人源化抗claudin-1抗体及其用途的制作方法
本发明涉及人源化抗claudin-1抗体及其用途，尤其用于预防和治疗丙肝病毒感染、病毒相关性肝病与肝细胞癌。
背景技术：
慢性丙肝病毒(hcv)感染是全世界肝硬化和肝细胞癌(hcc)的主要原因。虽然最近批准的新型直接作用抗病毒药物(daa)已经彻底改变了hcv治疗，但并非所有患者群体都对治疗有反应。特别是，基因型3hcv对daa的反应很差，并且与脂肪变性相关且快速进展为晚期肝病(1)。选择daa抗性hcv变体也可以引起治疗失败，因为当前daa的靶标由高度可变的病毒基因组编码。daa预防肝移植再感染的能力仍有待确定(4)。此外，daa的极高成本阻碍了大多数患者获得治疗，特别是在发展中国家，但也在高资源环境中。
宿主靶向剂(hta)为抗病毒疗法提供了有吸引力的补充方法。在这种情况下，hcv的进入(一个复杂且高度协调的过程)提供了许多抗病毒靶标，具有hta阻断进入可以预防肝移植再感染这一明显优势。此外，由于这些分子的靶标由宿主细胞基因组编码，因此对抗性具有更高的遗传屏障。hcv需要几种宿主因子来建立感染，包括分化簇81(cd81)(5)、清除剂受体bi(sr-bi)(6)、claudin-1(cldn1)(7)、occludin(8)、受体酪氨酸激酶(9)、niemann-pickc1样1(npc1l1)(10)、harvey大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(hras)(11)和转铁蛋白受体1(12)。由于这些宿主因子对于hcv进入是必需的并且有助于持久性，因此它们也是开发广谱且有效的抗hcv剂的有吸引力的靶标。实际上，已经表明靶向cd81(13-16)、sr-b1(17-19)和cldn1(20,21)的抗体在体外和体内有效地且泛基因型地抑制hcv感染，以及靶向egfr(9)、npc1l1(10)和hras(11)的小分子同样表现出抗hcv活性。重要的是，hta与daa协同作用(22)，并已被证明可以防止出现daa抗性变体(23)，这对于联合治疗用途是有吸引力的特征。
发明人先前报道了使用hcv假颗粒(hcvpp)和细胞培养物衍生的hcv(hcvcc)模型系统，用肝癌细胞和原代人肝细胞(phh)制备了在体外具有强大抗hcv活性的大鼠抗cldn1单克隆抗体(mab)(20、24和wo2010034812)。这些抗体通过破坏cd81-cldn1共受体复合物的形成来抑制hcv进入。此外，他们最近报道在人肝嵌合upascid小鼠中，最重要的大鼠抗cldn1单克隆抗体(om-7d3-b3)预防新生hcv感染并清除慢性hcv感染，而不会诱导任何毒性(21)。鉴于这些最有希望的发现，该抗体的人源化是其临床开发的下一步。
发明简述
本发明涉及人源化抗claudin-1抗体及其用途，尤其用于治疗丙肝病毒感染。具体地，本发明由权利要求所限定。
发明详述
丙肝病毒感染是慢性肝病的主要原因，也是肝移植的主要指征。虽然直接作用抗病毒药物(daa)可有效治愈慢性hcv感染，但治疗失败的患者仍需要替代策略。此外，daa预防肝移植再感染的能力仍在临床研究中。由于其泛基因型效应和对抗性的高遗传屏障，宿主靶向剂是daa的有力替代物。紧密连接蛋白claudin-1(cldn1)是hcv必需的进入因子，并且是治疗的有希望的靶标。本发明人最近描述了通过遗传免疫产生的大鼠抗cldn1抗体，其不仅可以预防hcv感染，还可以治愈慢性感染的人肝嵌合小鼠。为了进一步进行其临床开发，发明人现已将这种抗体人源化。最重要的人源化抗cldn1抗体(h3l3)泛基因型地抑制了原代人肝细胞(phh)的hcv假颗粒感染而没有可检测的逃逸，可能是由于phh中其他claudin亚型的表达水平低。h3l3有效抑制了多种hcv基因型3菌株的感染，并显示出与daa的显著协同作用。最后，发明人证明抗cldn1h3l3在单一疗法中治愈了人肝嵌合upa-scid小鼠中的持久性hcv感染。该研究为旨在进一步开发抗cldn1抗体用于预防和治愈hcv感染的临床前和临床研究铺平了道路。
因此，本发明的第一个方面提供抗claudin-1人源化抗体。
如本文所用，术语“claudin-1”或“cldn1”具有其在本领域中的一般含义，并且是指与紧密连接claudin-1相关的整合的膜蛋白。首先从分离的鸡肝连接部分鉴定了22-kd多肽的cldn1，并克隆编码其小鼠同源物的cdna(furuse等，1998)。克隆并测序cldn1的人cdna(别名＝semp1)(swisshelm等，1999)。它包含四个外显子，包括636个核苷酸。翻译产生211个氨基酸残基的产物。cldn1具有四跨膜拓扑结构，具有四个跨膜区。在细胞内，cldn1表现出7个氨基酸的n-末端、12个氨基酸的环和27个氨基酸的c-末端。细胞外环(ecl)1由53个氨基酸组成，具有两个保守的半胱氨酸。ecl2具有27个氨基酸。术语“人clau-1或人cldn1”是指具有ncbi登录号np_066924中所示序列的蛋白质，或任何天然存在的变体。术语claudin-1的“细胞外结构域”或“胞外域”是指延伸到细胞外空间(即细胞外的空间)的claudin-1序列的区域。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同含义，并且将在本发明中同等使用。本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语抗体不仅包括完整抗体分子，还包括抗体片段以及抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。在天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。有两种类型的轻链，lambda(1)和kappa(k)。有五种主要的重链类型(或同种型)，其决定了抗体分子的功能活性：igm、igd、igg、iga和ige。每条链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，可变结构域(vl)和恒定结构域(cl)。重链包括四个结构域，可变结构域(vh)和三个恒定结构域(ch1、ch2和ch3，统称为ch)。轻链(vl)和重链(vh)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(cl)和重链(ch)的恒定区结构域赋予重要的生物学特性，例如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动、补体结合和与fc受体(fcr)的结合。fv片段是免疫球蛋白fab片段的n-末端部分，由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(cdr)的残基组成。偶尔，来自非高变区或框架区(fr)的残基可参与抗体结合位点或影响整个结构域结构，并因此影响结合位点。互补决定区或cdr是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个cdr，分别称为l-cdr1、l-cdr2、l-cdr3和h-cdr1、h-cdr2、h-cdr3。因此，抗原结合位点通常包括六个cdr，其包含来自每一个重链和轻链v区的cdr组。框架区(fr)是指插入cdr之间的氨基酸序列。抗体可变结构域中的残基通常根据kabat等设计的系统编号。该系统如kabat等，1987，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，usdepartmentofhealthandhumanservices，nih，usa(以下称“kabat等”)所述。本说明书使用该编号系统。kabat残基名称并不总是与seqid序列中氨基酸残基的线性编号直接对应。实际的线性氨基酸序列可含有比严格kabat编号更少或更多的氨基酸，其对应于基本可变域结构的框架区或互补决定区(cdr)中结构组分的缩短或插入。通过将抗体序列中的同源残基与“标准”kabat编号的序列比对，可以确定给定抗体的残基的正确kabat编号。根据kabat编号系统，重链可变结构域的cdr位于残基31-35b(h-cdr1)、残基50-65(h-cdr2)和残基95-102(h-cdr3)。根据kabat编号系统，轻链可变结构域的cdr位于残基24-34(l-cdr1)、残基50-56(l-cdr2)和残基89-97(l-cdr3)。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指嵌合抗体，其包含来自非人高变区的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基。特别地，人源化抗体将包含基本上至少一个，通常两个可变结构域的全部，其中所有或基本上所有cdr对应于非人抗体的cdr，并且所有或基本上所有fr对应于人抗体的fr。人源化抗体任选地可以包含至少一部分衍生自人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经历人源化的抗体。
因此，本发明的第一个方面涉及人源化抗体，其包含a)至少一条由seqidno：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(vh)，或b)至少一条由seqidno：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(vl)，或c)至少一条由seqidno：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(vh)和至少一条由seqidno：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(vl)。
seqidno:1:人源化可变重链h3
qvqlvesgggvvqpgrslrlsclgsgfsfssygmnwvrqapgkglewvasispsgsyfyyadsvkgrftisrdnskntlylqmtslraedtaiyycarlpgfnppfdhwgqgtlvtvss
seqidno:2:人源化可变轻链l3
diqmtqspsslsasvgdrvtitckasqnvggnvdwyqwkpgkapklliygasnrytgvpdrfrgsgsgtdftltisslqpedvatyyclqyknnpwtfgggtkveik
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体包含a)两条由seqidno：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(vh)，或b)两条由seqidno：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(vl)，或c)两条由seqidno：1的氨基酸序列组成的抗体可变重链(vh)和两条由seqidno：2的氨基酸序列组成的抗体可变轻链(vl)。
根据本发明，本发明的人源化抗体是单克隆抗体。本文所用的术语“单克隆抗体”、“单克隆ab”、“单克隆抗体组合物”、“mab”等是指单个分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
本发明的人源化抗体可以通过上述方面的一个或多个功能性或结构性特征来表征，或通过选择的功能性和结构性特征的任何组合来表征。
本发明的人源化抗体可以是任何同种型。通常由期望的效应子功能(例如adcc诱导)指导同种型的选择。示例性同种型是igg1、igg2、igg3和igg4。可以使用人轻链恒定区中的任一个，κ或λ。如果需要，可以通过已知方法转换本发明的人源化抗体的类别。通常，类别转换技术可用于将一个igg亚类转换成另一个，例如从igg1转变为igg2。因此，本发明的人源化抗体的效应子功能可以通过同种型转换为例如igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm抗体来改变，以用于各种治疗用途。在一些实施方案中，本发明的人源化抗体是全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体是igg1抗体。在一些实施方案中，全长抗体是igg4抗体。在一些实施方案中，cldn1特异性igg4抗体是稳定化的igg4抗体。合适的稳定化的igg4抗体的实例是如以上kabat等的eu索引中所述的其中人igg4的重链恒定区中第409位的精氨酸被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸，优选赖氨酸所取代的抗体(描述于wo2006033386)和/或其中铰链区包含cys-pro-pro-cys序列的抗体。其他合适的稳定化的igg4抗体公开在其全文通过引用并入本文的wo2008145142中。在一些实施方案中，本发明的人源化抗体是非igg4型抗体，例如igg1、igg2或igg3，其已经被突变以使得介导效应子功能(例如adcc)的能力已经降低或甚至消除。这种突变描述于例如dall'acquawf等,jimmunol.177(2):1129-1138(2006)和hezarehm,jvirol.75(24):12161-12168(2001)。
