一种基于并行光斑扫描的实时荧光辐射微分超分辨显微方法与装置与流程

本发明属于超分辨显微领域，尤其涉及一种能在远场同时获得一幅由实心光斑调制得到的正共焦图像与空心光斑调制得到的负共焦图像，并利用差分方法实现超衍射极限分辨率的超分辨显微方法与装置。

背景技术：

荧光显微镜的发展极大地促进了生物细胞学等领域的研究，然而由于光学衍射，常规的远场光学显微方法存在一个分辨率极限，根据阿贝衍射极限理论，其衍射极限可以用物镜的聚焦光斑的半高全宽来表示，即δr＝0.61λ/na，其中λ是光波波长，na是物镜数值孔径。近十几年来，许许多多的科研人员在突破光学衍射极限上取得了一个又一个重大的突破，例如受激辐射损耗超分辨显微技术(stimulationemissiondepletionmicroscopy，sted)、荧光辐射微分超分辨显微技术(fluorescenceemissiondifferencemicroscopy,fed)、结构光照明超分辨显微技术(structureilluminationmicroscopy,sim)、光激活定位超分辨显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,plam)以及随机光学重构超分辨显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,storm)等。

荧光辐射微分超分辨显微术是最近才提出的一种新型的超分辨显微方法，该方法在共焦基础上利用两种不同模式的激发光斑激发产生荧光图像，即一种是由实心光斑调制得到的正共聚焦显微图像，另一种是由面包状空心光斑调制得到的负共聚焦显微图像，其中空心光斑的中心为一个尺寸小于衍射极限的暗斑，利用这两幅图像的强度差异消除边缘激发的信号，实现超分辨，是一种微分成像。

与其他超分辨显微方法相比，fed可以实现更低的荧光漂白特性，更快的成像速度，且具有一定的光学层析能力。然而，由于fed的原理，其在成像时需要一张正共焦图像与一张负共焦图像，这便造成如果要得到一幅超分辨图像，其需要扫描两次，使得成像速度降低。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于并行光斑扫描的实时荧光辐射微分超分辨显微方法与装置，本发明方法与传统的fed方法相比，其成像速度提高两倍，实现在共焦成像速度下的超分辨成像。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于并行光斑扫描的实时荧光辐射微分超分辨显微方法，包括以下步骤：

(1)将激光器发出的激光光束准直后利用偏振分光镜(pbs)分成s偏振光和p偏振光；

(2)利用四分之一波片将s偏振光调制为圆偏振实心光斑；

(3)对p偏振光进行相位调制，调制成涡旋偏振光；

(4)利用四分之一波片将调制后的p偏振光进一步调制为圆偏振空心光斑；

(5)根据圆孔衍射极限公式，为保证实心光斑和空心光斑不会互相干扰，利用光束偏转装置使得实心光斑激发光和空心光斑激发光在物面上错开至少200nm以上；

(6)利用实心光斑激发光和空心光斑激发光对荧光样品同时进行二维扫描，滤去杂散光和激发光，收集荧光信号，得到由实心光斑调制得到的正共聚焦荧光强度图i1(x,y)和由空心光斑调制得到的负共聚焦荧光强度图i2(x,y)；

(7)将两幅荧光强度图进行移位匹配，根据公式i(x,y)＝i1(x,y)-γi2(x,y)得到超分辨图像i(x,y)，其中为第一信号光强i1(x,y)的最大值，为第二信号光强i2(x,y)的最大值；i(x,y)为负数时，设置i(x,y)＝0。

进一步地，所述步骤(1)中，利用二分之一波片调整两束偏振光的分光比，使得s偏振光的光强弱于p偏振光。

进一步地，所述步骤(3)中，利用涡旋位相板对p偏振光进行相位调制，调制函数为其中ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

进一步地，所述步骤(5)中，光束偏转装置可以采用平面反射镜、二色镜等。

进一步地，所述步骤(6)中，利用雪崩光电二极管(apd)或光电倍增管(pmt)收集荧光信号。

本发明提供了两种基于并行光斑扫描的实时荧光辐射微分超分辨显微装置，均包括激光器、激发光调制光路子模块、承载待测荧光样品的载物台、投射光线到载物台的显微镜架和探测光路子模块。

