PD-1和4-1BB的融合蛋白的制作方法

本发明涉及融合蛋白，其包含(a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包含位于其n-端的源自pd-1或cd40l的多肽；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内结构域，所述细胞内结构域包含位于其c-端的源自4-1bb或cd28的多肽。本发明也设想cd28位于n-端和cd40l位于c-端的融合蛋白。本发明还涉及编码该融合蛋白的核酸分子、包含该核酸分子的载体和包含该载体的宿主细胞。本发明进一步涉及用于生产该宿主细胞的方法。最后，本发明涉及包含该融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞的药物组合物，特别用于治疗与pd-1/pd-l2或cd40结合和/或pd-l1/pd-l2或cd40表达相关的疾病或障碍，如癌症和慢性病毒感染。
背景技术：
：肿瘤浸润淋巴细胞的过继转移(til)是一种有希望的抗肿瘤治疗选择(rosenberg等,science(2015),348:62-68)。不幸的是，不是所有的肿瘤实体都能分离和表达til。因此，发展出了用转基因t细胞受体(tcr)基因改造t细胞的概念(hurwitz等,cancermicroenviron(2014),7:1-9)。然而，迄今这样的t细胞存活期短，且在患者体内失去功能(janicki等,cancerres(2008),68:2993-3000；bai等,pnasusa(2008),105:13003-13008；bendle等,cancerres(2004),64:8052-8056；anderson等,jimmunol(2007),178:1268-1276)。通过cd28等共刺激受体的tcr信号转导级联的共刺激可增强t细胞的增殖、存活和细胞毒性(chen等,natrevimmunol(2013),13:227-242)。但是，因为上皮肿瘤不表达共刺激受体cd28的配体(cd80/86)，且人效应t细胞本身对这样的受体是阴性的，因此共刺激不能按照保守的方式发生。为了向t细胞提供独立于这种经典方式的共刺激，产生了嵌合共刺激受体。它们由共抑制受体pd-1(也称为cd279)的细胞外结构域和cd28的信号传导结构域组成(ankri等,jimmunol(2013),4121-4129；prosser等,molimmunol(2012),263-272；wo2013/019615)。通常，肿瘤特异性t细胞在表面上表达pd-1，pd-1与其表达在肿瘤细胞上的配体pd-l1结合。这一结合引起tcr-信号传导和t细胞活化的阻断，因而导致所述肿瘤特异性t细胞的抑制。为了共刺激tcr信号传导(进而增加t细胞活化)，刺激cd28会是很必要的；参见如上所述。包含pd-1和cd28结构域的嵌合共刺激受体应当表现出两者的相关功能，一方面是pd-1的细胞外受体功能，另一方面是cd28的细胞内信号传导功能。在这种已经呈现过的嵌合构建体中(ankri，参见上文；prosser，参见上文；wo2013/019615)，跨膜结构域取自相应的信号传导分子。然而，尽管这样的构建体已经被描述来减少pd-l1介导的t细胞抑制以及增加t细胞活化，依然需要进一步改进这种构建体。技术实现要素：如本文所述和权利要求书中限定的本发明已经解决了这一技术问题。本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含：(a)细胞外结构域(ecd)，所述细胞外结构域包含位于其n-端的源自pd-1或cd40l的多肽；(b)跨膜结构域(tmd)；和(c)细胞内结构域(icd)，所述细胞内结构域包含位于其c-端的源自4-1bb或cd28的多肽。优选地，根据本发明，如果所述细胞外结构域(ecd)包含位于其n-端的源自pd-1的多肽，所述细胞内结构域(icd)就包含位于其c-端的源自4-1bb的多肽；反之亦然。类似地，如果所述细胞外结构域包含位于其n-端的源自cd40l的多肽，所述细胞内结构域就包含位于其c-端的源自cd28的多肽；反之亦然。