在一些实施方案中，可以将在框架或cdr区内进行的修饰工程化以改变抗体的一种或多种功能特性。例如，应当理解，可以使用本领域已知的任何合适的方法改变本发明提供的抗体的亲和力。因此，本发明还涉及本发明的抗体分子的变体，其对cldn1具有改进的亲和力。用于抗体亲和力成熟的许多方法是本领域已知的，包括突变cdr(yang等,j.mol.biol.,254,392-403,1995)、链改组(marks等,bio/technology,10,779-783,1992)、使用大肠杆菌的突变菌株(lowetal.,j.mol.biol.,250,359-368,1996)、dna改组(patten等,curr.opin.biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(thompson等,j.mol.biol.,256,77-88,1996)和pcr(crameri等,nature,391,288-291,1998)。例如，噬菌体展示技术可用于增加所公开抗体的亲和力。该技术可用于获得可用于组合方法的高亲和力抗体。这种被称为亲和力成熟的技术采用诱变或cdr步移并使用此类受体或配体(或其细胞外结构域)或其抗原性片段进行重新选择，以鉴定与初始或亲本抗体相比结合时对抗原具有更高亲和力的抗体(参见例如glaser,s.m.等(1992)“antibodyengineeringbycodon-basedmutagenesisinafilamentousphagevectorsystem,”j.immunol.149:3903-3913)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸导致半随机化的氨基酸突变库。可构建由一组变体克隆组成的文库，每个变体克隆的区别在于单个cdr中的单个氨基酸变化，并且其含有代表每个cdr残基的每个可能的氨基酸取代的变体。可以通过使固定的突变体与标记的抗原接触来筛选对抗原的结合亲和力增加的突变体。本领域已知的任何筛选方法可用于鉴定对抗原的亲合力增加的突变抗体(例如，elisa)(参见例如，wu,h.等(1998)“stepwiseinvitroaffinitymaturationofvitaxin,analphavbeta3-specifichumanizedmab,”proc.natl.acad.sci.(usa)95(11):6037-6042；yelton,d.e.等(1995)“affinitymaturationofthebr96anti-carcinomaantibodybycodon-basedmutagenesis,”j.immunol.155:1994-2004)。可以使用使轻链随机化的cdr步移(参见schier等(1996)“isolationofpicomolaraffinityanti-c-erbb-2single-chainfvbymolecularevolutionofthecomplementaritydeterminingregionsinthecenteroftheantibodybindingsite,”j.mol.biol.263:551-567)。随机诱变也可用于鉴定改进的cdr。或者，噬菌体展示技术可用于增加(或降低)cdr亲和力。该技术称为亲和力成熟，采用诱变或“cdr步移”，并且使用靶标抗原或其抗原性片段进行重新选择，以鉴定与初始或亲本抗体相比结合时对抗原具有更高(或更低)亲和力的抗体(参见例如glaser,s.m.等(1992)“antibodyengineeringbycodon-basedmutagenesisinafilamentousphagevectorsystem,”j.immunol.149:3903-3913)。诱变整个密码子而不是单个核苷酸导致半随机化的氨基酸突变库。可构建由一组变体克隆组成的文库，每个变体克隆的区别在于单个cdr中的单个氨基酸变化，并且其含有代表每个cdr残基的每个可能的氨基酸取代的变体。可以通过使固定的突变体与标记的抗原接触来筛选对抗原的结合亲和力增加(或降低)的突变体。本领域已知的任何筛选方法可用于鉴定对抗原的亲合力增加(或降低)的突变抗体(例如，elisa)(参见例如，wu,h.等(1998)“stepwiseinvitroaffinitymaturationofvitaxin,analphavbeta3-specifichumanizedmab,”proc.natl.acad.sci.(usa)95(11):6037-6042；yelton,d.e.等(1995)“affinitymaturationofthebr96anti-carcinomaantibodybycodon-basedmutagenesis,”j.immunol.155:1994-2004)。可以使用使轻链随机化的cdr步移(参见schier等(1996)“isolationofpicomolaraffinityanti-c-erbb-2single-chainfvbymolecularevolutionofthecomplementaritydeterminingregionsinthecenteroftheantibodybindingsite,”j.mol.biol.263:551-567)。完成这种亲和力成熟的方法描述于例如：krause,j.c.等(2011)“aninsertionmutationthatdistortsantibodybindingsitearchitectureenhancesfunctionofahumanantibody,”mbio.2(1)pii:e00345-10.doi:10.1128/mbio.00345-10；kuan,c.t.等(2010)“affinity-maturedanti-glycoproteinnmbrecombinantimmunotoxinstargetingmalignantgliomasandmelanomas,”int.j.cancer10.1002/ijc.25645；hackel,b.j.等(2010)“stabilityandcdrcompositionbiasesenrichbinderfunctionalitylandscapes,”j.mol.biol.401(1):84-96；montgomery,d.l.等(2009)“affinitymaturationandcharacterizationofahumanmonoclonalantibodyagainsthiv-1gp41,”mabs1(5):462-474；gustchina,e.等(2009)“affinitymaturationbytargeteddiversificationofthecdr-h2loopofamonoclonalfabderivedfromasynthetic
在一些实施方案中，可以将本发明的人源化抗体工程化以在fc区内包括修饰，通常改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定、fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，可以对本发明的人源化抗体进行化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分与抗体连接)或者进行修饰以改变其糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能特性。
在一些实施方案中，修饰ch1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变(例如增加或减少)。在bodmer等的美国专利no.5,677,425中进一步描述了这种方法。改变ch1铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如促进轻链和重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。
在一些实施方案中，修饰本发明的人源化抗体以增加其生物半衰期。各种方法都是可能的。例如，如ward的美国专利no.6,277,375中所述，可以引入一种或多种下列突变：t252l、t254s、t256f。或者，为了增加生物半衰期，如presta等的美国专利号5,869,046和6,121,022所述，可以改变抗体的chi或cl区，以包含取自igg的fc区的ch2结构域的两个环的补救受体结合表位。
在一些实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基替换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应子配体的亲和力改变，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力改变的效应子配体可以是例如，fc受体或补体的ci组分。在winter等的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述了这种方法。
在一些实施方案中，可以用不同的氨基酸残基替换选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸，使得抗体具有改变的c1q结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(cdc)。在ldusogie等的美国专利号6,194,551中进一步详细描述了这种方法。
在一些实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。bodmer等的pct公开wo94/29351进一步描述了这种方法。在一些实施方案中，修饰fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(adcc)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对fc受体的亲和力。presta的pct公开wo00/42072进一步描述了这种方法。此外，已经绘制了人igg1上fcγri、fcγrii、fcγriii和fcrn的结合位点，并且已经描述了具有改进的结合的变体(参见shields,r.l.等,2001j.biol.chen.276:6591-6604,wo2010106180)。
在一些实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。这种碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以取代一个或多个氨基酸，导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位点的糖基化。这种糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。在co等的美国专利号5,714,350和no.6,350,861中进一步详细描述了这种方法。另外或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少量的岩藻糖基残基或不具有岩藻糖基残基的低岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗体，或具有增加的二等分glcnac结构的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加了抗体的adcc能力。这种碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，其中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如hang等的ep1,176,195描述了具有功能性破坏的fut8基因(其编码岩藻糖基转移酶)的细胞系，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化或缺乏岩藻糖基残基。因此，在一些实施方案中，本发明的人源化抗体可以通过在表现出低岩藻糖基化或非岩藻糖基化模式的细胞系(例如，编码岩藻糖基转移酶的fut8基因表达缺陷的哺乳动物细胞系)中重组表达来产生。presta的pct公开wo03/035835描述了变体cho细胞系(lecl3细胞)，其将岩藻糖连接至与asn(297)连接的碳水化合物的能力降低，还导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(参见shields,r.l.等,2002j.biol.chem.277:26733-26740)。umana等的pct公开wo99/54342描述了工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-n乙酰葡糖胺基转移酶iii(gntiii))的细胞系，使得在该工程化细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分glcnac结构，其导致抗体的adcc活性增加(也参见umana等,1999nat.biotech.17：176-180)。eurekatherapeutics进一步描述了基因工程化cho哺乳动物细胞，其能够产生不含岩藻糖残基的具有改变的哺乳动物糖基化模式的抗体(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html)。或者，本发明的人源化抗体可以在针对哺乳动物样糖基化模式工程化且能够产生缺乏岩藻糖作为糖基化模式的抗体的酵母或丝状真菌中产生(参见例如ep1297172b1)。
