抗CTLA-4抗体的制作方法
本发明涉及与细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)结合的抗体。
背景技术：
t细胞衰竭是在许多慢性感染和癌症期间出现的t细胞功能障碍的情形。其被确定为t细胞效应子功能差、抑制性受体的持续表达和不同于功能性效应子或记忆t细胞的转录状态。衰竭阻止了对感染和肿瘤的最优控制。(ejohnwherry，natureimmunology12,492-499(2011))。
t细胞衰竭的特征在于t细胞功能的阶梯性和渐进性丧失。衰竭在慢性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)感染期间是明确存在的，并且通常在抗原持续的条件下发展，这种情况发生在许多慢性感染之后，所述慢性感染包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和人类免疫缺陷病毒感染，以及肿瘤转移期间。衰竭不是一种一致的缺陷状态，因为可以表现出表型和功能缺陷的渐变，并且这些细胞不同于原型效应物、记忆和无反应性t细胞。衰竭的t细胞最常出现在高级慢性感染期间，并且抗原刺激的水平和持续时间是该过程的关键决定因素。(yi等，immunologyapr2010；129(4)：474-481)。
循环的人肿瘤特异性cd8+t细胞可能具有细胞毒性并在体内产生细胞因子，这表明自身特异性和肿瘤特异性的人cd8+t细胞在有效免疫治疗后或过继转移后可以具有功能能力，有效免疫治疗是例如接种肽、弗氏不完全佐剂(ifa)和cpg。与外周血相反，浸润肿瘤部位的t细胞通常是功能有缺陷的，具有异常低的细胞因子产量和抑制性受体pd-1、ctla-4、tim-3和lag-3的上调。功能缺陷是可逆的，因为从黑素瘤组织分离的t细胞可以在短期体外培养后恢复ifn-γ的产生。然而，这种功能性损伤是否涉及其他分子途径仍然有待确定，可能类似于动物模型中定义的t细胞衰竭或无反应性。(baitsch等人，jclininvest.2011；121(6)：2350-2360)。
细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)，也称为cd152，是在人类体内由ctla4基因编码的i型跨膜蛋白。本文描述的ctla-4的分子特性和生物学功能总结于mccoy和legros的免疫学和细胞生物学(1999)77：1-10和grosso和kunkel的癌症免疫(2013)13：5.中。
在抗原呈递细胞(apc)上阳性共刺激受体cd28与其配体cd80和cd86的结合引起t细胞的活化，导致t细胞增殖和白细胞介素-2(il-2)的产生。ctla-4在活化的cd4+和cd8+t细胞的细胞表面表达，并且是t细胞功能的重要负调节物。ctla-4具有与cd28相似的结构，并且还与apc上的cd80和cd86结合，但具有更高的亲合性(avidity)和亲和力(affinity)(collins等，immunity(2002)17：201-210)。
已显示ctla-4通过内在和外在机制负调节免疫激活，总结于grosso和kunkel的癌症免疫(2013)13：5的表1。简而言之，(i)通过cd80和cd86在apc上的反向信号传导导致t细胞应答的抑制和/或促进幼稚t细胞向tregs的转化，(ii)通过ctla-3的信号传导刺激调节性细胞因子如tgf-β的产生，导致apc抑制抗原呈递和t细胞功能的抑制，(iii)ctla-4与cd80/cd86的结合减少了可与cd28结合的这些配体，导致apc对t细胞的活化减少，(iv)ctla-4与cd80/cd86的结合导致其反式内吞作用增多，降低了apc激活t细胞的能力，(v)ctla-4向t细胞突触募集抑制蛋白如pp2a和ptpn11，抑制通过cd28和tcr的信号传导，(vi)ctla-4作为高亲和力竞争者，占据cd80/86，从而阻止cd28的结合，(vii)ctla-4的可溶性剪接变体可能能够抑制t细胞活化，(viii)ctla-4抑制t细胞停止信号，所述t细胞停止信号对apc对t细胞的激活是重要的。
对ctla-4负调节的抑制已经显示可促进适应性免疫应答和t细胞活化的刺激。ctla-4阻断抗体已经在癌症的小鼠模型中显示是有效的，并且人们正在研究抗ctla-4抗体如伊匹单抗(ipilimumab)(yervoy，mdx-010,10d1；描述于wo2001014424a1)和曲美单抗(tremelimumab)(替昔单抗(ticilimumab)；cp-675,206)作为促进癌症中抗肿瘤免疫的策略。阻断ctla-4也是与t细胞衰竭相关的疾病(例如慢性病毒感染)的有前景的治疗策略。
已经证明伊匹单抗不能结合鼠ctla-4(wo2001/1014424a1，表5，第81页)，并且同样地显示曲美单抗不与鼠ctla-4结合(hanson等人，procamerassoccancerres(2004)64：877)。汉森等人还公开了曲美单抗显示与人cd28的结合。
发明概述
本发明涉及与ctla-4结合的抗体或抗原结合片段。本发明还公开了其重链和轻链多肽。所述抗体、抗原结合片段和多肽可以以分离和/或纯化的形式提供，并且可以配制成适合用于研究、治疗和诊断的组合物。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段或多肽可有效恢复t细胞，例如cd4+或cd8+t细胞中的t细胞功能。在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段或多肽可有效恢复表现出t细胞衰竭或t细胞无反应性的t细胞中的t细胞功能。
在本发明的一个方面，提供了一种抗体或抗原结合片段，其结合ctla-4，并且基本上不显示与cd28的结合。
在本发明的另一个方面，提供了一种抗体或抗原结合片段，其结合ctla-4，并且不阻止或抑制cd28和cd80之间的相互作用，和/或cd28和cd86之间的相互作用。
在本发明的一个方面，提供了一种抗体或抗原结合片段，抗体的氨基酸序列可包含氨基酸序列i)至iii)，或氨基酸序列iv)至vi)，或优选地氨基酸序列i)至vi)：
i)lc-cdr1ratqgisswla(seqidno:5)；
ii)lc-cdr2aasslqs(seqidno:6)；
iii)lc-cdr3qqantlplft(seqidno:7)；
iv)hc-cdr1sntaawn(seqidno:8)；
v)hc-cdr2rtyyrskwysdyglsvks(seqidno:9)；
vi)hc-cdr3egsggtliy(seqidno:10)；
或其变体，其中序列(i)至(vi)中的一个或多个中的一个或两个或三个氨基酸被另一个氨基酸取代。
在一些实施方式中，lc-cdr1为ratqgisswla(seqidno:5)。在一些实施方式中，lc-cdr2为aasslqs(seqidno:6)。在一些实施方式中，lc-cdr3为qqantlplft(seqidno:7)。在一些实施方式中，hc-cdr1为sntaawn(seqidno:8)。在一些实施方式中，hc-cdr2为rtyyrskwysdyglsvks(seqidno:9)。在一些实施方式中，hc-cdr3为egsggtliy(seqidno:10)。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段可包含至少一个包含以下cdr的轻链可变区：
lc-cdr1：ratqgisswla(seqidno:5)
lc-cdr2:aasslqs(seqidno:6)
lc-cdr3:qqantlplft(seqidno:7)。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段可包含至少一个包含以下cdr的重链可变区：
hc-cdr1：sntaawn(seqidno:8)
hc-cdr2：rtyyrskwysdyglsvks(seqidno:9)；
hc-cdr3：egsggtliy(seqidno:10)。
所述抗体可包括至少一个包括图1中所示cdr的轻链可变区。所述抗体可包括至少一个包括图2中所示cdr的重链可变区。
所述抗体可包括至少一个轻链可变区(vl)，包括seqidnos1、5、6、7之一或2、5、6、7之一的氨基酸序列，，或图1中所示的氨基酸序列的一种，或与seqidnos1、5、6、7之一或2、5、6、7之一或图1中所示的vl链的氨基酸序列中的一种具有至少70％的序列同一性，更优选地至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
所述抗体可包括至少一个重链可变区(vh)，包括seqidnos3、8、9、10之一或4、8、9、10之一的氨基酸序列，或图2中所示的氨基酸序列的一种，或与seqidnos3、8、9、10之一或4、8、9、10之一或图2中所示的vh链的氨基酸序列中的一种具有至少70％的序列同一性，更优选地至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。
所述抗体可包括至少一个轻链可变区和至少一个重链可变区，所述至少一个轻链可变区包括seqidnos1、5、6、7之一或2、5、6、7之一的氨基酸序列，或图1中所示的氨基酸序列的一种(或与seqidnos1、5、6、7之一或2、5、6、7之一或图1中所示的vl链的氨基酸序列中的一种具有至少70％的序列同一性，更优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列)，并且所述至少一个重链可变区包括seqidnos3、8、9、10之一或4、8、9、10之一的氨基酸序列，，或图2中所示的氨基酸序列的一种(或与seqidnos3、8、9、10之一或4、8、9、10之一或图2中所示的vh链的氨基酸序列中的一种具有至少70％的序列同一性，更优选地至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列)。
所述抗体可任选地结合ctla-4，任选地结合人或鼠的ctla-4。在一些实施方式中，所述抗体能够结合人和鼠的ctla-4。所述抗体可任选地具有如上所述的氨基酸序列组分。所述抗体可以是igg。在一个实施方式中，提供了一种任选分离的体外复合物，包括与ctla-4结合的如本文所述的抗体或抗原结合片段。
所述抗体可任选地抑制或阻止人ctla-4与人cd80或cd86之间或鼠ctla-4与鼠cd80或cd86之间的相互作用或功能性结合。这种抑制或阻止ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用或功能性结合可抑制或阻止cd80或cd86介导的ctla-4激活、cd80/ctla-4信号传导或cd86/ctla-4信号传导。
在本发明的一个方面，提供了一种分离的轻链可变区多肽，所述轻链可变区多肽包括以下cdr：
lc-cdr1：ratqgisswla(seqidno:5)
lc-cdr2:aasslqs(seqidno:6)
lc-cdr3:qqantlplft(seqidno:7)。
在本发明的一个方面，提供了一种分离的轻链可变区多肽，包括与以下轻链序列具有至少85％序列同一性的氨基酸序列：seqidno:1或2(图1)。在一些实施方式中，所述分离的轻链可变区多肽能够结合ctla-4。
在本发明的一个方面，提供了一种分离的重链可变区多肽，所述重链可变区多肽包括以下cdr：
hc-cdr1：sntaawn(seqidno:8)
hc-cdr2：rtyyrskwysdyglsvks(seqidno:9)；
hc-cdr3：egsggtliy(seqidno:10)。
在本发明的一个方面，提供了一种分离的轻链可变区多肽，包括与重链序列seqidno:3或4(图2)具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述分离的重链可变区多肽能够结合ctla-4。
在本发明的一个方面，提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链和轻链可变区序列，其中：
所述轻链包括lc-cdr1、lc-cdr2、lc-cdr3，与lc-cdr1：ratqgisswla(seqidno:5)，lc-cdr2：aasslqs(seqidno:6)，lc-cdr3：qqantlplft(seqidno:7)具有至少85％的序列同一性，并且；
所述重链包括hc-cdr1、hc-cdr2、hc-cdr3，与hc-cdr1：sntaawn(seqidno:8)，hc-cdr2：rtyyrskwysdyglsvks(seqidno:9)，hc-cdr3：egsggtliy(seqidno:10)具有至少85％的序列同一性。
在一些实施方式中，所述序列同一性的程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。
在本发明的另一个方面，提供了一种抗体或抗原结合片段，任选地是分离的，包括重链和轻链可变区序列，其中：
所述轻链序列与轻链序列seqidno：1或2(图1)具有至少85％的序列同一性，并且；
所述重链序列与seqidno：3或4的重链序列具有至少85％的序列同一性(图2)。
在一些实施方式中，所述序列同一性的程度可以是86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。
在一些实施方式中，所述抗体、抗原结合片段或多肽在cdr之间)还包括以下排列的可变区轻链框架序列：lcfr1:lc-cdr1:lcfr2:lc-cdr2:lcfr3:lc-cdr3:lcfr4。所述框架序列可以衍生自人共有框架序列。
在本发明的一个方面，提供了一种分离的轻链可变区多肽，任选地与如本文所述的重链可变区多肽组合，所述轻链可变区多肽包含以下cdr：
lc-cdr1：ratqgisswla(seqidno:5)
lc-cdr2:aasslqs(seqidno:6)
lc-cdr3:qqantlplft(seqidno:7)。
在一些实施方式中，所述抗体、抗原结合片段或多肽在cdr之间还包括以下排列的可变区重链框架序列：hcfr1:hc-cdr1:hcfr2:hc-cdr2:hcfr3:hc-cdr3:hcfr4。所述框架序列可以衍生自人共有框架序列。
在本发明的一个方面，提供了一种分离的重链可变区多肽，任选地与如本文所述的轻链可变区多肽组合，所述重链可变区多肽包含以下cdr：
hc-cdr1：sntaawn(seqidno:8)
hc-cdr2：rtyyrskwysdyglsvks(seqidno:9)；
hc-cdr3：egsggtliy(seqidno:10)。
在一些实施方式中，所述抗体或抗体结合片段可以进一步包括人恒定区。例如，选自igg1、igg2、igg3和igg4中的一种。
在一些实施方式中，所述抗体或抗体结合片段可以进一步包括鼠恒定区。例如，选自lgg1、igg2a、igg2b和igg3中的一种。
在本发明的另一个方面，提供了一种抗体或抗原结合片段，任选地是分离的，其能够结合ctla-4，是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段。所述双特异性抗体或抗原结合片段包括(i)如本文所述的能够结合ctla-4的抗原结合片段或多肽，和(ii)能够结合除ctla-4以外的靶蛋白的抗原结合片段或多肽。
在一些实施方式中，所述除ctla-4以外的靶蛋白可以是细胞表面受体，例如在t细胞的细胞表面上表达的受体。在一些实施方式中，所述细胞表面受体可以是免疫检查点受体，例如共刺激受体或抑制性受体。在一些实施方式中，所述共刺激受体可选自cd27、cd28、icos、cd40、cd122、0x43、4-1bb和gitr。在一些实施方式中，所述抑制性受体可以选自b7-h3、b7-h4、btla、lag-3、a2ar、vista、tim-3、pd-1和kir。
在一些实施方式中，所述除ctla-4以外的靶蛋白可以是癌症标志物，其表达与癌症相关。在一些实施方式中，所述癌症标志物可以在细胞表面表达。在一些实施方式中，所述癌症标志物可选自her-2、her-3、egfr、epcam、cd30、cd33、cd38、cd20、cd24、cd90、cd15、cd52、ca-125、cd34、ca-15-3、ca-19-9、cea、cd99、cd117、cd31、cd44、cd123、cd133、abcb5和cd45。
在本发明的另一个方面，提供了一种嵌合抗原受体(car)，包括如本文所述的抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了一种包括如本文所述的car的细胞。
在本发明的另一个方面，提供了一种体外复合物，包括与ctla-4结合的如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car或细胞。所述体外复合物可任选地是分离的。
在本发明的另一个方面，提供了一种组合物，例如药物组合物或药物。所述组合物可包括如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car或细胞和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂或稀释剂。
