417-420-academicpressltdlondon-1993”中描述了两种基本类型的薄脆饼：

1)无糖或低糖薄脆饼。成品饼干包含零至低百分比的蔗糖或其它糖。典型产品为扁平且空心的薄脆饼片、模制锥体或奇特形状。

2)高糖薄脆饼。超过10％的蔗糖或其它糖用于实现新鲜烘焙的饼干片的可塑性。它们可以在糖再结晶发生之前成形为不同形状。典型产品为模制和辊压的糖锥体、辊压的薄脆饼棒和深度成形的奇特形状。

饮料粉末可为热处理乳粉、可可粉或麦芽饮料粉末或饮料奶精，诸如与咖啡一起使用的乳质或非乳质奶精。

在本发明的上下文中，焦糖是由加热多种糖制成的甜食产品，例如水中的食糖糖浆。乳质成分诸如脱脂乳粉或炼乳通常与食糖糖浆一起加热。焦糖可为液体，或其可经历一定程度的糖结晶以形成固体。它一般为棕色并且通常作为巧克力甜食产品中的填充物。

根据本发明的方法的可食用含肽物质可选自面粉(例如，小麦粉)、乳以及它们的含肽组分，例如谷蛋白(小麦粉的组分)或酪蛋白(乳的组分)。根据本发明的方法的可食用含肽物质可为蛋白水解产物，诸如酪蛋白水解产物。

在本发明的方法的实施方案中，可食用含肽物质、脯氨酰内肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶可在30℃至60℃的温度例如45℃至55℃在含水分散体中接触。可食用含肽物质、脯氨酰内肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶可在ph5.0至8.5下在含水分散体中接触。

在本发明的方法的实施方案中，可食用含肽物质可按顺序或同时与脯氨酰内肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶接触。在其中可食用含肽物质与脯氨酰内肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶按顺序接触的实施方案中，可食用含肽物质应先与脯氨酰内肽酶接触之后再与氨酰基脯氨酸二肽酶接触。使可食用含肽物质在含水分散体中与脯氨酰内肽酶接触的最佳温度将取决于所选的确切脯氨酰内肽酶。在本发明的方法中，可食用含肽物质可在45℃至55℃的温度下在含水分散体中与氨酰基脯氨酸二肽酶接触。可食用含肽物质可在ph6.3至8.2下在含水分散体中与氨酰基脯氨酸二肽酶接触。

在根据本发明的方法的热处理期间，可将食物制备物加热到60℃至300℃。热处理可选自巴氏灭菌、消毒、烘箱烘烤、辊筒式干燥和挤出。热处理可在喷雾干燥期间施加。

在第二方面，本发明提供可通过使可食用含肽物质与氨酰基脯氨酸二肽酶接触来获得的水解制备物，其中氨酰基脯氨酸二肽酶包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列。水解制备物可通过使可食用含肽物质与脯氨酰内肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶接触来获得，其中氨酰基脯氨酸二肽酶包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列。例如，脯氨酰内肽酶可在与氨酰基脯氨酸二肽酶接触之前或在与之接触的同时接触可食用含肽物质。作为游离氨基酸的脯氨酸的摩尔份数可以是具有相同组成、不同之处在于可食用含肽物质已完全水解成游离氨基酸的水解制备物的至少2倍。

本发明可提供引入有根据本发明的第二方面的水解制备物的食物制备物。在另一方面，本发明提供了包含脯氨酰内肽酶、氨酰基脯氨酸二肽酶、作为游离氨基酸的脯氨酸以及作为游离氨基酸的鸟氨酸的食物制备物，其中氨酰基脯氨酸二肽酶包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列；并且，如果存在甲硫氨酸作为游离氨基酸，则脯氨酸与甲硫氨酸作为游离氨基酸的摩尔比大于18。甲硫氨酸用于获得成味/肉味，而这在许多烘焙产品诸如甜食薄脆饼中是不期望的。脯氨酰内肽酶可例如为得自黑曲霉的脯氨酸特异性内切蛋白酶，例如，脯氨酰内肽酶可为得自dsm的maxipropsp或maxiproxf。本发明可提供可通过加热此类食物制备物获得的热处理食物产品。