本发明预期的本发明的人源化抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，通常在其中一个或多个peg基团与抗体或抗体片段连接的条件下，将抗体或其片段与聚乙二醇(peg)，例如peg的反应性酯或醛衍生物反应。聚乙二醇化可以通过与反应性peg分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖用于衍生其他蛋白质的peg的任何形式，例如单(c1-c10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的人源化抗体。参见例如nishimura等的ep0154316和ishikawa等的ep0401384。
本发明预期的人源化抗体的另一种修饰是将至少本发明的人源化抗体的抗原结合区与血清蛋白(例如人血清白蛋白)或其片段偶联或蛋白融合，以增加所得分子的半衰期。例如balance等的ep0322094描述了这种方法。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体是抗原结合片段。可通过常规技术获得抗体片段，例如通过全长抗体的片段化或通过在重组细胞中表达编码抗体片段的核酸(参见例如evans等j.immunol.meth.184,123-38(1995))。然后可以以本文所述的用于全长抗体的相同方式测试或筛选片段的性质。以下描述了本发明的cldn1特异性抗原结合片段的示例性形式：
-f(ab')2片段，其是二价片段且包含在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段。这些可以通过例如用胃蛋白酶处理全长抗体来产生。
-fab'或fab片段，其是单价片段且由vl、vh、cl和ch1结构域组成。fab片段可以例如通过用木瓜蛋白酶处理igg抗体来获得。fab'片段可以通过例如使用还原剂如二硫苏糖醇还原f(ab')2片段的二硫键来获得。
-fd片段，其基本上由vh和ch1结构域组成。
-fv片段，其基本上由抗体单臂的vl和vh结构域及其单链抗体组成。单链抗体(也称为单链fv(scfv)抗体)是这样的构建体：其中使用重组方法将fv片段的vl和vh结构域通过合成接头连接，所述合成接头使得它们能够表达为其中vl和vh区配对形成单价分子的单个蛋白质链(参见例如bird等,science242,423-426(1988)andhustonetal.,pnasusa85,5879-5883(1988))。
在一些实施方案中，本发明提供多特异性抗体，其包含来自上文所述的本发明分子的人源化抗体的至少一条可变重链或轻链和至少一个第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第二抗原结合位点用于募集杀伤机制，例如通过在人效应子细胞上结合抗原或通过结合细胞毒剂或第二治疗剂。如本文所用，术语“效应子细胞”是指免疫细胞，其参与免疫应答的效应子阶段(与免疫应答的认知和激活阶段相反)。示例性免疫细胞包括髓样或淋巴样细胞，例如淋巴细胞(例如b细胞和t细胞，包括细胞溶解性t细胞(ctl))、杀伤细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞和粒细胞，例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。一些效应子细胞表达特异性fc受体(fcr)并执行特异性免疫功能。在一些实施方案中，效应子细胞能够诱导adcc，例如天然杀伤细胞。例如，表达fcr的单核细胞、巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤并将抗原呈递给免疫系统的其他组分。在一些实施方案中，效应子细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。效应子细胞上特定fcr的表达可以通过体液因子如细胞因子来调节。效应子细胞可以吞噬靶抗原或吞噬或裂解靶细胞。合适的细胞毒剂和第二治疗剂在下面举例说明，包括毒素(如放射性标记的肽)、化疗剂和前药。
在一些实施方案中，第二抗原结合位点结合组织特异性抗原，促进多特异性抗体定位至特定组织。
本发明的多特异性抗体分子的示例性形式包括但不限于(i)通过化学异源偶联交联的两种抗体，一种对cldn1具有特异性，另一种对第二抗原具有特异性；(ii)包含两个不同抗原结合区的单个抗体；(iii)单链抗体，其包含两个不同的抗原结合区，例如通过额外的肽接头串联连接的两个scfv；(iv)双可变结构域抗体(dvd-ig)，其中每条轻链和重链包含通过短肽串联连接的两个可变结构域(wu等,generationandcharacterizationofadualvariabledomainimmunoglobulin(dvd-igtm)molecule,in:antibodyengineering,springerberlinheidelberg(2010))；(v)化学连接的双特异性(fab')2片段；(vi)tandab，其是两个单链双抗体的融合物，产生四价双特异性抗体，其对于每种靶抗原具有两个结合位点；(vii)flexibody，它是scfv与双抗体的组合，产生多价分子；(viii)一种所谓的“对接和锁定”分子，基于蛋白激酶a中的“二聚化和对接结构域”，当应用于fab时，其可以产生由与不同fab片段连接的两个相同fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(ix)所谓的scorpion分子，其包含例如与人fab臂的两个末端融合的两个scfv；和(x)双抗体。双特异性抗体的另一种示例性形式是具有互补ch3结构域的igg样分子，以强制异二聚化。这些分子可以使用已知技术制备，例如称为triomab/quadroma(trionpharma/freseniusbiotech)、knob-into-hole(genentech)、crossmab(roche)和静电匹配(amgen)、luz-y(genentech)、链交换工程域体(seedbody)(emdserono)、biclonic(merus)和duobody(genmaba/s)的技术。
在一些实施方案中，通过受控的fab臂交换获得或可获得双特异性抗体，通常使用duobody技术。wo2008119353和wo2011111717(均由genmaba/s)已经描述了通过受控的fab臂交换产生双特异性抗体的体外方法。在wo2008119353中描述的一种示例性方法中，在还原条件下孵育时，通过两种均包含igg4样ch3区域的单特异性抗体之间的“fab-臂”或“半分子”交换(交换重链和连接的轻链)形成双特异性抗体。所得产物是具有两个fab臂的双特异性抗体，所述fab臂可包含不同的序列。在wo2011131746中描述的另一个示例性方法中，通过包括以下步骤的方法制备本发明的双特异性抗体，其中第一和第二抗体中的至少一种是本发明的人源化抗体：a)提供包含免疫球蛋白的fc区的第一抗体，所述fc区包含第一ch3区；b)提供包含免疫球蛋白fc区的第二抗体，所述fc区包含第二ch3区；其中所述第一和第二ch3区的序列不同，并且使得所述第一和第二ch3区之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二ch3区的每个同源二聚体相互作用；c)在还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起孵育；和d)获得所述双特异性抗体，其中所述第一抗体是本发明的人源化抗体，所述第二抗体具有不同的结合特异性，反之亦然。还原条件可以例如通过添加例如选自2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦的还原剂来提供。步骤d)可以进一步包括将条件恢复为非还原或较少还原，例如通过去除还原剂，例如通过脱盐。优选地，第一和第二ch3区的序列不同，仅包含少数相当保守的不对称突变，使得所述第一和第二ch3区之间的异源二聚体相互作用强于所述第一和第二ch3区的每个同源二聚体相互作用。关于这些相互作用及其如何实现的更多细节在wo2011131746中提供，其通过引用整体并入本文。以下是这种不对称突变的组合的示例性实施方案，任选地其中一个或两个fc区是igg1同种型。
在一些实施方案中，第一fc区在选自以下的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，并且第二fc区在选自以下的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405、407和409，并且其中第一和第二fc区不在相同位置被取代。
在一些实施方案中，第一fc区在第405位具有氨基酸取代，并且第二fc区在选自以下的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、407和409，任选第409位。
在一些实施方案中，第一fc区在第409位具有氨基酸取代，并且第二fc区在选自以下的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405和407，任选第405位或第368位。
在一些实施方案中，第一和第二fc区均为igg1同种型，其中第一fc区具有第405位的leu，第二fc区具有第409位的arg。
本发明的人源化抗体可以通过本领域已知的任何技术产生，例如但不限于任何单独或组合的化学、生物学、遗传学或酶学技术。例如，已知所需序列的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以容易地通过产生多肽的标准技术来产生所述抗体。例如，它们可以使用熟知的固相方法，优选使用市售的肽合成装置(例如appliedbiosystems，fostercity，california制造)并遵循制造商的说明书来合成。或者，可以通过本领域熟知的重组dna技术合成本发明的抗体。例如，在将编码抗体的dna序列整合入表达载体并将这些载体引入将表达所需抗体的合适的真核或原核宿主中后，可以获得作为dna表达产物的抗体，之后可以使用熟知技术分离它们。
因此，本发明的另一个目的涉及编码本发明的人源化抗体的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列编码本发明的人源化抗体的重链和/或轻链。
通常，所述核酸是dna或rna分子，其可以包含在任何合适的载体中。如本文所用，术语“载体”意指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指环状双链dna环，其中可以连接额外的dna区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组dna技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们具有相同的功能。
因此，本发明的另一个目的涉及包含本发明的核酸的载体。
此类载体可包含调控元件，例如启动子、增强子、终止子等，以在施用于受试者时引起或指导所述抗体的表达。用于动物细胞表达载体的启动子和增强子的实例包括sv40的早期启动子和增强子(mizukamit.等1987)、莫洛尼小鼠白血病病毒的ltr启动子和增强子(kuwanay等1987)、免疫球蛋白h链的启动子(masonjo等，1985)和增强子(gilliessd等，1983)等。可以使用任何用于动物细胞的表达载体，只要可以插入和表达编码人抗体c区的基因。合适载体的实例包括page107(miyajih等1990)、page103(mizukamit等1987)、phsg274(bradyg等1984)、pkcr(o'harek等1981)、psg1βd2-4-(miyajih等，1990)等。质粒的其他实例包括包含复制起点的复制质粒或整合质粒，例如puc、pcdna、pbr等。病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和aav载体。此类重组病毒可通过本领域已知的技术，例如通过转染包装细胞或通过辅助质粒或病毒的瞬时转染产生。病毒包装细胞的典型实例包括pa317细胞、psicrip细胞、gpenv+细胞、293细胞等。用于产生这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可以在例如wo95/14785、wo96/22378、us5,882,877、us6,013,516、us4,861,719、us5,278,056和wo94/19478中找到。