所述激发光调制光路子模块包括：

用于将激光器发出的点光源的光扩束为平行光的扩束镜；

用于调制扩束镜出射光偏振方向的二分之一波片；

用于将二分之一波片出射光分为p偏振光和s偏振光的偏振分光器；

用于将p偏振光进行0～2π相位调制的涡旋位相板；

用于将p偏振光和s偏振光调制为圆偏振光的四分之一波片；

用于将p偏振光和s偏振光合束的光束分光镜；

用于反射s偏振光且透射荧光的二色镜；

用于将两束圆偏振光在物面上错开至少200nm以上的第一平面反射镜；

用于将光束分光镜出射光进行聚焦的扫描透镜。

所述显微镜架包括：

用于将扫描透镜出射光进行光束偏转的第二平面反射镜；

用于将第二平面反射镜出射光进行准直的管镜；

用于将管镜出射光汇聚到载物台的显微物镜；

进一步地，显微物镜的数值孔径na＝1.49，放大倍率为100倍，管镜的焦距为200mm，扫描透镜的焦距为50mm。

所述探测光路子模块包括两种方案：

方案一，具体包括：

用于滤去二色镜出射光中的杂散光的带通滤波片；

用于将带通滤波片出射光进行汇聚的双胶合透镜；

用于将双胶合透镜的两路出射光进行分路的半圆形平面反射镜；

用于将半圆形平面反射镜出射的两路信号光分别进行放大的第一4f透镜组；

用于将第一4f透镜组出射光束进行空间滤波的空间滤波器；空间滤波器可选用针孔或多模光纤实现，大小应小于一个艾里斑直径；

用于探测空间滤波器出射光束的第一探测器；第一探测器可选用光电倍增管(pmt)或雪崩光电二极管(apd)。

方案二，具体包括：

用于滤去二色镜出射光中的杂散光的带通滤波片；

用于将带通滤波片出射光进行汇聚的双胶合透镜；

用于将双胶合透镜的两路出射光进行放大的第二4f透镜组；

用于将第二4f透镜组出射的两路光分别进行空间滤波的并行滤波光纤；并行滤波光纤的间距为375um，为了保证收集到艾里斑60％的能量，整个系统的放大倍率设置为800倍，因此两光斑在物面的间距应为470nm±50nm。

用于探测并行滤波光纤出射光束的第二探测器；第二探测器可选用光电倍增管(pmt)或雪崩光电二极管(apd)。

本发明原理如下：在原有的荧光辐射微分超分辨显微系统的基础上进行了创新，将两重合光斑错开大于一个艾里斑的距离，并改进了探测模块，利用一个半圆形平面反射镜将其中一路错开信号反射到独立的探测系统中，而另一路则直接探测，或者利用并行滤波光纤探测错开的荧光信号。

根据圆孔衍射极限公式其中k为波矢，a为圆孔半径，θ为孔径角，i0为中心光强极大值，其艾里斑直径可由公式得到，次级大的相对强度为i2≈0.00175i0，因此当两光斑相间大于一个艾里斑距离时，其旁瓣的影响则小于千分之二，因此两光斑需要间隔大于一个艾里斑，以保证光斑相互间不影响。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：由于采用两光斑同时扫描，相比于传统的荧光发射差分显微系统来回切换调制光斑的做法，其采样速度大于传统两倍，实现共焦扫描速度下超分辨动态显微效果，可明显提高成像速度。

附图说明

图1为本发明显微装置方案一示意图；

图2为本发明显微装置方案二示意图；

图3为本发明所提出的并行光斑扫描在物面间隔位置示意图；

图4中，(a)为图1虚线框内半圆形平面反射镜示意图，(b)为图2虚线框内并行滤波光纤示意图；

图5中的(a)、(b)分别为实心光斑和空心光斑放大示意图；

图6为实心光斑减去空心光斑微分超分辨示意图。

具体实施方式

下面结合实例和附图来详细说明本发明，但本发明不限于此。

实施例1

本实施例提供的一种基于并行光斑扫描的实时荧光辐射微分超分辨显微方法，包括以下步骤：

(1)将激光器发出的激光光束准直后利用偏振分光镜(pbs)分成s偏振光和p偏振光；

(2)利用四分之一波片将s偏振光调制为圆偏振实心光斑；

(3)对p偏振光进行相位调制，调制成涡旋偏振光；

(4)利用四分之一波片将调制后的p偏振光进一步调制为圆偏振空心光斑；

(5)根据圆孔衍射极限公式，为保证实心光斑和空心光斑不会互相干扰，利用光束偏转装置使得实心光斑激发光和空心光斑激发光在物面上错开至少200nm以上；

(6)利用实心光斑激发光和空心光斑激发光对荧光样品同时进行二维扫描，滤去杂散光和激发光，收集荧光信号，得到由实心光斑调制得到的正共聚焦荧光强度图i1(x,y)和由空心光斑调制得到的负共聚焦荧光强度图i2(x,y)；

(7)将两幅荧光强度图进行移位匹配，根据公式i(x,y)＝i1(x,y)-γi2(x,y)得到超分辨图像i(x,y)，其中为第一信号光强i1(x,y)的最大值，为第二信号光强i2(x,y)的最大值；i(x,y)为负数时，设置i(x,y)＝0。