对于具有源自cd40l的ecd和源自cd28的icd的融合蛋白，同样可能icd位于tmd的n-端，而所述tmd正好位于所述融合蛋白的c-端；参见图8所示的作为示例的(而非限制性的)融合蛋白。在本发明的一个实施方案中，所述细胞外结构域(a)包含位于其n-端的源自pd-1的多肽和位于其c-端的源自4-1bb的多肽。相比cd28，4-1bb(cd137)是在t细胞亚群上呈现的一种共刺激受体，能够增强tcr信号传导能力。4-1bb是肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族的成员，在原初t细胞中不存在，但在t细胞刺激和分化为效应细胞后被诱导(cheuk等,cancergenether(2004),11:215-226)。4-1bb的细胞内结构域包含qee基序，该基序在与4-1bbl连接后在apc上表达，招募tnfr相关因子2(traf2)(arch等,molcellbiol(1998),18:558-565；nam等,jimmunol(2005),174:1898-1905)。traf2激活包括erk的mapk通路，并激活nfκb的核转位(watts,annurevimmunol(2005),23:23-68)。它由此增强细胞因子产生和t细胞存活。因此，本发明提供包含pd-1的细胞外结构域(ecd)和4-1bb的细胞内结构域(icd)或由pd-1的细胞外结构域(ecd)和4-1bb的细胞内结构域(icd)组成的融合(本文也称为“嵌合”)蛋白。在本发明的进一步方面，设想了一种融合蛋白，该融合蛋白包含位于其n端的源自cd28的icd、源自cd40l的icd的片段、cd40l的tmd和位于其c端的源自cd40l的ecd(图8)。在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白包含seqinno:29中所示的氨基酸序列或由seqinno:29中所示的氨基酸序列组成。进一步地，本发明提供一种融合(嵌合)蛋白，该融合(嵌合)蛋白包含cd40l的细胞外结构域(ecd)和cd28的细胞内信号传导结构域(icd)。在t细胞中表达，在本发明的上下文中，已令人惊奇地发现当与表达其受体cd40的细胞相互作用时，这种嵌合蛋白发挥双重功能：在t细胞中，认为它启动共刺激途径，从而提供存活和增强的效应子活性(顺式效应)。在相互作用的cd40细胞(反式效应)中，即在肿瘤细胞、肿瘤内皮细胞中，认为它引起细胞死亡；而在相互作用的细胞是抗原呈递细胞的情况下，认为它能够诱导进一步支持t细胞活性的细胞因子(如il-12)的分泌(图7)。一般而言，在本发明的上下文中，除非本文中另有规定，否则包含源自pd-1的细胞外结构域(ecd)、跨膜结构域(tmd)和源自4-1bb的细胞内结构域(icd)或由源自pd-1的细胞外结构域(ecd)、跨膜结构域(tmd)和源自4-1bb的细胞内结构域(icd)组成的融合蛋白也在本文称为“pd-1:4-1bb”或“pd-1:bb”。类似地，包含源自pd-1的细胞外结构域(ecd)、跨膜结构域(tmd)和源自cd28的细胞内结构域(icd)或由源自pd-1的细胞外结构域(ecd)、跨膜结构域(tmd)和源自cd28的细胞内结构域(icd)组成的融合蛋白也在本文称为“pd-1:cd28”。类似地，包含源自cd40l的细胞外结构域(ecd)、跨膜结构域(tmd)和源自cd28的细胞内结构域(icd)或由源自cd40l的细胞外结构域(ecd)、跨膜结构域(tmd)和源自cd28的细胞内结构域(icd)组成的融合蛋白也在本文称为“cd40l:cd28”或“cd28:cd40l”(因为cd28的反向icd，也在本文称为“cd40l:cd28i”或“cd40l:cd28i”；还参见图7中的且在图8至11中被评估的如示为变体3)的示例性融合蛋白实施方案)，其中cd28的icd形成融合蛋白的n-端，而cd40l的ecd形成融合蛋白的c-端。在融合蛋白的上下文中的标记“tm”或“tm”表示哪个跨膜结构域被用于各自的构建体。例如，“pd-1tm:bb”或“pd-1tm:bb”表示所述融合蛋白包含pd-1的跨膜结构域，而“pd-1:bbtm”或“pd-1:bbtm”表示所述融合蛋白包含4-1bb的跨膜结构域。