本发明的另一个目的涉及用根据本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的宿主细胞。
术语“转化”是指将“外源”(即外源或细胞外)基因、dna或rna序列引入宿主细胞，使得宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需物质，通常是由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并表达引入的dna或rna的宿主细胞被“转化”。
本发明的核酸可用于在合适的表达系统中产生本发明的人源化抗体。术语“表达系统”是指在(例如，用于表达由载体携带的外源dna编码的蛋白质并引入宿主细胞的)合适条件下的宿主细胞和相容载体。常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(例如细菌)和真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母或酵母菌酵母、哺乳动物细胞系(例如vero细胞、cho细胞、3t3细胞、cos细胞等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠sp2/0-ag14细胞(atcccrl1581)、小鼠p3x63-ag8.653细胞(atcccrl1580)、其中二氢叶酸还原酶基因(下文称为“dhfr基因”)缺陷型的cho细胞(urlaubg等；1980)、大鼠yb2/3hl.p2.g11.16ag.20细胞(atcccrl1662，下文称为“yb2/0细胞”)等。
本发明还涉及产生表达根据本发明的抗体的重组宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将如上所述的重组核酸或载体体外或离体引入感受态宿主细胞，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞和(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述抗体的细胞。这些重组宿主细胞可用于产生本发明的抗体。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体与治疗部分(即药物)偶联。治疗部分可以是例如细胞毒素、化疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、免疫刺激剂、裂解肽或放射性同位素。此类偶联物在本文中称为“抗体-药物偶联物”或“adc”。
在一些实施方案中，抗体与细胞毒性部分偶联。细胞毒性部分可以例如选自以下：紫杉醇；细胞松弛素b；短杆菌肽d；溴化乙锭；吐根碱；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷；长春新碱；长春碱；秋水仙碱；多柔比星；柔红霉素；二羟基蒽二酮；微管蛋白抑制剂如美登素或其类似物或衍生物；抗有丝分裂剂如单甲基奥瑞他汀e或f或其类似物或衍生物；海兔毒素10或15或其类似物；伊立替康或其类似物；米托蒽醌；光辉霉素；放线菌素d；1-脱氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛尔；嘌呤霉素；卡奇霉素或其类似物或衍生物；抗代谢药，如甲氨喋呤、6巯基嘌呤、6硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5氟尿嘧啶、癸二嗪、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨；烷化剂，如二氯甲基二乙胺、硫代嘌呤、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(bsnu)、洛莫司汀(ccnu)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、达卡巴嗪(dtic)、丙卡巴嗪、丝裂霉素c；铂类衍生物，如顺铂或卡铂；多卡霉素a、多卡霉素sa、雷切霉素(cc-1065)或其类似物或衍生物；抗生素，如放线菌素、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、光霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普力霉素、安定霉素(amc)；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(pdb)；白喉毒素及相关分子如白喉a链及其活性片段和杂合分子、蓖麻毒素如蓖麻毒素a或去糖基化蓖麻毒素a链毒素、霍乱毒素、志贺样毒素如slti、sltii、sltiiv、lt毒素、c3毒素、志贺毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆bowman-birk蛋白酶抑制剂、假单胞菌外毒素、阿罗林、皂草素、蒴莲根毒素、胶凝蛋白、相思豆毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-sarcin、油桐(aleuritesfordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白如papi、papii和pap-s、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、泻果素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒素、丝裂霉素、局限曲菌素、酚霉素和依诺霉素毒素；核糖核酸酶(rnase)；dnasei、葡萄球菌内毒素a；商陆抗病毒蛋白；白喉毒素和假单胞菌内毒素。
在一些实施方案中，抗体与奥瑞他汀或其肽类似物、衍生物或前药偶联。已经表明，奥瑞他汀干扰微管动力学、gtp水解以及核和细胞分裂(woyke等(2001)antimicrob.agentsandchemother.45(12):3580-3584)并具有抗癌(us5663149)和抗真菌活性(pettit等，(1998)antimicrob.agentsandchemother.42：2961-2965)。例如，奥瑞他汀e可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应，分别产生aeb和aevb。其他典型的奥瑞他汀衍生物包括afp、mmaf(单甲基奥瑞他汀f)和mmae(单甲基奥瑞他汀e)。合适的奥瑞他汀和奥瑞他汀的类似物、衍生物和前药，以及用于将奥瑞他汀与ab偶联的合适接头描述于例如美国专利号5,635,483、5,780,588和6,214,345以及国际专利申请公开wo02088172、wo2004010957、wo2005081711、wo2005084390、wo2006132670、wo03026577、wo200700860、wo207011968和wo205082023。
在一些实施方案中，抗体与吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓(pdb)或其肽类似物、衍生物或前药偶联。合适的pdb以及pdb衍生物和相关技术描述于例如hartleyj.a.等,cancerres2010；70(17):6849-6858；antonowd.等,cancerj2008；14(3):154-169；howardp.w.等,bioorgmedchemlett2009；19:6463-6466和sagnou等,bioorgmedchemlett2000；10(18):2083-2086。
在一些实施方案中，抗体与选自以下的细胞毒性部分偶联：蒽环类抗生素、美登素、卡奇霉素、多卡霉素、雷切霉素(cc-1065)、海兔毒素10、海兔毒素15、伊立替康、单甲基奥瑞他汀e、单甲基奥瑞他汀f、pdb，或它们任何的类似物、衍生物或前药。
在一些实施方案中，抗体与蒽环类抗生素或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与美登素或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与卡奇霉素或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与多卡霉素或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与雷切霉素(cc-1065)或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与海兔霉素10或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与海兔霉素15或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与单甲基奥瑞他汀e或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与单甲基奥瑞他汀f或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂卓或其类似物、衍生物或前药偶联。在一些实施方案中，抗体与伊立替康或其类似物、衍生物或前药偶联。
在一些实施方案中，抗体与核酸或核酸相关分子偶联。在一个这种实施方案中，偶联的核酸是细胞毒性核糖核酸酶(rnase)或脱氧核糖核酸酶(例如dnasei)、反义核酸、抑制性rna分子(例如sirna分子)或免疫刺激性核酸(例如含免疫刺激性cpg基序的dna分子)。在一些实施方案中，抗体与适体或核酶偶联。
在一些实施方案中，抗体例如作为融合蛋白偶联与裂解肽(例如clip、马加宁2、蜂毒肽、天蚕素和p18)偶联。
在一些实施方案中，抗体与细胞因子(例如il-2、il-4、il-6、il-7、il-10、il-12、il-13、il-15、il-18、il-23、il-24、il-27、il-28a、il-28b、il-29、kgf、ifna、ifn3、ifny、gm-csf、cd40l、flt3配体、干细胞因子、安西司亭和tnfa)偶联。
在一些实施方案中，抗体与放射性同位素或含放射性同位素的螯合物偶联。例如，抗体可以与允许抗体与放射性同位素络合的螯合剂接头(例如dota、dtpa或噻西坦)偶联。抗体还可以或可选地包含一个或多个放射性标记的氨基酸或其他放射性标记的分子或与之偶联。放射性同位素的非限制性实例包括3h、14c、15n、35s、90y、99tc、125i、131i、186re、213bi、225ac和227th。为了治疗目的，可以使用发射β或α颗粒辐射的放射性同位素，例如131i、90y、211at、212bi、67cu、186re、188re和212pb。
将分子与抗体偶联的技术是本领域熟知的(参见例如arnon等,“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy,”inmonoclonalantibodiesandcancertherapy(reisfeld等eds.,alanr.liss,inc.,1985)；hellstrom等,“antibodiesfordrugdelivery,”incontrolleddrugdelivery(robinson等eds.,marceldeiker,inc.,2nded.1987)；thorpe,“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview,”inmonoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications(pinchera等编辑,1985)；“analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy,”inmonoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy(baldwin等编辑,academicpress,1985)；和thorpe等,1982,immunol.rev.62:119-58。还参见例如pct公开wo89/12624.))。通常，核酸分子分别通过n-羟基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺官能团与抗体上的赖氨酸或半胱氨酸共价连接。据报道，使用工程化半胱氨酸或整合非天然氨基酸的偶联方法可改进偶联物的同质性(axup,j.y.,bajjuri,k.m.,ritland,m.,hutchins,b.m.,kim,c.h.,kazane,s.a.,halder,r.,forsyth,j.s.,santidrian,a.f.,stafin,k.等(2012)。使用非天然氨基酸合成位点特异性抗体-药物偶联物。proc.natl.acad.sci.usa109,16101–16106.；junutula,j.r.,flagella,k.m.,graham,r.a.,parsons,k.l.,ha,e.,raab,h.,bhakta,s.,nguyen,t.,dugger,d.l.,li,g.等(2010)。工程化硫代-曲妥珠单抗-dm1偶联物，其对于靶向人表皮生长因子受体2阳性的乳腺癌具有改进的治疗指数。clin.cancerres.16,4769-4778。junutula等(2008)开发了称为“thiomab”(tdc)的基于半胱氨酸的位点特异性偶联，据称与常规偶联方法相比显示出改进的治疗指数。也正在探索用于adc的与已经整合入抗体的非天然氨基酸的偶联；然而，这种方法的普遍性尚未确定(axup等，2012)。特别地，本领域技术人员还可以预期用含酰基供体谷氨酰胺的标签(例如含有gin肽的标签或q-标签)或通过多肽工程(例如通过多肽上的氨基酸缺失、插入、取代或突变)产生反应性的内源性谷氨酰胺工程化的含fc多肽。然后，转谷氨酰胺酶可与胺供体剂(例如，包含或连接于反应性胺的小分子)共价交联，以形成稳定且均质的工程化含fc多肽偶联物群，其中胺供体剂通过含酰基供体谷氨酰胺标签或可接近/暴露/反应性的内源性谷氨酰胺位点特异性地与含fc多肽偶联(wo2012059882)。