在本发明的另一个方面，提供了一种编码如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽或car的分离的核酸。所述核酸可以具有seqidnos11、12、13或14(图3)之一的序列，或者由于遗传密码而简并的编码序列，或者与其可以具有至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核苷酸序列的核酸序列。
在本发明的一个方面，提供了一种包含本文所述核酸的载体。在本发明的另一个方面，提供了一种包含所述载体的宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是真核细胞，或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(cho)，或人细胞，或可以是原核细胞(例如大肠杆菌)。
在本发明的一个方面，提供了一种制备如本文所述的抗体或抗原结合片段、多肽或car的方法，所述方法包括在适于表达编码所述抗体、抗原结合片段、多肽或car的载体的条件下，培养如本文所述的宿主细胞，并回收抗体、抗原结合片段、多肽或car。
在本发明的另一个方面，提供了一种抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物在治疗或用于医学治疗方法的用途。在本发明的另一个方面，提供了一种如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物在治疗t细胞功能障碍疾病的用途。在本发明的另一个方面，提供了一种如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物在制造用于治疗t细胞功能障碍疾病的药物或药物组合物中的用途。
在本发明的另一个方面，提供了一种增强t细胞功能的方法，包括将本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物施用于功能障碍的t细胞。所述方法可以在体外或体内进行。
在本发明的另一个方面，提供了一种治疗t细胞功能障碍疾病的方法，所述方法包括向患有t细胞功能障碍疾病的患者施用如本文所述的抗体、抗原结合片段或多肽。
在本发明的另一个方面，提供了一种抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物在治疗癌症中的用途。在本发明的另一个方面，提供了一种如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物在制造用于治疗癌症的药物或药物组合物中的用途。
在本发明的另一个方面，提供了一种杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括将如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物施用于肿瘤细胞。所述方法可以在体外或体内进行。例如，杀伤肿瘤细胞可以是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)、或通过与抗体结合的药物、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物的作用的结果。
在本发明的另一方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的患者施用如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物。
所述癌症可以是表达或过表达ctla-4的癌症，或者可以包括表达或过表达ctla-4的细胞。
在本发明的另一个方面，提供了一种调节受试者的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物，使得受试者的免疫应答被调节。
在本发明的另一个方面，提供了一种抑制肿瘤细胞生长的方法，包括施用如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物。所述方法可以在体外或体内进行。在一些实施方式中，提供了一种抑制受试者的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、细胞或组合物。
在本发明的另一个方面，提供了一种方法，所述方法包括使含有或疑似含有ctla-4的样品与如本文所述的抗体、抗原结合片段、car或细胞接触，并检测抗体、抗原结合片段、car或细胞和ctla-4的复合物的形成。
在本发明的另一个方面，提供了一种诊断受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括在体外使来自受试者的样品与如本文所述的抗体、抗原结合片段、car或细胞接触，并检测抗体、抗原结合片段、car或细胞和ctla-4的复合物的形成。
在本发明的另一个方面，提供了一种如本文所述的抗体、抗原结合片段、car或细胞在体外用于检测ctla-4的用途。在本发明的另一个方面，提供了一种如本文所述的抗体、抗原结合片段、car或细胞在体外作为检测ctla-4的诊断试剂的用途。
在本发明的方法中，所述抗体、抗原结合片段、多肽、car或细胞可以作为本文所述的组合物提供。
在另一方面，本发明提供了一种治疗或预防受试者癌症的方法，包括：
(a)从受试者中分离出至少一个细胞；
(b)修饰所述的至少一个细胞，以表达或包括本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、核酸或载体，和；
(c)将所述的修饰的至少一个细胞施用于受试者。
在另一方面，本发明提供了一个治疗或预防受试者癌症的方法，包括：
(a)从受试者中分离出至少一个细胞；
(b)将如本文所述的核酸或载体引入所述的至少一个细胞，从而修饰所述的至少一个细胞，和；
(c)将所述的修饰的至少一个细胞施用于受试者。
在另一方面，本发明提供了一种试剂盒，包括预定量的如本文所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car、组合物、核酸、载体或细胞。
在一些实施方式中，所述抗体可以是如本文所述的克隆2c8或2c8_g1。
术语
抗体
本发明所述的抗体优选地结合ctla-4(抗原)，优选人或鼠ctla-4，任选地具有2至20nm的kd值。
本发明所述的抗体可以以分离的形式提供。
本发明所述的抗体可以表现出以下性质中的至少一种：
a)与人或小鼠ctla-4结合的kd值为1μm或更低，优选地≤100nm、≤75nm、≤50nm、≤40nm、≤30nm、≤20nm、≤15nm、≤12.5nm、≤10nm、≤9nm、≤8nm、≤7nm、≤6nm、≤5nm、≤4nm≤3nm、≤2nm、≤1nm、≤500pm之一(例如通过spr确定)；
b)与人或小鼠ctla-4结合的亲和力(affinity)为ec50＝1μm或更低，优选地≤100nm、≤75nm、≤50nm、≤40nm、≤30nm、≤20nm、≤15nm、≤12.5nm、≤10nm、≤9nm、≤8nm、≤7nm、≤6nm、≤5nm、≤4nm≤3nm、≤2nm、≤1nm、≤500pm之一(例如通过elisa确定)；
c)与人或小鼠ctla-4结合的亲合性(avidity)为ec50＝500pm或更低，优选地≤400pm、≤300pm、≤200pm、≤150pm、≤100pm、≤90pm、≤80pm、≤75pm、≤70、≤65pm、≤60pm、≤55pm，≤50pm之一(例如通过elisa测定)；
d)基本上不显示与cd28(例如人cd28或小鼠cd28)的结合。
e)与人和小鼠ctla-4结合，并且基本上不显示与人cd28的结合；
f)抑制或阻止ctla-4和cd80，任选地人ctla-4和人cd80之间的相互作用；
g)抑制或阻止ctla-4和cd86，任选地人ctla-4和人cd86之间的相互作用；
h)抑制或阻止ctla-4和cd80之间的相互作用以及ctla-4和cd86之间的相互作用，任选地人ctla-4、人cd80和人cd86；
i)不抑制或阻止cd28和cd80，任选地人cd28和人cd80之间的相互作用；
j)不抑制或阻止cd28和cd86，任选地人cd28和人cd86之间的相互作用；
k)不抑制或阻止cd28和cd80之间的相互作用以及cd28和cd86之间的相互作用，任选地人cd28、人cd80和人cd86；
l)体外增加t细胞的活化；
m)在t细胞再激活试验中增加t细胞的il-2产量；
n)对感染起反应，增加t细胞增殖、il-2产量和ifnγ产量中的一种或多种；
o)抑制肿瘤生长，任选地在体内进行。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体可用于扩增免疫细胞数量的方法，例如t细胞。本发明所述的抗体可用于扩增具有所需特性的免疫细胞数量。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体可用于扩增具有效应表型(例如ctl)的免疫细胞数量的方法，优选具有免疫调节/免疫抑制表型的免疫细胞(例如tregs)。
“抗体”包括其片段或衍生物，或合成抗体或合成抗体片段。
鉴于单克隆抗体技术相关的现有技术，可以针对大多数抗原制备抗体。抗原结合部分可以是抗体的一部分(例如fab片段)或合成抗体片段(例如单链fv片段[scfv])的一部分。可以通过已知技术制备针对所选抗原的合适的单克隆抗体，例如在“单克隆抗体：技术手册”，hzola(crc出版社，1988)和“单克隆杂交瘤抗体：技术与应用”，jgrhurrell(crc出版社，1982年)公开的那些。neuberger等人(1988，第8届国际生物技术研讨会第2部分，792-799)讨论了嵌合抗体。
单克隆抗体(mab)可用于本发明的方法，并且是特异性靶向抗原上的单个表位的同源抗体群。
多克隆抗体可用于本发明的方法。单特异性多克隆抗体是优选的。可以使用本领域熟知的方法制备合适的多克隆抗体。
在一些实施方式中，所述抗体/片段是完全人抗体/片段。所述完全人抗体/片段由人核酸序列编码。所述完全人抗体/片段中没有非人氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述抗体/片段可以是嵌合抗体/片段。所述嵌合抗体/片段可包括衍生自不同抗体/片段的氨基酸序列。例如，嵌合抗体/片段可包含来自一个抗体/抗原结合片段的cdr或可变域序列和来自另一个抗体/抗原结合片段的恒定区序列。在一些实施方式中，所述嵌合抗体/片段可包括来自一种抗体/抗原结合片段的cdr，和来自另一种抗体/抗原结合片段的恒定区序列和框架区序列。
在一些实施方式中，所述嵌合抗体/片段可包括如本文所述的抗ctla-4克隆2c8或2c8_g1的cdr或可变域序列，和来自另一抗体/抗原结合片段的恒定区序列。在一些实施方式中，所述嵌合抗体/片段可包含如本文所述的抗ctla-4克隆2c8或2c8_g1的cdr，和来自另一抗体/抗原结合片段的恒定区序列和框架区序列。
在一些实施方式中，所述嵌合抗体/片段可包括来自一个物种的抗体的cdr或可变域序列和来自另一物种的抗体的恒定区序列。在一些实施方式中，所述嵌合抗体/片段可包括来自一种物种的抗体的cdr和来自另一物种的抗体的恒定区序列和框架区序列。
在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗体/片段可包括如本文所述的抗ctla-4克隆2c8或2c8_g1的cdr或可变域序列，和来自非人物种的抗体的恒定区序列。在一些实施方式中，本发明所述的嵌合抗体/片段可包括如本文所述的抗ctla-4克隆2c8或2c8_g1的cdr，和来自非人物种的抗体的恒定区序列和框架区序列。
在一些实施方式中，所述非人物种是非人哺乳动物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿类动物(包括来自任何啮齿目动物的细胞)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括牛，如奶牛，或任何牛属动物)、马(包括任何马科动物)、驴，和非人灵长类动物)。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体/片段可以包含修饰(例如一个或多个氨基酸取代)以增加与感兴趣物种中天然产生的抗体的相似性。
也可以使用/提供抗体的抗原结合片段，例如fab和fab2片段，因为其可以是基因工程抗体和抗体片段。所述抗体的可变重链(vh)和可变轻链(vl)结构域参与抗原识别，这是早期蛋白酶消化实验中首先被认识到的事实。通过啮齿动物抗体的“人源化”进行了进一步的确认。啮齿动物来源的可变结构域可以与人源的恒定结构域融合，使得所得抗体保留啮齿动物亲本抗体的抗原特异性(morrison等(1984)proc.natl.acad.sd.美国81，6851-6855)。
所述抗原特异性由可变结构域赋予并且与恒定结构域无关，这从涉及抗体片段的细菌表达的实验中已知，所述抗体片段均含有一个或多个可变结构域。这些分子包括fab样分子(better等(1988)science240,1041)；fv分子(skerra等(1988)science240,1038)；单链fv(scfv)分子，其中vh和vl配偶体结构域通过柔性寡肽连接(bird等(1988)science242,423；huston等(1988)proc.natl.acad.sd.美国85，5879)和包括分离的v结构域(ward等(1989)nature341,544)的单链抗体(dabs)。在winter&milstein(1991)nature349,293-299中可以找到保留抗体片段特异性结合位点的抗体片段合成所涉及的技术的综述。
“scfv分子”是指其中vh和vl配偶体结构域共价连接的分子，例如通过柔性的寡肽。
fab、fv、scfv和dab抗体片段都可以在大肠杆菌中表达和分泌，因此可以容易地产生大量的所述片段。
全抗体和f(ab')2片段是“二价”的。“二价”是指所述抗体和f(ab')2片段具有两个抗原结合位点。相反，fab、fv、scfv和dab片段是单价的，仅具有一个抗原结合位点。结合ctla-4的合成抗体也可以使用本领域熟知的噬菌体展示技术制备。
本发明还提供了多特异性抗体和多特异性抗原结合片段，包括本发明所述的抗原结合片段或多肽。
如本文所用，“多特异性”意指对多于一个表位具有特异性。在一些实施方式中，多特异性抗体或多特异性抗原结合片段可以对例如2(双特异性)、3(三特异性)、4、5、6、7、8、9或10个不同的表位具有特异性。
在一些实施方式中，本发明所述的多特异性抗体/片段可以对多于一种靶分子具有特异性。在一些实施方式中，多特异性抗体/片段可以对例如2(双特异性)、3(三特异性)、4、5、6、7、8、9或10种不同的靶分子具有特异性。
在一些实施方式中，所述多特异性抗体和多特异性抗原结合片段包括能够结合ctla-4的抗原结合片段，和能够结合另一种靶蛋白的抗原结合片段。在一些实施方式中，所述多特异性抗体/片段包括能够结合ctla-4的抗原结合片段，和能够结合另一种靶蛋白(即ctla-4以外的蛋白质)的，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个抗原结合片段。
本发明还提供了一种抗体或抗原结合片段，能够结合ctla-4，并且是双特异性抗体或双特异性抗原结合片段。在一些实施方式中，所述双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以是分离的。
在一些实施方式中，所述多特异性抗体和多特异性抗原结合片段包括本发明所述的抗原结合片段或多肽。在一些实施方式中，所述双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包括能够结合ctla-4的抗原结合片段，其中能够结合ctla-4的抗原结合片段包括本发明所述的抗原结合片段或多肽或由其组成。
在一些实施方式中，所述双特异性抗体和双特异性抗原结合片段包括能够结合ctla-4的抗原结合片段，和能够结合另一种靶蛋白的抗原结合片段。
所述能够结合另一种靶蛋白的抗原结合片段可能能够结合除ctla-4以外的另一种蛋白质。
在一些实施方式中，所述靶蛋白可以是细胞表面受体。在一些实施方式中，所述靶蛋白可以是在免疫细胞(例如t细胞)的细胞表面上表达的细胞表面受体。在一些实施方式中，所述细胞表面受体可以是免疫检查点受体。在一些实施方式中，所述免疫检查点受体可以是共刺激受体。在一些实施方式中，所述共刺激受体可选自cd27、cd28、icos、cd40、cd122、0x43、4-1bb和gitr。在一些实施方式中，所述免疫检查点受体可以是抑制受体。在一些实施方式中，所述抑制性受体可以选自b7-h3、b7-h4、btla、lag-3、a2ar、vista、tim-3、pd-1和kir。
