一种荧光探针检测肌氨酸、肌氨酸氧化酶及其浓度的方法与流程

本发明属于肌氨酸检测的应用技术领域，具体涉及一种基于原位制备的铜纳米簇作为荧光探针检测肌氨酸和/或肌氨酸氧化酶的方法。采用铜纳米簇荧光法检测肌氨酸浓度的方法、采用铜纳米簇荧光法检测肌氨酸氧化酶浓度的方法以及采用铜纳米簇荧光法检测样品中是否含有肌氨酸或肌氨酸氧化酶的方法，尤其涉及一种荧光铜纳米簇在荧光法检测肌氨酸和/或肌氨酸氧化酶中的应用。

背景技术：

金属纳米簇是一种特殊材料，尺寸介于金属原子和纳米粒子之间。当金属本体材料的尺寸降到纳米级别甚至接近于电子费米水平，原来连续的能带就会分裂成若干个分立能级，这些分立能级导致了纳米簇具有可调的激发，良好的水溶性，光稳定性和低毒性等特点。因此纳米簇在生物小分子检测领域具有很高的应用价值。

肌氨酸又称为肌酸，是一种在肝脏产生的酸性物质，其作用是给人体肌肉群提供能量。肌氨酸最常见于脊椎动物。大多数身体产生的肌氨酸存储在支持骨骼的肌肉里。尿液中肌氨酸浓度的异常通常可以诊断重大疾病，如前列腺癌等，因此，在生命科学和临床医学中肌氨酸检测是十分重要的。目前，文献中记载的检测肌氨酸的方法大多是通过质谱或电化学等方式。这类方法一般需要大型仪器而且操作比较复杂。通过荧光方法具有灵敏度高，良好的选择性，线性范围较宽等特点。文献中大部分基于纳米簇检测肌氨酸的报道并不多见，而且原理都是通过荧光淬灭的方式实现。这种荧光“turn-off”的方式比较容易受到外界环境的影响，因为其他假信号可能带来阳性结果。因此，建立一种基于荧光功能金属纳米簇荧光“turn-on”方法来检测肌氨酸具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于铜纳米簇作为荧光探针检测肌氨酸和/或肌氨酸氧化酶的方法。该方法利用将肌氨酸氧化酶(sox)和肌氨酸(so)反应，原位条件下制备铜纳米簇并获得荧光性质，获得的纳米簇荧光发射强度与肌氨酸的浓度可以建立定量关系，从而实现检测是否含有肌氨酸以及检测肌氨酸的浓度。同理也可以检测是否含有肌氨酸酶以及检测肌氨酸酶的浓度。

本发明为更好的实现肌氨酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，完整和细化整个肌氨酸检测过程，所述检测待测样品中的肌氨酸浓度具体过程如下：

(1)取3500～4000μl不同浓度梯度的肌氨酸溶液(100～2000μm)，分别将其与100～500μl浓度为1mg/ml的肌氨酸氧化酶(sox)共混。然后置于40～45℃水浴锅中温育2～3h；

(2)在上述步骤(1)的各种浓度的溶液中，依次加入柠檬酸缓冲溶液(浓度为1mm,ph＝3.0)100～500μl,甲基丙烯酸100～400μl(浓度为40mm)，feso410～100μl(浓度为50mm)。震荡摇匀，室温下反应10～120min。之后用分子量为500～1500da的透析袋透析12～24h；

(3)取步骤(2)制得的溶液500μl，依次加入cu(no3)2100～500μl(100mm)，醋酸缓冲溶液50～100μl(ph＝4.0～5.0)，并震荡混合均匀。将样品置于波长为256nm的紫外光下辐照2～10分钟，得到铜纳米簇cuncs最终溶液；

(4)重复步骤(1)～(3)，测量不同浓度下的肌氨酸，测试铜纳米簇最终溶液的荧光发射光谱。建立铜纳米簇最终溶液的荧光强度的数值与肌氨酸浓度的定量关系曲线，作为铜纳米簇的荧光强度与肌氨酸浓度的工作曲线；

将肌氨酸溶液替换为待测样品后，按照步骤(1)～(3)进行，得到具有一定荧光强度的铜纳米簇cuncs的最终溶液；当最终溶液含有具有荧光强度的铜纳米簇时，所述待测样品中含有肌氨酸；

当最终溶液不含有具有荧光强度的铜纳米簇时，所述待测样品中不含有肌氨酸；根据待测样品溶液中铜纳米簇的荧光强度，关联定量关系，可以计算得到待测样品中的肌氨酸浓度；

同理，调换肌氨酸为肌氨酸酶并变化其浓度，可以检测是否含有肌氨酸酶以及检测肌氨酸酶的浓度。

本发明的这种一种基于铜纳米簇作为荧光探针检测肌氨酸和/或肌氨酸氧化酶的方法具有以下特点：1、避免了生物体其他氨基酸的干扰，可以选择性的检测尿液、汗液、血液中肌氨酸的浓度，可以无创地检测肌氨酸浓度；2、使用荧光turn-on的方法检测肌氨酸的浓度，而不是使用事先制备好的荧光金属纳米簇；最大限度地避免了实验中的假信号可能带来的干扰；3、生成的铜纳米簇具有优良的荧光性质，在光学材料、生物医学等领域上的应用具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例1肌氨酸浓度为600μm所制备的荧光铜纳米簇cuncs的透射电镜照片，表明制备的cuncs粒径均一，尺寸在1.3nm左右；