在另一个方面，本发明涉及本文任一方面或实施方案中定义的本发明的人源化抗体用作药物的用途。
本发明的人源化抗体特别适于治疗与cldn1表达相关的任何疾病。本发明的人源化抗体可以单独使用，或与任何合适的试剂联合使用。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体特别适于治疗病毒感染。在一些实施方案中，病毒感染包括被一种或多种选自以下的病毒感染：沙粒病毒科(arenaviridae)、星状病毒科(astroviridae)、双核糖核酸病毒科(birnaviridae)、雀麦花叶病毒科(bromoviridae)、布尼亚病毒科(bunyaviridae)、杯状病毒科(caliciviridae)、长线形病毒科(closteroviridae)、豇豆花叶病毒科(comoviridae)、囊状病毒科(cystoviridae)、黄病毒科(flaviviridae)、弯曲病毒科(flexiviridae)、戊肝病毒属(hepevirus)、光滑病毒科(leviviridae,黄症病毒科(luteoviridae)、单分子负链rna病毒目(mononegavirales)、花叶病病毒(mosaicviruses)、尼多病毒目(nidovirales)、诺达病毒科(nodaviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、小双节段rna病毒科(picobirnavirus)、小rna病毒科(picornaviridae)、马铃薯y病毒科(potyviridae)、呼肠孤病毒科(reoviridae)、逆转录病毒科(retroviridae)、塞维病毒科(sequiviridae)、纤细病毒属(tenuivirus)、披膜病毒科(togaviridae)、番茄病毒科(tombusviridae)、全病毒科(totiviridae)、芜菁发黄镶嵌病毒科(tymoviridae)、嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)、疱疹病毒科(herpesviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)或乳头瘤病毒科(papillomaviridae)病毒。在一些实施方案中，病毒感染包括被一种或多种选自以下的病毒感染：腺病毒、鼻病毒、肝炎病毒、免疫缺陷病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、埃博拉病毒、柯萨奇病毒、犀牛病毒、西尼罗河病毒、小痘病毒、脑炎病毒、黄热病病毒、冠状病毒、登革热、流感(包括人、禽和猪)、拉沙病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、胡宁病毒、马丘普波病毒、瓜纳瑞托病毒、汉坦病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、加州脑炎病毒、克里米亚-刚果病毒、马尔堡病毒、日本脑炎病毒、科萨努尔森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、严重急性呼吸道综合征(sars)病毒、副流感病毒、呼吸道合胞体病毒、蓬塔托罗病毒、塔卡里布病毒、帕钦德病毒、腺病毒、登革热病毒、甲型流感和乙型流感(包括人、禽和猪)病毒、胡宁病毒、麻疹病毒、副流感病毒、帕钦德病毒、蓬塔托罗病毒、呼吸道合胞体病毒、鼻病毒、裂谷热病毒、严重急性呼吸综合征(sars)病毒、塔卡里布病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗河和黄热病病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、墨累谷病毒、powassan病毒、罗西欧病毒、跳跃病病毒、班兹病毒、ilheus病毒、科科贝拉病毒、库京病毒、阿尔弗病毒，牛腹泻病毒和科萨努尔森林病毒。特别地，本发明的人源化抗claudin-1抗体也可以用于治疗和/或预防hcv感染的治疗性和预防性方法。本发明的人源化抗claudin-1抗体可通过与细胞表面上的claudin-1的胞外结构域结合而干扰hcv-宿主细胞的相互作用，从而减少、抑制、阻断或阻止hcv进入细胞和/或细胞的hcv感染(wo2010034812)。本发明的抗体可用于各种治疗性或预防性方法。特别地，本发明提供了治疗或预防受试者的肝脏疾病或病理的方法，该方法包括向受试者施用有效量的抑制hcv进入或感染受试者的细胞的本发明的抗体，从而治疗或预防受试者的肝脏疾病或病理。肝脏疾病或病理可以是与hcv感染相关的肝脏炎症、肝纤维化、肝硬化和/或肝细胞癌(即肝癌)。本发明还提供了治疗或预防受试者中hcv相关疾病或病症(包括肝病)的方法，该方法包括向受试者施用有效量的抑制hcv进入或感染受试者的细胞的本发明的抗体，从而治疗或预防受试者中的hcv相关疾病或病症。在本发明的某些实施方案中，向诊断患有急性丙肝的受试者施用抗体或组合物。在本发明的其他实施方案中，向诊断患有慢性丙肝的受试者施用抗体或组合物。在一些实施方案中，本发明的方法可用于降低受试者易感细胞因肝移植而感染hcv的可能性。如上文已经提及，当从hcv感染患者中移除患病的肝脏时，血清病毒水平直线下降。然而，在接受健康的肝移植后，病毒水平反弹并且可在几天内超过移植前水平。肝移植患者可受益于施用结合肝细胞表面上claudin-1的胞外域的本发明抗体，从而减少、抑制、阻断或阻止hcv进入细胞。可以在肝移植之前、肝移植期间和/或肝移植之后进行施用。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体适于治疗肝细胞癌。在一些实施方案中，本发明的人源化抗体适于治疗hcv相关的肝细胞癌。在一些实施方案中，本发明的人源化抗体适于治疗非hcv相关的肝细胞癌。
如本文所用，术语“肝细胞癌”或“hcc”是指最常见的肝癌类型，也称为恶性肝癌。如本文所用，术语“hcv相关的肝细胞癌”和“hcv相关的肝病”分别指继发于丙肝病毒(hcv)感染的肝细胞癌和肝病。该术语包括在hcv感染治愈后发展或开始的hcc。如本文所用，术语“非hcv相关的肝细胞癌”是指在从未感染hcv的患者中发展或易于发展的肝细胞癌。“非hcv相关的肝细胞癌”还包括在hcv感染已经治愈的患者中发展或易于发展的肝细胞癌。类似地，术语“非hcv相关的肝病”是指在从未感染过hcv的患者或hcv感染已经治愈的患者中发展的肝病。非hcv相关的肝细胞癌/肝病的实例包括继发于乙肝病毒(hbv)感染的肝细胞癌/肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝病、遗传性血色素沉着症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、自身免疫性肝炎、某些卟啉症、威尔森氏病、黄曲霉毒素暴露、2型糖尿病、肥胖等...，以及不明来源的肝细胞癌/肝病。特别地，本发明提供一种用于预防肝病患者发展肝细胞癌的方法。肝脏疾病或病理可以是肝脏炎症、肝纤维化和/或肝硬化。在本发明的实践中，肝病的根本原因不是hcv感染。因此，本发明提供预防和/或治疗非hcv相关肝细胞癌的方法，即用于预防和/或治疗在从未感染过hcv的患者或hcv感染已经治愈的患者中发展或易于发展的肝细胞癌。在本发明的一些实施方案中，肝病的根本原因是hbv感染。hbv慢性感染导致肝硬化，并且和慢性hcv感染导致肝癌成为世界上许多地区最常见的癌症。全世界约有20亿人感染hbv。在感染发病率较低的西方工业化国家，hbv和/或hcv感染者的hcc风险高出约20倍。或者，肝病可能是酒精性肝病，其中肝病的根本原因是酒精中毒。酒精摄入已被明确认为是慢性肝病(包括肝细胞癌)的原因。酒精可通过直接(基因毒性)和间接机制参与hcc的发展。间接机制包括肝硬化的发展，这可能是发达国家肝癌发生的最常见途径。在本发明的一些实施方案中，肝病的根本原因是非酒精性脂肪肝病(nafld)。nafld是西方工业化国家中最常见的肝病。它被认为是代谢综合征的肝脏表现。因此，nafld倾向于在超重或肥胖的人和/或患有糖尿病、高胆固醇或高甘油三酯的人中发展。对于大多数人来说，nafld没有任何体征和症状，也没有并发症。但是在一些患有nafld的人中，肝脏中积聚的脂肪会导致肝脏炎症和疤痕，据信这会导致纤维化和肝硬化。这种更严重的nafld形式有时被称为非酒精性脂肪性肝炎(nash)。值得注意的是，已经证明代谢综合征和2型糖尿病是hcc的独立风险因子。在一些实施方案中，肝病的根本原因是遗传性代谢疾病，例如遗传性血色素沉着症。患有遗传性血色素沉着症的人从他们的食物中吸收过多的铁。铁沉淀在整个身体的组织中，包括肝脏。如果肝脏中积聚了足够的铁，就会导致肝硬化。其他作为肝细胞癌的风险因子的遗传性代谢疾病包括α1抗胰蛋白酶缺乏症、迟发性皮肤卟啉病、威尔森氏病、酪氨酸血症和糖原贮积病。在一些实施方案中，肝病的根本原因是自身免疫性肝炎(也称为狼疮性肝炎)。自身免疫性肝炎是一种慢性肝病，当身体的免疫系统攻击肝脏细胞导致肝脏发炎时就会发生。另一种影响肝脏并可引起肝硬化的自身免疫性疾病是原发性胆汁性肝硬化或pbc。pbc是一种自身免疫疾病，其中免疫系统会缓慢攻击肝脏的胆管。当胆管受损时，胆汁在肝脏中积聚并随着时间的推移而损伤组织。这可能导致疤痕、纤维化和肝硬化。在一些实施方案中，肝病的根本原因是暴露于黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是由在储存不佳的作物(如花生、小麦、大豆、玉米和水稻)上生长的真菌产生的毒物。长期暴露于这些物质是肝癌的主要风险。hcv或hbv感染者的风险甚至更高。在发达国家，食物中黄曲霉毒素的含量通过测试来调节。黄曲霉毒素污染在非洲和亚洲的某些地区更为常见。在一些实施方案中，肝病的根本原因是未知的，或者肝病是由尚未发现的试剂(包括遗传来源的试剂、感染试剂或化学和/或物理的肝毒剂)引起的。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗cldn1抗体可用于治疗癌症，特别是结肠直肠癌。与cldn1过表达相关的癌症疾病通常包括但不限于结肠直肠癌、妇科癌症、卵巢癌、宫颈瘤、黑素瘤、鳞状细胞癌(scc)如口腔scc、下唇scc、头颈部、皮肤scc、扁桃体scc、胃腺癌、甲状腺癌、乳腺癌、松果体区神经上皮乳头状瘤(ptpr)、透明细胞肾细胞癌、唾液腺粘液表皮样癌(mec)、鼻咽癌、上泌尿道尿路上皮癌、食管癌、间皮瘤、胸膜转移性腺癌和一些胰腺肿瘤。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体适于治疗肝病。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体适于治疗脂肪性肝病(fld)。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体适于治疗非酒精性脂肪肝病(nafld)。
在一些实施方案中，本发明的人源化抗体适于治疗非酒精性脂肪肝炎(nash)。
术语“肝病”具有其在本领域的一般含义并且指肝脏炎症、肝脏瘢痕、肝脏脂肪变性、肝纤维化、脂肪性肝病(fld)、非酒精性脂肪肝病(nafld)、非酒精性脂肪肝炎(nash)或肝硬化。
如本文所用，术语“脂肪肝病”(fld)或“肝脏脂肪变性”具有其在本领域的一般含义并且是指“酒精性脂肪肝病”、“非酒精性脂肪肝病”(nafld)和非酒精性脂肪肝炎(nash)。nafld是一种进化病症，其可以包括不同形式的病变、范围从简单的脂肪变性(在本文中也称为“非酒精性脂肪肝”或nafl)到非酒精性脂肪肝炎(nash)、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌(hcc)。
如本文所用，术语“nash”具有其在本领域中的一般含义并且指非酒精性脂肪肝炎。慢性炎症和纤维化是nash的关键特征。nash具有纤维化、肝硬化失代偿和肝细胞癌的潜力。