类似地，“cd28:cd40ltm”或“cd40ltm:cd28”表示所述融合蛋白包含cd40l的跨膜结构域，而“cd40l:cd28tm”或表示所述融合蛋白包含cd28的跨膜结构域。根据本发明，提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含pd-1或cd40l(例如pd-1)的细胞外结构域、跨膜结构域(tmd)和4-1bb的细胞内结构域(icd)。如在本发明的上下文中令人惊讶地发现的，如在人黑色素瘤异种移植物中示例性所示的，表达这种pd-1:bb融合蛋白的t细胞与表达pd-1:cd28融合蛋白的t细胞相比显示出提高的和更早的增殖率。如根据本发明还令人惊讶地发现的，在t细胞上表达的cd40l:cd28融合蛋白能够激活b细胞(反式效应；图10)以及支持t细胞功能(顺式效应)，例如增加的ifn-γ分泌(参见图11a)和细胞毒性(图11b)。也就是说，如在本发明的上下文中所发现的，当在t细胞中例如在人黑色素瘤异种移植物中表达时，包含4-1bb(cd137)的icd的融合产物与包含cd28的icd的构建体相比，显示出形式为增加的增殖率的优越效果。因此，在本发明的上下文中所描述和提供的具有源自pd-1的ecd的融合蛋白的ecd优选具有结合肿瘤细胞表面上pd-l1/2的功能，所述肿瘤细胞表达pd-l1作为本领域已知的逃逸机制的一部分。本发明融合蛋白的ecd结合后，所述融合蛋白的icd——包含源自4-1bb的多肽——优选作为激活信号传导分子起作用，从而增加宿主细胞(例如，t细胞如cd8+t细胞)的增殖和/或细胞因子分泌。类似地，根据本发明，在本发明的上下文中所描述和提供的具有源自cd40l的ecd的融合蛋白的ecd优选具有结合肿瘤细胞表面上cd40的功能，所述肿瘤细胞表达cd40作为本领域已知的逃逸机制的一部分。本发明融合蛋白的ecd结合后，所述融合蛋白的icd——包含源自cd28的多肽——优选作为激活信号传导分子起作用，从而增加宿主细胞(例如，t细胞如cd8+t细胞)的增殖和/或存活和/或细胞因子分泌和/或细胞毒性。根据本发明提供的融合蛋白可进一步包含cd3ξ结构域。这可特别适用于融合蛋白在t细胞中或一般在tcr阴性细胞中不被表达的情况，或者tcr和/或car在表达本发明的融合构建体的细胞中不被共转导(或一般不被共表达)的情况。cd3ξ的icd氨基酸序列可以取自本领域已知的数据库(np_932170)。通常情况下，cd3ξ可以优选地在4-1bb或cd28蛋白的icd之后引入。本文提供的融合蛋白可以特别在n端包含ecd，该ecd包含源自pd-1的多肽，优选pd-1(例如，人或鼠、优选人pd-1)的ecd，或该ecd包含源自cd40l的多肽。在该上下文中，术语“源自”特别是指ecd中包含的多肽分别包含pd-1(例如，人或鼠、优选人pd-1)的至少一部分，优选pd-1的ecd；或包含cd40l的至少一部分。如在本文中所用地，与pd-1(人或鼠、优选人pd-1)或cd40l的天然序列或其部分(例如ecd)相比，术语“源自”pd-1或cd40l还允许多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸置换、缺失和/或插入。例如，如果ecd源自cd40l，本发明的上下文中还设想源自cd40l的ecd可包含在图1的seqidno:30中突出显示的ecd或由在图1的seqidno:30中突出显示的ecd组成。在该上下文中的一个实施方案中，它可以是cd40l的可溶部分(例如，seqidno:30的氨基酸113-261；图8)。如本领域技术人员容易认识到的，对于融合蛋白的ecd，信号肽序列(如对于本领域技术人员而言是可识别的，并且如本文中所提及的特定seqinno中所描绘的)通常在融合蛋白在膜中的整合之前、期间或之后在成熟蛋白中被切掉。根据本发明还可能的是，如果ecd源自cd40l，信号肽也可源自pd-1(图8)。也就是说，当提及如本文所描述和提供的融合蛋白或表达融合蛋白的宿主细胞时，根据本发明还总是涵盖融合蛋白的ecd可缺乏相应的信号肽。