用于冷冻多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法与流程

本申请要求日本专利申请号2016-055913的优先权，其全部内容通过引用并入本文。本公开涉及用于冷冻多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法。
背景技术：
：期望将来源于多能干细胞的心肌细胞实际应用于诸如细胞移植、药物筛选和心脏毒性评价的应用。这样的实际应用将需要同一批具有相同功能性质的心肌细胞的大量生产和供应以及高效的用于低温保存心肌细胞的方法。当前的用于冷冻多能干细胞来源心肌细胞的方法利用蛋白水解酶分散多能干细胞来源心肌细胞的片状或集落状聚集体并且以单细胞状态冷冻分散的心肌细胞。这些方法导致不稳定且低的细胞存活率，并且由于蛋白水解酶或冷冻造成的损坏难以再现均匀的聚集体。另外，当将心肌细胞以单细胞状态冷冻时，在细胞解冻后则无法再现在冷冻前的电生理学功能模式(如细胞内钙变化波形或心率)。这会是因为随着心肌细胞以单细胞状态分散和冷冻，丢失了原始心肌细胞聚集体的三维结构如形状或细胞间结合的信息。引用清单专利文献专利文献1：wo2012/026491专利文献2：wo2013/111875专利文献3：wo2014/136519专利文献4：wo2015/037706专利文献5：wo2015/182765专利文献6：美国专利申请公开号2013/0183753专利文献7：美国专利申请公开号2014/0127807专利文献8：美国专利申请公开号2015/0017718专利文献9：美国专利申请公开号2016/0002600非专利文献非专利文献1：kimyy等，cryopreservationofhumanembryonicstemcellsderived-cardiomyocytesinducedbybmp2inserum-freecondition(在无血清条件中由bmp2诱导的人胚胎干细胞来源心肌细胞的低温保存)，reprodsci.2011年3月；18(3):252-60。doi:10.1177/1933719110385130.epub2011年1月25日。发明概述本公开的一个目的是提供冷冻多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法以及冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体。在一个实施方案中，本公开提供了一种冷冻多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法，所述方法包括：(i)将多能干细胞来源心肌细胞的聚集体浸入冷冻保护液中；和(ii)冷冻浸入所述冷冻保护液中的所述聚集体。在另一个实施方案中，本公开提供了一种制备冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法，所述方法包括：(i)将多能干细胞来源心肌细胞的聚集体浸入冷冻保护液中；和(ii)冷冻浸入所述冷冻保护液中的所述聚集体。在另一个实施方案中，本公开提供了一种通过所述方法冷冻或制备的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体。在另一个实施方案中，本公开提供了一种冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其用于药物反应评价或用于移植。在另一个实施方案中，本公开提供了一种试剂盒或组合物，其包含冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体。本公开提供的冷冻多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法和冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体有利于多能干细胞来源心肌细胞的实际使用。附图简述图1示出了来自单细胞冷冻和聚集体冷冻的人ips来源心肌细胞的聚集体的形状的比较。图1-a示出了在通过单细胞冷冻冷冻的细胞的冷冻-解冻后第三天的心肌细胞聚集体的形状(一个聚集体/孔)。图1-b示出了在通过聚集体冷冻冷冻的细胞的冷冻-解冻后第二天的心肌细胞聚集体的形状。图2示出了聚集体的形状的分析以及单细胞冷冻和聚集体冷冻之间的细胞存活率的定量比较。图3示出了在通过聚集体冷冻冷冻的细胞的冷冻-解冻之前和之后的gcamp-心肌细胞的荧光图的变化。图4示出了在通过聚集体冷冻冷冻的人或猴的ips来源心肌细胞的冷冻-解冻之前和之后的参数变化率以及冷冻保护液的比较。图5示出了利用gcamp荧光测量e4031对冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体的影响。图6示出了e4031对冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体的浓度依赖性影响。图7示出了利用gcamp荧光测量的一些试剂(e4031、阿司咪唑(astemizole)、尼非卡兰(nifekalant)、色原烷醇(chromanole)293b、美西律(mexiletine)、硝苯地平(nifedipine)、异丙肾上腺素(isoproterenol)、心得安(propranol)、利阿诺定(ryanodine))对冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体的影响。图8示出了蒽环霉素(anthracycline)在冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体中的心脏毒性。图9示出了蒽环霉素在冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体中的心脏毒性的分析。图10示出了在不同尺寸的聚集体的冷冻-解冻之前和之后的参数变化率。实施方案描述如本文所使用的，带有术语“约”的数值包括在所述值的±10％的范围内的任何值。由两个端点限定的数值范围涵盖在两个端点之间的所有值以及在两个端点处的值。带有术语“约”的数值范围意指在两个端点处的值带有术语“约”。例如，“约20至30”意指“20±10％至30±10％”。术语“多能干细胞”是指具有分化成任何类型的构成成年人体的细胞的能力(多能性)和自我更新能力的细胞，所述自我更新能力是在细胞分裂期间保持多能性的能力。“多能干细胞”的实例包括胚胎干细胞(es细胞)、胚胎生殖细胞(eg细胞)和诱导多能干细胞(ips细胞)。“多能干细胞”可以无限制地是任何物种的细胞，并且优选为哺乳动物细胞，并且更优选为啮齿动物或灵长类动物细胞。本公开适用于猴或人的多能干细胞，特别是猴或人的es或ips细胞。es细胞是来源于早期胚胎的多能干细胞，并且可以由囊胚的内细胞团或早期胚胎的着床后外胚层建立。es细胞的实例包括在以下文献中描述的那些：人(thomsonj.a.等，science282:1145-1147(1998),biochembiophysrescommun.345(3),926-32(2006)；灵长类动物如恒河猴和狨(thomsonj.a.等，proc.natl.acad.sci.usa92:7844-7848(1995)；thomsonj.a.等，biol.reprod.55:254-259(1996))；兔(国际专利申请号2000-508919的国家公布)；仓鼠(doetshmant.等，dev.biol.127:224-227(1988))，猪(evansm.j.等，theriogenology33:125128(1990)；piedrahitaj.a.等，theriogenology34:879-891(1990)；notariannie.等，j.reprod.fert.40:51-56(1990)；talbotn.c.等，cell.dev.biol.29a:546-554(1993))，羊(notariannie.等，j.reprod.fert.suppl.43:255-260(1991))，牛(evansm.j.等，theriogenology33:125-128(1990)；saitos.等，roux.arch.dev.biol.201:134-141(1992))，和貂(sukoyanm.a.等，mol.reorod.dev.33:418-431(1993))。例如，可以使用诸如cmk6.4、khes-1、khes-3、khes-4、khes-5、h1和h9的es细胞。eg细胞是来源于原生殖细胞的多能干细胞，并且eg细胞的实例包括人eg细胞(shamblott等，proc.natl.acad.sciusa95:13726-13731(1998))。