在无机胞外纳米基质上不添加生长因子进行的神经干细胞增殖和分化的制作方法

本申请要求2016年5月23日提交的美国临时专利申请序列号62/340,500和2017年5月22日提交的美国非临时专利申请序列号15/600,808的优先权，这个两个专利申请的公开内容以引用方式并入本文。

本发明属于生物技术和医药工业领域。具体地，本发明涉及用于在不使用化学生长因子的情况下分化神经干细胞的方法和底物。

背景技术：

近年来，干细胞疗法在生物医学科学中发展起来并且进展极快。它将有望治疗神经退行性疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病甚至中风。在干细胞疗法中，使用到细胞培养技术。必须使用化学生长因子以诱导干细胞增殖和细胞分化。许多这些生长因子也是能促进癌细胞生长和癌症转移的生长因子。因此，迫切需要开发在不使用化学生长因子的情况下诱导体外干细胞增殖和分化的方法。

本发明的目的是提供用于借助物理结构进行神经干细胞增殖和分化的方法和物理底物，而无需使用化学生长因子。

就本发明人所知，本文公开的本发明相对于现有技术具备新颖性和创造性。

本部分或本申请的任何其他部分中对任何参考文献的引用或标识，不应被解释为承认这样的参考文献可用作本申请的现有技术。

技术实现要素：

本发明属于生物技术和医药工业领域。具体地，本发明涉及用于神经干细胞的细胞分化的方法和底物。在本发明的一个实施方案中，提供了用于借助物理结构进行神经干细胞分化的方法和底物，而不需要使用生长因子。

在本发明的第一方面，提供了一种纳米结构，其包含多个纳米螺旋体(nanohelix)或纳米z形折弯体(nanozigzag)，其中所述多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体由包含sio2或tiox的材料制成，其中x在0.33≤x≤2的范围内。

在本发明第一方面的第二实施方案中，提供了包含多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体的纳米结构，其中所述干细胞是神经干细胞。

在本发明第一方面的第一实施方案中，提供了一种纳米结构，其包含多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体，其中每个纳米螺旋体的长度为至少540nm，每个纳米螺旋体包括至少两个节并且一个螺旋的节为至少240nm。

在本发明第一方面的第二实施方案中，提供了一种纳米结构，其包含多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体，其中每个纳米z形折弯体的长度为至少550nm，每个纳米z形折弯体包括至少三个节并且一个节为至少165nm。

在本发明第一方面的第三实施方案中，提供了包含多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体的纳米结构，其中sio2纳米螺旋体具有12.6±1.8μn/nm的劲度(stiffness)。

在本发明第一方面的第四实施方案中，提供了包含多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体的纳米结构，其中sio2纳米z形折弯体具有19.7±2.3μn/nm的劲度。

在本发明第一方面的第五实施方案中，提供了包含多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体的纳米结构，其中所述纳米结构使用glad技术制造。

在本发明第一方面的第六实施方案中，提供了包含多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体的纳米结构，其中tiox，其中x在0.33≤x≤2的范围内，并且该纳米结构具有不超过26μn/nm的独立于形状的劲度。

在本发明第一方面的第七实施方案中，提供了包含多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体的纳米结构，其中纳米螺旋体是左旋的或右旋的。

在本发明的第二方面，提供了一种纳米结构，其用于在不存在化学生长因子的情况下诱导干细胞的增殖和分化，其中所述纳米结构由包含sio2的材料制成。

在本发明第二方面的第一个实施方案中，提供了一种纳米结构，其用于在不存在化学生长因子的情况下诱导干细胞的增殖和分化，其中所述纳米结构包含多个纳米螺旋体或纳米z形折弯体。

在本发明第二方面的第二实施方案中，提供了一种纳米结构，其用于在不存在化学生长因子的情况下诱导干细胞的增殖和分化，其中所述干细胞是神经干细胞。

在本发明第二方面的第三实施方案中，提供了一种纳米结构，其用于在不存在化学生长因子的情况下诱导干细胞的增殖和分化，其中每个纳米螺旋体的长度为至少540nm，每个纳米螺旋体包括至少两个节并一个节为至少240nm。

在本发明第二方面的第四实施方案中，提供了一种纳米结构，其用于在不存在化学生长因子的情况下诱导干细胞的增殖和分化，其中每个纳米z形折弯体的长度为至少550nm，每个纳米z形折弯体包括至少三个节并且一个节为至少165nm。

在本发明第二方面的第五实施方案中，提供了一种纳米结构，其用于在不存在化学生长因子的情况下诱导干细胞的增殖和分化，其中sio2纳米螺旋体具有12.6±1.8μn/nm的劲度。

在本发明第二方面的第六实施方案中，提供了一种纳米结构，其用于在不存在化学生长因子的情况下诱导干细胞的增殖和分化，其中sio2纳米z形折弯体具有19.7±2.3μn/nm的劲度。