在又一方面，本发明提供可通过包括如下步骤的方法获得的热处理食物产品：a)使可食用含肽物质与氨酰基脯氨酸二肽酶接触以形成水解制备物，其中氨酰基脯氨酸二肽酶包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列；b)将可得自步骤(a)的水解制备物掺入到至少包含还原糖的食物制备物中；或者，当水解制备物已至少包含还原糖时，水解制备物可以为食物制备物；以及c)使食物制备物经受热处理以获得热处理食物产品。热处理食物产品可通过包括以下步骤的方法获得：a)使可食用含肽物质与脯氨酰内肽酶和氨酰基脯氨酸二肽酶接触以形成水解制备物，其中氨酰基脯氨酸二肽酶包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列；b)将可得自步骤(a)的水解制备物掺入到至少包含还原糖的食物制备物中；或者，当水解制备物已至少包含还原糖时，水解制备物可以为食物制备物；以及c)使食物制备物经受热处理以获得热处理食物产品。

在又一方面，本发明提供包含与seqidno：1具有至少95％同一性的氨基酸序列的氨酰基脯氨酸二肽酶用于改善热处理食物产品的风味的用途。氨酰基脯氨酸二肽酶可与脯氨酰内肽酶结合使用，例如氨酰基脯氨酸二肽酶可在使用脯氨酰内肽酶之后或与之同时使用。

本领域的技术人员将理解，他们可自由地组合本文所公开的本发明的所有特征。具体地讲，可将针对本发明的方法描述的特征与本发明的产品组合，反之亦然。此外，可组合针对本发明的不同实施方案所描述的特征。对于具体的特征如果存在已知的等同物，则此类等同物被纳入，如同在本说明书中明确提到这些等同物。

参见附图和非限制性实施例后，本发明的更多优点和特征将变得显而易见。

实施例

实施例1：使用脯氨酰内肽酶和酿酒酵母氨酰基脯氨酸二肽酶产生氨基酸。

表达从酿酒酵母获得的具有seqidno：1的氨酰基脯氨酸二肽酶(biocatalystsltd.uk)。将10％w/v的小麦谷蛋白悬浮液与0.4％vsprot.的脯氨酰内肽酶(得自dsm的maxiproxf)一起在50℃和ph5.5下温育10分钟。然后将ph增大至7.2，添加得自酿酒酵母的1.0％prot.vsprot.的氨酰基脯氨酸二肽酶并将混合物再次在50℃下温育24小时。为了比较，在相同的ph和温育条件下处理小麦谷蛋白，但仅使用脯氨酰内肽酶。

使用nucleodur100-3hilic柱来进行氨基酸的测定。用乙腈中的水梯度溶液来洗脱氨基酸，两者均包含0.5％的乙酸。使用triplequadropole(qqq)质谱仪来进行检测。使用标准溶液的不同稀释度来将每种氨基酸的峰面积与对应氘代氨基酸的峰面积之间的比率的线性回归测定作为浓度的函数。获得的氨基酸的量绘制于图1中，也示出了未反应的小麦谷蛋白(空白)。可以看出，使小麦谷蛋白与脯氨酰内肽酶和得自酿酒酵母的氨酰基脯氨酸二肽酶(b)接触比单独使用脯氨酰内肽酶(a)提供更大的脯氨酸收率。

实施例2：与脯氨酰内肽酶/羧肽酶cpd-y的比较。

使用wo2005/117595中所提议的组合来比较脯氨酰内肽酶/酿酒酵母氨酰基脯氨酸二肽酶的组合；脯氨酰内肽酶/羧肽酶cpd-y。首先，将49％w/v的小麦粉悬浮液(对应于10％w/v的小麦谷蛋白悬浮液)与0.4％vsprot.的脯氨酰内肽酶(maxiproxf)和0.1％prot.vsprot的羧肽酶cpd-y(sigma)或如实施例1中得自酿酒酵母的氨酰基脯氨酸二肽酶一起在50℃和ph5.0下温育2小时。发现羧肽酶cpd-y的活性与得自酿酒酵母的氨酰基脯氨酸二肽酶不同(羧肽酶cpd-y具有总体更高的活性)，因此评估酶的选择性，以类似的转换程度执行进一步的实验，与得自酿酒酵母的氨酰基脯氨酸二肽酶相比，cpd-y的量减少。