术语“ips细胞”是指由除多能干细胞以外的细胞(如体细胞和组织干细胞)诱导的多能干细胞。例如，在以下文献中描述了用于制备ips细胞的方法：wo2007/069666，wo2009/006930，wo2009/006997，wo2009/007852，wo2008/118820，cellstemcell3(5):568-574(2008)，cellstemcell4(5):381-384(2009)、nature454:646-650(2008)，cell136(3):411-419(2009)，naturebiotechnology26:1269-1275(2008)，cellstemcell3:475-479(2008)，naturecellbiology11:197-203(2009)，cell133(2):250-264(2008)，cell131(5):861-72(2007),science318(5858):1917-20(2007)。另外，本公开的“ips细胞”包括通过任何人工诱导多能干细胞的方法制备的细胞。可以使用诸如imr90-1、imr90-4、201b7和253g1的ips细胞。多能干细胞来源心肌细胞是指由多能干细胞诱导的心肌细胞，并且不限于通过任何具体方法诱导的细胞。例如，可以通过以下方法诱导多能干细胞来源心肌细胞：使用bmp4和激活素a的方法(natbiotechnol.2007年9月；25(9):1015-24.epub2007年8月26日)；使用诸如激活素a、fgf2、vegfa和dkk1的试剂的方法(cellstemcell.2012年1月6日；10(1):16-28.doi:10.1016/j.stem.2011.12.013.)；和使用重组白蛋白和chir99021以及wnt抑制剂的方法(natmethods.2014年8月；11(8):855-60.doi:10.1038/nmeth.2999.epub2014年6月15日)。也可以使用诸如心肌细胞(cellulardynamicsinternational,inc.)或心肌细胞(来自p11012)/(来自chipsa22)(takarabioinc.)的心肌细胞和以类似于那些心肌细胞的方式诱导的心肌细胞。在一个优选实施方案中，多能干细胞来源心肌细胞是通过在wo2015/182765中描述的方法诱导的细胞。具体地，可以通过包括以下步骤的方法获得多能干细胞来源心肌细胞：(1)在含有wnt信号传导激活剂和pkc激活剂的培养基中培养多能干细胞；和(2)在含有wnt信号传导抑制剂、src抑制剂和egfr抑制剂的培养基中培养通过步骤(1)获得的细胞。本公开的冷冻方法还可以包括通过包括以下步骤的方法在步骤(i)之前获得多能干细胞来源心肌细胞：(1)在含有wnt信号传导激活剂和pkc激活剂的培养基中培养多能干细胞；和(2)在含有wnt信号传导抑制剂、src抑制剂和egfr抑制剂的培养基中培养通过步骤(1)获得的细胞。多能干细胞来源心肌细胞可以是通过在此段落中记载的方法中的任一种诱导的细胞。另外，本公开的冷冻方法可以包括通过在此段落中记载的方法中的任一种获得多能干细胞来源心肌细胞。1.一种用于诱导多能干细胞的心脏分化的方法，所述方法包括以下步骤：(1)在含有wnt信号传导激活剂和pkc激活剂的培养基中培养多能干细胞；和(2)在含有wnt信号传导抑制剂、src抑制剂和egfr抑制剂的培养基中培养通过步骤(1)获得的细胞。2.项目1所述的方法，其中所述wnt信号传导抑制剂是式(i)的化合物或其盐：其中r1至r5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-nr12r13，其中r12和r13各自独立地是氢原子、氧原子或者未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中在r1至r5中的两个相邻基团可以结合到一起以形成-o-ch2-o-或-o-(ch2)2-o-；r6至r9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-c(o)a取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中a是饱和或不饱和的5或6元环，其是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代，并且环可以含有独立地选自氮原子、氧原子和硫原子的1或2个原子；未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-nr12r13，其中r12和r13各自独立地是氢原子、氧原子或者未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中在r6至r9中的两个相邻基团可以结合到一起以形成-o-ch2-o-或-o-(ch2)2-o-；r10至r11各自独立地是氢原子；或具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；x是-cr14，其中r14是氢原子、卤素原子、羟基、具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基或者未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；氧原子；硫原子；硒原子；或基团-nr15，其中r15是氢原子、具有1至5个碳原子的直链或支链烷基或者具有1至5个碳原子的直链或支链酰基；以及n是0至6的整数。3.项目2所述的方法，其中r1、r4、r5、r6、r9、r10和r11是氢原子；r2和r3各自独立地是甲氧基、乙氧基或丙氧基；r7是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-c(o)a取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中a是饱和或不饱和的5或6元环，其是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代，并且环可以含有独立地选自氮原子、氧原子和硫原子的1或2个原子；未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-nr12r13，其中r12和r13各自独立地是氢原子、氧原子或者未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；r8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或r7和r8结合到一起以形成-o-ch2-o-或-o-(ch2)2-o-；x是硫原子，以及n是0至4的整数。4.项目2所述的方法，其中r1、r4、r5、r6、r8、r9、r10和r11是氢原子；r2和r3各自独立地是甲氧基、乙氧基或丙氧基；r7是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-c(o)a取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中a是饱和或不饱和的5或6元环，其是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代，并且环可以含有独立地选自氮原子、氧原子和硫原子的1或2个原子；未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-nr12r13，其中r12和r13各自独立地是氢原子、氧原子或者未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；x是硫原子，以及n是0至4的整数。5.项目4所述的方法，其中r7是卤素原子。6.项目3-5中任一项所述的方法，其中n是1至4的整数。7.项目1所述的方法，其中所述wnt信号传导抑制剂是选自由以下各项组成的组中的化合物或其盐：ky02111ky01041t61164ky02114ky01045ky01040ky02109ky01042ky01043ky01046pb2852n11474pb2572pb2570ky02104so087so102so096so094so3031(ky01-i)so2031(ky02-i)so3042(ky03-i)和so20778.项目7所述的方法，其中所述wnt信号传导抑制剂是ky02111、so3031(ky01-i)、so2031(ky02-i)或so3042(ky03-i)。