基于荧光功能金纳米簇的探针检测尿酸及其浓度的方法与流程

本发明属于尿酸检测的应用技术领域，具体涉及一种基于荧光功能金纳米簇的探针检测尿酸及其浓度的方法。

背景技术：

金属纳米簇是由几个到几十个金属原子组成的、尺寸介于金属原子和纳米粒子之间，甚至接近于电子费米波长。由于具有超小的尺寸，使其表现出不同于大尺寸纳米粒子的特殊性质，如可调的荧光发射、良好的光稳定性、较高的荧光量子产率、较大的斯托克斯位移、低毒性、易于制备等，因此纳米簇在生物小分子检测领域具有很高的应用价值。

尿酸是一种在人体代谢嘌呤时产生的物质。正常情况下，尿酸能溶解于血液，并通过尿液排出体外。但在身体产生太多尿酸，或无法从尿液排除时，血尿酸水平就会升高。血液中有太多尿酸会导致肾结石或痛风，这是一种以关节沉积尿酸晶体为特征的疼痛性关节炎。因此，在生命科学和临床医学中尿酸的检测是十分重要的。

目前，在临床分析中使用的传统方法是基于酶反应将其转化生成尿囊素，co2和h2o2等底物，然后进行通过紫外光谱进行测试；文献中报道的大部分检测尿酸的浓度方法也都是基于质谱或电化学分析。这类方法需要昂贵的和不稳定的试剂，也需要复杂的样品制备步骤和大型仪器。而通过荧光测试的方法具有灵敏度高，选择性好，线性范围较宽等特点。因此，建立一种基于荧光金属纳米簇荧光“turn-on”方法来实现尿酸浓度的方法，在临床研究等方面都具有重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于荧光金纳米簇作为探针检测尿酸和/或尿酸氧化酶的方法。该方法利用将尿酸氧化酶(uox)和尿酸(uo)发生反应，在原位条件下制备金纳米簇并获得荧光性质，获得的纳米簇荧光发射强度与尿酸的浓度可以建立定量关系，从而实现检测是否含有尿酸以及检测尿酸的浓度。

本发明为更好的实现尿酸的检测，保证荧光发射强度以及检测结果准确性和稳定性，完整和细化整个尿酸检测过程，所述检测待测样品中的尿酸浓度具体过程如下：

(1)配制不同浓度的尿酸(uo)水溶液(100～2000μm)。取其中3.5～4.0ml，加入浓度为50u/ml的尿酸氧化酶(uox)0.1～0.5ml，并用浓度为1m的naoh将其ph调至8～8.5。然后置于37～40℃水浴锅中温育2～3h；

(2)取上述步骤(1)的不同浓度的混合溶液，依次加入浓度为40mm的甲基丙烯酸(maa)水溶液0.1～0.4ml，浓度为50mm的feso4水溶液0.01～0.1ml，搅拌反应0.5h后，加入浓度为1mm,ph＝3.0柠檬酸缓冲溶液0.1～0.5ml并搅拌摇匀，室温下反应10～120min。之后用分子量为500～1500da的透析袋透析12～24h；

(3)取上述步骤(2)的不同浓度的混合溶液0.5ml，加入ph为4.0～5.0醋酸缓冲溶液0.5～1.0ml混合，得到的溶液中加入浓度为100mm的haucl4水溶液0.1～0.5ml，还原剂(可以是硼氢化钠、水合肼、柠檬酸钠、抗坏血酸等)，还原剂与haucl4的摩尔比为1～100：1(优选为1～20：1)，搅拌混合均匀。将样品置于波长为356nm的紫外光下辐照2～10分钟，得到金纳米簇最终溶液；

(4)重复步骤(1)～(3)，测量不同浓度下的尿酸，测试金纳米簇最终溶液的荧光发射光谱。建立金纳米簇最终溶液的荧光强度的数值与尿酸浓度的定量关系曲线，作为金纳米簇的荧光强度与尿酸浓度的工作曲线；

将尿酸溶液替换为待测样品后，按照步骤(1)～(3)进行，得到具有一定荧光强度的金纳米簇的待测样品溶液，当最终溶液含有具有一定荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中含有尿酸；

当最终溶液不含有具有荧光强度的金纳米簇时，所述待测样品中不含有尿酸；根据待测样品溶液中金纳米簇的荧光强度，关联定量关系，可以计算得到待测样品中的尿酸浓度。

该方法的优势在于对于样品中检测尿酸的过程中，避免了生物体中其它氨基酸的干扰，可以选择性和无创地检测尿液、汗液、血液中尿酸的浓度；并利用荧光turn-on的方法检测尿酸的浓度，避免了实验中的假信号可能带来的干扰；生成的金纳米簇具有优良的荧光性质，在生物医学等领域具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1尿酸浓度为1200μm所制备的荧光auncs的透射电镜照片，表明制备的auncs粒径均一，在1.5nm左右；

图2为实施例1中尿酸浓度为1200μm所制备的荧光auncs的荧光光谱，表明具有强烈的橙红色荧光；

图3为实施例1不同尿酸浓度下所制备的auncs荧光发射光谱；附图中为拟合的荧光发射强度与尿酸浓度的定量关系曲线，表明可以定量检测尿酸的浓度。

具体实施方式

实施例1

(1)配制不同浓度的尿酸(uo)水溶液(100～2000μm)。取其中4.0ml，加入浓度为50u/ml的尿酸氧化酶(uox)0.5ml，并用浓度为1m的naoh将其ph调至8.5。然后置于40℃水浴锅中温育3h；