在一些实施方式中，所述靶蛋白可以是癌症标志物。也就是说，所述靶蛋白可以是其表达(例如上调的表达)与癌症相关的蛋白质。在一些实施方式中，所述癌症标志物可以在细胞表面表达。在一些实施方式中，所述癌症标志物可以是受体。在一些实施方式中，所述癌症标志物可选自her-2、her-3、egfr、epcam、cd30、cd33、cd38、cd20、cd24、cd90、cd15、cd52、ca-125、cd34、ca-15-3、ca-19-9、cea、cd99、cd117、cd31、cd44、cd123、cd133、abcb5和cd45。
在一些实施方式中，cd27的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd27结合片段，例如抗cd27抗体克隆0323(millipore)或伐利单抗(varlilumab)(celldextherapeutics)的cd27结合片段。在一些实施方式中，cd28的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd28结合片段，例如抗cd28抗体克隆cd28.6(ebioscience)、克隆cd28.2、克隆jj319(novusbiologicals)、克隆204.12、克隆b-23、克隆10f3(thermoscientificpierceantibodies)、克隆37407(r&dsystems)、克隆204-12(abnovacorporation)、克隆15e8(emdmillipore)、克隆204-12、克隆yth913.12(abdserotec)、克隆b-t3(acris抗体)、克隆9h6e2(sinobiological)、克隆c28/77(mybiosource.com)、克隆kolt-2(alpco)、克隆152-2e10(santacruzbiotechnology)、或克隆xph-56(creativediagnostics)的cd28结合片段。在一些实施方式中，icos的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他icos结合片段，例如抗icos抗体克隆isa-3(ebioscience)、克隆sp98(novusbiologicals)、克隆1g1、克隆3g4(abnovacorporation)、克隆669222(r&dsystems)、克隆tq09(creativediagnostics)或克隆c398.4a(biolegend)的icos结合片段。在一些实施方式中，cd40的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd40结合片段，例如抗cd40抗体克隆82111(r&dsystems)或askp1240(okimura等，amjtransplant(2014)14(6)1290-1299)的cd40结合片段。在一些实施方式中，cd122的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd122结合片段，例如cd122抗体克隆mik32(pharmingen)的cd122结合片段。在一些实施方式中，0x43的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他0x43结合片段，例如在us20130280275、us8283450或wo2013038191中公开的抗ox43抗体，例如克隆12h3或克隆20e5的0x43结合片段。在一些实施方式中，4-1bb的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他4-1bb结合片段，例如抗4-1bb抗体pf-05082566(fisher等，cancerimmunolimmunother(2012)61：1721-1733)，或乌洛单抗(urelumab)(bms-665513；bristol-myerssquibb；li和liu，clinpharmacol(2013)；5：47-53)的4-1bb结合片段。在一些实施方式中，gitr的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他gitr结合片段，例如抗gitr抗体trx-518(tolerxr；schaer等，(2010)11(12)：1378-1386)，或克隆ait518d(lifespanbiosciences)的gitr结合片段。在一些实施方式中，b7-h3的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他b7-h3结合片段，例如在us20130078234、wo2014160627或wo2011109400中公开的抗b7-h3抗体克隆的b7-h3结合片段。在一些实施方式中，b7-h4的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他b7-h4结合片段，例如在wo2013067492、wo2009073533或ep2934575中公开的抗b7-h4抗体克隆，例如克隆2h9的b7-h4结合片段。在一些实施方式中，btla的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他btla结合片段，例如抗btla抗体克隆1b7、克隆2g8、克隆4c5(abnovacorporation)、克隆4b8(antibodies-online)、克隆mih26(thermoscientificpierceantibodies)、克隆umab61(origenetechnologies)、克隆330104(r&dsystems)、克隆1b4(lifespanbioscience)、克隆440205、克隆5e7(creativediagnostics)的btla结合片段。在一些实施方式中，lag-3的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他lag-3结合片段，例如抗lag-3抗体克隆17b4(enzolifesciences)、克隆333210(r&dsystems)、克隆14l676(unitedstatesbiological)、bms-986016，或wo2015042246a1中描述的抗lag-3抗体的lag-3结合片段。在一些实施方式中，a2ar的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他a2ar结合片段，例如抗a2ar抗体克隆7f6(millipore；koshiba等molecularpharmacology(1999)；55：614-624)的a2ar结合片段。在一些实施方式中，vista的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他vista结合片段，例如在wo2015097536或us20140105912中公开的抗vista抗体，例如克隆13f3的vista结合片段。在一些实施方式中，tim-3的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他tim-3结合片段，例如抗tim-3抗体克隆f38-2e2(biolegend)、克隆2e2(merckmillipore；piresdasilva等，cancerimmunolres(2014)2(5)：410-422)、克隆6b6e2、克隆024(sinobiological)、克隆344801(r&dsystems)、克隆e-18、克隆h-191(santacruzbiotechnology)或克隆13a224(unitedstatesbiological)的tim-3结合片段。在一些实施方式中，pd-1的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他pd-1结合片段，例如抗pd-1抗体克隆j116、克隆mih4(ebioscience)、克隆7a11b1(rocklandimmunochemicalsinc.)、克隆192106(r&dsystems)、克隆j110、克隆j105(mblinternational)、克隆12a7d7、克隆7a11b1(abbiotec)、克隆#9x21(mybiosource.com)、克隆4h4d1(proteintechgroup)、克隆d3w4u、克隆d304s(cellsignalingtechnology)、克隆rmp1-30、克隆rmp1-14(merckmillipore)、克隆eh12.2h7(biolegend)、克隆10b1227(unitedstatesbiological)、克隆umab198、克隆umab197(origenetechnologies)、尼沃单抗(nivolumab)(bms-936558)、兰布利单抗(lambrolizumab)，或在wo2010/077634或wo2006/121168中描述的抗pd-1抗体的pd-1结合片段。在一些实施方式中，kir的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他kir结合片段，例如抗kir抗体克隆1-7f9(romagne等，blood(2009)114(13)：2667-2677)、利鲁单抗(lirilumab)(bms-986015；sola等，jimmunothercancer(2013)；1：p40)或在us2015/0344576或wo2014/066532中描述的抗kir抗体的kir结合片段。在一些实施方式中，her-2的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他her-2结合片段，例如抗her-2抗体曲妥珠单抗(赫赛汀)，或在wo2003/006509或wo2008/019290中描述的抗her-2抗体的her-2结合片段。在一些实施方式中，her-3的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他her-3结合片段，例如抗her-3抗体克隆mm-121(lyu等，int.jclinexppathol(2015)8(6)：6143-6156)、mehd7945a(schaefer等，cancercell(2011)20(4)：472-486)、amg888(u3-1287；aurisicchio等，oncotarget(2012)3(8)：744-758)或在wo2008/100624或wo2013048883中描述的抗her-3抗体的her-3结合片段。在一些实施方式中，egfr的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他egfr结合片段，例如抗egfr抗体帕尼单抗(abx-egf；vectibix)、西妥昔单抗(erbitux)、尼妥珠单抗、马他珠单抗(emd7200)或抗体克隆048-006(sogawa等，nuclmedcomm(2012)33(7)：719-725)的egfr结合片段。在一些实施方式中，epcam的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他epcam结合片段，例如抗epcam抗体埃曲洛莫布(edrecolomab)、ing-1、3622w4或阿达卡莫单抗(adecatumumab)(munz等，cancercellint(2010)10:44)的epcam结合片段。在一些实施方式中，cd30的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd30结合片段，例如抗cd30抗体布鲁昔单抗(brentuximab)(cac10)、克隆sgn-30(wahl等，cancerres200262(13)：3736-3742)、克隆5f11(borchmann等，blood(2003)102(1)：3737-3742)或在wo1993024135或wo2003059282中描述的抗cd30抗体的cd30结合片段。在一些实施方式中，cd33的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd33结合片段，例如抗cd33抗体林妥珠单抗(lintuzumab)(sgn-33)、吉珠单抗(gemtuzumab)(mylotarg)，或克隆hp67.7(sievers等，blood(1999)93(11)：3678-3684)的cd33结合片段。在一些实施方式中，cd38的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd38结合片段，例如抗cd38抗体达他单抗(daratumumab)(darzalex)、sar650984(martin等，jclinoncol(2014)32：5s、(suppl；abstr8532)或mor202(morphosysag)，或在wo2006099875或us20100285004中描述的抗cd38抗体的cd38结合片段。在一些实施方式中，cd20的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd20结合片段，例如抗c240抗体利妥昔单抗、奥克里西单抗(ocrelizumab)、阿法单抗(ofatumumab)、奥匹妥珠单抗(obinutuzumab)或bm-ca(kobayashi等，cancermed(2013)2(2)：130-143)的cd20结合片段。在一些实施方式中，cd24的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd24结合片段，例如抗cd24抗体克隆ebiosn3(ebioscience)、克隆ml5(bdbiosciences)或在wo2008059491中描述的抗cd24抗体的cd24结合片段。在一些实施方式中，cd90的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd90结合片段，例如cd90抗体克隆5e10(bdbiosciences)的其他cd90结合片段。在一些实施方式中，cd15的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd15结合片段，例如cd15抗体克隆c3d-1、carb-3(dakoa/s)、mma(roche)或by87(abcam)的cd15结合片段。在一些实施方式中，cd52的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd52结合片段，例如cd52抗体阿仑单抗、克隆h1186或克隆yth34.5(abdserotec)的cd52结合片段。在一些实施方式中，ca-125的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他ca-125结合片段，例如抗ca-125抗体奥戈伏单抗(oregovomab)的ca-125结合片段。在一些实施方式中，cd34的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd34结合片段，例如cd34抗体克隆561(biolegend)、克隆581(becktondickinson)或克隆5f3(sigmaaldrich)的cd34结合片段。在一些实施方式中，ca-15-3的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他ca-15-3结合片段，例如抗ca-15-3抗体克隆2f16(usbiological)、克隆ta998(thermofisherscientific)、克隆1d1(sigmaaldrich)，或mabar20.5(qi等，hybridhybridomics(2001)20(5-6)：313-324)的ca-15-3结合片段。在一些实施方式中，ca-19-9的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他ca-19-9结合片段，例如抗ca-19-9抗体克隆116-ns-19-9(dakoa/s)、克隆spm110或克隆121sle(thermofisherscientific)的ca-19-9结合片段。在一些实施方式中，cea的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cea结合片段，例如抗-cea抗体拉贝珠单抗、c2-45(kyowahakkokirinco.ltd.)或imakiire等人，intjcancer(2004)108：564-570或wo2011034660中公开的抗cea抗体的cea结合片段。在一些实施方式中，cd99的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd99结合片段，例如抗cd99抗体克隆c7a(moricoli等，jimmunolmethods(2014)408：35-45)或克隆12e7(dakoa/s)的cd99结合片段。