9.项目8所述的方法，其中所述wnt信号传导抑制剂是so3042(ky03-i)。10.项目1-9中任一项所述的方法，其中步骤(2)的培养基包含两种以上wnt信号传导抑制剂，并且其中所述两种以上wnt信号传导抑制剂中的一种是如在项目2-9中任一项记载的式(i)的化合物或其盐，并且所述两种以上wnt信号传导抑制剂中的一种或多种选自由iwp2、xav939和iwr1组成的组。11.项目10所述的方法，其中所述两种以上wnt信号传导抑制剂是如在项目2-9中任一项记载的式(i)的化合物或其盐和xav939。12.项目1-11中任一项所述的方法，其中所述wnt信号传导激活剂是bio或chir99021。13.项目12所述的方法，其中所述wnt信号传导激活剂是chir99021。14.项目1-13中任一项所述的方法，其中所述pkc激活剂是pma或prostratin。15.项目1-14中任一项所述的方法，其中所述pkc激活剂是pma。16.项目1-15中任一项所述的方法，其中所述src抑制剂是a419259或su6656。17.项目1-16中任一项所述的方法，其中所述src抑制剂是a419259。18.项目1-17中任一项所述的方法，其中所述egfr抑制剂是ag1478或吉非替尼(gefitinib)。19.项目1-18中任一项所述的方法，其中所述egfr抑制剂是ag1478。20.项目1-19中任一项所述的方法，其中所述wnt信号传导激活剂是chir99021，所述pkc激活剂是pma，所述wnt信号传导抑制剂包含选自ky02111、so3031(ky01-i)、so2031(ky02-i)和so3042(ky03-i)的化合物和xav939，所述src抑制剂是a419259，并且所述egfr抑制剂是ag1478。21.项目20所述的方法，其中所述wnt信号传导抑制剂包含so3042(ky03-i)和xav939。22.项目1-21中任一项所述的方法，其中步骤(1)的培养基和步骤(2)的培养基不含任何蛋白质或肽组分。23.项目1-22中任一项所述的方法，其中步骤(1)和(2)的培养是悬浮培养。24.项目1-23中任一项所述的方法，其中步骤(1)的培养进行1至3天，并且步骤(2)的培养进行2至13天。“wnt信号传导激活剂”是指激活wnt信号传导途径的物质。wnt信号传导激活剂的实例包括gsk3β抑制剂，如bio、chir99021和tws119。在一个实施方案中，wnt信号传导激活剂是chir99021或bio，并且优选chir99021。在wo2015/182765中描述的方法中，可以组合地使用两种以上wnt信号传导激活剂。例如，可以使用chir99021和bio两者。“wnt信号传导抑制剂”是指抑制wnt信号传导途径的物质。wnt信号传导抑制剂的实例包括如本文所述的式(i)的化合物或其盐，以及诸如iwp2、iwp4、xav939和iwr1的化合物。在本公开中，可以组合地使用两种以上wnt信号传导抑制剂。在一个实施方案中，两种以上wnt信号传导抑制剂中的一种是式(i)的化合物或其盐，并且其余的是选自iwp2、xav939和iwr1的一种或多种化合物，并且优选xav939。两种以上wnt信号传导抑制剂中的每一种都可以是式(i)的化合物或其盐。具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基和戊氧基。具有1至5个碳原子的直链或支链烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基和戊基。具有1至5个碳原子的直链或支链酰基包括甲酰基、乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基和异戊酰基。卤素原子包括cl、br、i或f。在一个优选实施方案中，r1至r5各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中在r1至r5中的两个相邻基团可以结合到一起以形成-o-ch2-o-或-o-(ch2)2-o-。r2和r3各自独立地是具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，或者结合到一起以形成-o-ch2-o-或-o-(ch2)2-o-。更优选地，r2和r3各自独立地是甲氧基、乙氧基或丙氧基，并且进一步优选甲氧基。r1、r4和r5各自优选为氢原子。在一个实施方案中，r6至r9各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-nr12r13，其中r12和r13各自独立地是氢原子、氧原子或者未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；其中在r6至r9中的两个相邻基团可以结合到一起以形成-o-ch2-o-或-o-(ch2)2-o-。r6和r9优选地各自独立地是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或者未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基，更优选氢原子。在一个优选实施方案中，r7是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；被基团-c(o)a取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基，其中a是饱和或不饱和的5或6元环，其是未取代的或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代，并且环可以含有独立地选自氮原子、氧原子和硫原子的1或2个原子；未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或基团-nr12r13，其中r12和r13各自独立地是氢原子、氧原子或者未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；r8是氢原子；卤素原子；羟基；具有1至5个碳原子的直链或支链烷氧基；或者未取代或被卤素原子取代的具有1至5个碳原子的直链或支链烷基；或者r7和r8结合到一起以形成-o-ch2-o-或-o-(ch2)2-o-。在一个实施方案中，r7是被基团-c(o)a取代的具有1至5个碳原子的直链烷氧基，并且基团-c(o)a与烷氧基的末端碳原子结合。在一个优选实施方案中，a含有至少一个氮原子，并且这样的a的实例包括未取代或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代的吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、唑基、异唑基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基和哒嗪基。在一个更优选的实施方案中，a是未取代或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代的哌啶基、哌嗪基或吗啉基。在一个进一步优选的实施方案中，a是未取代或被具有1至5个碳原子的直链或支链烷基取代的哌啶-1-基、哌嗪-1-基或吗啉-4-基。r10和r11各自优选为氢原子。在一个实施方案中，n是0至4、1至4或1至3的整数，或者n是2或3。在一个实施方案中，x是氧原子；硫原子；或基团-nr15，其中r15是氢原子、具有1至5个碳原子的直链或支链烷基、具有1至5个碳原子的直链或支链酰基。x优选为硫原子。在一个实施方案中，式(i)的化合物是以下这样的化合物：其中r1、r4、r5、r6、r8、r9、r10和r11各自是氢原子，r7是卤素原子，r2和r3各自独立地是甲氧基、乙氧基或丙氧基，x是硫原子，n是0至4的整数，优选1至4。在一个实施方案中，式(i)的化合物是以下这样的化合物：其中r1、r4、r5、r6、r8、r9、r10和r11各自是氢原子，r7是卤素原子，r2和r3各自为甲氧基，x是硫原子，n是0至4的整数，优选1至4。式(i)的化合物优选为ky02111、so3031(ky01-i)、so2031(ky02-i)或so3042(ky03-i)，更优选ky02111或so3042(ky03-i)，甚至更优选so3042(ky03-i)。可以通过已知方法(j.med.chem.,1965,8(5),pp734-735)或根据在wo2012/026491中描述的方法来合成式(i)的化合物。备选地，它们例如可由ukrorgsynthesisltd.(pb2852、pb2572和pb2570)和enamine(t61164)获得。