在本发明第二方面的第七实施方案中，提供了一种纳米结构，其用于在不存在化学生长因子的情况下诱导干细胞增殖和分化，其中所述纳米结构使用glad技术制备。

在本发明第二方面的第八实施方案中，提供了一种纳米结构，其用于在不存在化学生长因子的情况下诱导干细胞的增殖和分化，其中所述纳米螺旋体是左旋的或右旋的。

结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团，应理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。

本领域技术人员将理解，除了具体描述的发明方案之外，还可对本文描述的发明作出各种变化方案和修改方案。

本发明包括所有这些变化方案和修改方案。本发明还包括说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤和特征，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”将被理解为暗示纳入所规定的一个整数或一组整数，但不排除任何其他一个整数或一组整数。还要指出的是，在本公开文件中，特别是在权利要求和/或段落中，诸如“包含”等术语可具有美国专利法中赋予其的含义；例如，其可以表示“包括”等；并且诸如“基本上由......组成”的术语具有美国专利法中赋予其的含义，例如，其允许未明确叙及的要素，但排除现有技术中发现的要素或者影响本发明的基本特性或新颖特性的要素。

此外，在整个说明书和权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”将被理解为暗示纳入所规定的一个整数或一组整数，但不排除任何其他一个整数或一组整数。

本文使用的所选术语的其他定义可以在本发明的“具体实施方式”部分找到并且适用于全文。除非另外定义，否则本文使用的所有其他技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

通过阅读后续的描述，本发明的其他方面和优点对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

附图说明

结合附图阅读下文的“具体实施方案”，本发明的上述和其他目的和特征将变得显而易见，附图中：

图1a显示通过glad制作的具有两节式左手纳米螺旋体(nh)的sio2ecnm的tem图像。插图：ecnm的横截面sem图像。

图1b显示通过glad制作的具有三节式纳米z形折弯体(nz)的sio2ecnm的tem图像。插图：ecnm的横截面sem图像。

图1c显示通过glad制作的sio2ecnm的nh:si2p的xps谱图。

图1d显示通过glad制作的sio2ecnm的nh:o1s的xps谱图。

图1e显示通过glad制作的沉积在玻璃上的sio2ecnmnh的xrd谱图。

图1f显示通过glad制作的sio2ecnm的nh和nz的纳米压痕图。

图2a显示通过glad制作的tioxecnm的左旋nh的横截面sem图像。插图显示通过glad制作的tioxecnm的左旋nh的俯视图（比例尺：200nm）。

图2b显示通过glad制作的tioxecnm的nz的横截面sem图像。插图显示通过glad制作的tioxecnm的nz的俯视图（比例尺：200nm）。

图2c显示通过glad制作的左旋nhtioxecnm的单个tiox纳米结构的tem图像。

图2d显示通过glad制作的nztioxecnm的单个tiox纳米结构的tem图像。

图3a显示在螺旋体(nh)形状和z形折弯体(nz)形状的sio2ecnm上培养的nsc在第4天和第7天的存活率。**p<0.01，与对照组（即ctr）相比，^##p<0.01，与nhs组相比。

图3b显示在螺旋体(nh)形状和z形折弯体(nz)形状的tioxecnm上培养的nsc在第4天和第7天的存活率。*p<0.05,**p<0.01，与对照组相比。

图4显示神经元细胞sh-sy5y在不同纳米基质上的细胞活力。

图5显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的sio2ecnm上培养4天和7天的nsc的神经球生长的显微镜图像。比例尺：100μm。

图6显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的tioxecnm上培养4天和7天的nsc的神经球生长的显微镜图像。比例尺：100μm。

图7a显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的sio2ecnm上培养的nsc中的巢蛋白的荧光图像。比例尺：50μm。

图7b显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的tioxecnm上培养的nsc中的巢蛋白的荧光图像。比例尺：50μm。

图8a显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的sio2ecnm上培养的nsc中的map2c的荧光图像。比例尺：50μm。

图8b显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的tioxecnm上培养的nsc中的map2c的荧光图像。比例尺：50μm。

图9a显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的sio2ecnm上培养的nsc中的tuj1的荧光图像。比例尺：50μm。

图9b显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的tioxecnm上培养的nsc中的tuj1的荧光图像。比例尺：50μm。

图10a显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的sio2ecnm上培养第4天的nsc中的巢蛋白表达的蛋白质印迹分析。**p<0.01，与对照组相比；^#p<0.05,^##p<0.01，与nhs组相比。

图10b显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的sio2ecnm上培养第7天的nsc中的tuj1蛋白表达的蛋白质印迹分析。**p<0.01，与对照组相比；^#p<0.05,^##p<0.01，与nhs组相比。

图10c显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的sio2ecnm上培养第7天的nsc中的map2c蛋白表达的蛋白质印迹分析。**p<0.01，与对照组相比；^#p<0.05,^##p<0.01，与nhs组相比。

图10d显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的tioxecnm上培养第4天的nsc中的巢蛋白表达的蛋白质印迹分析。^*p<0.05,**p<0.01，与对照组相比。