在一些实施方式中，cd117的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd117结合片段，例如抗cd117抗体克隆ck6(lebron等，cancerbiolther(2014)15(9)：1208-1218)，或克隆104d2(sigmaaldrich)的cd117结合片段。在一些实施方式中，cd31的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd31结合片段，例如cd31抗体克隆jc70a(dakoas)的cd31结合片段。在一些实施方式中，cd44的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd44结合片段，例如抗cd44抗体pf-03475952(runnels等，advther(2010)；27(3)：168-180)、rg7356(vugts等，mabs(2014)6(2)：567-575)、克隆im7，或克隆a3d8(sigmaaldrich)的cd44结合片段。在一些实施方式中，cd123的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd123结合片段，例如抗cd123抗体csl362(nievergall等，blood(2014)123(8)：1218-1228)、csl360(he等，leuklymphoma(2015)56(5)：1406-1415)、73g(jin等，cellstemcell(2009)5(1)：31-42)、克隆6h6(abdserotec)或在wo2014130635中描述的抗cd123抗体的cd123结合片段。在一些实施方式中，cd133的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd133结合片段，例如抗cd133抗体克隆6b3、克隆9g4、克隆ac141(wang等，hybridoma(larchmt)(2010)29(3)：241-249)、克隆6b6(chen等，hybridoma(larchmt)(2010)29(4)：305-310)、克隆ac113(miltenyibiotec)，或在wo201114493中描述的抗cd133抗体的cd133结合片段。在一些实施方式中，abcb5的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他abcb5结合片段，例如abcb5抗体克隆5h3c6(thermofisherscientific)的abcb5结合片段。在一些实施方式中，cd45的抗原结合片段可包括cdr、轻链和重链可变结构域或其他cd45结合片段，例如抗cd45抗体yaml568(glatting等，jnuclmed(2006)47(8)：1335-1341)，或克隆bra-55(sigmaaldrich)的cd45结合片段。
本发明所述的双特异性抗体或双特异性抗原结合片段的抗原结合片段可以是能够结合抗原的多肽的任何片段。在一些实施方式中，抗原结合片段包含至少三个轻链cdr(即lc-cdr1、lc-cdr2和lc-cdr3)和三个重链cdr(即hc-cdr1、hc-cdr2和hc-cdr3)，其一起确定抗体或抗原结合片段的抗原结合区。在一些实施方式中，抗原结合片段可包括抗体或抗原结合片段的轻链可变域和重链可变域。在一些实施方式中，抗原结合片段可包括抗体或抗原结合片段的轻链多肽和重链多肽。
本发明所述的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段可以以任何合适的形式提供，例如kontermannmabs2012,4(2)：182-197中描述的那些形式，其全部内容通过引用并入本文。例如，双特异性抗体或双特异性抗原结合片段可以是双特异性抗体缀合物(例如igg2、f(ab')2或covx-body)、双特异性igg或igg样分子(例如igg、scfv4-ig、igg-scfv、scfv-igg、dvd-ig、igg-svd、svd-igg、1-1gg的2、mab2或tandemabcommonlc)、不对称双特异性igg或igg样分子(例如kihigg、kihiggcommonlc、crossmab、kihigg-scfab、mab-fv、电荷对或seed体)、小双特异性抗体分子(例如diabody(db)、dsdb、dart、scdb、tandabs、串联scfv(tafv)、串联dabahh、三体、三头、fab-scfv或f(ab')2-scfv2)、双特异性fc和ch3融合蛋白(例如tafv-fc、di-双抗体、scdb-ch3、scfv-fc-scfv、hcab-vhh、scfv-kih-fc或scfv-kih-ch3)，或双特异性融合蛋白(例如scfv2-白蛋白、scdb-白蛋白、tafv-毒素、dnl-fab3、dnl-fab4-igg、dnl-fab4-igg-细胞因子2)。特别是参见kontermannmabs2012,4(2)：182-19的图2。
本领域技术人员能够设计和制备本发明所述的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段。
生产双特异性抗体的方法包括抗体或抗体片段的化学交联，例如利用可还原的二硫化物或不可还原的硫醚键，例如segal和bast，2001，双特异性抗体的生产，免疫学现行方案，14：iv：2.13：2.13.1-2.13.16中所述，其全部内容通过引用并入本文。例如，n-琥珀酰亚胺基-3-(-2-吡啶基二硫代)-丙酸酯(spdp)可用于化学交联，例如fab片段，通过铰链区sh-基团，以产生二硫键连接的双特异性f(ab)2异二聚体。
生产双特异性抗体的其他方法包括融合产抗体的杂交瘤(例如用聚乙二醇)，制备能够分泌双特异性抗体的四倍体细胞，例如d.m.和bast，b.j.2001，双特异性抗体的生产，免疫学现行方案，14：iv：2.13：2.13.1-2.13.16中所述。
本发明所述的双特异性抗体和双特异性抗原结合片段也可以通过重组产生，通过表达例如编码抗原结合分子多肽的核酸构建体，例如抗体工程：方法和步骤，第二版(humana出版社，2012年)，第40章：双特异性抗体的生产：diabodies和tandemscfv(hornig和farber-schwarz)，或french，如何制备双特异性抗体，methodsmol.med.2000；40：333-339中所述，两者的内容均通过引用并入本文。
例如，编码两个抗原结合片段的轻链和重链可变结构域(即能够结合ctla-4的抗原结合片段的轻链和重链可变结构域，以及能够结合另一种靶蛋白的抗原结合片段的轻链和重链可变结构域)，并且包括在抗原结合片段之间编码合适的接头或二聚化结构域的序列的dna构建体，可以通过分子克隆技术被制备。此后，可以通过在合适的宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中表达(例如体外)构建体来产生重组双特异性抗体，然后任选地可以纯化表达的重组双特异性抗体。
抗体可以通过亲和力成熟过程产生，其中产生修饰的抗体，与未修饰的亲本抗体相比，其具有抗体对抗原的亲和力的改善。亲和力成熟的抗体可以通过本领域已知的方法生产，例如marks等，rio/technology10：779-783(1992)；barbas等，proc.nat.acad.sci.美国91：3809-3813(1994)；schier等，gene169：147-155(1995)；yelton等，j.immunol.155:1994-2004(1995)；jackson等，j.immunol.154(7)：3310-159(1995)和hawkins等，j.mol.biol.226：889-896(1992)。
本发明所述的抗体优选表现出与ctla-4的特异性结合。特异性结合靶分子的抗体优选以更高的亲和力结合靶标，和/或以比结合其他靶标更长的持续时间结合靶标。在一些实施方式中，本发明抗体对ctla-4的亲和力可以大于对pd-1、tim-3、icos、btla、cd28或lag-3中的一种或多种的结合。
在本发明的实施方式中，所述抗体、片段或多肽基本上不显示与cd28，例如人cd28的结合。这是能够结合ctla-4的抗体的意外特征，因为现有技术的抗体(例如抗体克隆l3d10)在高浓度显示与cd28结合(如图5)。有利地，所述抗体能够抑制/阻止ctla-4/cd80或ctla-4/cd86信号传导，而不抑制/阻止cd28/cd80或cd28/cd86信号传导。
如本文所用，“基本上没有结合”是指结合不显著大于阴性对照抗体(例如针对与cd28无关的靶标的抗体，或已知不结合cd28的抗体)的结合水平。在一些实施方式中，在给定的测定中或在给定的浓度下，本发明所述的抗体表现出的与cd28(例如人cd28)的结合是阴性对照抗体(例如针对与cd28无关的靶标的抗体，或已知不结合cd28的抗体)的结合的≤500％、≤400％、≤300％、≤250％、≤200％、≤150％或≤100％。
本发明所述的抗体与给定分子的结合可以通过本领域技术人员熟知的技术测定，包括elisa、spr、生物层干涉测量法、流式细胞术或放射免疫测定(ria)。通过这种分析，可以测定和量化与给定目标的结合。在一些实施方式中，所述结合可以是在给定测定中检测到的响应。
在一个实施方式中，抗体与不相关靶标的结合程度小于抗体与靶标结合的约10％，例如通过elisa、spr、生物层干涉测量法或通过ria测定。或者，所述结合特异性可以反映在结合亲和力方面，其中本发明的抗ctla-4抗体与ctla-4结合的kd值比抗体对另一靶分子的kd至少大0.1个数量级(即0.1×10n，其中n是一个整数，表示数量级)。这可以任选地为至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5或2.0中的一种。
本发明所述的抗体优选地具有以下之一的解离常数(kd)：<10nm、<5nm、<3nm、<2nm、<1.5nm、<1.4nm、<1.3nm、<1.25nm、<1.24nm、<1.23nm、<1.22nm、<1.21nm、<1.2nm、<1.15nm、<1.1nm、<1.05nm、<1nm、<900pm、<800pm、<700pm、<600pm、<500pm。所述kd可以在约0.1至约3nm的范围内。抗体对其靶标的结合亲和力通常以其解离常数(kd)来描述。结合亲和力可以通过本领域已知的方法测量，例如通过elisa、表面等离子体共振(spr；参见例如hearty等，methodsmolbiol(2012)907：411-442)、生物层干涉测量法(参见例如lad等人，(2015)jbiomolscreen20(4)：498-507)，或通过抗体和抗原分子的fab形式进行的放射性标记的抗原结合试验(ria)。
本发明所述的抗体优选地表现出与ctla-4(例如人ctla-4或小鼠ctla-4)的结合，其具有比参照抗ctla-4抗体结合亲和力更大的亲和力或具有相似的亲和力。本发明所述的抗体和参照抗体与给定靶标的结合的相对亲和力可以通过例如elisa测定，如本文所述。
本发明所述的抗体可以表现出与人ctla-4的结合，其具有比抗体克隆l3d10(例如，描述于may等，blood(2005)105：1114-1120)结合亲和力更大的亲和力或具有相似的亲和力。在一些实施方式中，所述抗体可以表现出与小鼠ctla-4的结合，其具有比能够结合小鼠ctla-4的参照抗体更大的亲和力，或具有相似的亲和力。
如本文所用，与参照抗体相比，对给定靶分子显示出“更大亲和力”的抗体与该靶分子的结合强度高于参照抗体与靶分子的结合强度。可以定量测定抗体对给定靶分子的亲和力。在一些实施方式中，对靶蛋白显示比参照抗体更大亲和力的抗体，结合靶分子的kd值或ec50值小于参照抗体与靶分子结合的值。
在一些实施方式中，在给定的分析中，本发明所述的抗体对ctla-4的亲和力可以为参照抗体对ctla-4的亲和力的1.01倍或更高、1.05倍或更高、1.1倍或更高、1.15倍或更高、1.2倍或更高、1.25倍或更高、1.3倍或更高、1.35倍或更高、1.4倍或更高、1.45倍或更高、1.5倍或更高。在一些实施方式中，在给定的分析中，本发明所述的抗体结合ctla-4的kd值或ec50值可以为参照抗体结合ctla-4的相应kd值或ec50值的0.99倍或更少、0.95倍或更少、0.9倍或更少、0.85倍或更少、0.8倍或的较少、0.75倍或更少、0.7倍或更少、0.65倍或更少、0.6倍或更少、0.55倍或更少、0.5倍或更少。
本发明所述的抗体优选地与人或小鼠ctla-4结合的亲合性(avidity)为ec50＝500pm或更低，优选地≤400pm、≤300pm、≤200pm、≤150pm、≤100pm、≤90pm、≤80pm、≤75pm、≤70、≤65pm、≤60pm、≤55pm，≤50pm之一。如本文所用，结合的亲合性(avidity)是指抗体与靶分子结合以形成抗体：靶标复合物的强度。具有高亲合性(avidity)的抗体更强烈地结合靶分子，因此形成稳定的抗体：靶标复合物。抗体与靶分子结合的亲合性(avidity)可以通过elisa分析，例如如本文所述，并量化。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体可以抑制/阻止ctla-4和cd80之间的相互作用。在一些实施方式中，本发明所述的抗体可以抑制/阻止ctla-4和cd86之间的相互作用。在一些实施方式中，本发明所述的抗体可以抑制/阻止ctla-4和cd80之间的相互作用，并抑制/阻止ctla-4和cd86之间的相互作用。
通过分析ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用相关的响应，可以推断ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抑制/阻止。本发明所述的抗体对ctla-4与cd80或cd86之间相互作用的相对抑制/阻止可以在例如体外测定，如本文所述。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体对ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抑制/阻止的程度可以达到大于或等于能够结合ctla-4的参照抗体(例如抗体克隆l3d10)对ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抑制/阻止的程度。在一些实施方式中，在给定的分析中，本发明所述的抗体对ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抑制/阻止的程度可以达到能够结合ctla-4的参照抗体对ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抑制/阻止的程度的1.01倍或更高、1.05倍或更高、1.1倍或更高、1.15倍或更高、1.2倍或更高、1.25倍或更高、1.3倍或更高、1.35倍或更高、1.4倍或更高、1.45倍或更高、1.5倍或更高。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体可能不抑制/阻止cd28和cd80之间的相互作用。在一些实施方式中，本发明所述的抗体可能不抑制/阻止cd28和cd86之间的相互作用。在一些实施方式中，本发明所述的抗体可能不抑制/阻止cd28和cd80之间的相互作用，并且可能不抑制/阻止cd28和cd86之间的相互作用。
可以通过测量与cd28与cd80或cd86之间的相互作用相关的响应(例如在体外测定中)来分析cd28与cd80或cd86之间相互作用的抑制/阻止。
在一些实施方式中，在本发明所述的抗体存在下，与cd28与cd80或cd86之间的相互作用相关的响应可以是在本发明所述的抗体不存在的情况下，或在阴性对照抗体(即针对一个不相关的靶标的抗体，或已知不结合cd28、cd80或cd86的抗体)存在下响应值的≥70％、≥75％、≥80％、≥85％、≥90％、≥95％或≥99％。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体对ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抑制/阻止的程度可以达到大于或等于能够结合ctla-4的参照抗体(例如抗体克隆l3d10)对ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抑制/阻止的程度。在一些实施方式中，在给定的分析中，本发明所述的抗体对ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抑制/阻止的程度可以达到能够结合ctla-4的参照抗体对ctla-4与cd80或cd86之间的相互作用的抑制/阻止的程度的1.01倍或更高、1.05倍或更高、1.1倍或更高、1.15倍或更高、1.2倍或更高、1.25倍或更高、1.3倍或更高、1.35倍或更高、1.4倍或更高、1.45倍或更高、1.5倍或更高。