“pkc激活剂”是指激活蛋白激酶c(pkc)或在其下游的信号传导途径的物质。pkc激活剂的实例包括佛波醇(phorbol)12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(pma)、prostratin、苔藓虫素(bryostatin)1、苔藓虫素2、fr236924、(-)-吲哚内酰胺(indolactam)v、pep005、佛波醇12,13-二丁酸酯、sc-9、sc-10、1-油酰基-2-乙酰基-sn-甘油、1-o-十六烷基-2-o-花生四烯酰基(arachidonyl)-sn-甘油、1,2-二辛酰基-sn-甘油、pip2、树脂毒素(resiniferatoxin)、佛波醇12,13-二己酸酯、密执毒素(mezerein)、巨大戟醇3-当归酸酯(ingenol3-angelate)、rhc-80267、dcp-la和脂氧素(lipoxin)a4。在一个实施方案中，pkc激活剂是佛波醇酯型pkc激活剂，如pma、prostratin、pep005、佛波醇12,13-二丁酸酯、树脂毒素、佛波醇12,13-二己酸酯、密执毒素或巨大戟醇3-当归酸酯。在wo2015/182765中描述的方法中，可以组合地使用两种以上pkc激活剂。在一个优选实施方案中，pkc激活剂是pma或prostratin，更优选pma。“src抑制剂”是指抑制src酪氨酸激酶或在其下游的信号传导途径的物质。src抑制剂的实例包括a419259、su6656、pp1、1-萘基pp1、pp2、靛玉红-3′-(2,3-二羟基丙基)-肟醚(indirubin-3′-(2,3-dihydroxypropyl)-oximether)、tx-1123、src激酶抑制剂i(cas179248-59-0)、azm475271、博舒替尼(bosutinib)、除莠霉素(herbimycin)a、kbsrc4、mns、pd166285和tc-s7003。在一个实施方案中，src抑制剂是a419259、kbsrc4、su6656或靛玉红-3′-(2,3-二羟基丙基)-肟醚。在wo2015/182765中描述的方法中，可以组合地使用两种以上src抑制剂。在一个优选实施方案中，src抑制剂是a419259或su6656，更优选a419259。“egf受体抑制剂”(也描述为egfr抑制剂)是指抑制来自egf受体的信号传导的物质。egf受体抑制剂的实例包括ag1478、吉非替尼、阿法替尼(afatinib)、arry334543、ast1306、azd8931、bibu1361、bibx1382、bpdq、bpiq-i、bpiq-ii、卡奈替尼(canertinib)、cl-387,785、cudc101、达克替尼(dacomitinib)、凡徳他尼(vandetanib)、egfr抑制剂iii(n-(4-((3,4-二氯-6-氟苯基)氨基)-喹唑啉-6-基)-2-氯乙酰胺，cas733009-42-2)、egfr/erbb-2抑制剂(4-(4-苄氧基苯胺基)-6,7-二甲氧基喹唑啉，cas179248-61-4)、埃罗替尼(erlotinib)、gw583340、gw2974、hds029、拉帕替尼(lapatinib)、whi-p154、osi-420、pd153035、pd168393、pd174265、培利替尼(pelitinib)、化合物56、xl657、pp3、ag-490、ag555、酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)b42、酪氨酸磷酸化抑制剂b44、ag556、ag494、ag825、rg-13022、daph、egfr抑制剂(环丙烷甲酸(3-(6-(3-三氟甲基-苯基氨基)-嘧啶-4-基氨基)-苯基)-酰胺，cas879127-07-8)、癌基因抑活药(erbstatin)类似物(2,5-二羟基肉桂酸甲酯，cas63177-57-1)、jnj28871063、酪氨酸磷酸化抑制剂47、薰草菌素(lavendustin)a、薰草菌素c、薰草菌素c甲基化物、lfm-a12、tak165、tak285、酪氨酸磷酸化抑制剂51、酪氨酸磷酸化抑制剂ag183、酪氨酸磷酸化抑制剂ag528、酪氨酸磷酸化抑制剂ag99、酪氨酸磷酸化抑制剂rg14620、wz3146、wz4002、wz8040、紫铆因(butein)和酪氨酸磷酸化抑制剂ag112。在一个实施方案中，egf受体抑制剂是具有喹唑啉结构的egf受体抑制剂，如ag1478、吉非替尼、阿法替尼、arry334543、ast1306、azd8931、bibu1361、bibx1382、bpdq、bpiq-i、bpiq-ii、卡奈替尼、cl-387,785、cudc101、达克替尼、凡徳他尼、egfr抑制剂iii(cas733009-42-2)、egfr/erbb-2抑制剂(cas179248-61-4)、埃罗替尼、gw583340、gw2974、hds029、拉帕替尼、whi-p154、osi-420、pd153035、pd168393、pd174265、培利替尼、化合物56或xl657。在一个优选实施方案中，egf受体抑制剂是ag1478或吉非替尼，更优选ag1478。可以例如由santacruzbiotech获得egf受体抑制剂。体外进行在wo2015/182765中描述的方法。该方法使用任何常规的用于多能干细胞的心脏分化培养基，而不是具有特定组成的培养基。培养基优选地不含蛋白质或肽组分，尽管培养基可以含有这样的组分。在wo2015/182765中描述的培养基含有例如imdm培养基和/或dmem培养基、mem非必需氨基酸溶液和l-谷氨酰胺。在一个实施方案中，培养基含有imdm培养基和dmem培养基(优选地，imdm：dmem＝1:1)、mem非必需氨基酸溶液和l-谷氨酰胺。除了imdm培养基和/或dmem培养基、mem非必需氨基酸溶液和l-谷氨酰胺以外，培养基还可以含有l-肉毒碱、抗坏血酸和/或肌酸。在一个优选实施方案中，培养基含有imdm培养基和dmem培养基(优选地，imdm：dmem＝1:1)、mem非必需氨基酸溶液、l-谷氨酰胺、l-肉毒碱、抗坏血酸和肌酸。根据需要，培养基还可以含有抗生素，如青霉素-链霉素。培养基的实例包括在实施例中使用的基于imdm和dmem的培养基(含有242ml的imdm、242ml的dmdm、5ml的mem非必需氨基酸溶液(×100)、5ml的青霉素-链霉素(×100)、5ml的0.2ml-谷氨酰胺、100μl的1ml-肉毒碱、50mg的抗坏血酸和1ml的0.5m肌酸)。该方法可以使用其他类型的培养基，如基于本领域已知的imdm培养基的心脏分化培养基(例如，含有200ml的imdm培养基、50ml的胎牛血清、2.5ml的mem非必需氨基酸溶液(x100)、2.5ml的200mml-谷氨酰胺、2μl的2-巯基乙醇、255μl的5nnaoh的培养基)，基于本领域已知的dmem培养基的心脏分化培养基(例如，含有200ml的dmem/f12培养基、50ml的胎牛血清、2.5ml的mem非必需氨基酸溶液(x100)、2.5ml的200mml-谷氨酰胺和2-巯基乙醇)，或(gibco)+bmp4(10ng/ml)。可以通过适用于多能干细胞的心脏分化的任何常规培养方法来诱导多能干细胞来源心肌细胞。培养方法的实例包括粘附培养、漂浮培养和悬浮培养。在一个优选实施方案中，以悬浮培养诱导多能干细胞来源心肌细胞。可以通过诸如培养方法、培养容器和细胞类型的因素适当地确定在培养开始时的多能干细胞的细胞数，并且可以以约1×105个细胞/ml至10×105个细胞/ml接种细胞。培养基可以一至三天替换一次，例如两天替换一次。步骤(1)和(2)中每一个的时间段以及从步骤(1)结束到步骤(2)开始的时间段可以根据诸如细胞类型的因素适当地确定。步骤(2)可以恰好在步骤(1)结束后开始，或者可以在步骤(1)结束一定时间段后开始。例如，在步骤(1)结束后，可以在不含wnt信号传导激活剂、pkc激活剂、wnt信号传导抑制剂、src抑制剂或egf受体抑制剂的培养基中将细胞培养一或两天，优选一天，然后可以用含有wnt信号传导抑制剂、src抑制剂和egf受体抑制剂的培养基替换培养基以开始步骤(2)。例如，步骤(1)的培养可以进行1至3天，并且步骤(2)可以恰好在步骤(1)结束后开始，或在步骤(1)结束后1或2天开始。步骤(2)的培养可以进行2至13天，优选3至10天，更优选4至10天，甚至更优选4至8天。