图10e显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的tioxecnm上培养第7天的nsc中的tuj1蛋白表达的蛋白质印迹分析。^*p<0.05,**p<0.01，与对照组相比。

图10f显示在螺旋体(nhs)形状或z形折弯体(nzs)形状的tioxecnm上培养第7天的nsc中的map2c蛋白表达的蛋白质印迹分析。*p<0.05,**p<0.01，与对照组相比。

图11a显示沉积在蓝宝石：ti2p上的tioxnhecnm的xps谱图。

图11b显示沉积在蓝宝石：o1s上的tioxnhecnm的xps谱图。

图11c显示沉积在蓝宝石上的tioxnhecnm的xrd谱图。星号标记的峰值归于蓝宝石。

图12a显示在第7天在sio2nhsecnm上的nsc分化的横截面sem图像。

图12b显示在第7天在sio2nzsecnm上的nsc分化的横截面sem图像。

图13a显示在第7天在tioxnzsecnm上的nsc分化的横截面sem图像。

图13b显示在第7天在tioxnhsecnm上的nsc分化的横截面sem图像。

图14显示螺旋体或z形折弯体形状的tioxecnm的纳米压痕图。

具体实施方式

本发明的范围不受本文描述的任何具体实施方案的限制。以下实施方案仅用于举例说明。

近年来，干细胞疗法在生物医学科学中发展起来并且进展极快。神经干细胞(nsc)是自我更新和多能细胞，用于治疗各种神经退行性疾病。化学生长因子(gf)被广泛用于诱导干细胞增殖和分化。如今，在常用的nsc培养方法“神经球测定”中，细胞的生长基本上依赖于gf；分化的细胞在几天内死亡，并且一些未分化的细胞可以响应于表皮gf和碱性成纤维细胞gf而活跃增殖以形成神经球。然而，gf能强效调节细胞信号传导途径。如果使用大量的gf来诱导体外干细胞分化，则在移植后可能会造成体外发展癌细胞或者体内发展肿瘤的风险。例如，对细胞增殖、存活和迁移至关重要的成纤维细胞gf信号传导在许多癌症中起着致癌作用；血管表皮gf（一种血管生成诱导剂）和失调的胰岛素gf与癌症的发生和发展有关。因此，迫切需要开发在没有化学gf或添加剂的情况下诱导体外nsc增殖和分化的新方法。

基于nsc的疗法通常需要细胞外基质(ecm)进行体外培养或接受额外的治疗。ecm可以由有机骨架如聚-l-鸟氨酸(po)、聚-l-赖氨酸(pll)、层粘连蛋白和纤连蛋白(fn)制成。然而，一些研究表明，po和pll可能增强宿主炎症反应的可能性，层粘连蛋白有成为致癌物质的风险，fn会诱导nsc在反复传代后失去其增殖潜力。纳米技术的发展正在以惊人的速度渗透生物医学科学，以设计出广泛的生物相容/生物可分解的细胞外纳米基质(extracellularnanomatrix,ecnm)来指导干细胞的体外命运。例如，在劲挺的(stiff)三维石墨烯泡沫上生长的nsc表现出增强的分化；具有纳米形貌(nanotopography)的微阵列使原代鼠神经祖细胞能够分化，并且无序纳米图案与有序阵列相比可有利于干细胞谱系的定型；nsc可在碳纳米管上成功分化为神经元和星形胶质细胞。针对干细胞命运的指令有几个方面，通常可归类为生化信号和生理信号。生化信号源于gf，而ecnm的干细胞微环境易受多种生理信号的影响，如材料、劲度和形貌（包括晶体结构、纳米结构的几何特征、纤维状局灶接触深度(fibrillarfocalcontactdepth)、图案无序和图案间距）。向细胞提供纯机械支持，一些材料对细胞活力没有影响。形貌信号可引起局灶粘附结构的显著变化并改变细胞骨架和基因表达，从而实质上影响细胞附着、迁移、增殖和分化。因此，人们将越来越多的注意力集中在纳米形貌上，因为它与体外环境相似。然而，这些研究是用化学gf进行的，以防止仅研究生理信号。迄今为止，模拟生理微环境的新型生物材料引起人们极大的兴趣，这种新型生物材料用于在没有gf或其他额外生物材料的情况下培养和扩增nsc。对ecnm的刚性(rigidity)和形貌控制是一个有用的工具，可以在基础层面和应用层面理解如何在ecnm中编码指令以得到特化的细胞定型和功能。

在本发明中，发明人利用通过掠射角沉积法(glad)沉积的雕刻无机ecnm来诱导不用gf的nsc增殖和分化。本发明的ecnm由包含sio2或tio2的生物相容/可生物降解材料制成，呈具有不同形貌的螺旋和z形折弯体。术语“ecnm”、“纳米结构”和“纳米基质”在本文中可互换使用，其定义了本发明用于干细胞的增殖和分化。本发明的ecnm由这样的无机氧化物制成：与化学gf的诱导相比，该无机氧化物促使nsc生长得更快。本发明的sio2ecnm使干细胞能够朝神经元定型(neuronalcommitment)进行分化。本发明的z形折弯体和螺旋纳米结构均使干细胞能够分化。在一个优选的实施方案中，sio2z形折弯体纳米结构介导的分化优于螺旋介导的分化，这可归因于形貌和劲度的生理信号。在本发明的一个实施方案中，提供了一种无gf方法，以使nsc疗法中产生癌细胞的风险减至最低。