本发明所述的抗体优选在体外增加t细胞的活化。通过在给定测定中检测增加的t细胞增殖、il-2表达/产量或ifnγ表达/产量中的一种或多种，可以推断t细胞的活化增加。t细胞增殖可以通过本领域技术人员熟知的方法评估，例如通过测量氚标记的胸苷的掺入或通过cfse染料稀释的方法，例如，如anthony等人，2012cells1：127-140中所述。il-2和/或ifnγ的表达/产量可以被分析(例如通过本领域技术人员熟知的基于核酸和/或抗体的方法)，例如qrt-pcr、蛋白质印迹、免疫组织化学、免疫细胞化学、流式细胞术、elisa、elispot，或通过基于报告分子的方法。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体可以使t细胞增殖、il-2产量和ifnγ产量中的一种或多种增加，使得能够在给定的测定中，与能够结合ctla-4的参照抗体(例如l3d10)产生相似的或更大程度的增加。在一些实施方式中，在给定的分析中，本发明所述的抗体可以使t细胞增殖、il-2产量和ifnγ产量中的一种或多种增加的程度是为响应能够结合ctla-4的参照抗体的t细胞增殖、il-2产量和ifnγ产量的增加的程度的1.01倍或更高、1.05倍或更高、1.1倍或更高、1.15倍或更高、1.2倍或更高、1.25倍或更高、1.3倍或更高、1.35倍或更高、1.4倍或更高、1.45倍或更高、1.5倍或更高。
在一些实施方式中，本发明所述的抗体可以能够抑制肿瘤生长或癌症进展。在一些实施方式中，本发明所述的抗体可以显示抗癌活性。在一些实施方式中，所述抑制肿瘤生长或癌症进展可以是在体内的。“抑制”可以是肿瘤的减少或控制肿瘤生长，或减少或控制癌细胞的数量。可以在体内评估肿瘤生长或癌症进展的抑制，例如在如本文所述的癌症的动物模型中。
本发明所述的抗体可以是“拮抗剂”抗体，其抑制或降低与其结合的抗原的生物活性。通过阻断ctla-4与cd80和/或cd86之间的相互作用来抑制由ctla-4介导的免疫抑制信号传导途径，以帮助恢复t细胞功能。
本发明还提供了一种嵌合抗原受体(car)，其包含本发明所述的抗原结合片段。
所述嵌合抗原受体(car)是提供抗原结合和t细胞活化功能的重组受体。car的结构和工程改造在例如dotti等，immunolrev(2014)257(1)中综述，该文献通过引用整体并入本文。
所述car包括与细胞膜锚定区和信号传导区连接的抗原结合区。任选的铰链区可以提供抗原结合区和细胞膜锚定区之间的分隔，并且可以充当柔性接头。
car的抗原结合区可以基于抗体的抗原结合区或者能够结合靶标的其他试剂，所述抗体的抗原结合区对car靶向的抗原具有特异性。例如，car的抗原结合结构域可包括特异性结合靶蛋白的抗体的互补决定区(cdr)的氨基酸序列或完整轻链和重链可变区氨基酸序列。car的抗原结合结构域可基于其他蛋白质：蛋白质相互作用靶向抗原，例如配体：受体结合；例如，已经使用基于il-13的抗原结合结构域开发了il-13ra2靶向的car(参见例如kahlon等，2004cancerres64(24)：9160-9166)。
本发明所述的car包括ctla-4结合区。在一些实施方式中，本发明所述的car包括抗原结合区，所述抗原结合区包括本发明所述的抗体/抗原结合片段或由其组成。
本发明所述的car的ctla-4结合区可以以任何合适的形式提供，例如scfv、fab等。在一些实施方式中，本发明的car的ctla-4结合区包括结合ctla-4的scfv或由其组成。
所述细胞膜锚定区被提供在抗原结合区域和car的信号传导区域之间。所述细胞膜锚定区用于将car锚定至表达car的细胞的细胞膜，所述细胞的细胞外空间中具有抗原结合区域以及细胞内具有信号传导区域。在一些实施方式中，本发明的car包括细胞膜锚定区，所述细胞膜锚定区的氨基酸序列包括包含、衍生自或由cd3-ζ、cd4、cd8或cd28之一的跨膜区氨基酸序列组成的氨基酸序列，或由其组成。
如本文所用，“衍生自”参照氨基酸序列的区域包括与参照序列具有至少60％的序列同一性的氨基酸序列，例如，具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100之一的序列同一性。
所述car的信号传导区允许t细胞的激活。所述car的信号传导区可以包括cd3-ζ的胞内结构域的氨基酸序列，所述cd3-ζ的胞内结构域的氨基酸序列提供基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)，用于磷酸化和激活表达car的t细胞。包括其他含有itam的蛋白质的序列的信号传导区也已应用于car，例如包括含有itam的fcγri区的结构域(haynes等，2001jimmunol166(1)：182-187)。包括衍生自cd3-ζ的胞内结构域的信号传导区的car通常被称为第一代car。
所述car的信号传导区还可以包括衍生自共刺激分子的信号传导区的共刺激序列，以促进与靶蛋白结合后表达car的t细胞的活化。合适的共刺激分子包括cd28、ox40、4-1bb、icos和cd27。具有包括额外共刺激序列的信号传导区的car通常被称为第二代car。
在一些情况下，car被改造为可提供不同胞内信号传导途径的共刺激。例如，与cd28共刺激相关的信号传导优先激活磷脂酰肌醇3-激酶(p13k)途径，而4-1bb介导的信号传导是通过tnf受体相关因子(traf)接头蛋白进行的。因此car的信号传导区有时包括衍生自一个以上共刺激分子的信号传导区的共刺激序列。包括多种共刺激序列的信号传导区的car通常被称为第三代car。
在一些实施方式中，本发明的car包括一种或多种共刺激序列，所述一种或多种共刺激序列的氨基酸序列包括包含、衍生自或由cd28、ox40、4-1bb、icos和cd27中的一种或多种的胞内域的氨基酸序列组成的氨基酸序列，或由其组成。
任选的铰链区可以在抗原结合结构域和跨膜结构域之间提供分隔，并且可以充当柔性接头。所述铰链区可以是柔性结构域，允许结合部分取向于不同方向。所述铰链区可以衍生自igg1或免疫球蛋白的ch2ch3区。在一些实施方式中，本发明的car包括铰链区，所述铰链区的氨基酸序列包括包含、衍生自或由igg1的铰链区或免疫球蛋白的ch2ch3区的氨基酸序列组成的氨基酸序列，或由其组成。
car可以与共刺激配体、嵌合共刺激受体或细胞因子组合以进一步增强t细胞的效力、特异性和安全性(sadelain等，嵌合抗原受体(car)设计的基本原理，cancerdiscov.2013年4月；3(4)：388-398.doi：10.1158/2159-8290.cd-12-0548，特别地通过引用并入本文)。
本发明还提供了一种包括本发明所述的car的细胞。本发明所述的car可用于产生t细胞。将car改造为t细胞可以在培养期间进行、在体外进行、用于转导和扩增，例如在用于过继性t细胞疗法的t细胞扩增期间进行。
在一些方面，所述抗体是克隆2c8或2c8_g1，或2c8或2c8_g1的变体。2c8和2c8_g1包括以下cdr序列：
lc-cdr1ratqgisswla(seqidno:5)
lc-cdr2aasslqs(seqidno:6)
lc-cdr3qqantlplft(seqidno:7)。
重链：
hc-cdr1sntaawn(seqidno:8)
hc-cdr2rtyyrskwysdyglsvks(seqidno:9)
hc-cdr3egsggtliy(seqidno:10)
cdr序列是由kabat定义确定的。
本发明所述的抗体可包括2c8或2c8_g1的cdr或seqidnos1和3之一；或2和4之一。在本发明所述的抗体中，六个cdr序列中的一个或两个或三个或四个可以变化。变体可以在六个cdr序列中的一个或两个中具有一个或两个氨基酸的取代。
抗ctla-4克隆的vh和vl链的氨基酸序列示于图1和2中。编码核苷酸序列示于图3中。
轻链和重链cdr也可以特别用于与许多不同的框架区的结合。因此，具有lc-cdr1-3或hc-cdr1-3的轻链和/或重链可具有替代的框架区。合适的框架区是本领域熟知的，并且被描述于例如m.lefranc和g.lefranc(2001)“免疫球蛋白事实手册”，academic出版社，其通过引用并入本文。
在本说明书中，抗体可以具有vh和/或vl链，所述vh和/或vl链包括与seqidnos1和3；或2和4的vh和/或vl氨基酸序列的一个或多个，或与图1和2中所示的氨基酸序列的一个或多个具有高百分比的序列同一性的氨基酸序列。
例如，本发明所述的抗体包括结合ctla-4并具有vh或vl链的抗体，所述vh或vl链包括与seqidnos1至4中的一种的vh或vl链的氨基酸序列，或与图1和2中所示的一个或多个氨基酸序列具有至少70％的序列同一性的氨基酸序列，更优选地至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％之一。
本发明所述的抗体可以被可检测地标记或至少能够被检测。例如，所述抗体可以用放射性原子或有色分子或荧光分子或可以以任何其他方式容易地被检测的分子标记。合适的可检测分子包括荧光蛋白、荧光素酶、酶底物和放射性标签。结合部分可以用可检测标签直接标记，或者可以被间接标记。例如，所述结合部分可以是未标记的抗体，其可以被另一种自身标记的抗体检测到。
或者，第二抗体可以与生物素结合，并且标记的链霉亲和素与生物素的结合用于间接标记第一抗体。
核酸/载体
本发明提供了编码本发明所述的抗体、抗原结合片段或car的核酸。在一些实施方式中，所述核酸是被纯化或分离的，例如来自其他核酸或天然存在的生物材料。
本发明还提供了包括编码本发明所述的抗体、抗原结合片段或car的核酸的载体。
本发明所述的核酸和/或载体可被提供以用于引入细胞，例如原发性人免疫细胞。合适的载体包括质粒、二元载体、dna载体、mrna载体、病毒载体(例如γ逆转录病毒载体(例如鼠白血病病毒(mlv)衍生载体)、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、牛痘病毒载体和疱疹病毒载体)、基于转座子的载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)，例如如maus等，annurevimmunol(2014)32：189-225或morgan和boyerinas，biomedicines20164,9中所述，它们均通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，所述病毒载体可以是慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或单纯性疱疹病毒载体。在一些实施方式中，所述慢病毒载体可以是pelns，或可以衍生自pelns。在一些实施方式中，所述载体可以是编码crispr/cas9的载体。
包括/表达抗体/片段/car的细胞
本发明还提供了包括或表达本发明所述的抗体、抗原结合片段或car的细胞。本发明还提供了包括或表达本发明所述的核酸或载体的细胞。
所述细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞。所述哺乳动物可以是非人哺乳动物(例如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他啮齿类动物(包括任何啮齿目动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛(包括牛、如奶牛、或任何牛属动物)、马(包括任何马科动物)、驴，和非人灵长类动物)。
在一些实施方式中，所述细胞可以来自或可以取自人类受试者。
所述细胞可以是免疫细胞。所述细胞可以是造血来源的细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞或单核细胞。所述淋巴细胞可以是例如t细胞、b细胞、nk细胞、nkt细胞或先天性淋巴细胞(ilc)，或其前体。所述细胞可表达例如cd3多肽(例如cd3γ、cd3ε、cd3ζ或cd3σ)、tcr多肽(tcrα或tcrβ)、cd27、cd28、cd4或cd8。在一些实施方式中，所述细胞是t细胞。在一些实施方式中，所述t细胞是cd3+t细胞。在一些实施方式中，所述t细胞是cd3+，cd8+t细胞。在一些实施方式中，所述t细胞是细胞毒性t细胞(例如细胞毒性t淋巴细胞(ctl))。
当所述细胞是包括本发明所述的car的t细胞时，所述细胞可以称为car-t细胞。
在一些实施方案中，所述细胞是抗原特异性t细胞。在本文的实施方式中，“抗原特异性”t细胞是为响应于t细胞特异性的抗原或表达所述抗原的细胞而显示t细胞的某些功能特性的细胞。在一些实施方式中，所述特性是与效应t细胞(例如细胞毒性t细胞)相关的功能性质。在一些实施方式中，抗原特异性t细胞可以显示一种或多种以下特性：细胞毒性(例如包括/表达t细胞特异性的抗原的细胞)、增殖、ifnγ表达、cd107a表达、il-2表达、tnfα表达、穿孔素表达、颗粒酶表达、颗粒溶素表达，和/或fas配体(fasl)表达，例如响应于t细胞特异性的抗原或包括/表达t细胞特异性的抗原的细胞。在一些实施方式中，所述t细胞特异性的抗原可以是病毒的肽或多肽，例如爱泼斯坦-巴尔病毒(ebv)、流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、单纯疱疹病毒(hsv)或人类乳头状瘤病毒(hpv)。
本发明还提供了一种用于生产包括本发明所述的核酸或载体的细胞的方法，包括将本发明所述的核酸或载体引入细胞中。本发明还提供了一种生产表达本发明所述的抗体、抗原结合片段或car的细胞的方法，包括将本发明所述的核酸或载体引入细胞中。在一些实施方式中，所述方法还包括在适于细胞表达核酸或载体的条件下培养细胞。在一些实施方式中，所述方法在体外进行。
在一些实施方式中，将本发明所述的分离的核酸或载体引入细胞中包括转导，例如逆转录病毒转导。因此，在一些实施方式中，所述分离的核酸或载体被包括在病毒载体中，或所述载体是病毒载体。在一些实施方式中，所述方法包括通过电穿孔引入本发明所述的核酸或载体，例如，如koh等人，分子疗法-nucleicacids(2013)2，e114所述，其全部内容通过引用并入本文。
本发明还提供了通过本发明所述的细胞的制备方法获得的或可获得的细胞。
检测方法
本文所述的抗体、抗原结合片段、car或细胞可被用于涉及抗体、抗原结合片段、car或细胞与ctla-4结合的方法中。此类方法可涉及检测抗体、抗原结合片段、car或细胞和ctla-4的结合复合物。因此，在一个实施方式中，提供了一种方法，所述方法包括使含有或疑似含有ctla-4的样品与如本文所述的抗体、抗原结合片段、car或细胞接触，并检测抗体、抗原结合片段、car或细胞和ctla-4的复合物的形成。
合适的方法形式是本领域熟知的，包括免疫测定，例如夹心测定，例如夹心测定，例如elisa。所述方法可以包括用可检测的标记物标记抗体、抗原结合片段、car或细胞，或ctla-4，或两者，所述可检测的标记物例如荧光的、发光的或放射性标记。ctla-4的表达可以通过免疫组织化学(ihc)的方法测定，例如检测活组织获得的组织样品。
所述方法可以提供诊断需要检测和/或定量ctla-4或cd80或cd86的疾病或病症的方法的基础。所述方法可以对患者样品在体外进行，或者在对患者样品进行处理后进行。一旦收集样品，就不需要患者参与用于体外诊断的方法，因此所述方法可以是不在人体或动物体上实施的方法。
所述方法可涉及确定患者样品中存在的ctla-4的量。所述方法可以进一步包括将确定的量与标准值或参考值进行比较，作为达到诊断目的的过程的一部分。其他诊断测试可以与这里描述的方法联合使用，以增强诊断或预后诊断的准确性或确认通过使用本文所述的测试获得的结果。
癌细胞可利用ctla-4途径通过上调ctla-4的表达来产生免疫抑制环境，从而允许在渗入肿瘤微环境的任何t细胞上激活抑制性ctla-4受体，从而抑制其活性。已经在许多不同的癌症类型中证实了ctla-4表达的上调，并且高ctla-4表达也与不良临床结果相关。
存在于患者样品中的ctla-4或cd80或cd86的水平可以指示患者可以对抗ctla-4抗体的治疗作出反应。样品中高水平的ctla-4或cd80或cd86的存在可用于选择用抗ctla-4抗体治疗的患者。因此，本发明的抗体可用于选择患者，以用抗ctla-4疗法治疗。
样品中ctla-4的检测可用于患者的t细胞功能障碍性疾病或癌症的诊断、患癌倾向的诊断或提供癌症的预后(预测)。诊断或预后可以涉及现有的(先前诊断的)癌症状况(可以是良性的或恶性的)，可以涉及疑似的癌症状况，或者可以涉及患者癌症状况的筛查(可以是预先未确诊的)。
在一个实施方式中，可以检测cd8+t细胞上ctla-4表达的水平，以指示t细胞衰竭的程度和疾病状态的严重程度。
在一个实施方式中，可以检测cd80或cd86表达水平(例如在抗原呈递细胞或肿瘤细胞中)以指示疾病状态的存在或严重程度，例如感染、组织炎症或癌症。
可以从任何组织或体液中取样。样品可包括或可源自：一定量的血液；来自个体血液的一定量血清，其可包括去除纤维蛋白凝块和血细胞后获得的血液的流体部分；组织样本或活组织检查；或从所述个体分离的细胞。