图2为实施例1中肌氨酸浓度为600μm所制备的荧光cuncs的荧光光谱，表明具有强烈的橙色荧光；

图3为实施例1不同肌氨酸浓度下所制备的cuncs荧光发射光谱；其中附图为拟合的铜纳米簇的荧光发射强度与肌氨酸浓度的定量关系曲线，表明可以定量检测肌氨酸的浓度；

图4为实施例1不同氨基酸为底物干扰时，最终溶液的荧光强度对比结果，表明可以特异性检测肌氨酸。

具体实施方式

实施例1

(1)取3600μl不同浓度梯度的肌氨酸溶液(100μm，200μm，400μm，600μm，800μm，1000μm，1200μm，1400μm)，分别将其与200μl浓度为1mg/ml的肌氨酸氧化酶(sox)共混。然后置于40℃水浴锅中温育3h；

(2)在上述步骤(1)的各种浓度的溶液中，依次加入柠檬酸缓冲溶液(浓度为1mm,ph＝3.0)500μl,甲基丙烯酸400μl(浓度为40mm)，feso4100μl(浓度为50mm)。震荡摇匀，室温下反应60min。之后用分子量为1500da的透析袋透析12h；

(3)取步骤(2)制得的溶液500μl，依次加入cu(no3)2100μl(100mm)，醋酸缓冲溶液100μl(ph＝4.0～5.0)，并震荡混合均匀。将样品置于波长为256nm的紫外光下辐照8分钟，得到铜纳米簇最终溶液；

(4)重复步骤(1)～(3)，测量不同浓度下的肌氨酸，测试铜纳米簇最终溶液的荧光发射光谱。建立铜纳米簇最终溶液的荧光强度的数值与肌氨酸浓度的定量关系曲线，作为铜纳米簇的荧光强度与肌氨酸浓度的工作曲线；

将肌氨酸溶液替换为待测样品后，按照步骤(1)～(3)进行，得到具有一定荧光强度的铜纳米簇的待测样品溶液；

最终溶液含有具有荧光强度的铜纳米簇，所述待测样品中含有肌氨酸；

其它不同氨基酸底物则不能得到含有具有荧光强度的铜纳米簇；

根据待测样品溶液中铜纳米簇的荧光强度，关联定量关系，可以计算得到待测样品中的肌氨酸浓度。

实施例2

(1)取4000μl不同浓度梯度的肌氨酸溶液(100μm，200μm，400μm，600μm，800μm，1000μm，1200μm，2000μm)，分别将其与100μl浓度为1mg/ml的肌氨酸氧化酶(sox)共混。然后置于45℃水浴锅中温育3h；

(2)在上述步骤(1)的各种浓度的溶液中，依次加入柠檬酸缓冲溶液(浓度为1mm,ph＝3.0)400μl,甲基丙烯酸300μl(浓度为40mm)，feso4100μl(浓度为50mm)。震荡摇匀，室温下反应60min。之后用分子量为1500da的透析袋透析20h；

(3)取步骤(2)制得的溶液500μl，依次加入cu(no3)2500μl(100mm)，醋酸缓冲溶液100μl(ph＝4.0～5.0)，并震荡混合均匀。将样品置于波长为256nm的紫外光下辐照8分钟，得到铜纳米簇最终溶液；

(4)重复步骤(1)～(3)，测量不同浓度下的肌氨酸，测试铜纳米簇最终溶液的荧光发射光谱。建立铜纳米簇最终溶液的荧光强度的数值与肌氨酸浓度的定量关系曲线，作为铜纳米簇的荧光强度与肌氨酸浓度的工作曲线；

将肌氨酸溶液替换为待测样品后，按照步骤(1)～(3)进行，得到具有一定荧光强度的铜纳米簇的待测样品溶液；

最终溶液含有具有荧光强度的铜纳米簇，所述待测样品中含有肌氨酸；

其它不同氨基酸底物则不能得到含有具有荧光强度的铜纳米簇；

根据待测样品溶液中铜纳米簇的荧光强度，关联定量关系，可以计算得到待测样品中的肌氨酸浓度。

实施例3

(1)取4000μl不同浓度梯度的肌氨酸溶液(100μm，200μm，400μm，600μm，800μm，1200μm，1800μm，2000μm)，分别将其与300μl浓度为1mg/ml的肌氨酸氧化酶(sox)共混。然后置于45℃水浴锅中温育3h；

(2)在上述步骤(1)的各种浓度的溶液中，依次加入柠檬酸缓冲溶液(浓度为1mm,ph＝3.0)300μl,甲基丙烯酸400μl(浓度为40mm)，feso4100μl(浓度为50mm)。震荡摇匀，室温下反应40min。之后用分子量为1000da的透析袋透析24h；

(3)取步骤(2)制得的溶液500μl，依次加入cu(no3)2400μl(100mm)，醋酸缓冲溶液100μl(ph＝4.0～5.0)，并震荡混合均匀。将样品置于波长为256nm的紫外光下辐照8分钟，得到铜纳米簇最终溶液；

(4)重复步骤(1)～(3)，测量不同浓度下的肌氨酸，测试铜纳米簇最终溶液的荧光发射光谱。建立铜纳米簇最终溶液的荧光强度的数值与肌氨酸浓度的定量关系曲线，作为铜纳米簇的荧光强度与肌氨酸浓度的工作曲线；

将肌氨酸溶液替换为待测样品后，按照步骤(1)～(3)进行，得到具有一定荧光强度的铜纳米簇的待测样品溶液；

最终溶液含有具有荧光强度的铜纳米簇，所述待测样品中含有肌氨酸；

其它不同氨基酸底物则不能得到含有具有荧光强度的铜纳米簇；

根据待测样品溶液中铜纳米簇的荧光强度，关联定量关系，可以计算得到待测样品中的肌氨酸浓度。