操作glad，以沉积以螺旋形雕刻（左手纳米螺旋体或nhs，图1a）或z形雕刻（纳米z形折弯体或nzs，图1b）的紧密堆积的氧化硅ecnm。这两个纳米结构沿着基材表面法线的方向垂直生长。si⁴⁺离子主要通过xps检测（图1c、1d），表明本发明的纳米结构表面由sio2组成。本发明的纳米结构是无定形的（图1e）。nz具有与nh相同的xps和xrd谱图，这里未示出。在一个实施方案中，纳米结构包含多个sio2纳米螺旋体，每个纳米螺旋体的长度(h)为至少540nm，并且每个纳米螺旋体包含至少两个节且一个螺旋的节(p)为~240nm。在另一个实施方案中，纳米结构包含多个sio2纳米z形折弯体，每个纳米z形折弯体的长度(h)为至少550nm，并且每个纳米z形折弯体包括至少三个节且一个节(p)为~165nm（如表1中总结）。本文中，纳米螺旋体的螺旋的节或纳米z形折弯体的节(p)定义为螺旋体或z形折弯体上在一个完整的螺旋转弯(helixturn)或折段(zigzag)的两个端点之间的垂直距离。n是每个纳米z形折弯体或纳米螺旋体中的折段或完整螺旋转弯的数目。每个纳米螺旋体/纳米z形折弯体的长度(h)由下式计算：h=np+d。nh的表面比nz更粗糙（比较图1a和1b）。丝径(d)在本文中定义为纳米z形折弯体和纳米螺旋体本体的直径。由于glad的自阴影效应引起的竞争生长，这两种纳米结构的丝径(d)沿着生长方向逐渐变宽，特别是对于nz。为了显示nsc增殖和分化对ecnm的不同材料的依赖性，使用glad将钛氧化物tiox沉积在nh（图2a、2c）和nz（图2b、2d）中。xps谱图显示在tioxnhsecnm的纳米结构表面（图11a、11b）上发现ti³⁺和ti⁴⁺离子，其中1.5≤x≤2。xrd谱图显示在ecnm的核心中发现tiox，其中0.33≤x≤1.5（图11c）。通过xrd在纳米结构表面上未检测到tio2。这可能是由于tio2的表面层太薄而无法检测到。已证明，ecnm的核心由具有较小的x(0.33≤x≤1.5)的tiox组成，而ecnm的壳或表面由具有较大的x(1.5≤x≤2)的tiox组成，这是由于表面上的自发氧化阻止芯中的进一步氧化。tioxecnm似乎长度比以相同形状雕刻的sio2ecnm短（表1），并且具有晶体结构（图11c）。类似地，tioxnh和nz对d（图2a、2b）和粗糙表面（图2c、2d）具有加宽效应。sio2具有低于tiox的电导率，sio2ecnm的sem图像看起来比tioxecnm更加模糊（图1a、1b的插图与图2a、2b相比）。在一个实施方案中，纳米结构包含由sio2或tiox制成的右旋nh。在另一个实施方案中，纳米结构包含左旋nh（这里未示出）。在另一个实施方案中，纳米结构包括右旋nh和左旋nh。

表1.由sio2或tiox制成的本发明左旋nh和nz的总结：纳米结构的上部分（远离沉积该纳米结构的基材）中的高度(h)、节(p)、节的数目(n)和丝径(d)。对于每个样本，进行多次（不少于10次）测量以评估代数平均值和标准偏差

为了显示nsc在ecnm上的增殖，在ecnm上培养nsc4天和7天后进行mtt和神经球测定。与对照组相比，nsc在sio2和tioxecnm上的存活率在第4天降低，但在第7天显著增加（图2a和3b）。nsc在ecnm上的存活率的变化归因于ecnm能够促进nsc增殖和抑制其他非干细胞的生长。下面的研究进一步证实了这一点，这些研究表明纳米结构的劲度可控制非干细胞的最终命运。螺旋结构和z形折弯体结构上的nsc增殖的程度是相似的（图2a和3b）。在第4天和第7天，与对照组相比，由sio2或tiox制成的nh和nz显著促进神经球的形成（图5和6）。在第4天形成的神经球具有大约大于50μm的直径。本领域已知神经球通常在gf存在下在第5天生长至具有50μm的直径。本发明的无机ecnm在没有gf的情况下加速nsc的增殖并刺激nsc的体外存活力。