如本文所用，术语“治疗”是指预防或预防性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包括治疗处于患病风险或怀疑患有该疾病的受试者以及生病或被诊断为患有疾病或医学病症的受试者，包括抑制临床复发。可以向患有医学病症或最终可能患有病症的受试者施用治疗，以预防、治愈、延迟病症或复发病症的一种或多种症状的发作、降低病症或复发病症的一种或多种症状的严重程度或病症或复发病症的一种或多种症状，或者为了延长受试者的存活期，超过在没有这种治疗的情况下预期的存活期。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的剂量模式。治疗方案可包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的一般目标是在治疗方案的初始阶段向受试者提供高水平的药物。诱导方案可以采用(部分或全部)“加载方案”，其可以包括施用比医生在维持方案期间使用的更大剂量的药物，比医生在维持治疗期间更频繁地施用药物，或两者。短语“维持方案”或“维持期”是指用于在治疗疾病期间维持受试者，例如使受试者长期(数月或数年)保持缓解的治疗方案(或治疗方案的一部分)。维持方案可以采用连续治疗(例如以规律的间隔(例如每周、每月、每年等)施用药物)或间歇治疗(例如中断治疗、间歇治疗、复发治疗或实现特定的预定标准[例如疾病表现等]时的治疗)。
“治疗有效量”的本发明抗体是指以适用于任何医学治疗的合理的益处/风险比来治疗所述癌症的抗体的足够量。然而，应该理解，本发明的抗体和组合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特异性抗体的活性；使用的具体组合物，患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和所用特异性抗体的排泄率；治疗的持续时间；与所用特定抗体联合或一起使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。例如，在本领域技术人员中众所周知的是，以低于实现期望治疗效果所需的水平开始化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到期望效果。然而，产品的每日剂量可在每个成人每天0.01至1,000mg的宽范围内变化。通常，组合物含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg活性成分，用于对待治疗的受试者的剂量的症状调整。药物通常含有约0.01mg至约500mg活性成分，优选1mg至约100mg活性成分。通常以每天0.0002mg/kg至约20mg/kg体重，特别是每天约0.001mg/kg至7mg/kg体重的剂量水平提供有效量的药物。
为了施用，将本发明的人源化抗体配制成药物组合物。包含本发明的人源化抗体的药物组合物可根据已知方法配制以制备药学上有用的组合物，由此治疗分子与药学上可接受的载体混合成混合物。如果其施用可以被接受患者耐受，则称该组合物是“药学上可接受的载体”。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上可接受的载体的一个实例。其他合适的载体是本领域技术人员所熟知的。(参见例如，gennaro(ed.),remington'spharmaceuticalsciences(mackpublishingcompany,19thed.1995))。制剂可进一步包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、白蛋白以防止小瓶表面上的蛋白质损失等。药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。本发明的药物组合物可以配制用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或眼内施用等。通常，药物组合物含有对于能够注射的制剂而言是药学上可接受的介质。这些可以特别是等渗无菌盐水溶液(磷酸二氢钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这些盐的混合物)，或干燥的尤其是冷冻干燥的组合物，其在添加无菌水或生理盐水(取决于情况)时，允许构成可注射溶液。用于施用的剂量可以根据各种参数进行调整，特别是根据所用施用方式、相关病理学或所需的治疗持续时间进行调整。为了制备药物组合物，可以将有效量的本发明的人源化抗体溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是以易于注射的程度流动的。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在适当地与表面活性剂(如羟丙基纤维素)混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，通过使用涂层(如卵磷脂)，在分散体的情况下通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在很多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。通过将所需量的活性化合物与适当的溶剂和上面列举的各种其它成分(如果需要)混合，然后过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分加入无菌介质来制备分散体，所述无菌介质含有基础的分散基质和所需的来自上面列举那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。还预期制备更浓缩或高度浓缩的直接注射溶液，其中考虑使用dmso作为溶剂以导致极快的渗透，将高浓度的活性剂递送至小肿瘤区域。在配制时，将以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用溶液。制剂易于以多种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型，但也可使用药物释放胶囊等。例如，对于以水溶液肠胃外给药，如果需要，溶液应适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开内容，可以使用的无菌水性基质是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶于1ml等渗nacl溶液中，并且将其加入1000ml皮下注射液或者在建议的输注部位注射(参见例如"remington'spharmaceuticalsciences"15thedition,第1035-1038和1570-1580页)。取决于所治疗的受试者的病症，剂量必然发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定个体受试者的适当剂量。本发明的人源化抗体可以在治疗混合物中配制成每剂量约0.0001至1.0毫克、或约0.001至0.1毫克、或约0.1至1.0或甚至约10毫克。也可以施用多个剂量。除了配制为用于肠胃外施用(例如静脉内或肌内注射)的化合物，其他药学上可接受的形式包括例如，用于口服施用的片剂或其他固体；时间释放胶囊；以及目前使用的任何其他形式。在一些实施方案中，预期使用脂质体和/或纳米颗粒将抗体引入宿主细胞中。脂质体和/或纳米颗粒的形成和使用是本领域技术人员已知的。纳米胶囊通常可以以稳定且可重复的方式捕获化合物。为了避免由细胞内聚合物过载引起的副作用，通常使用能够在体内降解的聚合物设计这种超细颗粒(大小约0.1μm)。预期在本发明中使用满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒，并且这些颗粒易于制备。脂质体由分散在水性基质中并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(mlv))的磷脂形成。mlv的直径通常为25nm至4μm。超声处理mlv导致形成直径在200至
通过以下附图和实施例进一步说明本发明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1.大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3的重链和轻链可变区的序列分析。(a)大鼠om-7d3-b3重链(上)(seqidno：3)和轻链(下)(seqidno：4)的蛋白质序列与最近的大鼠种系序列(seqidno：5和seqidno：6)的比对。最接近的匹配的种系序列与重链和轻链分别具有86.7％和90.5％的同源性。(b)大鼠om-7d3-b3重链(上)(seqidno：3)和轻链(下)(seqidno：4)与最近的人种系序列(seqidno：7和seqidno：8)的序列比对。还显示了在将大鼠om-7d3-b3人源化的过程中产生的重链(h1、h2和h3)(seqidno：9；seqidno：11和seqidno：1)和轻链(l1、l2和l3)(seqidno：10；seqidno：12和seqidno：2)的人源化变体。使用igblast工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi)鉴定最接近的种系序列。互补决定区(cdr)以黄色高亮显示，连接cdr3和重链和轻链恒定域的连接(j)区以粉红色显示。示出了框架区(fr)、cdr和j区。
图2.人源化抗cldn1mab特异性结合cldn1并有效抑制hcv感染。(a)人源化om-7d3-b3抗cldn1mab(20μg/ml)结合细胞系的流式细胞术分析。人源化抗体特异性结合表达人cldn1的huh7.5.1和hepg2细胞，但不结合缺乏cldn1表达的293t细胞。结合表示为δ中值荧光强度(δmfi)。(b)h3l3特异性结合293t细胞上表达的外源cldn1。用空的或表达cldn1的pcdna3.1载体转染cldn-裸293t细胞。48小时后，用同种型对照、大鼠om-7d3-b3或人源化h3l3抗体(20μg/ml)染色细胞。示出了重复两次进行的一个实验的δmfi。(c)所有9个人源化抗cldn1mab有效抑制hcvcc感染。在用hcvcc感染之前，将huh7.5.1细胞与不同mab(25μg/ml)在37℃孵育1小时。72小时后通过测量荧光素酶活性评估感染性，并表示为对数相对荧光素酶单位(rlu)。(d)人源化抗cldn1mab抑制携带菌株h77(基因型1a)和hcv-j(基因型1b)的包膜糖蛋白的hcvpp进入。在感染hcvpp之前，用人源化抗体(20μg/ml)在37℃预处理phh1小时。72小时后通过荧光素酶活性测量感染性，并表示为rlu。图表示出了重复两次(a、b、d)或重复三次(c)进行的一个实验的结果。
图3.细胞培养中的人源化抗cldn1抗体克隆h3l3的功能表征。(a)h3l3有效且剂量依赖性地抑制hcv感染。在用hcvcc(jc1野生型，jc1-a156s或jc1-r155k)感染之前，将huh7.5.1细胞与递增浓度的大鼠om-7d3-b3、人源化h3l3或同种型对照抗体一起孵育。72小时后，通过测量荧光素酶活性来评估感染。结果表示为重复三次进行的三个独立实验的logrlu。(b，c)h3l3与亲本大鼠抗体一样抑制hcv的细胞-细胞传播。用hcvjc1rna(生产细胞)电穿孔huh7.5.1细胞，并在对照或抗cldn1抗体(11μg/ml)存在下与初始huh7.5.1-gfp细胞(靶细胞)共培养。24小时后，用pfa固定共培养的细胞，并用ns5a抗体染色(b)。通过计算gfp+ns5a+细胞的百分比确定细胞-细胞传播的程度(c)。示出了重复两次进行的单个实验的结果。(d)h3l3与daa协同作用。在用hcvcc感染之前，用h3l3与索非布韦(sof)或达卡他韦(dcv)联合预处理huh7.5.1细胞。72小时后，通过荧光素酶活性评估感染。根据prichard和shipman方法评估协同作用(定义为比预期的叠加效应高出20％的抑制，以黑色显示)。示出了代表性实验的结果。
图4.h3l3泛基因型地抑制phh的hcvpp感染而不逃逸。(a)h3l3与亲本抗体一样，结合phh和huh7.5.1细胞。用同种型对照、大鼠om-7d3-b3或人源化h3l3抗体(20μg/ml)染色细胞。示出了重复两次进行的一个实验的δmfi。(b)phh仅表达非常低的cldn6和cldn9表面水平。用同种型对照或cldn1-、cldn6-或cldn9-特异性mab(20μg/ml)处理随后在抑制实验中测试的来自供体的phh。cldn1、cldn6和cldn9的表达显示为δmfi。(c)h3l3抑制phh的hcvpp感染而不逃逸。在用hcvpp感染之前，用h3l3处理来自多达十个不同供体的phh1小时。72小时后，通过荧光素酶活性评估感染。结果显示重复两次进行的一个实验(phh)或重复三次进行的两个独立实验(huh7.5.1)。
图5.h3l3治愈慢性hcv感染的人-肝嵌合upa-scid小鼠。(a)每周用500μg的h3l3抗-cldn1mab处理慢性感染hcvjc1的两只小鼠，持续4周。作为对照，用同种型对照人抗体类似地处理一只小鼠。监测人白蛋白(b)和igg4(c)水平。红色+符号表示抗体治疗的次数。
具体实施方式