例如，当步骤(1)的第一天是第0天时，步骤(1)可以是从第0天到第1天、第0天到第2天或第0天到第3天，并且步骤(2)可以是恰好在步骤(1)结束后，或在步骤(1)结束后1或2天，从第2天到第10天(进行8天)、第2天到第9天(进行7天)、第2天到第8天(进行6天)、第2天到第7天(进行5天)、第2天到第6天(进行4天)、第3天到第10天(进行7天)、第3天到第9天(进行6天)、第3天到第8天(进行5天)、第3天到第7天(进行4天)、第4天到第10天(进行6天)、第4天到第9天(进行5天)或第4天到第8天(进行4天)。由于步骤(1)对应于多能干细胞分化成中胚层的心脏分化的早期阶段，可以基于中胚层相关基因的表达来确定步骤(1)的时间段。中胚层相关基因的实例包括t、mixl1和nodal。步骤(2)对应于中胚层分化成心肌细胞的心脏分化的晚期阶段，并且该时间段可以通过检测到心肌细胞的分化来确定。到心肌细胞的分化可以由例如搏动心脏集落(beatingcardiaccolonies)的数量、心脏标志物的表达、离子通道的表达或对电生理学刺激的反应来检测。心脏标志物的实例包括α-mhc、β-mhc、ctnt、α-辅肌动蛋白(α-actinin)和nkx2.5。另外，离子通道的实例包括hcn4、nav1.5、cav1.2、cav3.2herg1b和kcnq1。可以以基于所使用的细胞和试剂适当地确定的浓度来使用wnt信号传导激活剂和wnt信号传导抑制剂。当wnt信号传导激活剂是bio或chir99021时，例如，可以以100nm至100μm、优选1μm至10μm的最终浓度使用wnt信号传导激活剂。当wnt信号传导抑制剂是iwp2、xav939或iwr1时，可以例如以0.5至20μm、优选0.5至10μm、更优选1至10μm的最终浓度使用wnt信号传导抑制剂。当wnt信号传导抑制剂是式(i)的化合物或其盐时，取决于所使用的化合物或盐，可以例如以0.1至20μm、优选0.1至10μm、更优选1至10μm的最终浓度使用wnt信号传导抑制剂。可以以基于所使用的细胞和试剂适当地确定的浓度来使用pkc激活剂。当pkc激活剂是pma时，例如，可以以0.01μm至10μm、优选0.03至1μm、更优选0.1至1μm的最终浓度使用pkc激活剂。当pkc激活剂是prostratin时，例如，可以以0.1μm至100μm、优选1至10μm的最终浓度使用pkc激活剂。可以以基于所使用的细胞和试剂适当地确定的浓度来使用src抑制剂。当src抑制剂是a419259或su6656时，例如，可以以0.1μm至10μm、优选0.1至3μm、更优选0.3至3μm的最终浓度使用src抑制剂。可以以基于所使用的细胞和试剂适当地确定的浓度来使用egf受体抑制剂。当egf受体抑制剂是吉非替尼或ag1478时，例如，可以以100nm至100μm、优选1至20μm的最终浓度使用egf受体抑制剂。当egf受体抑制剂是pp3时，例如，可以以1μm至1mm、优选10μm至100μm的最终浓度使用egf受体抑制剂。优选地，在步骤(2)后，用不含wnt信号传导抑制剂、src抑制剂和egf受体抑制剂的心脏分化培养基替换培养基，然后在冷冻前，将心肌细胞培养数天、数周或数月，优选约1周至3个月，更优选约3周至3个月。多能干细胞来源心肌细胞可以由表达钙传感蛋白如gfp-钙调蛋白-肌球蛋白轻链片段结合蛋白(在本文中也称为gcamp系列蛋白)或膜电位传感蛋白如vsfp以使得细胞内ca2+浓度变化可检测的多能干细胞诱导。因此，在一个实施方案中，多能干细胞或多能干细胞来源心肌细胞表达钙传感蛋白，优选gcamp系列蛋白。gcamp系列蛋白的实例包括gcamp、gcamp2、gcamp3和gcamp7。表达通过与ca2+结合发射荧光的钙传感蛋白的心肌细胞使得能够根据荧光强度的变化检测细胞内ca2+浓度的变化，以及通过荧光将心肌搏动可视化。ca2+适合于实际使用，如心脏毒性评价，因为其直接引起肌肉收缩。另外，使用这样的心肌细胞的测量不需要细胞外电极，由此可以在悬浮液中进行而不受细胞-电极连接状态影响，并且可以通过洗去加入到聚集体的试剂、使用相同的心肌细胞聚集体长时间重复进行。待通过本公开的冷冻方法冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的直径可以是50至5000μm。优选地，聚集体的直径为50至3000μm、50至2000μm、100至3000μm或100至2000μm。在一个实施方案中，聚集体的直径为200至2000μm，优选500至1000μm。聚集体的直径意指如图2所示的聚集体的外径。可以通过以下方式获得多能干细胞来源心肌细胞的聚集体：将通过多能干细胞的分化诱导的心肌细胞的聚集体分散成单细胞，并且再形成聚集体。备选地，可以直接冷冻通过多能干细胞的分化诱导的心肌细胞的聚集体(也就是说，不需要分散成单细胞和再形成聚集体)。因此，本公开的方法在步骤(i)之前可以包括：(a)将通过多能干细胞的分化诱导的心肌细胞的聚集体用蛋白水解酶分散成单细胞；和(b)将通过步骤(a)获得的细胞接种在容器上并且培养以制备聚集体。将聚集体分散成单细胞可以使用含有蛋白水解酶的溶液如胰蛋白酶/胶原酶溶液或trypleselect。将通过将聚集体分散成单细胞获得的细胞以0.3至30×105个细胞/cm2接种在容器上，并且培养以制备如本文所述尺寸的心肌细胞聚集体。用于培养的容器的实例与下文所述的用于将聚集体浸入冷冻保护液中的那些相同。因此，制备聚集体并且将聚集体浸入冷冻保护液中可以在一个容器中进行。作为实例，当使用96孔板时，优选地以0.1至10×105个细胞/孔、优选0.5至2×105个细胞/孔接种细胞。培养时间段一般可以适当地确定在3至180天内，但是不限于此。在一个实施方案中，培养时间段是14至30天。将多能干细胞来源心肌细胞的聚集体浸入冷冻保护液中在诸如多孔板、皿或管的容器中进行。容器可以是用于冷冻细胞的可商购获得的容器，并且可以是由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯或玻璃制成的容器。多孔板可以是6、12、24、48、96或384孔板、平板、u底板或v底板。例如，可以使用sumilon96孔v底板。冷冻保护液可以是可商购获得的冷冻保护液，诸如但不限于cellbanker1(nipponzenyakukogyoco.,ltd.)、stem-cellbanker(nipponzenyakukogyoco.,ltd.)或bambanker(nippongeneticsco,ltd.)。另外，本领域技术人员能够制备合适的冷冻保护液。冷冻保护液可以包含常规的冷冻保护试剂。优选地，冷冻保护液包含dmso或甘油。例如，冷冻保护液可以是包含dmso或甘油的血清。在一些实施方案中，冷冻保护液包含约5-20％dmso或约5-20％甘油。优选地，将聚集体浸入在2至24℃、更优选在2至10℃、甚至更优选在约4℃的冷冻保护液中。浸入的时间段是例如5至60分钟，更优选10至40分钟，甚至更优选10至30分钟，甚至更优选20至30分钟。以足够覆盖细胞聚集体的量加入冷冻保护液。例如，当使用96孔板时，冷冻保护液的量可以是5至30μl/孔。在浸入冷冻保护液之后冷冻聚集体。优选在-60至-150℃、更优选在-60至-100℃、甚至更优选在-70至-90℃、甚至更优选在约-80℃冷冻聚集体。可以将含有聚集体的容器放置在常规冷冻容器如bicell生物冷冻容器中，并且在冷冻器中冷冻。当例如通过使用程序冷冻器使温度随时间降低(例如，以0.1至1℃/分钟)时，浸入冷冻保护液中的时间段可以少于5分钟。冷冻保护液的量在冷冻时优选是少量的，因此优选在不暴露细胞聚集体的程度下去除过量的冷冻保护液。例如，当使用96孔板时，去除过量的冷冻保护液以使得冷冻保护液保持在5至20μl/孔。在所述温度进行冷冻后，可以在-140至-150℃储存冷冻的聚集体。在使用前将冷冻的聚集体解冻。例如，可以通过将用于心肌细胞的培养培养基加入到含有冷冻聚集体的容器中使冷冻的聚集体解冻。培养基可以是，但不限于，用于培养心肌细胞的基于imdm和/或dmem的培养基。也可以将在wo2015/182765中描述的方法中使用的用于心脏分化的培养基用于解冻。例如，培养基可以包含imdm培养基和/或dmem培养基、mem非必需氨基酸溶液和l-谷氨酰胺。在一个实施方案中，培养基包含imdm培养基和dmem培养基(优选地，imdm：dmem＝1:1)、mem非必需氨基酸溶液和l-谷氨酰胺。除了imdm培养基和/或dmem培养基、mem非必需氨基酸溶液和l-谷氨酰胺以外，培养基还可以包含l-肉毒碱、抗坏血酸和/或肌酸。在一个优选实施方案中，培养基包含imdm培养基和dmem培养基(优选地，imdm：dmem＝1:1)、mem非必需氨基酸溶液、l-谷氨酰胺、l-肉毒碱、抗坏血酸和肌酸。在有需要的情况下，培养基可以包含抗生素如青霉素-链霉素。培养基的具体实例是在实施例中使用的基于imdm和dmem的培养基(含有242ml的imdm、242ml的dmdm、5ml的mem非必需氨基酸溶液(×100)、5ml的青霉素-链霉素(×100)、5ml的0.2ml-谷氨酰胺、100μl的1ml-肉毒碱、50mg的抗坏血酸和1ml的0.5m肌酸)。