神经球的形成是诱导细胞分化和神经元细胞成熟的第一步，其对于治疗脑中疾病的神经修复和细胞替代疗法是至关重要的。快速细胞成熟有利于移植，因为它可以缩短将nsc置于培养中的时间窗口，该培养是一种具有高医疗风险和污染风险的程序。为了证明雕刻的ecnm上的nsc分化，进行蛋白质印迹和免疫细胞化学分析（图10a-10c、7a、8a和9a）。蛋白质印迹分析显示，与对照组相比，在sio2ecnm上，巢蛋白（nsc的标志物）的表达在第4天降低（图10a），而tuj1和map2c蛋白的表达在第7天显著增加（图10b、10c）。tuj1是成熟神经元的一种重要蛋白标志物，tuj1免疫染色清楚地显示神经元细胞形态的成熟，具有明显的核周体和神经突增生。map2c是map2的最小同种型，已知其参与突触发生，在神经元发育的后期阶段被下调。发现sio2nzs上的tuj1蛋白水平比sio2nh上更高，而观察到sio2nh上的map2c表达比sio2nz上更多。由于map2c是一种早期神经元标志物并且其表达在成熟神经元中降低，因此证实nsc分化在sio2nz上的出现比在sio2nh上的出现早。免疫细胞化学结果与蛋白质印迹结果非常吻合（图7a、8a和9a）。结果表明，在没有任何化学gf的情况下，sio2ecnm有效地诱导神经球的生长并刺激nsc向神经元的分化。sio2nz表现出比sio2nh更快的神经元细胞成熟。

没有使用化学gf，因此仅考虑sio2ecnm的不同结构的生理信号、形貌和劲度对nsc分化的影响。通过sem研究了扩散的神经元与ecnm的下部分（邻近沉积该ecnm的基材）的相互作用。分化的神经元细胞强烈粘附于sio2nh和nz（图12a-12b），与先前的报道一致，即细胞与二维ecm的相互作用发生在细胞的基部。纤维状局灶接触形成至这样的程度，即扩散的神经元细胞强烈地包裹sio2ecnm的上部分，表明分化的神经元细胞可以感知nh和nz的不同形貌。形貌信号，包括接触深度、接触的几何轮廓和细胞粘附区域，将在nsc分化中起重要作用。针对这三种形貌信号，进行了sio2nh和nz的比较。接触深度，即nsc与ecnm接触的距离，大约是邻近nsc的nh的节的一半（即，~120nm，图12a）和nz的节（即，~160nm，图12b）。据报道，100nm深度图案上的人间充质干细胞的细胞组织化(cellularorganization)水平比10nm深度图案上的细胞组织化水平更高，最终导致分化成成骨细胞谱系。据表明，sio2nz具有的大接触深度有利于nsc分化。对于几何轮廓，nh具有螺旋轮廓，而nz具有倾斜杆的轮廓，其表面比nh更平滑（图1b与1a对比）。此外，nz阵列似乎在神经元/ecnm接触处具有无序沟槽（图2b的插图），这在螺旋ecnm上未观察到（图2a的插图）。据报道，在具有沟槽的纳米图案化基材上有利于nsc分化，与本发明一致。这可以归因于更多的表面沟槽可以增强局灶粘附并且允许生长的细胞体和ecnm之间有更多的物理接触，尤其是当神经炎扩张而嵌入z形折弯体纳米结构之间的空间时。为了计算细胞粘附面积，有必要测量ecnm中纳米结构的表面密度，但由于sio2ecnm的低导电性，sio2ecnm的俯视sem图像模糊而未能测量。此外，ecnm的劲度控制细胞类型的最终命运，这将在下面讨论。

虽然tioxecnm可以诱导nsc增殖和神经球生长（图3b和6），但与对照组相比，它们倾向于不促进分化成神经元定型（图7b、10d-10f）。分化的神经元细胞粘附于tioxecnm的方式类似于粘附于sioecnm的方式（图13a-13b）。给定螺旋体或z形折弯体的形状，tioxecnm具有类似于sio2ecnm的纳米结构（表1）。据表明，形态信号几乎不能解释由材料引起的nsc在无机ecnm上的分化的差异。nsc分化程度的差异归因于ecnm的劲度，该劲度通过纳米压痕评估。sio2nh的劲度为12.6±1.8μn/nm，低于sio2nz的19.7±2.3μn/nm（图1f）。tioxecnm具有~26μn/nm的独立于形状的劲度（图14），高于sio2ecnm。如发明人所发现的，ecm的劲度对细胞定型具有复杂的影响。例如，软ecm（低于10μn/nm）有利于分化为多能干细胞，而中等劲度凝胶极大地有利于神经元定型。据观察，在中等劲度时，间充质干细胞分化的双相响应具有最大水平的成骨作用，这可以解释在本研究中观察到的现象。10-30μn/nm之间的中等劲度最有利于神经元定型，这对应于sio2nz的~20μn/nm的中等劲度。sio2nh太软而不能强烈诱导神经元定型。tioxecnm的劲度过高而阻碍nsc分化；因此，不建议将tio2用于在不含gf的情况下进行的nsc分化。