(2)取上述步骤(1)的不同浓度的混合溶液，依次加入浓度为40mm的甲基丙烯酸(maa)水溶液0.4ml，浓度为50mm的feso4水溶液0.1ml，搅拌反应0.5h后，加入浓度为1mm,ph＝3.0柠檬酸缓冲溶液0.5ml并搅拌摇匀，室温下反应60min。之后用分子量为600da的透析袋透析12h；

(3)取上述步骤(2)的不同浓度的混合溶液0.5ml，加入ph为4.5醋酸缓冲溶液0.5ml混合，得到的溶液中加入浓度为100mm的haucl4水溶液0.5ml，还原剂(可以是硼氢化钠、水合肼、柠檬酸钠、抗坏血酸等)，还原剂与haucl4的摩尔比为3：1，搅拌混合均匀。将样品置于波长为356nm的紫外光下辐照5分钟，得到金纳米簇最终溶液；

(4)重复步骤(1)～(3)，测量不同浓度下的尿酸，测试金纳米簇最终溶液的荧光发射光谱。建立金纳米簇最终溶液的荧光强度的数值与尿酸浓度的定量关系曲线，作为金纳米簇的荧光强度与尿酸浓度的工作曲线；

将尿酸溶液替换为待测样品后，按照步骤(1)～(3)进行，得到具有荧光强度的金纳米簇的最终溶液，表明待测样品中含有尿酸；

根据待测样品溶液中金纳米簇的荧光强度，关联定量关系，可以计算得到待测样品中的尿酸浓度。

实施例2

(1)配制不同浓度的尿酸(uo)水溶液(100～2000μm)。取其中3.5ml，加入浓度为50u/ml的尿酸氧化酶(uox)0.3ml，并用浓度为1m的naoh将其ph调至8.5。然后置于40℃水浴锅中温育2h；

(2)取上述步骤(1)的不同浓度的混合溶液，依次加入浓度为40mm的甲基丙烯酸(maa)水溶液0.2ml，浓度为50mm的feso4水溶液0.05ml，搅拌反应0.5h后，加入浓度为1mm,ph＝3.0柠檬酸缓冲溶液0.3ml并搅拌摇匀，室温下反应30min。之后用分子量为800da的透析袋透析20h；

(3)取上述步骤(2)的不同浓度的混合溶液0.5ml，加入ph为4.5醋酸缓冲溶液0.5ml混合，得到的溶液中加入浓度为100mm的haucl4水溶液0.2ml，还原剂(可以是硼氢化钠、水合肼、柠檬酸钠、抗坏血酸等)，还原剂与haucl4的摩尔比为2：1，搅拌混合均匀。将样品置于波长为356nm的紫外光下辐照5分钟，得到金纳米簇最终溶液；

(4)重复步骤(1)～(3)，测量不同浓度下的尿酸，测试金纳米簇最终溶液的荧光发射光谱。建立金纳米簇最终溶液的荧光强度的数值与尿酸浓度的定量关系曲线，作为金纳米簇的荧光强度与尿酸浓度的工作曲线；

将尿酸溶液替换为待测样品后，按照步骤(1)～(3)进行，得到具有荧光强度的金纳米簇的最终溶液，表明待测样品中含有尿酸；

根据待测样品溶液中金纳米簇的荧光强度，关联定量关系，可以计算得到待测样品中的尿酸浓度。

实施例3

(1)配制不同浓度的尿酸(uo)水溶液(100～2000μm)。取其中4.0ml，加入浓度为50u/ml的尿酸氧化酶(uox)0.4ml，并用浓度为1m的naoh将其ph调至8.0。然后置于38℃水浴锅中温育2h；

(2)取上述步骤(1)的不同浓度的混合溶液，依次加入浓度为40mm的甲基丙烯酸(maa)水溶液0.3ml，浓度为50mm的feso4水溶液0.08ml，搅拌反应0.5h后，加入浓度为1mm,ph＝3.0柠檬酸缓冲溶液0.2ml并搅拌摇匀，室温下反应20min。之后用分子量为600da的透析袋透析12h；

(3)取上述步骤(2)的不同浓度的混合溶液0.5ml，加入ph为4.5醋酸缓冲溶液0.6ml混合，得到的溶液中加入浓度为100mm的haucl4水溶液0.2ml，还原剂(可以是硼氢化钠、水合肼、柠檬酸钠、抗坏血酸等)，还原剂与haucl4的摩尔比为3：1，搅拌混合均匀。将样品置于波长为356nm的紫外光下辐照5分钟，得到金纳米簇最终溶液；

(4)重复步骤(1)～(3)，测量不同浓度下的尿酸，测试金纳米簇最终溶液的荧光发射光谱。建立金纳米簇最终溶液的荧光强度的数值与尿酸浓度的定量关系曲线，作为金纳米簇的荧光强度与尿酸浓度的工作曲线；

将尿酸溶液替换为待测样品后，按照步骤(1)～(3)进行，得到具有荧光强度的金纳米簇的最终溶液，表明待测样品中含有尿酸；

根据待测样品溶液中金纳米簇的荧光强度，关联定量关系，可以计算得到待测样品中的尿酸浓度。