本发明所述的方法优选在体外进行。术语“体外”旨在包括培养细胞的实验，而术语“体内”旨在包括完整多细胞生物的实验。
治疗应用
可以提供本发明所述的抗体、抗原结合片段、car、细胞和多肽以及包含这些试剂的组合物，用于医学治疗方法。可以向患有需要治疗的疾病或病症的受试者提供治疗。所述疾病或病症可以是t细胞功能障碍疾病之一，包括与癌症相关的t细胞功能障碍病症，或癌症，或与感染相关的t细胞功能障碍病症，或感染。
t细胞功能障碍性疾病可以是正常t细胞功能受损的疾病或病症，导致受试者对致病性抗原的免疫应答下调，例如，通过外源因子例如微生物、细菌和病毒感染产生，或通过由宿主在某些疾病状态如某些形式的癌症(例如以肿瘤相关抗原的形式)产生。
所述t细胞功能障碍性疾病可包括t细胞衰竭或t细胞无反应性。t细胞衰竭包括cd8+t细胞响应抗原刺激时，不能增殖或发挥t细胞效应功能，如细胞毒性和细胞因子(例如ifnγ)的分泌。衰竭的t细胞还可以通过ctla-4的持续表达来表征，其中ctla-4：cd80或ctla-4：cd86相互作用的阻断可以逆转t细胞衰竭并恢复抗原特异性t细胞应答。
所述t细胞功能障碍性疾病可表现为感染，或不能产生针对感染的有效免疫应答。所述感染可以是慢性的、持续的、潜伏的或缓慢的，并且可以是细菌、病毒、真菌或寄生虫感染的结果。因此，可以向细菌、病毒或真菌感染的患者提供治疗。细菌感染的实例包括幽门螺杆菌感染。病毒感染的例子包括hiv、乙型肝炎或丙型肝炎感染。
所述t细胞功能障碍性疾病可能与癌症，例如肿瘤免疫逃逸有关。许多人肿瘤表达由t细胞识别并能够诱导免疫应答的肿瘤相关抗原。在几项研究中已经证明抑制ctla-4的t细胞活化负调节是一种有前景的治疗方法，例如在grosso和kunkel，cancerimmunity(2013)13：5中综述。
在没有t细胞功能障碍的迹象如t细胞耗尽的情况下也可以治疗癌症，但是使用本发明所述的抗体、抗原结合片段、多肽、car或细胞引起受试者抑制ctla-4信号传导和产生有效的免疫反应，所述受试者具有有限的损伤、逃避或诱导肿瘤免疫逃逸。在所述治疗中，抗体、抗原结合片段、多肽、car或细胞可提供癌症治疗，所述癌症治疗涉及预防肿瘤免疫逃逸的发展。
过度表达ctla-4的癌症也可以被治疗。例如，通过抗ctla-4抗体的处理、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)或使用抗ctla-4抗体-药物偶联物，过表达ctla-4的肿瘤细胞可以直接被杀死。
所述治疗可以旨在预防t细胞功能障碍，例如，对感染或癌症的发展或进展的预防。因此，所述抗体、抗原结合片段、car、细胞和多肽可用于配制药物组合物或药物，并且受试者可以被预防性地治疗以针对疾病状态的发展。这可以在疾病症状发作之前进行，和/或可以施用于被认为具有更高的感染或癌症发展风险的受试者。
治疗可包括与疫苗(例如t细胞疫苗)的联合治疗，可以包括同时、分开或顺序治疗，或在单一组合物中联合施用疫苗和抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽。在本文中，所述抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽可以作为疫苗的佐剂被提供。衰竭t细胞的有限的增殖潜力被认为是t细胞免疫治疗失败的主要原因，并且，能够阻断或逆转t细胞耗竭的药剂的组合是提高t细胞免疫疗法功效的潜在策略(barber等，nature439卷，9号，682-687页，2006年2月)。
抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽的施用优选地为“治疗有效量”，这足以显示对个体的益处。实际施用的量、施用的速率和时间过程将取决于所治疗的疾病的性质和严重程度。治疗的处方，例如剂量的决定等，是在一般医师和其他医疗人员的责任范围内，并且通常考虑待治疗的疾病、个体患者的状况、递送部位、施用方法和医师已知的其它因素。上述技术和方案的实例可以参考雷明顿的制药科学，第20版，2000年出版，lippincott，williams&wilkins。
配制药学上有用的组合物和药物
本发明所述的抗体、抗原结合片段、car、细胞和多肽可以配制成临床使用的药物组合物，并且可以包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。
本发明还提供了制备药学上有用的组合物的方法，所述方法可包括选自以下的一个或多个步骤：分离如本文所述的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽；和/或将如本文所述的分离的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合。
例如，本发明的另一方面涉及一种配制或生产用于治疗t细胞功能障碍疾病的药物或药物组合物的方法，所述方法包括通过将如本文所述的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽与药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂或稀释剂混合，配制药物组合物或药物。
感染
感染可以是任何感染或传染病，例如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。在一些实施方式中，可能特别期望治疗慢性/持续性感染，例如这种感染与t细胞功能障碍或t细胞衰竭有关。
众所周知，t细胞衰竭是在许多慢性感染(包括病毒、细菌和寄生虫)以及癌症期间出现的t细胞功能障碍状态(wherrynatureimmunology卷12，6号，492-499页，2011年6月)。
感染或传染病可能是ctla-4上调的疾病。
可以治疗的细菌感染的实例包括芽孢杆菌属(bacillusspp.)、百日咳博代氏杆菌(bordetellapertussis)、梭状芽孢杆菌(clostridiumspp.)、棒状杆菌属(corynebacteriumspp.)、霍乱弧菌(vibriochloerae)、葡萄球菌属(staphylococcusspp.)、链球菌属(streptococcusspp.)、埃希氏杆菌属(escherichia)、克雷白氏杆菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、耶尔森菌属(yersinia)、欧文氏菌(erwina)、沙门氏菌(salmonella)、李斯特菌属(listeriasp)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、分枝杆菌(mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis))和铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)引起的感染。例如，所述细菌感染可以是败血症或结核病。
kirman等，infectimmun(1999)67(8)：3786-3792描述了ctla-4的阻断增强由分枝杆菌感染诱导的免疫应答的能力，并且rowe等，immunology(2008)128：e471-e478描述了通过阻断ctla-4而增强的响应于单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)感染的t细胞应答。
可以治疗的病毒感染的实例包括流感病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、单纯疱疹病毒和人类乳头状瘤病毒感染。
在hiv感染期间，ctla-4的表达已显示与病毒载量呈正相关，并且ctla-4阻断已被证明可恢复hiv特异性cd4+t细胞的增殖以及ifn-γ和il-2的产量(kaufmann等，natimmunol(2007)8：1246-1252)。阻断ctla-4也会降低hiv特异性cd8+t细胞的tgf-β和il-10的产量，但会增加hiv特异性cd8+t细胞的ifn-γ产量(elrefaei等，plosone(2009)4(12)：e8194)。
慢性病毒感染，例如由lcmv、hcv、hbv和hiv引起的慢性病毒感染通常涉及逃避免疫清除的机制，例如抑制性受体的表达增加。schurich等(2011)53(5)：1494-1503描述了慢性hbv感染患者中cd8t细胞的ctla-4的表达上调，并且这与病毒载量相关。
可以治疗的真菌感染的实例包括链格孢属(alternariasp)、曲霉属真菌(aspergillussp)、假丝酵母属(candidasp)和组织胞浆菌属(histoplasmasp)引起的感染。所述真菌感染可能是真菌性败血症或组织胞浆菌病。已经确定了t细胞衰竭在介导真菌感染中的重要性，例如chang等，criticalcare(2013)17：r85，和lazar-molnar等，pnas(2008)105(7)：2658-2663。
可以治疗的寄生虫感染的实例包括疟原虫物种(例如恶性疟原虫、约氏疟原虫、卵形疟原虫、间日疟原虫或夏氏疟原虫)引起的感染。所述寄生虫感染可以是例如疟疾、利什曼病和弓形虫病的疾病。
癌症
癌症可以是任何有害的细胞增殖(或任何由不需要的细胞增殖表现出来的疾病)、赘生物或肿瘤，或有害的细胞增殖、赘生物或肿瘤的增加风险或倾向。所述癌症可以是良性的或恶性的，可以是原发性的或继发性的(转移性的)。所述赘生物或肿瘤可以是细胞的任何异常生长或增殖，并且可以位于任何组织中。组织的实例包括肾上腺、肾上腺髓质、肛门、阑尾、膀胱、血液、骨、骨髓、脑、乳腺、盲肠、中枢神经系统(包括或不包括脑)、小脑、子宫颈、结肠、十二指肠、子宫内膜、上皮细胞(例如肾上皮细胞)、胆囊、食道、胶质细胞、心脏、回肠、空肠、肾、泪腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴结、淋巴母细胞、上颌骨、纵隔、肠系膜、子宫肌层、鼻咽、网膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周围神经系统、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙状结肠、皮肤、小肠、软组织、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、舌、扁桃体、气管、子宫、外阴、白细胞。
在一些实施方式中，待治疗的癌症可以是选自下组的组织的癌症：结肠、直肠、鼻咽、子宫颈、口咽、胃、肝、头颈、口腔、食道、唇、口腔、舌、扁桃体、鼻子、喉咙、唾液腺、窦、咽、喉、前列腺、肺、膀胱、皮肤、肾、卵巢或间皮。
待治疗的肿瘤可以是神经系统或非神经系统肿瘤。神经系统肿瘤可能起源于中枢神经系统或外周神经系统，例如胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤和少突神经胶质瘤。非神经系统癌症/肿瘤可能起源于任何其他非神经组织，实例包括黑色素瘤、间皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、霍奇金淋巴瘤、慢性粒细胞白血病(cml)、急性髓性白血病(aml)、骨髓增生异常综合征(mds)、皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、肝癌、表皮样癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、nsclc、血液癌和肉瘤。
在具体的实施方式中，所述待治疗的癌症可以是前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌或黑素瘤(例如晚期黑素瘤)。
在一些实施方式中，所述待治疗的癌症可以是结肠癌、大肠癌、结肠直肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、口咽癌、胃癌、肝细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、口腔癌、喉癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、肾细胞癌、卵巢癌或间皮瘤。
过继性t细胞转移疗法
在本发明的实施方式中，治疗或预防的方法可包括免疫细胞的过继细胞转移。过继性t细胞转移疗法通常是指从受试者中取出白细胞(通常通过抽取血液样本，从中分离出白细胞)、在体外或离体扩增并返回到同一受试者或不同的受试者的过程。所述治疗通常旨在增加受试者中所需t细胞群的活性形式的量/浓度。这种治疗对于经历t细胞衰竭的受试者可能是有益的。
能够阻断或逆转t细胞衰竭机制的抗体，提供了增强t细胞活性和促进t细胞扩增的手段。
针对免疫检查点受体(例如ctla-4)的抗体也可用于t细胞扩增的方法中，例如用于扩增特别感兴趣的t细胞群。例如，抗体可用于t细胞扩增的方法中，以优先扩增具有所需特性的t细胞亚群(例如优先于具有不良特性的t细胞亚群)。
因此，在本发明的另一方面，提供了一种扩增t细胞群的方法，其中t细胞在体外或离体与本发明的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽接触。
所述方法可任选地包括以下步骤中的一个或多个：从受试者中取血液样本；从血液样本中分离t细胞；体外或离体培养t细胞(这里它们可以与抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽接触)，收集扩增的t细胞群；将t细胞与佐剂、稀释剂或载体混合；将扩增的t细胞施用于受试者。
因此，在本发明的一些方面，提供了一种治疗患有t细胞功能障碍疾病的受试者的方法，所述方法包括从需要治疗的受试者获得血液样品，在本发明所述的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽的存在下，培养从血液样品中获得的t细胞，以扩增t细胞群，收集扩增的t细胞，并将扩增的t细胞施用于需要治疗的受试者。
所述t细胞可以从需要治疗的受试者获得，并且可以被分离和/或纯化。它们可以是cd4+和/或cd8+t细胞群。所述t细胞可以代表经历t细胞衰竭的群体，并且任选地可以具有上调的ctla-4表达。
在培养期间，t细胞可以在一定条件下与抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽接触一段合适的时间，以使t细胞扩增至所需数量的细胞。在一段合适的时间后，可以收获t细胞，任选地浓缩，并且可以与合适的载体、佐剂或稀释剂混合并返回受试者的身体。受试者可以进行一轮或多轮这样的治疗。
t细胞扩增的方法是本领域熟知的，例如描述于kalamasz等，jimmunother2004年9月-10月；27(5)：405-18；montes等，clinexpimmunol2005年11月；142(2)：292-302；wolfl和greenburg，natureprotocols9p950-9662014年3月27日；trickett和kwan，journalofimmunologicalmethods卷275，issues1-2，2003年4月1日，第251-255页；butler等，plosone7(1)2012年1月12日。
例如，t细胞扩增的方法可包括刺激t细胞。刺激可以包括非特异性刺激，例如通过抗cd3/抗cd28治疗。t细胞的刺激可包括特定刺激，例如通过抗原处理(例如与mhc复合，例如由抗原呈递细胞表达)。t细胞扩增的方法可包括在一种或多种促进t细胞增殖/扩展的因子存在下培养。例如，t细胞扩增的方法可包括在il-2存在下的培养。
在本发明中，可以进行过继细胞转移(act)，以将细胞或细胞群引入受试者，和/或增加受试者中细胞或细胞群的频率。
例如，在kalos和2013年6月，immunity39(1)：49-60中描述t细胞的过继转移，其全部内容通过引用并入本文。例如，nk细胞的过继转移，在davis等，2015，cancerj.21(6)：486-491中描述，其全部内容通过引用并入本文。
所述细胞可以是例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、淋巴细胞或单核细胞。所述淋巴细胞可以是例如t细胞、b细胞、nk细胞、nkt细胞或先天性淋巴细胞(ilc)，或其前体。在一些实施方式中，所述细胞是t细胞。在一些实施方式中，所述t细胞是cd3+t细胞。在一些实施方式中，所述t细胞是cd3+，cd8+t细胞。在一些实施方式中，所述t细胞是细胞毒性t细胞(例如细胞毒性t淋巴细胞(ctl))。在一些实施方式中，所述细胞是病毒特异性t细胞。在一些实施方式中，所述t细胞对ebv、hpv、hbv、hcv或hiv具有特异性。
本发明提供了一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括修饰从受试者获得的至少一个细胞，以表达或包括本发明所述的抗体、抗原结合片段、car、核酸或载体，任选地扩增经修饰的至少一个细胞，并将经修饰的至少一个细胞施用于受试者。
在一些实施方式中，所述方法包括：
(a)从受试者中分离出至少一个细胞；