在不使用化学gf的情况下，采用通过glad以螺旋形和z形雕刻的sio2ecnm来增殖nsc以形成神经球并在体外分化成神经元定型。就发明人所知，这是关于在没有化学gf的情况下实现ecnm诱导的nsc增殖和分化的第一份报道。nsc在没有gf的情况下的增殖往往比gf诱导的nsc生长更快。雕刻形状对nsc增殖几乎没有影响，但z形折弯体结构有利于分化成神经元。与螺旋相比，z形折弯体形貌提供更大的接触深度和在螺旋中所缺乏的大量沟槽以强烈增强细胞粘附，并且具有适合神经元定型的中等劲度。尽管由tiox(0.33≤x≤2)制成的雕刻ecnm可以增殖nsc的生长，但是它们劲度太大而不能将nsc分化为神经元。

本发明的一个实施方案对nsc增殖和分化提供了一些深远的影响。首先，本发明的在没有gf的情况下进行的nsc的生长和分化显著地使在干细胞疗法中产生癌细胞的风险减至最低。其次，glad技术使人们能够灵活地设计雕刻的ecnm的材料和结构，为通过控制ecnm的形貌和劲度的生理信号定制细胞命运打开了一扇门。第三，glad技术提供了一步法生产工艺，可以大面积（例如在4英寸晶片上）生产具有均匀结构的雕刻ecnm。它为将nsc分化成可设计的细胞定型并得到足量的分化细胞铺平了道路，这对干细胞疗法具有迫切的临床需求。

材料和方法

纳米矩阵

通过掠射角沉积(glad)（物理气相沉积的一种特殊技术）将无机纳米基质沉积在表面上。该沉积是相对于基材的表面法线以超过80度的入射角操作，以产生由螺旋或z形折弯体的纳米柱(nanopillar)阵列组成的纳米基质。纳米柱的材料是可以物理蒸发的材料，包括但不限于介电材料（如siox（图1a-1f）、tiox（图2a-2d）、fexoy、nixoy、ito）、贵金属（如au、ag）、过渡金属（fe、ni、co）以及它们的合金和复合材料。纳米柱的形状通过控制基材旋转来雕刻，包括但不限于螺旋（图1a；图2a和2c）、z形折弯体（图1b；图2b和2d）、垂直杆(post)、方形盘旋(spiral)以及这些结构在三维图案中的组合。纳米基质可以沉积在多种基材上，包括但不限于透明基材（即，玻璃）、不透明基材（即硅晶片）、导电基材（即，金属、ito、ito涂覆的玻璃）和柔性基材（即聚合物）。

nh和nz的glad：

在具有10⁻⁷–10⁻⁶托的高真空的定制物理气相沉积系统（junsuntechco.ltd，台湾）中，使用8.0kv的电子束加速电压和83-87ma的发射电流，将sio2（99.99%，kurtj.lesker公司）和tio2（99.9%，kurtj.lesker公司）以~0.3nm/s的速率进行蒸发，通过位于样本附近的石英晶体微量天平(qcm)监测。sio2和tio2分别以相对于基材的表面法线87°和86°的沉积角(α)沉积。将样本沉积在ito玻璃（xinyantechnologyltd公司）和si晶片（semiconductorwafer,inc公司）上，并使用乙醇/水冷却系统将基材温度控制在室温。为了产生左旋/右旋nh，使基材以速率rr（单位为每秒度数，或°/s为）逆时针/顺时针旋转，rr按以下公式计算：

rr=360rd/p(s1)

其中rd为在基材表面上的沉积速率，对于sio2，以87°α沉积，校准为0.28nm/s，对于tio2，以86°α沉积，校准为0.12nm/s。p为螺旋的节，设计为~200nm。为了产生nz，使基材以180°区间来回摆动，在此期间以给定长度（即，z形折弯的节）沉积倾斜的纳米棒(nanorod)。ecnm的结构总结在表1中。

材料表征：

将沉积后的样本进行机械分离，留下新暴露的表面用于进行扫描电子显微镜表征(sem,oxford,leo1530)。将nh和nz从基材上刮下并通过超声处理5分钟充分分散在乙醇中。将几滴所得的混合物施加到网格结构上的带有花边的碳膜(electronmicroscopysciences)。将网格在环境中干燥并通过透射电子显微镜(tem,tecnaig220stwin)进行检查。在没有沉积后处理的情况下，通过以下方法对样本进行表征：x射线衍射（xrd，bruker，非单色cukαx射线，波长为0.15418nm，advanced8多用途x射线衍射仪）、x射线光电子光谱分析（xps，sengyangskl-12，非单色mgkα辐射1253.6ev，电流为15ma，电压为10kv，起飞角度（样本和探测器之间）为90⁰，真空度为~2×10^-9毫巴）和纳米压痕（nanoindenterxp，具有100μm曲率半径的球形尖端）。