解冻培养基优选地包含血清(例如，胎牛血清(fbs)或人血清)，并且还优选地包含血清和rock抑制剂。优选地，解冻培养基包含5-30％血清，优选约20％血清。更优选地，除了血清以外，解冻培养基还包含1至10μmrock抑制剂，优选约3μmrock抑制剂。rock抑制剂的实例包括y27632、法舒地尔(fasudil)和瑞舒地尔(ripasudil)。期望尽可能快地进行解冻。例如，将升温到约37℃的解冻培养基以容器中的冷冻保护液的量的5倍以上、优选10倍以上的量加入到含有冷冻聚集体的容器中。在快速弃去上清后，将解冻培养基再次加入到容器中用于培养。当解冻培养基包含rock抑制剂时，在解冻的第二天用不含rock抑制剂的培养基替换全部培养基。从解冻的第二天起，例如解冻后1至7天，可以将细胞用于功能分析中。还提供了一种冷冻和解冻多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法，所述方法包括：(i)将多能干细胞来源心肌细胞的聚集体浸入冷冻保护液中；(ii)冷冻浸入冷冻保护液中的聚集体；和(iii)利用包含血清和rock抑制剂的培养基将冷冻的聚集体解冻。如关于本公开的冷冻方法所描述的进行步骤(i)和步骤(ii)。在一个实施方案中，步骤(iii)包括：将升温到约37℃的包含血清和rock抑制剂的培养基优选地以容器中的冷冻保护液的量的5倍以上、更优选10倍以上的量加入到含有冷冻聚集体的容器中；快速弃去上清并且再次将培养基加入到容器中；和在第二天用包含血清但不含rock抑制剂的培养基替换培养基。本公开的冷冻方法产生冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体。也就是说，还提供了一种制备冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法。另外，还提供了一种包含冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的组合物。在一个实施方案中，本公开的组合物包含冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体和冷冻保护液。为了用于药物反应评价如心脏毒性评价或药物筛选或用于移植，冷冻的心肌细胞在它们解冻后应保持冷冻前的电生理学性质(如细胞内钙变化波形和心率)或药物反应。另外，期望冷冻的心肌细胞是容易解冻的，并且解冻后的存活率高。本公开的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体在解冻后对这些应用保持足够的电生理学性质和药物反应，并且可以用于药物反应评价或用于移植。另外，本公开的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体可以以简单的操作解冻，并且在解冻后显示出高存活率。在本公开的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的一个实施方案中，在聚集体解冻后，心肌细胞显示出70％以上、优选80％以上的存活率。细胞存活率可以由活细胞数和总细胞数计算，活细胞数和总细胞数可以通过利用区分活细胞和死细胞的技术如台盼蓝染色对活细胞和死细胞的数量计数获得。当心肌细胞表达钙传感蛋白如gcamp或膜电位传感蛋白如vsfp时，细胞内钙浓度或膜电位的变化可以检测为荧光强度的变化，并且心肌细胞的搏动可以通过荧光可视化。不表达任何钙传感蛋白的心肌细胞可以与钙指示剂(如fluo-4、fluo-8或fura-2)、电压敏感性染料(如dioc)或细胞外电极一起使用以用于药物反应评价。本公开的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体可以作为用于诸如药物反应评价或移植的应用的试剂盒提供。试剂盒可以包括适合于其应用的容器(如微板、皿或管)，并且容器可以包含冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体。试剂盒还可以包含解冻培养基和/或培养培养基和其他必需的试剂。特别地，通过在wo2015/182765中描述的方法诱导并且通过本公开的冷冻方法冷冻的多能干细胞来源心肌细胞可以提供冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体或包含其的试剂盒，所述试剂盒更适合于药物反应评价如心脏毒性评价或药物筛选。在包含冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的组合物或试剂盒的一个实施方案中，在组合物或试剂盒中10％以上的多能干细胞来源心肌细胞形成一个或多个直径为50至5000μm的聚集体。优选地，在组合物或试剂盒中10％以上的多能干细胞来源心肌细胞形成一个或多个直径为50至3000μm、50至2000μm、100至3000μm或100至2000μm的聚集体。在一个实施方案中，在组合物或试剂盒中10％以上的多能干细胞来源心肌细胞形成一个或多个直径为200至2000μm或500至1000μm的聚集体。在另一个实施方案中，在组合物或试剂盒中20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％以上的多能干细胞来源心肌细胞可以形成一个或多个具有预定直径的聚集体。在一个优选实施方案中，在组合物或试剂盒中70％、80％、90％或95％以上的多能干细胞来源心肌细胞可以形成一个或多个具有预定直径的聚集体。在wo2015/182765中描述的方法以低成本和高效率由多能干细胞诱导心肌细胞，因此使得能够大量生产心肌细胞。通过该方法诱导的心肌细胞表达较高水平的通道基因(如herg和kcnq1)，具有在膜片钳技术中与较成熟的心肌细胞的电生理学性质类似的电生理学性质，并且通过通道抑制剂如e4031和色原烷醇293b显示出动作电位的延长(qt延长)。本公开的冷冻方法使得能够冷冻和储存诱导的心肌细胞，同时保持其存活率和功能性。因此，可以大规模生产和储存同一批的心肌细胞，并且可以在任何时间供应具有有保证的电生理学性质的细胞。因此，将提供代替动物试验或herg通道试验的新的用于药物评价的系统。在下文中提供本公开的实施方案的实例。1.一种冷冻多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法，所述方法包括：(i)将多能干细胞来源心肌细胞的聚集体浸入冷冻保护液中；和(ii)冷冻浸入所述冷冻保护液中的所述聚集体。2.一种制备冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体的方法，所述方法包括：(i)将多能干细胞来源心肌细胞的聚集体浸入冷冻保护液中；和(ii)冷冻浸入所述冷冻保护液中的所述聚集体。3.项目1或2所述的方法，其中将所述聚集体浸入所述冷冻保护液中5至60分钟。4.项目1-3中任一项所述的方法，其中将所述聚集体浸入所述冷冻保护液中10至30分钟。5.项目1-4中任一项所述的方法，其中将所述聚集体浸入在2至24℃的所述冷冻保护液中。6.项目1-5中任一项所述的方法，其中将所述聚集体浸入在2至10℃的所述冷冻保护液中。7.项目1-6中任一项所述的方法，其中在-60至-150℃冷冻所述聚集体。8.项目1-7中任一项所述的方法，其中在-70至-90℃冷冻所述聚集体。9.项目1-8中任一项所述的方法，其中所述聚集体的直径为50至5000μm。10.项目1-9中任一项所述的方法，其中所述聚集体的直径为50至2000μm。11.项目1-10中任一项所述的方法，其中所述聚集体的直径为100至2000μm。12.项目1-11中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞来源心肌细胞表达gfp-钙调蛋白-肌球蛋白轻链片段结合蛋白。13.项目1-12中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞来源心肌细胞是通过包括以下步骤的方法获得的细胞：(1)在含有wnt信号传导激活剂和pkc激活剂的培养基中培养多能干细胞；和(2)在含有wnt信号传导抑制剂、src抑制剂和egfr抑制剂的培养基中培养通过步骤(1)获得的细胞。14.项目1-13中任一项所述的方法，其中所述方法还包括通过包括以下步骤的方法在步骤(i)之前获得多能干细胞来源心肌细胞：(1)在含有wnt信号传导激活剂和pkc激活剂的培养基中培养多能干细胞；和(2)在含有wnt信号传导抑制剂、src抑制剂和egfr抑制剂的培养基中培养通过步骤(1)获得的细胞。