实施例1：
材料和方法
大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3可变区的测序。使用qiagenrneasy迷你试剂盒从107个杂交瘤细胞的无rnase的纯水中分离总rna。通过逆转录，使用来自大鼠igg2b的恒定结构域(ch1)和大鼠κ轻链的引物制备vh和vlcdna。使用对应于信号序列区的引物库扩增cdna，随后将其克隆到pgem-teasy载体(promega)。筛选克隆的插入物，并通过测序测定dna序列。如所述(29)，参考其他抗体序列鉴定cdr。
大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3的人源化和抗体制备。如所述(30,31)，通过cdr移植进行人源化。简言之，使用igblast工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)鉴定与imgt数据库中的大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3最相似的人种系vh和vk序列(图1a)。将mabom-7d3-b3的cdr移植到鉴定的vh和vk人种系序列的框架区。另外，将抗cldn1mabom-7d3-b3的框架区与大鼠种系序列进行比较，以鉴定可能有助于抗体特异性的主要序列变异。框架区中的这些氨基酸被保留或改变(单独或成组)为最相似的人种系序列中存在的氨基酸。以这种方式，在第一轮人源化中产生三个变体，每个重链(h1、h2、h3)和轻链(l1、l2、l3)(图1b)。将这些vh和vk变体分别与人igg4重链和人κ轻链的恒定结构域框内融合，并克隆到合适的哺乳动物表达载体中。通过将含有适当重链和轻链变体的质粒共转染到中国仓鼠卵巢(cho)细胞中，制备了9个全长人源化抗体(h1l1、h1l2、h1l3、h2l1、h2l2、h2l3、h3l1、h3l2和h3l3)。收获上清液并使用mabtrap试剂盒(gehealthcare)纯化抗体。在将抗体用于后续实验之前，将抗体缓冲液变为pbs。
细胞和病毒。如上所述培养huh7.5.1(16)、hepg2(32)和人胚肾293t(33)细胞。先前已经描述了携带菌株h77、hcv-j、jfh1、j8、nihs52、ukn3a1.28、ukn4.21.16、ukn5.14.4、ukn6.5.340的包膜糖蛋白的hcvpp(34)的制备。从慢性感染hcv并在斯特拉斯堡大学医院咨询的患者的血清中克隆菌株gt3sxb1(基因型3)。如对于hcv-ad78(33)所述，使用ecorv限制性位点扩增e1e2序列并将其插入phcmvires载体。已经描述了荧光素酶报告基因hcvcc(luc-jc1)以及daa抗性突变体luc-jc1-a156s、luc-jc1-r155k和luc-jc1-y93h的制备(23,35)。
原代人肝细胞(phh)。从在斯特拉斯堡大学医院接受肝切除术的患者的肝组织中分离phh。获得了知情同意并且方案得到了斯特拉斯堡大学医院当地伦理委员会的批准(cpp10-17)。如(24)所述分离和培养phh。
流式细胞术。为了评估人源化抗体与huh7.5.1、hepg2和293t细胞上表达的cldn1的结合，将2x105个细胞与20μg/ml抗cd81mabjs-81(bdbiosciences)、大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3、人源化抗cldn1mab或pbs在室温下孵育1小时。洗涤细胞并与藻红蛋白(pe)偶联的物种特异性第二抗体在4℃孵育45分钟以允许检测结合。随后洗涤细胞并用2％多聚甲醛(pfa)固定，然后使用bdlsrii流式细胞仪通过流式细胞术分析。减去pbs的背景荧光后获得净δ中值荧光强度(δmfi)。为了评估结合的特异性，用空载体或编码人cldn1的pcdna3.1转染293t细胞。48小时后，如上所述评估抗体的结合。
我们还评估了人源化抗体克隆h3l3与phh的结合，以及phdn表面上cldn亚型的表达。如(28)所述，用20μg/ml的cldn特异性mab(cldn1、大鼠om-7d3-b3或人源化h3l3；cldn6、大鼠wu-9e1-g2；cldn9、大鼠yd-4e9-a2)或对照同种型抗体处理冷冻保存的phh(来自与抑制实验中使用的相同供体)。然后用物种特异性的pe偶联的第二抗体染色细胞以检测结合。洗涤后，用2％pfa固定细胞，并通过流式细胞术(facscan)分析。在所有实验中，平行分析huh7.5.1细胞和phh。
使用人源化抗cldn1mab的抑制测定。将huh7.5.1或phh与抗体(对照mab、大鼠om-7d3-b3和人源化h3l3；测试100μg/ml至0.001μg/ml的连续稀释)一起在37℃预孵育1小时，随后分别暴露于hcvcc或hcvpp。对于hcvpp实验，评估来自几个不同供体的phh。处理后，用hcvpp在37℃下感染细胞4小时。72小时后，通过测量细胞内荧光素酶活性来分析感染，表示为相对光单位(rlu)。
细胞-细胞传播测定。已经描述了hcv细胞-细胞传播测定(36)。简言之，用hcvjc1rna(病毒生产细胞)电穿孔huh7.5.1细胞，并在人源化抗cldn1克隆h3l3抗cldn1、大鼠抗cldn1克隆om-7d3-b3或同种型对照mab(11μg/ml)存在下与稳定表达绿色荧光蛋白(gfp)的未感染huh7.5靶细胞共培养。通过中和hcv抗e2mab，ap33(25μg/ml)阻断无细胞的传播。24小时后，用2％pfa固定细胞，并用ns5a特异性抗体(virostat，0.1μg/ml)染色。通过流式细胞术(bdlsrii)评估新生感染(gfp和ns5a双阳性细胞)。细胞-细胞传播表示为在hcv抗-edmabap33存在下相对于huh7.5-gfp+靶细胞的gfp+ns5a+感染细胞的百分比。
评估抗病毒协同作用。如前所述(22)，在hcvcc(jc1-luc)模型中与daa联合测试人源化抗cldn1抗体h3l3。用h3l3与索非布韦或达卡他韦的组合在37℃下预处理huh7.5.1细胞1小时，然后在组合化合物存在下与hcvcc一起在37℃孵育4小时。72小时后，通过荧光素酶活性评估病毒感染。使用prichard和shipman方法评估协同作用(37)。抑制比叠加效应预期的水平高出20％以上表明显著的协同作用(37)
hcv感染和人-肝嵌合upa-scid小鼠的处理。根据当地伦理委员会批准(cremeas，项目编号02014120416254981(apafls#72.02)和02014120511054408(apafis#74.03))在insermu1110动物设施中进行实验。如(38)所述，在小鼠白蛋白启动子控制下与尿激酶型纤溶酶原激活物表达同源的严重联合免疫缺陷小鼠(upa-scid)中植入phh。然后如(21)所述，通过腹膜内(ip)注射用hcvcc(jc1；基因型2a)感染人肝-嵌合upa-scid小鼠。感染后三周，每周一次腹膜内注射25mg/kg人源化h3l3或同种型对照mab，持续4周(21)。如(21)所述，监测血浆hcvrna、人白蛋白和igg4水平。
结果：
抗cldn1抗体om-7d3-b3的人源化。先前描述的大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3在体外和体内有效抑制hcv感染(20,21)。此外，该抗体在人肝脏嵌合upa-scid和免疫活性balb/c小鼠中未显示毒性或副作用(21)。为了进一步促进该mab的临床开发，我们将其人源化为人igg4亚型。为此，将从杂交瘤细胞中回收的cdna测序以鉴定vh和vl基因。大鼠om-7d3-b3的vh和vl源自vh5(ighv5s49*01)和vk6(igkv6s11*01)基因家族，其分别经历了j区段基因的jh2(ighj2*01)和jk1(igkj1*01)家族的重排(图1a)。为了确定vh和vl序列的功能，我们在cho细胞中制备了重组全长igg2b(亲本同种型)抗体，并表征了其结合和抑制特性。实际上，该抗体能够结合cldn1并抑制hcvcc感染(数据未显示)，证实了序列的功能性，从而使我们能够进行人源化。
我们通过修饰框架区中的残基同时保持cdr完整来使vh和vl链人源化。为了促进该过程，我们首先使用igblast工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)通过与imgt数据库中的序列进行比较来鉴定最相似的人种系vh和vl氨基酸序列。最接近的匹配的人ig种系v序列是vh的ighv3-21*01和vl的igkv3-15*01，其中相应的同源性分别为83.7％和64.5％(图1a)。使用这些人种系序列作为指导，我们通过cdr移植制备了重链和轻链的不同变体。将这些变体克隆到携带人igg4恒定结构域的载体中，产生一组9个具有不同重链和轻链组合的全长抗体(图1b)，我们将其称为h1l1、h1l2、h1l3、h2l1、h2l2、h2l3、h3l1、h3l2和h3l3。通过用含有大鼠抗cldn1抗体om-7d3-b3的人源化重链和轻链可变结构域和人igg4恒定结构域的质粒瞬时共转染cho细胞产生重组全长抗体。使用mabtrap试剂盒(gehealthcare)中提供的蛋白g柱从上清液中纯化抗体，然后将缓冲液更换为pbs。然后我们测试了这些抗体与huh7.5.1和hepg2细胞表面上表达的cldn1结合的能力；将不表达cldn1的293t细胞用作阴性对照。如图2a所示，人源化抗体与huh7.5.1和hepg2细胞结合，但不与cldn1阴性的293t细胞结合。人源化抗体的结合谱与亲本大鼠抗cldn1抗体相似。选择克隆h3l3以研究人源化抗体的结合特异性。我们用编码人cldn1的质粒转染293t细胞，并比较抗体与亲本cldn1缺陷型293t细胞的结合。如对亲本大鼠抗体所观察到的，人源化抗cldn1mabh3l3与过表达人cldn1的293t细胞结合，但不与空载体转染的对照细胞结合(图2b)。
人源化cldn1特异性抗体的抗病毒活性。我们接下来在hcvcc抑制测定中评估了一组人源化抗体的抗hcv活性。正如基于它们的结合谱所预期的，25μg/ml的所有九个人源化抗体均有效抑制huh7.5.1细胞的hcvcc感染(图2c)。为了研究人源化抗体是否在更生理的背景下抑制hcv进入，我们使用携带基因型1a和1b包膜糖蛋白的假颗粒测试了这些抗体抑制phh的hcvpp感染的能力。所有抗体均以20μg/ml抑制hcvpp进入phh(图2d)。此外，所有人源化抗体的抗hcv活性与亲本大鼠抗体的抗hcv活性最相似。总之，这些数据表明所有九个人源化抗体在功能上与原始大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3相似。
我们制备了第二组九个衍生自三种另外的人源化轻链和重链变体的不同组合的抗体。发现所有九个另外的抗体以剂量依赖性方式同样有效地抑制huh7.5.1细胞的hcvcc感染(数据未显示)。由于在这18个人源化抗体的框架区中所做的改变都没有对它们的抗hcv活性产生任何影响，我们得出结论，大鼠mabom-7d3-b3的功能性残基可能位于cdr中。
h3l3有效抑制hcv感染和扩散。基于其有利的结合和抑制特性，我们选择人源化抗cldn1mab克隆h3l3用于详细的功能表征。我们首先使用hcvcc(luc-jc1；基因型2a)和huh7.5.1细胞比较人源化抗cldn1mabh3l3和亲本大鼠om-7d3-b3抗体的剂量-反应谱。人源化抗cldn1h3l3有效地且剂量依赖性地抑制huh7.5.1细胞的hcvcc感染，特征与亲本大鼠抗cldn抗体非常相似(图3a)。此外，h3l3和om-7d3-b3均抑制被daa抗性hcvccns3突变体jc1-a156s和jc1-r155k感染(图3a)。两种抗体对daa抗性hcvcc和野生型hcvcc同样有效(图3a)。
考虑到细胞-细胞传播在hcv持久性中的重要作用以及先前证明的大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3阻断这种hcv进入途径的能力(21)，我们在细胞-细胞传播测定中测试了人源化抗cldn1mabh3l3。如所预期的，h3l3有效阻断hcv的细胞-细胞传播(图3b)，效力与对大鼠mabom-7d3-b3观察到的相似(图3c)。这些数据表明，人源化抗cldn1mabh3l3与亲本大鼠抗体具有相同的功效。
先前的工作证明了大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3和daa之间的抗病毒协同作用(22)，这是联合疗法中的一个有吸引力的特征。我们使用prichard方法(37)来测定人源化抗cldn1mabh3l3是否保留与daa协同作用的能力。实际上，将h3l3与索非布韦或达拉他韦联合产生显著的协同活性(图3d)。
h3l3泛基因型地抑制phh的hcvpp感染，没有可检测的逃逸。鉴于之前已经报道了在表达cldn6和/或cldn9的细胞系中某些hcv基因型从cldn1定向治疗逃逸(25-27)，我们使用h3l3抗体研究了在phh环境中逃逸的生理相关性。如先前对亲本大鼠抗体所观察到的，我们首先使用流式细胞术分析来确定h3l3与phh结合(图4a)。基于先前观察到的phh表达可忽略不计的cldn6和cldn9水平，我们接下来评估了来自四个不同供体的phh上的cldn6和cldn9的表达水平(28)。实际上，流式细胞术分析显示，来自这四个供体的phh(phh218、235、283和s2310)仅表达非常低的cldn6表面水平，与huh7.5.1细胞中稳健的cldn6表达相反(图4b)。phh和huh7.5.1细胞均不表达可检测的cldn9(图4b)。