神经干细胞分离和细胞培养

大鼠(springedawley)购自香港中文大学。从p1至p2大鼠的svz解剖nsc，在24孔板中以每孔2×10⁵个细胞的细胞密度和在6孔板中以每孔1.0×10⁶个细胞的细胞密度进行培养，所述板中具有含10%fbs(gibco)、1%psn(gibco)和2%b27supplement(gibco)的nbm(gibco)。在37℃、5%co2下在无机ecnm上温育4天和7天后，分析特定蛋白质和神经球的定位、增殖、水平。

细胞毒性测定：

在作为对照组的玻璃板上培养nsc，并且在4孔板中的ecnm上培养nsc，该板中每孔具有1m完全培养基，然后温育4和7天。在第4天和第7天进行mtt测定。加入mtt溶液并在黑暗中置于37℃的培养箱中4小时。然后在mtt溶液中加入dmso以溶解深紫色晶体。通过分光光度计在570nm的波长下测量溶液的光密度。

免疫细胞化学测定：

首先，在黑暗中在37℃的培养箱中无照射，将培养物中的nsc用核染色剂dapi(μg/ml)在100％甲醇中的溶液染色15分钟。然后，漂洗细胞（1×60％甲醇），然后在室温下在黑暗中用4％多聚甲醛(pfa)固定30分钟。然后，将细胞与特异性一抗在含有triton和正常山羊血清的pbs中的溶液一起在4℃下在黑暗中进一步温育过夜。用pbs漂洗细胞，然后在室温下与特异性二抗在pbs中的溶液一起温育3小时。用pbs漂洗后，用荧光封固剂(dako)固定细胞。通过共聚焦显微镜(fluoviewfv1000,olympus)对细胞的免疫反应性进行成像。

蛋白质印迹分析：

蛋白质印迹用于比较在ecnm上生长的nsc中的巢蛋白、tuj1蛋白和map2c蛋白的水平。在补充有蛋白酶抑制剂混合物(calbiochem)的蛋白质提取试剂(novagen)中提取蛋白质。使用bio-rad蛋白质测定试剂盒(bio-rad)测量蛋白质浓度。在10％sds-聚丙烯酰胺凝胶上分离每个样本的总蛋白质(30μg)，并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。用抗巢蛋白抗体(millipore,1:1000)、抗tuj1抗体(millipore,1:1000)或抗map2c抗体(millipore,1:1000)探测膜，然后与缀合有hr的二抗一起温育。β-肌动蛋白抗体(sigma,1:5000)用作参考以评估每个泳道加载的蛋白质的相对量。使用凝胶记录系统(bio-rad)捕获条带图像。

统计分析：

定量结果表示为平均值±。nsc增殖和分化的数据通过spss中的单向方差分析进行分析，并且操作多个测量以评估代数平均值和标准偏差。所有分析均使用graphpadprism5.0进行。统计学显著性定义为p<0.05。

培养物中的细胞的裂解

在细胞培养物中，除去培养物中的所有培养基，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(3xpbs)漂洗细胞。向每个孔中加入裂解缓冲液，并在冰上用橡胶刮器刮擦细胞。然后收集细胞裂解物并在4℃下以11,000g离心30分钟。将上清液收集在eppendorf管中用于后续实验。

蛋白质浓度的测定

在凝胶电泳之前，测量蛋白质浓度（bio-rad蛋白质测定试剂盒）。用miliq水将样品稀释10倍，并将5ul样品加载到96孔板中，并加入25μl试剂a和200μl试剂b。然后将板在室温下在黑暗中温育30分钟。通过分光光度计测量750nm处的光密度，作为总蛋白质浓度。

凝胶电泳(sds-page)

使用来自每个实验组的相等浓度的蛋白质。在凝胶电泳之前，首先用sds将蛋白质样品在100℃下变性5分钟。将样品与电泳缓冲液混合，然后加载到凝胶中。在室温下，使用30v开始电泳约30分钟，然后用70v电泳约3小时。

蛋白质印迹分析(proteinblotting）

在使用凝胶电泳完成蛋白质分离后，将凝胶上的蛋白质在15v下在转移缓冲液中过夜转移到聚偏二氟乙烯膜上。

蛋白质印迹分析(westernblotting）

在与特异性抗体温育后，将膜用含有吐温20的tris缓冲盐水（tbst；2×10分钟）洗涤，然后用tbs（1×10分钟）洗涤。用化学发光检测试剂westsaveup显示蛋白质条带。使用凝胶记录系统(bio-rad)获取条带图像。