15.项目1-14中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人或猴的多能干细胞。16.项目1-15中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人ips细胞。17.项目1-16中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞表达gfp-钙调蛋白-肌球蛋白轻链片段结合蛋白。18.项目1-17中任一项所述的方法，其中所述冷冻保护液包含dmso或甘油。19.一种冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其是通过项目1-18中任一项所述的方法冷冻或制备的。20.一种冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其用于药物反应评价或用于移植。21.项目19或20所述的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其中在所述聚集体解冻后，所述心肌细胞显示出70％以上的存活率。22.项目19-21所述的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其中所述聚集体的直径为50至5000μm。23.项目19-22所述的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其中所述聚集体的直径为50至2000μm。24.项目19-23所述的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其中所述聚集体的直径为100至2000μm。25.一种冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其直径为50至5000μm。26.项目25所述的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其中所述聚集体的直径为50至2000μm。27.项目25或26所述的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体，其中所述聚集体的直径为100至2000μm。28.一种试剂盒，所述试剂盒包含项目19-27中任一项所述的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体。29.项目28所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括多孔板、皿或管。30.项目28或29所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含解冻培养基和/或培养培养基。31.项目28-30中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于药物反应评价或用于移植。32.一种组合物，所述组合物包含直径为50至5000μm的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体。33.项目32所述的组合物，其中所述聚集体的直径为50至2000μm。34.项目32或33所述的组合物，其中所述聚集体的直径为100至2000μm。35.项目32-34中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于药物反应评价或用于移植。36.项目19-27中任一项所述的冷冻的多能干细胞来源心肌细胞的聚集体、项目28-31中任一项所述的试剂盒或项目32-34中任一项所述的组合物在评价药物反应或在移植中的用途。还参照以下实施例进一步描述本发明，但是本发明不在任何意义下限制于所述实施例。实施例1.来自单细胞冷冻和聚集体冷冻的人ips来源心肌细胞的聚集体的形状的比较根据在wo2015/182765中描述的方法由人ips细胞(253g1株)制备心肌细胞的聚集体。具体地，在心脏分化的早期阶段(第0-2天)，在悬浮培养中在补充有gsk3β抑制剂(2μmchir99021)和pkc激活剂(0.3μmpma)的表1的培养基(在下文中称为无蛋白心脏分化(pfcd)培养基)中培养人ips细胞(253g1株)的漂浮集落(根据minami,i.等，cellreports2,1448-1460(2012)和wo2013/111875制备)。接下来，将集落在没有gsk3β抑制剂和pkc激活剂的pfcd培养基中培养一天(第2-3天)，并且在心脏分化的晚期阶段(第3-7天)，在悬浮培养中(在低粘附皿上(wako641-07391或corningyo-01835-24))在补充有wnt信号传导抑制剂(3μmky03-i和1μmxav939)和egfr抑制剂(10μmag1478)以及src抑制剂(0.3μma419259)的pfcd培养基中培养四天。然后将集落在没有wnt信号传导抑制剂、egfr抑制剂和src抑制剂的pfcd培养基中培养21-30天，并且用于以下实验。[表1]制剂目录号量imdmsigmai3390242mldmemsigmad5796242mlmem非必需氨基酸sigmam71455ml青霉素-链霉素gibco151405ml0.2ml-谷氨酰胺sigmag75135ml1ml-肉毒碱sigmac0283100μl抗坏血酸sigmaa596050mg0.5m肌酸sigmac07801ml总量500ml对于单细胞冷冻，利用胰蛋白酶/胶原酶溶液将由此获得的心肌细胞集落分散成单细胞，并且立即用冷冻保护液(cellbanker1，nipponzenyakukogyoco.，ltd.)替换培养基，并且在cryotube(nunc)中在-80℃冷冻。对于聚集体冷冻，利用胰蛋白酶/胶原酶溶液将由此获得的心肌细胞聚集体分散成单细胞，并且以1×105个细胞/孔接种在sumilonprimesurface96孔v底板上，并且培养七天以形成聚集体(直径700至1000μm)。然后，用冷冻保护液(cellbanker1)替换培养基。在将板在4℃静置20分钟后，弃去过量的冷冻保护液以使得冷冻保护液的量为5至20μl/孔，并且将板在-80℃冷冻。为了制备解冻培养基，将补充有20％胎牛血清(fbs)和3μmrock抑制剂(y-27632)的pfcd培养基升温到37℃。为了将单细胞冷冻的样品解冻，将解冻培养基(10ml)快速加入到样品中。在弃去上清后，将细胞用解冻培养基悬浮，并且以1×105个细胞/孔接种在sumilonprimesurface96孔v底板上。在次日，用补充有10％fbs的pfcd培养基(不含rock抑制剂)替换全部培养基。将细胞培养三天以形成待分析的聚集体(图1-a)。为了将聚集体冷冻的样品解冻，将解冻培养基(200μl/孔)快速加入到各孔中。在弃去上清后，将解冻培养基加入到各孔中用于培养。在次日，用补充有10％fbs的pfcd培养基(不含rock抑制剂)替换全部培养基。将聚集体培养两天，然后进行分析(图1-b)。由单细胞冷冻后的细胞形成的聚集体的尺寸和形状在孔之间显著不同(图1-a)。据信这是由于细胞存活率的差别或细胞-细胞粘附的不稳定性。另一方面，当在形成聚集体后冷冻细胞时，冷冻-解冻的聚集体是均匀的，并且具有高存活率，同时保持其尺寸和形状(图1-b)。2.来自单细胞冷冻和聚集体冷冻的聚集体的形状的分析以及单细胞冷冻和聚集体冷冻之间的细胞存活率的比较测量图1-a和图1-b的聚集体的外径和内径(图2-a)，并且计算外径和内径的比率(图2-b)。当细胞作为聚集体冷冻时，冷冻-解冻的聚集体显示出在外径和内径之间小的差别，并且形状几乎为球形。还在单细胞冷冻和聚集体冷冻中的冷冻-解冻之前和之后用细胞计数器对细胞数进行计数以比较细胞存活率(图2-c)。单细胞冷冻中的细胞存活率为大约50％，而聚集体冷冻中的细胞存活率稳定地高并且为大约85％。3.gcamp阳性ips细胞来源心肌细胞的制备将编码gcamp3的基因通过由crispr介导的aavs1区特异性基因转移引入到人ips细胞系(253g1)或猴ips细胞系(ht4m2)中，gcamp3是在与细胞内钙结合时发射gfp荧光的钙敏感性gfp。以与部分1中相同的方式由人gcamp3-ips细胞诱导心肌细胞，以制备响应于搏动期间的细胞内钙浓度变化发射gfp荧光的心肌细胞的聚集体。另外，如前所述使用细胞因子由猴gcamp-ips细胞诱导心肌细胞(natbiotechnol.2007年9月；25(9):1015-24.epub2007年8月26日)，以制备响应于细胞内钙浓度变化发射gfp荧光的心肌细胞的聚集体。