(b)修饰所述的至少一个细胞，以表达或包括本发明所述的抗体、抗原结合片段、car、核酸或载体，
(c)任选地扩增所述的修饰的至少一个细胞，和；
(d)将所述的修饰的至少一个细胞施用于受试者。
在一些实施方式中，分离细胞的受试者是施用经修饰细胞的受试者(即，过继转移是自体细胞)。在一些实施方式中，分离细胞的受试者是与施用经修饰细胞的受试者不同的受试者(即，过继转移是同种异体细胞)。
本发明所述的修饰至少一个细胞可以根据本领域技术人员熟知的方法进行修饰。所述修饰可以包括核酸转移，用于转移的核酸的永久或瞬时表达。
在一些实施方式中，可另外修饰细胞以包括或表达嵌合抗原受体(car)，或编码car的核酸或载体。
可以使用任何合适的基因工程平台来修饰本发明所述的细胞。修饰细胞的合适的方法包括使用基因工程平台，例如γ逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、dna转染、基于转座子的基因递送和rna转染，例如在maus等，annurevimmunol(2014)32：189-225中所述，在此作为参考引入。
在一些实施方式中，所述方法可包括以下步骤中的一个或多个：从受试者中取血液样品；从血液样品中分离和/或扩增至少一个细胞；体外或离体培养至少至少一种细胞；向所述至少一个细胞中引入本发明所述的抗体、抗原结合片段、car、核酸或载体，从而修饰所述至少一个细胞；扩展至少一个修饰的细胞；收集所述至少一个修饰的细胞；将所述修饰的细胞与佐剂、稀释剂或载体混合；将所述修饰的细胞施用于受试者。
在一些实施方式中，所述方法可另外包括处理细胞以诱导/增强抗体、抗原结合片段、car、核酸或载体的表达。例如，所述核酸/载体可以包括控制元件，用于核酸/载体中抗体、抗原结合片段或car的表达的可诱导的上调，以响应于特定试剂的处理。在一些实施方式中，治疗可以是体内的，通过将药剂施用于受试者，所述受试者已经被施用了本发明所述的经修饰的细胞。在一些实施方式中，治疗可以在离体或体外进行，通过向离体或体外培养的细胞施用所述药剂。
本领域技术人员能够确定用于本发明所述的细胞过继转移的合适的试剂和步骤，例如参考dai等，2016jnatcancerinst108(7)：djv439，其全部内容通过引用并入本文。
在相关方面，本发明提供了一种制备修饰细胞的方法，所述方法包括向细胞中引入本发明所述的抗体、抗原结合片段、car、核酸或载体，从而修饰至少一个细胞。所述方法优选地在体外或离体进行。
在一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者的疾病或症状的方法，包括：
(a)从受试者中分离出至少一个细胞；
(b)将本发明所述的核酸或载体引入所述的至少一个细胞，从而修饰所述的至少一个细胞；和
(c)将所述的修饰的至少一个细胞施用于受试者。
在一些实施方式中，所述细胞可另外被修饰，以引入编码嵌合抗原受体(car)的核酸或载体。
在一些实施方式中，所述方法另外包括治疗性或预防性干预，例如用于治疗或预防癌症。在一些实施方式中，所述治疗性或预防性干预选自化学疗法、免疫疗法、放射疗法、手术、疫苗接种和/或激素疗法。
同时或依次施用
组合物可以单独施用或与其他治疗组合施用，根据待治疗的病症同时或依次地。
在本说明书中，本发明的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽，和抗感染剂或化学治疗剂(治疗剂)可以同时或依次施用。
在一些实施方式中，用本发明的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽作治疗可伴随化学疗法。
同时施用是指将抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽和治疗剂一起施用，例如作为包含两种药剂的药物组合物(组合制剂)，或者在彼此施用之后立即施用，以及任选地通过相同的施用途径施用，例如至同一动脉、静脉或其他血管。
依次给药是指施用抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽或治疗剂之一后，在给定的时间间隔后，单独施用另一种药剂。不要求两种药剂通过相同途径给药，尽管在一些实施方式中是这种情况。所述时间间隔可以是任何时间间隔。
已显示pd-1/pd-l1途径的抑制和ctla-4阻断的组合提供抗肿瘤功效，参见wolchok等，nejm(2013)；369：122-133。因此，在本发明的一个方面，提供了本发明所述的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽，在用于与pd-1/pd-l1途径的抑制剂的组合疗法中的用途。
在一些实施方式中，本发明提供了与pd-1、pd-l1或pd-1/pd-l1途径的抑制剂的组合疗法。在一些实施方式中，所述抑制剂是能够抑制或预防由pd-1和pd-l1之间的相互作用介导的信号传导的药剂。在一些实施方式中，所述抑制剂是能够下调pd-1和/或pd-l1的基因或蛋白质表达的药剂。在一些实施方式中，所述抑制剂是能够抑制或阻止pd-1和pd-l1之间结合的药剂。在一些实施方式中，所述药剂是抗体。在一些实施方式中，所述药剂是能够结合pd-1的抗体。在一些实施方式中，所述药剂是能够结合pd-l1的抗体。所述抗体可以是拮抗剂抗体或阻断抗体。pd-1、pd-l1或pd-1/pd-l1途径的抑制剂是本领域技术人员公知的，包括例如尼沃单抗(nivolumab)、匹利珠单抗(pidilizumab)、bms936559、mpdl328oa、彭布利单抗(pembrolizumab)和巴文西亚(avelumab)。本发明的预期用于pd-1/pdl-1的抑制剂包括在sunshine和taube，“pd-1/pd-l1抑制剂”，curr.opin.pharmacol.2015,23：32-38中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。
抗感染剂
在治疗感染中，本发明的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽可以与抗感染剂组合施用，如上所述。所述抗感染剂可以是已知的能够对抗由微生物或病毒引起的感染的试剂。
合适的抗感染剂包括抗生素(如青霉素、头孢菌素、利福霉素、闰年霉素、喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类、林可酰胺类、四环素类、环脂肽类、甘氨酰环素类、恶唑烷酮类和闰年霉素类)、抗病毒剂(如逆转录酶抑制剂、整合酶抑制剂、转录因子抑制剂、反义和sirna药剂和蛋白酶抑制剂)、抗真菌剂(如多烯类、咪唑类、三唑类、噻唑类、烯丙胺类和棘白菌素类)和抗寄生虫剂(如抗线虫剂、抗绦虫剂、抗吸虫剂、抗变形虫剂和抗原虫剂)。
化学疗法
化学疗法是指用药物或用电离辐射(例如使用x射线或γ射线的放射疗法)治疗癌症。在优选的实施方式中，化学疗法是指用药物治疗。所述药物可以是化学实体，例如小分子药物、抗生素、dna嵌入剂、蛋白质抑制剂(例如激酶抑制剂)或生物制剂、例如抗体、抗体片段、核酸或肽适体、核酸(例如dna、rna)、肽、多肽或蛋白质。所述药物可以配制成药物组合物或药物。制剂可包含一种或多种药物(例如一种或多种活性剂)以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。
治疗可包括施用一种以上的药物。药物可以单独施用或与其他治疗组合施用，根据待治疗的病症，决定同时或依次地施用。例如，所述化学疗法可以是涉及施用两种药物的共同疗法，其中一种或多种可以用于治疗癌症。
所述化学疗法可以通过一种或多种给药途径给药，例如肠胃外、静脉注射、口服、皮下、皮内或瘤内。
可以根据治疗方案施用化学疗法。所述治疗方案可以是化学疗法给药的预定时间表、计划、方案或安排，其可以由内科医生或执业医师准备并且可以定制以适合需要治疗的患者。
所述治疗方案可以指示以下中的一种或多种：给予患者的化学疗法类型；每种药物或辐射的剂量；各施用之间的时间间隔；每次治疗的时间长短；任何治疗期的数量和性质，如果有的话，等等。对于联合治疗，可以提供单一治疗方案，其指示每种药物的施用方式。
化学治疗药物和生物制剂可选自：烷化剂，例如顺铂、卡铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；嘌呤或嘧啶抗代谢物，如硫唑嘌呤或巯基嘌呤；生物碱和萜类化合物，例如长春花生物碱(例如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛)、鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉类如紫杉醇(紫杉酚tm)、多西他赛；拓扑异构酶抑制剂如i型拓扑异构酶抑制剂喜树碱伊立替康和拓扑替康，或ii型拓扑异构酶抑制剂安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类抗生素)，例如放线菌素、多柔比星(阿霉素tm)、表柔比星、博来霉素、雷帕霉素；基于抗体的药物，如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗tim-3抗体、抗ctla-4、抗4-1bb、抗gitr、抗cd27、抗blta、抗ox43、抗vegf、抗tnfα、抗il-2、抗gpllb/llla、抗cd-52、抗cd20、抗rsv、抗her2/neu(erbb2)、抗tnf受体、抗egfr抗体、单克隆抗体或抗体片段，实例包括：西妥昔单抗，帕尼单抗，英夫利昔单抗，巴利昔单抗，贝伐单抗
在一个实施方式中，化学治疗剂是抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗tim-3抗体、抗lag-3、抗-41bb、抗-gitr、抗-cd27、抗-blta、抗-0x43、抗-vegf、抗-tnfα、抗-il2、抗-gpllb/llla、抗cd-52、抗-cd20、抗rsv、抗her2/neu(erbb2)、抗tnf受体、抗egfr或其他抗体。在一些实施方式中，所述化学治疗剂是免疫检查点抑制剂或共刺激分子。
其他化学治疗药物可选自：13-顺式维甲酸、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、白蛋白结合型紫杉醇、
给药途径
本发明各方面所述的抗体、抗原结合片段、car、细胞、多肽和其他治疗剂、药物和药物组合物可以被配制用于通过多种途径的给药，包括但不限于肠胃外、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、皮内、瘤内和口腔。抗体、抗原结合片段、car、细胞、多肽和其他治疗剂可以以流体或固体形式配制。流体制剂可被配制以用于通过注射施用于人体或动物体的选定区域。
剂量方案
可以提供多种剂量的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽。一个或多个或每个剂量可以伴随另一种治疗剂的同时或依次给药。
多种剂量可以以预定的时间间隔分开，可以选择为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天中的一个，或1、2、3、4、5或6个月。举例来说，可以每7、14、21或28天(加或减3天、2天或1天)给予一次剂量。
试剂盒
在本发明的一些方面，提供了一套试剂盒。在一些实施方式中，所述试剂盒可具有至少一个容器，所述容器中具有预定量的抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽。所述试剂盒可以以药物或药物组合物的形式提供抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽，并且可以与施用于患者的说明书一起提供，以治疗特定的疾病或病症。所述抗体、抗原结合片段、car、细胞或多肽可以被配制，以便适合注射或输注到肿瘤或血液中。
在一些实施方式中，所述试剂盒可以进一步包括至少一个容器，所述容器具有预定量的另一种治疗剂(例如抗感染剂或化疗剂)。在这样的实施方式中，所述试剂盒还可包含第二药物或药物组合物，使得两种药物或药物组合物可以同时或分开给药，因此它们为特定疾病或病症提供综合治疗。治疗剂还可以被配制以适合注射或输注到肿瘤或血液中。
受试者
待治疗的受试者可以是任何动物或人。所述受试者优选是哺乳动物，更优选地是人。所述受试者可以是非人哺乳动物，但更优选是人。所述受试者可以是男性或女性。所述受试者可以是患者。所述受试者可能已被诊断患有需要治疗的疾病或病症，或疑似患有此类疾病或病症。
蛋白质表达
适用于在细胞中产生本发明所述的多肽的分子生物学技术是本领域熟知的，例如sambrook等，分子克隆：实验室手册，纽约：冷泉港出版社，1989年。
所述多肽可以从核苷酸序列表达。所述核苷酸序列可以包含在细胞中存在的载体中，或者可以引入细胞的基因组中。
如本文所用的“载体”是用作载体以将外源遗传物质转移到细胞中的寡核苷酸分子(dna或rna)。所述载体可以是用于在细胞中表达遗传物质的表达载体。此类载体可包括与编码待表达基因序列的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。载体还可包括终止密码子和表达增强子。本领域已知的任何合适的载体、启动子、增强子和终止密码子可用于从本发明所述的载体以表达多肽。合适的载体包括质粒、二元载体、病毒载体和人工染色体(例如酵母人工染色体)。
在本说明书中，术语“可操作地连接”可以包括这样的情况，即，选择的核苷酸序列和调节核苷酸序列(例如启动子和/或增强子)共价连接，以这样一种方式将核苷酸序列的表达置于调节序列影响或控制之下(从而形成表达盒)。因此，如果调节序列能够影响核苷酸序列的转录，则调节序列与所选择的核苷酸序列可操作地连接。在适当的情况下，然后可以将得到的转录物翻译成所需的蛋白质或多肽。
适合于表达多肽的任何细胞可用于生产本发明所述的肽。所述细胞可以是原核生物或真核生物。合适的原核细胞包括大肠杆菌。真核细胞的实例包括酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一些情况下，所述细胞不是原核细胞，因为一些原核细胞不允许与真核生物相同的翻译后修饰。并且，真核生物中可能具有非常高的表达水平，并且使用适当的标签可以更容易地从真核生物中纯化蛋白质。还可以使用特异性质粒，其增强蛋白质分泌到培养基中。
产生目的多肽的方法可以包括培养或发酵经修饰以表达多肽的细胞。所述培养或发酵可以在生物反应器中进行，所述生物反应器具有适当的营养物、空气/氧气和/或生长因子的供应。分泌的蛋白质可以通过从细胞中分离培养基/发酵液、提取蛋白质成分、分离单个蛋白质来收集，以分离分泌的多肽。培养、发酵和分离技术是本领域技术人员所熟知的。
生物反应器包括一个或多个可以培养细胞的容器。生物反应器中的培养可以连续发生，反应物连续流入以及来自反应器的培养细胞的连续流动。或者，培养可以分批进行。所述生物反应器监测和控制环境条件，例如ph、氧气、流入和流出的流速，以及容器内的搅拌，从而为培养的细胞提供最佳条件。
在培养表达目的多肽的细胞后，优选地分离该多肽。本领域已知的细胞培养物中分离多肽/蛋白质的任何合适方法可以被使用。为了从培养物中分离目标多肽/蛋白质，可能需要首先将培养的细胞与含有目的多肽/蛋白质的培养基分离。如果感兴趣的多肽/蛋白质是从细胞分泌的，则可以通过离心将细胞与含有分泌的多肽/蛋白质的培养基分离。如果感兴趣的多肽/蛋白质聚集在细胞内，则必须在离心之前裂解细胞，例如使用超声处理、快速冻融或渗透裂解。离心将产生含有培养细胞的沉淀或培养的细胞的细胞碎片，以及含有培养基和目的多肽/蛋白质的上清液。
然后可能需要从上清液或培养基中分离目的多肽/蛋白质，其可能含有其他蛋白质和非蛋白质组分。从上清液或培养基中分离多肽/蛋白质组分的常用方法是通过沉淀。不同溶解度的多肽/蛋白质在不同浓度的沉淀剂如硫酸铵中沉淀。例如，在低浓度的沉淀剂下，提取水溶性蛋白质。因此，通过加入增加浓度的沉淀剂，可以区分不同溶解度的蛋白质。随后可以使用透析从分离的蛋白质中除去硫酸铵。
用于区分不同多肽/蛋白质的其他方法是本领域已知的，例如离子交换色谱法和分子筛色谱法。这些可以用作沉淀的替代方法，或者可以在沉淀之后进行。
一旦从培养物中分离出目的多肽/蛋白质，就可能需要浓缩蛋白质。许多浓缩目的蛋白质的方法是本领域已知的，例如超滤或冷冻干燥。
序列同一性
用于确定氨基酸或核苷酸序列同一性百分比的比对可以以本领域技术人员已知的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如clustalw1.82、t-coffee或megalign(dnastar)软件。使用此类软件时，优选使用默认参数，例如间隙罚分和延伸罚分。clustalw1.82的默认参数是：蛋白质间隙开放罚分＝10.0，蛋白质间隙延伸罚分＝0.2，蛋白质矩阵＝gonnet，蛋白质/dnaendgap＝-1，蛋白质/dnagapdist＝4。
本发明包括所描述的方面和优选特征的组合，除非这样的组合是明显不允许或明确避免的。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为限制所描述的主题。