本发明有四个主要特征：

i.纳米基质对培养中的细胞无毒

mtt测定的结果显示，tiox和sio2的纳米基质不影响nsc细胞（图3a和3b）和sy-sh5y细胞（图4）的细胞活力。因此纳米基质是无毒的。

ii.纳米基质的物理基材可促进神经干细胞增殖成为神经球

所给出的数据表明，在从nsc诱导神经球生长时不需要额外的生长因子(gf)或其他化学因子（图5和图6）。在常规的nsc培养方法中，“神经球测定”，分化细胞在几天内死亡，因此一小部分未分化细胞可以积极响应表皮生长因子(egf)和碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)而增殖形成为神经球。在常规的nsc培养中，细胞的生长高度依赖于生长因子的使用。如果没有添加生长因子，细胞就会死亡。然而，生长因子在调节细胞信号传导途径方面非常强效。如果使用大量生长因子在体外诱导干细胞分化，则会造成在移植后在体外发展癌细胞或者在体内发展肿瘤的风险。例如，已证实，对增殖、存活和迁移至关重要的成纤维细胞生长因子(fgf)信号传导在许多癌症中起致癌作用。此外，血管表皮生长因子(vegf)（一种诱导血管生成的诱导物）和失调的胰岛素生长因子（igf）与癌症的发生和发展有关。

本发明人首次证实了在不添加化学生长因子的情况下在纳米基质上实现细胞增殖和分化（图5和图6）。早在第4天，就可以获得直径约50μm的清晰的神经球。发现了在纳米基质上生长的nsc的增殖较之在对照中所见的增殖大大得到增强（图5和图6）。

本发明的纳米基质包含选自sio2或tiox的材料。本发明的纳米基质可以引发细胞增殖以形成神经球。sio2在促进细胞增殖形成神经球中具有更强的作用（图5）。从那些对不同sio2结构进行的研究中，发现sio2z形折弯体结构是产生神经球的最佳结构（图5）。通常发现tioxz形折弯体结构与siox结构相当，而tiox盘旋结构在引起细胞增殖方面效果较差（图6）。细胞增殖的这些差异至少部分地归因于材料劲度的差异。

iii.纳米基质可以加速神经干细胞成熟为神经元

神经球的形成是细胞分化和神经元细胞成熟的第一步。这些是针对大脑疾病的神经修复和细胞替代疗法的关键步骤。更快的细胞成熟可以使移植更快，并且可以缩短将nsc置于培养中的时间窗口，该培养是一种对患者具有高医疗风险和污染风险的程序。结果显示，通过使用本发明的纳米基质，在不使用化学生长因子的情况下，可以实现快速的神经元细胞成熟（图7a-7b、8a-8b、9a-9b）。

本发明的sio2和tiox纳米基质均促进巢蛋白的表达，巢蛋白是一种与nsc的干性(stemness)相关的原纤维蛋白，并且是nsc的一种标志物。这些结果在第4天，nsc被纳米基质激活以促进生长并开始细胞成熟过程（图7a-7b）。

在纳米基质上生长的nsc中的map-2蛋白水平也持续升高（图8a-8b和图10c）。map-2是神经元中的一种独有的树突状蛋白。这表明在纳米基质上接触时树枝状蛋白质的合成增加。发现sio2结构在促进树枝状结晶的生长方面表现更好。

与map-2蛋白类似，tuj-1也是成熟神经元的一种重要蛋白标志物。tuj-1免疫染色可以清楚地显示神经元细胞形态的成熟，具有明显的核周体和神经突增生。就细胞成熟为神经元而言，在所测试的两种材料中，sio2是用于实现该目的的更好的材料（图9a）。在sio2z形折弯体纳米基质上温育后发现更多数量的tuj-1免疫阳性成熟神经元（图9b）。蛋白质印迹分析也强烈支持这些结果（图10b）。类似于细胞增殖效应，引起神经元细胞成熟的有效性的差异也可至少部分地归因于材料的劲度。

iv.纳米形貌对于细胞分化是至关重要的

纳米结构，即基质上的材料的形状，是影响nsc的增殖和分化的一个关键因素。越来越多的证据表明，细胞可以“落入(fell)”纳米尺度至微米尺度的基质形貌，因为该形貌可引起局灶粘附结构的模式的显著变化，从而影响细胞骨架并进而影响基因表达。因此，形貌信息可介导干细胞分化和增殖。细胞优先在所述基质之一的顶部上分化成神经元。通常，发现z形折弯体结构在促进nsc的细胞增殖和细胞分化方面比其他结构更有效（图5至9b）。这些观察结果可归因于这样的事实，即在z形折弯体结构中存在更多的“沟槽”和纳米空间，这可以使生长的细胞体和nsc的神经突之间有更多的物理接触，特别是当神经突延伸然后嵌入到z形折弯体结构之间的空间中时。

向细胞提供纯机械支持物，材料本身显示对细胞活力没有影响。在自然环境中，细胞通过与纳米尺度的细胞外基质(ecm)相互作用来响应其周围环境。细胞外的形貌可以影响细胞附着、迁移、增殖以及分化。因此，人们将越来越多的注意力集中在纳米形貌上，因为它与体外环境相似。

结论

本发明提供“无生长因子”的物理纳米结构，其促进培养中nsc的细胞增殖、细胞分化和成熟。本发明对于在用于大脑疾病的细胞疗法的细胞处理技术的将来可能临床应用中实现安全且成本效益性好的细胞成熟工艺手段而言，将迈出重要的一步。