在使用1.0％prot.vsprot.的得自酿酒酵母的氨酰基脯氨酸二肽酶或0.1％prot.vsprot.的cpd-y水解之前，将10％w/v的小麦谷蛋白悬浮液与0.4％vsprot.的脯氨酸特异性内肽酶(maxiproxf)在50℃和ph5.5下温育10分钟。将ph增大至7.2，并将混合物在50℃下温育约24小时。产生的游离氨基酸示于图2中。氨基酸的量以摩尔份数给出。摩尔份数表示单种氨基酸与酶促水解后存在的所有游离氨基酸的总量的比例。这是一种简单的方式来说明酶的选择性。可以看出，得自酿酒酵母的氨酰基脯氨酸二肽酶(d)比cpd-y(c)具有大得多的脯氨酸生产特异性。这是有利的，因为脯氨酸在美拉德反应中产生诱人的烘焙风味物。此外，得自酿酒酵母的氨酰基脯氨酸二肽酶比cpd-y产生较少的甲硫氨酸。甲硫氨酸用于获得成味/肉味，而这在许多烘焙产品诸如甜食薄脆饼中是不期望的。对于cpd-y而言，脯氨酸与甲硫氨酸的比率为13.4，但对于酿酒酵母氨酰基脯氨酸二肽酶而言，该值为22.9。

实施例3：酿酒酵母的热诱导裂解。

通过将10g的酵母提取物、20g的酪蛋白胨和20g的右旋糖溶于一升水中来制备酪蛋白胨(cp)培养基。溶液具有约6.5的ph并且通过过滤通过0.2μm的过滤器进一步灭菌。酿酒酵母(温度敏感菌株cncmi-4006)在cp培养基中培养。由存储在-80℃下的酵母菌株的甘油原液制备种菌。进行第一次培养，接种10ml的含2％菌株原液的新鲜cp培养基。之后进行第二次培养，接种10ml的含2％第一次培养物的新鲜cp培养基。然后在有氧条件下，将液体培养基在摇动器中于25℃和130rpm下温育24小时。在以下条件下，在包含cp培养基的小发酵罐中进行发酵；接种1％v/v，温度25℃，将溶解氧控制在最低含量为30％的有氧条件。

生长培养基中的糖耗尽反映生长培养基中的营养物质耗尽并指示微生物生长结束。通过hplc结合离子排斥和分配(柱aminexhpx87h，300×7.8mm)来测定糖。用0.6ml/min5mm的硫酸来洗脱糖，并且使用折射率检测器进行检测。使用标准溶液的不同稀释液来将峰面积的线性回归测定为浓度的函数。

微生物细胞的自溶是在生长培养基中的活微生物细胞计数的基础上间接测量的。所用方法是计数每毫升发酵液体培养基的菌落形成单位数(cfu/ml)的数值。使用系列稀释度的样品来找到从其它活细胞隔离每个单种活细胞的合适浓度。稀释剂由每升水中的1g胰蛋白胨和8.5g氯化钠组成。然后将不同稀释液的等分试样(20μl)沉积到ypd(酵母蛋白胨右旋糖)琼脂板上。干燥之后，将板在30℃下温育48小时。在无菌条件下执行先前步骤中的每一个。最后，计数菌落并使用以下公式计算活细胞计数：

活细胞计数＝n×50×d

其中n为所选点中的菌落的数目，并且d为稀释因子。

酿酒酵母(温度敏感菌株cncmi-4006)培养期间的生长培养基的初始测量ph为约6.5。当葡萄糖完全耗尽后，在24小时内获得最大生长(参见图4)。在24小时时，将葡萄糖添加到培养基中，4小时内的最大浓度为350mm。同时，将温度从25℃升高至37℃。(参见图3)

在生长阶段期间葡萄糖被完全消耗，并且在裂解期间消耗约250mm的添加葡萄糖(参见图4)。

一旦细胞在添加糖时再次尝试生长，酿酒酵母细胞的活力即下降。不受理论的束缚，据信温度升高阻止发生导致细胞裂解的普通细胞分裂(参见图5)。

在不同的时间测定发酵培养基中存在的游离氨基酸的量(如实施例1中所述的测定方法)。所选游离氨基酸的结果报告于图6中(天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸随时间进程的量变)。所有释放的氨基酸在发酵培养基中的所测得的最终浓度[mm]报告于图7中。

初始存在于cp培养基中的游离氨基酸在菌株cncmi-4006的生长期间被完全消耗。一旦细胞裂解并且ph通过添加naoh水溶液2m增大至7，得自酪蛋白胨和酵母提取物的蛋白质和肽的水解开始与游离氨基酸的释放相关联(参见图6和图7)，脯氨酸的含量是第二高的。

得益于所得到的游离氨基酸的含量，可将根据本发明的发酵制备物掺入到至少包含还原糖的食物制备物中，以通过由于美拉德反应而发生的热处理实现合适风味物的开发。

可以看出，酿酒酵母在施加热量时裂解并释放氨酰基脯氨酸二肽酶。