现在将参考附图通过示例来说明本发明的方面和实施例。其它方面和实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。本文中提及的所有文件通过引用并入本文。
在整个说明书(包括所附权利要求书)中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及其变体例如“包含(comprises)”和“包括有(comprises)”将被理解为暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤，或整数或步骤组。
必须指出，如说明书所使用的，除非上下文清楚地指出，否则在所附的权利要求书中，单数形式“一”、“一个”，和“该”包括复数形式。本发明的范围可以用“约”某个特定值，和/或另一个特定值“左右”来表示。表示这样的范围时，另一个例子，包括从一个特定的值和/或其他特定值。同样，当值表示为近似值时，通过使用先行词“约”，可以理解，该特定值形成另一个例子。
以下编号的段落(段)描述了本发明的特定的方面和实施方式：
1.一种治疗癌症的方法，包括将抗体或抗原结合片段施用于患有癌症的患者，其中所述抗体或抗原结合片段与ctla-4结合，并且包括：
至少一个包含以下cdr的轻链可变区：
lc-cdr1：ratqgisswla(seqidno:5)
lc-cdr2:aasslqs(seqidno:6)
lc-cdr3:qqantlplft(seqidno:7)；和
至少一个包含以下cdr的重链可变区：
hc-cdr1：sntaawn(seqidno:8)
hc-cdr2：rtyyrskwysdyglsvks(seqidno:9)；
hc-cdr3：egsggtliy(seqidno:10)。
2.如段1所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括与seqidno：3或4的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性的重链可变区序列，和与seqidno：1或2的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性的轻链可变区序列。
3.如段1所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含seqidno：3或4的氨基酸序列的重链可变区，和包含seqidno：1或2的氨基酸序列的轻链可变区。
4.如段1所述的方法，其中所述癌症可以是选自下组的组织的癌症：结肠、直肠、鼻咽、子宫颈、口咽、胃、肝、头颈、口腔、食道、唇、口腔、舌、扁桃体、鼻子、喉咙、唾液腺、窦、咽、喉、前列腺、肺、膀胱、皮肤、肾、卵巢或间皮，或所述癌症选自下组：直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、口咽癌、胃癌、肝细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、口腔癌、喉癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、肾细胞癌、卵巢癌或间皮瘤。
5.如段1所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段静脉内施用。
6.如段1所述的方法，其中所述抗体包括选自igg1、igg2、igg3和igg4的人恒定区。
7.如段1所述的方法，其中所述抗原结合片段是fab片段或scfv片段。
8.如段1所述的方法，其中所述抗原结合片段包括在嵌合抗原受体(car)中。
9.一种治疗癌症的方法，包括将抗体或抗原结合片段施用于患有癌症的患者，其中所述抗体或抗原结合片段与ctla-4结合，并且包括：
包括seqidno：3或4的氨基酸序列的重链可变区，和
包括seqidno：1或2的氨基酸序列的轻链可变区。
10.如段9所述的方法，其中所述癌症可以是选自下组的组织的癌症：结肠、直肠、鼻咽、子宫颈、口咽、胃、肝、头颈、口腔、食道、唇、口腔、舌、扁桃体、鼻子、喉咙、唾液腺、窦、咽、喉、前列腺、肺、膀胱、皮肤、肾、卵巢或间皮，或所述癌症选自下组：直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、口咽癌、胃癌、肝细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、口腔癌、喉癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、肾细胞癌、卵巢癌或间皮瘤。
11.如段9所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段静脉内施用。
12.如段9所述的方法，其中所述抗体包括选自igg1、igg2、igg3和igg4的人恒定区。
13.如段9所述的方法，其中所述抗原结合片段是fab片段或scfv片段。
14.如段9所述的方法，其中所述抗原结合片段包括在嵌合抗原受体(car)中。
15.一种治疗受试者的癌症的方法，包括：
在抗体或抗原结合片段存在下，培养从患有癌症的受试者的血液样品中获得t细胞以扩增t细胞群，所述抗体或抗原结合片段与ctla-4结合；和
将扩增的t细胞群施用于受试者；
其中结合ctla-4的抗体或抗原结合片段包括：至少一个包含以下cdr的轻链可变区：
lc-cdr1：ratqgisswla(seqidno:5)
lc-cdr2:aasslqs(seqidno:6)
lc-cdr3:qqantlplft(seqidno:7)；和
至少一个包含以下cdr的重链可变区：
hc-cdr1：sntaawn(seqidno:8)
hc-cdr2：rtyyrskwysdyglsvks(seqidno:9)；
hc-cdr3：egsggtliy(seqidno:10)。
16.如段15所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括包含seqidno：3或4的氨基酸序列的重链可变区序列，和包含seqidno：1或2的氨基酸序列的轻链可变区序列。
17.如段15所述的方法，其中所述癌症可以是选自下组的组织的癌症：结肠、直肠、鼻咽、子宫颈、口咽、胃、肝、头颈、口腔、食道、唇、口腔、舌、扁桃体、鼻子、喉咙、唾液腺、窦、咽、喉、前列腺、肺、膀胱、皮肤、肾、卵巢或间皮，或所述癌症选自下组：直肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、鼻咽癌、宫颈癌、口咽癌、胃癌、肝细胞癌、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌(hnscc)、口腔癌、喉癌、前列腺癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、晚期黑色素瘤、肾细胞癌、卵巢癌或间皮瘤。
18.如段15所述的方法，其中所述抗体包括选自igg1、igg2、igg3和igg4的人恒定区。
19.如段15所述的方法，其中所述抗原结合片段是fab片段或scfv片段。
20.如段15所述的方法，其中所述抗原结合片段包括在嵌合抗原受体(car)中。
附图简要说明
现在将参考附图来讨论说明本发明的原理的实施例和实验，其中：
图1.抗ctla-4抗体克隆2c8和2c8_g1的轻链可变结构域序列。cdr加下划线并单独显示。
图2.抗ctla-4抗体克隆2c8和2c8_g1的重链可变结构域序列。cdr加下划线并单独显示。
图3.抗ctla-4抗体克隆2c8和2c8_g1的重链和轻链可变结构域序列的核苷酸和编码的氨基酸序列。
图4.显示生物淘选后抗人ctla-4的筛选的条形图。将fab与人ctla-4混合，并通过elisa分析与cd80的结合。箭头表示克隆2c8，其被鉴定为ctla-4与cd80结合的有效阻断剂。
图5.显示2c8fab与人ctla-4结合的elisa分析结果的图。
图6.显示通过2c8fab阻断ctla-4与cd80结合的elisa分析结果的图。
图7.显示2c8igg与鼠ctla-4结合的elisa分析结果的图。
图8.显示2c8与人cd28结合的elisa分析结果的图。
图9.显示2c8与人ctla-4结合的结合亲和力的elisa分析结果的图。所示为2次独立实验的平均吸光度±sd，两次均做两个相同实验。
图10.显示2c8与人ctla-4结合的亲合性(avidity)的elisa分析结果的图。
图11.显示ctla-4诱导的cd80激活抑制后，2c8恢复t细胞活性的图表。所示为2次独立实验中各自的两个相同实验的吸光度测量的平均值，对应于上清液中的il-2浓度。
图12.显示ctla-4诱导的cd86激活抑制后，2c8恢复t细胞活性的图表。所示为2次独立实验中各自的两个相同实验的吸光度测量的平均值，对应于上清液中的il-2浓度。
图13.显示在结肠癌的mc38肿瘤生长小鼠模型中体内2c8的抗肿瘤活性的分析结果的图表。(a)和(b)显示了两个独立实验的结果。
图14.显示2c8与食蟹猕猴/恒河猴ctla-4的结合的图表。
图15.显示对小鼠ctla-4的结合亲和力的图表。所示为igg1形式的2c8、2c8g1和具有lala突变的2c8，lgg4形式的2c8、伊匹单抗(人抗huctla-4)的igg1和igg1同种型对照的平均吸光度±sd，一式两份。
图16.显示对小鼠ctla-4的结合亲合性(avidity)的图表。所示为igg1形式的2c8、2c8g1和具有lala突变的2c8，lgg4形式的2c8、伊匹单抗(已知不与小鼠ctla-4交叉反应的抗huctla-4)的igg1和igg1同种型对照的平均吸光度±sd，一式两份。
图17.显示2c8与人ctla-4转染的hek-293.6e细胞的结合的图表。所示为两次相同实验的平均荧光强度±sd的平均值。
图18.显示2c8与鼠ctla-4转染的hek-293.6e细胞的结合的图表。所示为两次相同实验的平均荧光强度±sd的平均值。
图19a至19d。显示ctla-4诱导的激活抑制后，2c8或其衍生的抗体恢复t细胞活性的图表。所示为的4个独立实验(a至d)中各自的两次相同实验中分泌的il-2的平均值±sd，伊匹单抗为阳性对照以及igg1同种型对照。
实施例
本发明人在以下实施例中描述了抗ctla-4抗体的分离和表征，其显示与人和小鼠ctla-4结合、不与人cd28结合、能够阻断ctla-4与cd80的相互作用、抑制ctla-4/cd80和ctla-4/cd86信号传导，并在体内显示抗癌活性。
实施例1：抗人ctla-4抗体克隆2c8的分离
通过体外选择从人抗体噬菌体展示文库中分离抗ctla-4抗体。在阻断elisa中，根据抗体阻断ctla-4与其配体结合的能力筛选抗体。在测试的384个克隆中，克隆2c8是唯一显示出对ctla-4结合有显著抑制的克隆(图4)。
实施例2：2c8与人ctla-4结合的分析
通过elisa分析2c8与人ctla-4的结合。将人ctla-4包被在elisa板上，并加入各种浓度的2c8fab或阴性对照fab。结果如图5所示。2c8显示出以剂量依赖性方式与人ctla-4强烈结合的能力。
实施例3：人ctla-4与cd80相互作用阻断的分析
通过elisa分析2c8抑制ctla-4与其配体cd80结合的能力。简而言之，将cd80包被在elisa板上。将2c8、阴性对照fab或l3d10(商业小鼠抗人ctla-4igg1)与人ctla-4预温育，然后加入elisa板。通过elisa测定ctla-4与cd80的结合。
结果如图3所示。显示2c8阻断ctla-4和cd80之间的相互作用。
实施例4：改造2c8至2c8_gl
抗体克隆2c8被表达为人igg1。对2c8可变结构域的框架区进行工程改造以恢复为种系样免疫球蛋白，并将改造的克隆命名为2c8_g1。
实施例5：物种交叉反应分析
通过elisa分析2c8识别小鼠ctla-4的能力。将2c8igg，2c8_g1igg和商业大鼠抗小鼠ctla-4igg包被到elisa板中。将小鼠ctla-4生物素化，然后以各种浓度加入elisa板中。使用链霉亲和素-hrp检测小鼠ctla-4与抗体的结合。
结果如图7所示。2c8显示能够识别小鼠ctla-4，并且具有比商业阳性对照高得多的效率。种系恢复工程不影响抗体的结合能力，因为2c8_g1显示出与2c8相同的结合特征(图7)。
实施例6：跨物种反应性分析：与食蟹猴和恒河猴ctla-4的结合
用食蟹猴/恒河猴ctla-4进行类似的elisa。ipilliumab被用作阳性对照。2c8显著食蟹猴/恒河猴ctla-4(图14)。
实施例7：与cd28的交叉反应性分析
ctla-4与cd28共享其配体。cd28在与cd80和cd86结合后向t细胞传递刺激信号，但同时ctla-4发送抑制信号。通过elisa研究2c8与cd28的结合。将与人fc偶联的人cd28包被在elisa板上，并加入各种浓度的抗ctla-4或阴性对照抗体。
结果如图8所示。与商业大鼠抗小鼠ctla-4igg不同，即使在高浓度的抗体下，2c8也完全不显示与cd28的结合(图5)。特别地，2c8与cd28显示出比l3d10更弱的结合。
实施例8：2c8与ctla-4结合的亲和力分析
通过elisa测量抗体2c8与ctla-4的结合亲和力。将抗体包被在平板上，并加入不同浓度的人ctla-4。绘制剂量响应曲线(参见图9)并计算有效浓度50％(ec50)。在该测定中，2c8显示平均ec50为5.0nm(来自2个独立实验)。
类似地测量对小鼠ctla-4的结合亲和力并推算小鼠ctla-4的ec50；2c8igg1显示ec50为9.6nm(2c8_g1igg1为23.5nm，具有lala突变的2c8igg1为5.1nm，2c8igg4为7.0nm)(图15)。“lala”突变是指fc区的位置234和234处的亮氨酸残基突变为丙氨酸(即l234a，l235a)；已知该突变会减弱fc和fc-γr之间的相互作用，从而抑制adcc活性(参见例如hezareh等，jvirol(2001)75(24)：12161-12168)。
还通过表面等离子体共振(spr)分析测量2c8与人ctla-4结合的亲和力。将抗体固定在生物传感器芯片上，使人ctla-4以不同浓度流过，并测量响应。在该测定中，2c8显示结合亲和力(kd)为9.6nm。
实施例9：2c8与ctla-4结合的亲合性(avidity)分析
通过elisa分析2c8与人ctla-4的结合亲合性(avidity)。简而言之，将人ctla-4包被在elisa板上，并将抗人ctla-4抗体以各种浓度加入elisa板中。绘制响应曲线(参见图10)，并计算ec50。独立测定中2c8的平均ec50为63.6pm。
类似地通过elisa测量小鼠ctla-4的亲合性(avidity)(图16)。对于小鼠蛋白，2c8igg1的ec50为4.9nm(2c8_g1igg1为77.1nm；具有lala突变的2c8igg1为8.0nm；2c8igg4为20.9nm)。
实施例10：与细胞表面表达的ctla-4结合的分析
用人或小鼠ctla-4转染hek-293.6e细胞。然后在2c8或同种型对照的存在下孵育过表达细胞，并通过流式细胞术测量抗体与细胞的结合。
在这些测定中，2c8能够有效地结合细胞表面表达的人ctla-4(图17)或小鼠ctla-4(图18)。
实施例11：抗ctla-4抗体2c8的体外活性分析
进行t细胞再激活测定以分析抗体的活性。在该测定中，用植物血凝素和cd80或cd86刺激jurkatt细胞。在这种处理后，细胞分泌il-2。ctla-4的添加抑制刺激和il-2的分泌。通过elisa测量在抗ctla-4和对照抗体存在下的细胞活化水平，即il-2的分泌(图11)。在再激活测定中，使用伊匹单抗(购自
在通过cd80(图11)或通过cd86(图12)刺激和用ctla-4抑制后，2c8能够以剂量依赖性方式恢复jurkatt细胞分泌il-2。
该测定重复数次并始终显示2c8和衍生抗体抑制ctla-4介导的抑制的能力(图19)。在这些测定中，2c8的ec50显示为0.6-2.0nm，与伊匹单抗(ec50显示为0.5-1.4nm)非常相似。lala突变不影响抗体的效力，因为2c8突变的ec50显示在0.7和1.2nm之间。抗体的种系形式在一个实验中显示出更高的ec50(5.6nm)和相当的ec50(1.1nm)，这可能不显著。
实施例12：抗ctla-4抗体2c8的体内活性分析
还使用结肠癌mc38细胞在肿瘤生长的小鼠模型体内测试2c8的活性。在第0天，用2×106个mc38细胞皮下接种小鼠。从第8天开始，给小鼠腹膜内注射5倍剂量(每只动物200μg)的2c8igg1或igg1同种型对照抗体。在整个实验过程中测量肿瘤大小。
两个独立实验的结果显示在图13a和13b中。结果显示2c8对控制肿瘤生长是有效的。
序列表
<110>新加坡科技研究局
<120>抗ctla-4抗体
<130>ric/fp7253289
<140>10201603721t
<141>2016-05-10
<160>14
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