进一步地，所述步骤(1)中，利用二分之一波片调整两束偏振光的分光比，使得s偏振光的光强弱于p偏振光。

进一步地，所述步骤(3)中，利用涡旋位相板对p偏振光进行相位调制，调制函数为其中ρ为光束上某点与光轴的距离，为光束垂直光轴剖面内位置极坐标矢量与x轴的夹角。

进一步地，所述步骤(5)中，光束偏转装置采用平面反射镜、二色镜等。

进一步地，所述步骤(6)中，利用雪崩光电二极管(apd)或光电倍增管(pmt)收集荧光信号。

实施例2

如图1所示，本实施例提供的一种基于并行光斑扫描的实时荧光辐射微分超分辨显微装置，包括激光器14、激发光调制光路子模块、承载待测荧光样品的载物台1、投射光线到载物台1的显微镜架和探测光路子模块；

所述激发光调制光路子模块包括：

用于将激光器14发出的点光源的光扩束为平行光的扩束镜12；

用于调制扩束镜12出射光偏振方向的二分之一波片11；

用于将二分之一波片11出射光分为p偏振光和s偏振光的偏振分光器10；

用于将p偏振光进行0～2π相位调制的涡旋位相板9；

用于将p偏振光和s偏振光调制为圆偏振光的四分之一波片8；

用于将p偏振光和s偏振光合束的光束分光镜6；

用于反射s偏振光且透射荧光的二色镜7；

用于将两束圆偏振光在物面上错开至少200nm以上的第一平面反射镜13，通过调整第一平面反射镜13的偏转角度，使得合束后的空心光斑和实心光斑形成一定的夹角。

用于将光束分光镜6出射光进行聚焦的扫描透镜5。

所述显微镜架包括：

用于将扫描透镜5出射光进行光束偏转的第二平面反射镜4；

用于将第二平面反射镜4出射光进行准直的管镜3；

用于管镜3出射光汇聚到载物台1的显微物镜2；

进一步地，显微物镜2的数值孔径na＝1.49，放大倍率为100倍，管镜3的焦距为200mm，扫描透镜5的焦距为50mm。

所述探测光路子模块包括：

用于滤去二色镜7出射光中的杂散光的带通滤波片15；

用于将带通滤波片15出射光进行汇聚的双胶合透镜16；

用于将双胶合透镜16的两路出射光进行分路的半圆形平面反射镜17；

用于将半圆形平面反射镜17出射的两路信号光分别进行放大的第一4f透镜组18；

用于将第一4f透镜组18出射光束进行空间滤波的空间滤波器19；空间滤波器19可选用针孔或多模光纤实现，大小应小于一个艾里斑直径；

用于探测空间滤波器19出射光束的第一探测器20；第一探测器20可选用光电倍增管(pmt)或雪崩光电二极管(apd)。

该装置还包括用于控制激光器14和第一探测器20的计算机24。

实施例3

如图2所示，本实施例提供的一种基于并行光斑扫描的实时荧光辐射微分超分辨显微装置，包括激光器14、激发光调制光路子模块、承载待测荧光样品的载物台1、投射光线到载物台1的显微镜架和探测光路子模块；

所述激发光调制光路子模块包括：

用于将激光器14发出的点光源的光扩束为平行光的扩束镜12；

用于调制扩束镜12出射光偏振方向的二分之一波片11；

用于将二分之一波片11出射光分为p偏振光和s偏振光的偏振分光器10；

用于将p偏振光进行0～2π相位调制的涡旋位相板9；

用于将p偏振光和s偏振光调制为圆偏振光的四分之一波片8；

用于将p偏振光和s偏振光合束的光束分光镜6；

用于反射s偏振光且透射荧光的二色镜7；

用于将两束圆偏振光在物面上错开至少200nm以上的第一平面反射镜13；用于将光束分光镜6出射光进行聚焦的扫描透镜5。

所述显微镜架包括：

用于将扫描透镜5出射光进行光束偏转的第二平面反射镜4；

用于将第二平面反射镜4出射光进行准直的管镜3；

用于管镜3出射光汇聚到载物台1的显微物镜2；

进一步地，显微物镜2的数值孔径na＝1.49，放大倍率为100倍，管镜3的焦距为200mm，扫描透镜5的焦距为50mm。

所述探测光路子模块包括：

用于滤去二色镜7出射光中的杂散光的带通滤波片15；

用于将带通滤波片15出射光进行汇聚的双胶合透镜16；

用于将双胶合透镜16的两路出射光进行放大的第二4f透镜组21；

用于将第二4f透镜组21出射的两路光分别进行空间滤波的并行滤波光纤22；并行滤波光纤22的间距为375um，为了保证收集到艾里斑60％的能量，整个系统的放大倍率设置为800倍，因此两光斑在物面的间距应为470nm±50nm。

用于探测并行滤波光纤22出射光束的第二探测器23；第二探测器23可选用光电倍增管(pmt)或雪崩光电二极管(apd)。

该装置还包括用于控制激光器14和第二探测器23的计算机24。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。