然后，我们评估了在phh中这种低cldn6表达的功能相关性。使用hcvpp系统，我们测试了所有主要基因型进入phh(供体283)。h3l3泛基因型地抑制phh的hcvpp感染，没有可检测的逃逸(图4c)。为了进一步排除逃逸的可能性，我们从另外9个供体中分离phh(包括phh235和s2310)，其具有非常低或可忽略的表面cldn6和cldn9表面表达水平(图4b)。我们选择了一个基因型1b菌株和三个基因型3a菌株进行进一步评估，因为这些基因型倾向于从cldn1逃逸(27)。此外，基因型3a目前难以治疗并且与快速进展为严重肝病相关(2)。在任何测试的phh中，我们没有检测到任何基因型的逃逸(图4c)。因此，从体内cldn1抗体逃逸可能被cldn6的低表面表达水平排除，并且可能与人肝脏的背景无关。
h3l3治愈人肝嵌合upa-scid小鼠的慢性hcv感染。最后，我们通过测试其治愈hcv慢性感染的人肝-嵌合upa-scid小鼠的能力来评估人源化抗cldn1mabh3l3的体内功效。每周向慢性hcv感染的小鼠腹膜内注射25mg/kg人源化抗cldn1mabh3l3(n＝2)或同种型对照人igg4mab(n＝1)，持续4周。所有cldn1特异性mabh3l3处理的小鼠在研究期结束时显示不可检测的hcvrna水平(图5a)。处理小鼠中稳定的人白蛋白水平证实了人phh的植入(图5b)，并表明h3l3抗体不影响肝功能(图5c)。因此，如对亲本大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3所观察到的，人源化cldn1特异性mabh3l3诱导慢性hcv感染的清除(21)。总之，我们的数据证明了大鼠抗cldn1mab的成功人源化，从而为其临床开发铺平了道路。
讨论：
我们先前报道了在体外和体内具有有效和广谱抗hcv活性的大鼠抗cldn1mab的制备(20,21,24)。为了促进这些抗体用于抗hcv治疗的临床开发，我们将我们的重要大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3人源化。我们通过在人igg4的骨架上移植大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3的cdr来制备人源化抗体。我们评估了在抗体功能中具有潜在作用的框架区中的残基。虽然我们注意到大鼠抗cldn1mab的轻链和重链在序列中的几个位置具有主要的种系变异，但在这些位置的氨基酸变化似乎是良好耐受的。与轻链(例如大鼠和人源化l3变体之间的18个取代)相比，重链相对容易人源化，需要更少的取代(例如大鼠和人源化h3变体之间的9个取代)。此外，我们发现由分别与嵌合(大鼠可变结构域和人igg4恒定结构域)轻链或重链配对的人源化重链或轻链组成的抗体不仅与cldn1结合，而且在抑制huh7.5.1细胞的hcvcc感染方面同样有效。这强烈表明抗cldn1mabom-7d3-b3在重链和轻链之间的配对方面对框架区中的取代高度耐受，如其活性所反映的。有趣的是，在该手稿的准备过程中，噬菌体展示筛选鉴定了与cldn1结合的人单链抗体片段(39)。将12个克隆转化为人igg4，其中一些抑制huh7.5细胞的hcvcc感染(39)。然而，这些抗体在phh和动物模型中的活性仍有待确定。
值得注意的是，我们制备的所有人源化抗体都能够以相似的效力结合cldn1并抑制hcvcc感染。我们选择mabh3l3进行详细表征，发现在抑制hcvcc感染和不同基因型的hcvpp进入、阻断细胞-细胞传播和治愈慢性hcv感染的人肝-嵌合upa-scid小鼠方面，它与亲本大鼠抗体一样有效。鉴于已经在细胞系中描述了通过cldn6和/或cldn9的cldn1靶向治疗的基因型依赖性逃逸(25-27)，我们使用h3l3抗体评估了在phh中逃逸的功能相关性。h3l3有效地且泛基因型地抑制来自多达十个不同供体的phh的hcvpp感染，没有任何可检测的逃逸(图4c)。phh中缺乏逃逸反映了cldn6和cldn9的低表面表达水平(图4b)，这与感染患者肝脏中高度变化的cldn6mrna表达(27)、肝脏切片中缺乏cldn6蛋白表达(28)和在原代肝细胞中缺乏cldn6和cldn9蛋白表达(26)一致。因此，至少对于大多数患者而言，体内从cldn1定向治疗例如h3l3抗体逃逸可能无关。
任何新开发的hcv抗病毒药物都可能被纳入联合治疗方案。重要的是，h3l3与目前批准的daa、索非布韦和达卡他韦协同作用(图3d)，并且h3l3也对daa抗性的hcvns3突变体具有活性(图3a)。这些是潜在联合治疗的有吸引力的特征。我们还显示，h3l3对目前难以治疗并且与更严重的肝病相关的基因型3a的不同分离株具有活性(2)。因此，h3l3代表治疗失败患者的新型治疗策略。
抗cldn1mabom-7d3-b3的人源化是其临床开发的第一步。任何潜在的抗受体抗体必须是安全的，没有任何抗体介导的效应子功能，并且是非免疫原性的。为了避免抗体介导的效应子功能破坏健康的肝细胞，我们将抗cldn1mabom-7d3-b3人源化为igg4同种型，其既不能使自然杀伤(nk)细胞敏感也不能激活补体系统。因此，igg4不诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体介导的靶细胞裂解。尽管大鼠抗体本身的人源化可能会降低其在人体中的免疫原性，但是抗体将需要在具有更接近人类的免疫系统的适当动物模型(例如非人灵长类动物)中进一步评估。即使在没有抗体介导的细胞毒性的情况下，靶向任何宿主蛋白也可能导致不希望的生理破坏。我们已经证明，大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3在免疫活性小鼠中不会引起任何毒性(21)；对于人源化抗cldn1mabh3l3，情况可能也是如此。值得注意的是，人源化抗体在体外不发挥任何细胞毒性(数据未显示)。我们在人肝嵌合体小鼠中未观察到任何明显的毒性作用(图5b)。
总之，我们报道了大鼠抗cldn1mabom-7d3-b3的成功人源化，而没有抗hcv功能的任何损失。在合适的动物模型中对该抗体进行临床前功效和毒性研究的进一步评估将为人类的临床试验铺平道路。针对对当前疗法没有反应或预防肝移植物感染没有反应的患者，诸如h3l3的抗受体抗体可以为hcv治疗提供替代方法。此外，将cldn1鉴定为登革热病毒的进入因子(40,41)也开启了开发人源化抗cldn1mab作为潜在的抗登革热剂的有趣的观点。
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41.gaof,duanx,lux,liuy,zhengl,dingz,lij.novelbindingbetweenpre-membraneproteinandclaudin-1isrequiredforefficientdenguevirusentry.biochembiophysrescommun2010；391:952-957.
实施例2：
用于治疗非酒精性脂肪肝炎(nash)的claudin-1特异性单克隆抗体的临床前开发
nash，下一个全球流行病。当少量饮酒或不饮酒的人的肝细胞中堆积过多脂肪时，发生非酒精性脂肪肝病(nafld)。nafld与各种代谢风险因素相关，例如肥胖和糖尿病。nafld可以发展为晚期肝病和肝癌(1)。简单的脂肪堆积(称为脂肪变性)占nafld病例的80-90％，而肝脏脂肪堆积和炎症(称为nash)占10-20％(2)。nash代表nafld的最极端形式，并且在西方国家中4-22％的hcc病例由nash诱导。此外，nafld相关性肝硬化占全球肝硬化诱发的hcc的15-30％(3)。由于nafld已达到流行病的比例，并且正在成为慢性肝病的最常见原因，nash可能会取代慢性丙肝，成为本十年肝硬化和肝移植的主要指征。尽管存在这种令人担忧的趋势，但仍缺乏有效的治疗，并且继续依赖已知效果有限的饮食干预和体育锻炼。因此，迫切需要安全的药物治疗，其成功地逆转或预防nash患者的肝损伤和纤维化进展(4)。一些用于治疗nash的化合物已达到临床开发--gft505、genfit；oca、intercept；aramchol-花生四酰酰胺胆酸、galmedpharmaceuticalsltd。然而，到目前为止，疗效仅限于临床化学(肝功能测试)的改进。对纤维化和疾病进展的效果很小，其安全性有局限性(5)。
鉴定用于临床前和临床开发的重要人源化cldn1mab。
为了确定用于进一步开发的重要人源化cldn1mab，我们在我们的基于肝细胞的系统中评估了我们的一组九个人源化cldn1mab同种型的性能。将huh7.5.1分化为肝细胞样huh7.5.1dif细胞，持续用hcvjc1感染以诱导肝病进展特征。在第7天用单克隆mab处理细胞3天。在不影响hcv负荷的浓度下用所有9个cldn1mab同种型处理导致肝病进展特征的显著逆转。这表明cldn1mab独立于其抗病毒活性作用于肝病进展特征并且独立于病因(病毒、酒精、nash)恢复肝病进展特征的表达。选择h3l3同种型作为重要cldn1mab用于进一步开发，因为其对肝病进展特征的强烈效果和在细胞培养和动物模型中的详细表征(colpitts等，gut2016inpress)。
验证人源化cldn1mab(h3l3)作为治疗慢性肝病和nash的重要候选化合物。
利用我们基于患者肝病进展特征的肝脏模型系统，我们评估了人源化cldn1mab在逆转由各种病因(hcv、hbv、酒精和nash)诱导的肝病进展特征方面的功效。人源化cldn1mab(h3l3)有效逆转nash模型(ffa)以及其他病因中的肝病进展特征，证实其作为nash治疗候选物的潜力。最引人注目的是，与nash治疗临床开发中最先进的分子(gtf505和oca)相比，cldn1mab在逆转肝病进展特征方面更有效(数据未显示)。
用于治疗慢性肝病/nash的抗claudin的体内概念验证
为了在小鼠模型中进行概念验证研究，我们制备了靶向人claudin-1的鼠源化抗体。小鼠cldn1特异性mabmigg3与小鼠和人cldn1结合，尽管对小鼠claudin-1的亲和力降低。重要的是，用鼠源化cldn1mab处理肝细胞样细胞导致肝病进展特征的逆转，证实该抗体在体外和体内研究中的进一步应用。小鼠的药代动力学研究显示半衰期为7.7天(数据未显示)。用人源化和鼠源化cldn1mab处理导致肝病进展特征的抑制(数据未显示)。
我们接下来使用体内小鼠模型进行了一项研究，以解决cldn1mab对肝病进展的影响。通过单次施用二乙基亚硝胺(den)在c3h/he小鼠中诱导肝病，其导致微血管脂肪变性，影响约6％的肝脏(数据未显示)。为了评估mab对肝病进展的影响，给予小鼠鼠源化cldn1mabmigg3五周。尽管所有对照动物在施用den后第23周继续发展肝脏脂肪变性，在用cldn1特异性mab处理的小鼠中观察到脂肪变性明显且大量减少(数据未显示)。由于在该模型中纤维化发展很少或不存在，因此无法评估mab对纤维化的影响。将在高脂肪饮食模型中评估对纤维化的影响，如以下章节所述。该初步研究表明，mab逆转肝病进展，包括体内脂肪变性的治疗。与之前描述的mab的优异体内安全性特征(12)一致，我们没有观察到任何可检测的副作用。
参考文献
1.musso,g.,cassader,m.&gambino,r.non-alcoholicsteatohepatitis:emergingmoleculartargetsandtherapeuticstrategies.nat.rev.drugdiscov.,2016,15:249-274
2.hashimoto,e.,taniai,m.&tokushige,k.characteristicsanddiagnosisofnafld/nash.j.gastroenterol.hepatol.,2013,28suppl4:64-70
3.michelotti,g.a.,machado,m.v.&diehl,a.m.nafld,nashandlivercancer.nat.rev.gastroenterol.hepatol.,2013,10:656-665
4.fuchs,m.newmedicaltreatmentstrategiesfornonalcoholicsteatohepatitis.curr.treat.optionsgastroenterol.,2015,13:259-273
5.ratziu,v.等,elafibranor,anagonistoftheperoxisomeproliferator-activatedreceptor-alphaand-delta,inducesresolutionofnonalcoholicsteatohepatitiswithoutfibrosisworsening.gastroenterol.,2016,150:1147-1159
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