具体地，将猴gcamp-ips细胞用补充有人重组激活素a(r&dsystems)(100ng/ml)的rpmi-b27培养基(invitrogen)培养24小时，然后用补充有人重组bmp4(r&dsystems)(10ng/ml)的rpmi-b27培养基培养四天。在用没有这些细胞因子的rpmi-b27培养基替换培养基后，将细胞培养21天。利用胰蛋白酶/胶原酶溶液将gcamp-心肌细胞分散成单细胞，并且以1×105个细胞/孔接种在sumilonprimesurface96孔v底板上，以形成均匀的聚集体(直径700至1000μm)。使用聚集体来分析细胞内钙浓度变化波形，其与心肌细胞的搏动同步。4.聚集体冷冻中的冷冻-解冻之前和之后的gcamp-心肌细胞的荧光图变化使用来源于人ips细胞的gcamp-心肌细胞的聚集体，在冷冻之前和解冻后一天测量细胞内钙响应的波形图(图3-a)。在冷冻-解冻之前和之后，波形参数(达峰时间(ttp)，cad50、70、90，如在下文部分6中描述的)和搏动间隔(峰到峰(ptp))没有明显变化(图3-b)。聚集体的外径仅减小约5-10％，并且聚集体在冷冻-解冻后保持基本形状(图3-c)。这些结果证明，在冷冻-解冻之前和之后，尺寸和形态以及电生理学响应模式是高度保守的。5.聚集体的冷冻-解冻之前和之后的参数变化率以及冷冻保护液的比较代替cellbanker1(nipponzenyakukogyoco.,ltd.)，使用含有5％dmso的胎牛血清(fbs)(5％dmso/fbs溶液)(dmso(sigma)，fbs(gibco))、含有10％甘油的胎牛血清(fbs)(10％甘油/fbs溶液)(甘油(sigma)，fbs(gibco))、stem-cellbanker(nipponzenyakukogyoco.,ltd.)或bambanker(nippongeneticsco,ltd.)以与部分1中相同的方式冷冻和解冻人ips来源心肌细胞的聚集体。为了分析在冷冻之前和之后的变化，在聚集体的冷冻之前和在解冻之后一天测量各参数。另外，使用cellbanker1作为冷冻保护液，以与部分1中相同的方式通过聚集体冷冻来冷冻如部分3中所述的猴ips来源心肌细胞，以分析在冷冻之前和之后的变化。在使用任一种冷冻保护液中的情况下，人ips细胞来源心肌细胞的聚集体的外径(在图4中显示为“直径”)仅减少约10％。另外，在冷冻之前和之后的gcamp荧光波形的各参数(ttp，cad50、70、90，ptp)的变化率在±25％之内，并且未观察到明显的变化。猴ips细胞来源心肌细胞的聚集体的直径减少约20％，并且gcamp荧光波形的各参数增加约20-40％。通过使用细胞因子的方法诱导的猴ips来源心肌细胞也适合于冷冻-解冻，同时保持功能性，尽管猴ips来源心肌细胞的变化率大于人ips来源心肌细胞的变化率。6.利用gcamp荧光测量e4031对冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体的影响在解冻后七天将herg通道抑制剂e4031(300nm)加入到来源于人ips细胞的gcamp-心肌细胞的聚集体以比较在加入e4031之前和在加入e4031之后10分钟的gcamp荧光波形的参数(细胞内钙离子浓度变化)。分析从荧光波形的上升到峰的时间(ttp)，和从荧光波形的上升到峰、然后到降低至峰值的50％的时间(cad50)、降低至峰值的70％的时间(cad70)或降低至峰值的90％的时间(cad90)(图5-a)。所有参数由于e4031的加入而延长大约40％，并且在孔之间的差别非常小(图5-b)。已知herg通道的抑制延长了心脏动作电位的持续时间和细胞内钙离子增加，其作为药物诱导的心电图qt延长而被观察到。结果证明，甚至在冷冻-解冻后也稳定地检测到对herg通道抑制剂的药物反应(qt延长)。7.e4031对冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体的浓度依赖性影响在解冻后七天，将e4031以0、0.3、3、30或300nm加入到来源于人ips细胞的gcamp-心肌细胞的聚集体以分析在使用e4031时的变化率。示出了在加入300nme4031之前和之后的gcamp荧光波形(图6-a)以及波形参数的变化率(图6-b)。在3nm以上e4031的情况下，ttp、cad50、cad70和cad90的值以浓度依赖性方式延长(图6-c)。结果证明，在聚集体的冷冻-解冻后以高灵敏度稳定地检测到对herg通道抑制剂的药物反应(qt延长)。如本文所示的对e4031的浓度依赖性药物反应(qt延长)是对于药物诱导心脏毒性的评价来说有用的特性。这些结果证明，可以在聚集体的冷冻-解冻后评价心脏毒性。8.一些试剂(e4031、阿司咪唑、尼非卡兰、色原烷醇293b、美西律、硝苯地平、异丙肾上腺素、心得安、利阿诺定)对冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体的影响在解冻后七天，向来源于人ips细胞的gcamp-心肌细胞的聚集体中加入300nme4031、1μm阿司咪唑、1μm尼非卡兰、10μm色原烷醇293b、30μm美西律、50nm硝苯地平、300nm异丙肾上腺素、1μm心得安或50μm利阿诺定，并且分析各参数的变化率(图7-a)。还示出了通过将ttp、cad50、cad70或cad90的值除以ptp的立方根获得的校正值的变化率(ttpcf、cad50cf、cad70cf或cad90cf)(图7-b)。该校正已经用于分析药物诱导的qt延长(qt校正的fridericia)。e4031、阿司咪唑和尼非卡兰是herg通道抑制剂，色原烷醇293b是kcnq1通道抑制剂，美西律是电压门控的钠通道抑制剂，硝苯地平是l型钙通道抑制剂，异丙肾上腺素是β兴奋剂，心得安是β抑制剂，并且利阿诺定是内质网利阿诺定受体的抑制剂。herg抑制剂、kcnq1抑制剂和电压门控的钠通道抑制剂延长了ttp、cad50、cad70和cad90的值，并且l型钙通道抑制剂缩短了这些参数。β兴奋剂降低了ptp(心率升高)；β抑制剂增加了ptp(心率降低)；利阿诺定受体抑制剂增加了ptp并且降低了gcamp荧光的峰值(peakvalue，细胞内钙增加)。这些结果表明，在冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体中的钙响应反映了各种试剂对实际心脏肌细胞的影响。9.蒽环霉素在冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体中的心脏毒性为了检测蒽环霉素抗癌剂的心脏毒性，在解冻后七天，将阿霉素(doxorubicin)(10μm)或柔红霉素(daunorubicin)(20μm)加入来源于人ips细胞的gcamp-心肌细胞的聚集体中达24小时。对于没有任何试剂(对照)(图8-a、8-b)、加入阿霉素后三天(图8-c)或加入柔红霉素后三天(图8-d)的心肌细胞聚集体，利用gcamp荧光对细胞内钙波形作图。加入蒽环霉素的聚集体显示出短的ptp、心动过速、多变的心跳间隔和心律失常(图8-c、8-d)。聚集体被证明不仅可用于检测在数分钟至数十分钟中看到的短期心脏毒性，如qt延长，而且可用于检测在数天或更多天中看到的长期心脏毒性，如抗癌剂的心脏毒性。10.蒽环霉素在冷冻-解冻后的心肌细胞聚集体中的心脏毒性的分析通过加入阿霉素(10μm)或柔红霉素(20μm)，分析gcamp荧光的参数变化(图9-a、9-b)。尽管ttp和cad并未显著变化，但是ptp显著地降低，并且定量地显示了心动过速的发生。另外，gcamp荧光波形的振幅(从上升到峰的荧光量的绝对值)倾向于显著降低(图9-c)。这些结果表明，蒽环霉素的心脏毒性引起心肌细胞死亡或细胞内钙离子增加的降低，导致心动过速或心律失常。11.在不同尺寸的聚集体的冷冻-解冻之前和之后的参数变化率使用部分1中描述的人ips来源心肌细胞来分析由较少量细胞(0.1×105个细胞/孔)制备并且直径为100至200μm的小尺寸的聚集体(cb1_小尺寸)和由较大量细胞(2×105个细胞/孔)制备并且直径为1200至1600μm的大尺寸的聚集体(cb1_大尺寸)在冷冻-解冻之前和之后的变化。以与部分1中相同的方式，使用cellbanker1作为冷冻保护液，通过聚集体冷冻来冷冻这些聚集体。类似于部分5中的结果，任一尺寸的聚集体的外径(在图10中显示为“直径”)仅减小约10％。另外，在冷冻之前和之后的gcamp荧光波形的各参数(ttp，cad50、70、90，ptp)的变化率在±25％之内，由此未观察到明显的变化。由不同数量的细胞形成并且尺寸不同的聚集体也适合于冷冻-解冻。当前第1页12