在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白包含ecd，该ecd包含源自pd-1或cd40l的多肽，与人或鼠pd-1、例如如seqidno:2中所示的人pd-1(具有或不具有如图1中对于seqidno:2所示的信号肽)或cd40l(如图1中seqidno:30中突出显示的；如根据seqidno:30的完整多肽或仅可溶片段(seqidno:30的氨基酸113-261))的ecd的氨基酸序列相比，所述多肽包含具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(优选保守或高度保守置换)、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中所述融合蛋白分别显示出pd-l1/2或cd40结合亲和力。这种结合亲和力可以与天然pd-1(例如人pd-1)或cd40l与其各自的配体pd-l1/2或cd40的结合亲和力进行比较。在本发明的上下文中，为了确定给定多肽是否显示出pd-l1/2或cd40结合亲和力，具有的与天然人pd-l1/2或cd40的结合亲和力和天然人pd-1与pd-l1/2或cd40l与cd40的结合亲和力相比为至少0.8倍、优选至少0.9倍或更优选至少1.0倍高的多肽被认为分别显示出与pd-l1/2或cd40的结合亲和力。在该上下文中，给定多肽与pd-l1/2或cd40的结合亲和力可通过本领域已知的方法测量，并且通常且优选包括测量kd值(离解常数)，该kd值表示为摩尔浓度。这种用于以kd测量蛋白质相互作用的方法在本领域是众所周知的，并且包括例如elisa、流式细胞术、表面等离子体共振法、biacore测量法等。在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白包含ecd，该ecd包含根据seqidno:2的pd-1的ecd的氨基酸序列(具有或不具有如图1对于seqidno:2中所示的信号肽)或由根据seqidno:2的pd-1的ecd的氨基酸序列组成。在本发明的另一个实施方案中，所述融合蛋白包含ecd，该ecd包含如图1中seqidno:30中突出显示的cd40l的ecd的氨基酸序列(如根据seqidno:30的完整多肽或仅根据seqidno:30的氨基酸113-261的可溶片段)或由如图1中seqidno:30中突出显示的cd40l的ecd的氨基酸序列组成。为了让ecd更具灵活性，本文描述和提供的融合蛋白的ecd可进一步包含位于ecd的c端的铰链-和/或接头区(例如，在融合蛋白的ecd和tmd之间，或在tmd位于icd的c端时，在融合蛋白的ecd和icd之间)。典型的铰链-或接头区是本领域已知的，并且包括源自抗体(例如，igg1、cd8α)的恒定区(fc)的那些(参见，例如shirasu等,anticancerres(2012),32:2377-2383和cartellieri等,jbiomedbiotechnol(2010),956304)(例如iggfc间隔区)、gly/ser接头或细丝蛋白(例如fil3间隔区)。然而，由于这种接头-或铰链区也可能由于激活分泌大量炎性细胞因子的nk细胞而导致副作用，因此在本发明的上下文中，可能希望本文所描述和提供的融合蛋白不包含接头-或铰链区。也就是说，在本发明的一个实施方案中，融合蛋白的ecd不包含接头-或铰链区。在另一个实施方案中，例如相应地如在图1的seqidno:27或28中突出显示地，在ecd源自cd40l而icd源自cd28时，在ecd的c端有一个或多个接头-或铰链区，如gly/ser接头加上fc间隔区(例如，iggfc间隔区)和/或细丝蛋白接头(例如，fil3)。本文提供的融合蛋白进一步包含可操作地连接在ecd和icd之间或连接在icd的c端(例如，当ecd源自cd40l而icd源自cd28时)的tmd。一般而言，tmd不限于特定的tmd。优选地，如本文所述和例证的，tmd允许融合蛋白稳定地锚定在表达融合蛋白的细胞(例如，t细胞)的膜中，并且进一步允许ecd分别与pd-l1/2或cd40结合，并且当与pd-l1/2或cd40结合时，允许含有源自4-1bb、cd28或cd40l的多肽的icd的信号传导诱导。在本发明的上下文中，tmd尤其可包含源自cd8(α)、cd28、icos、pd-1或4-1bb的那些。在一个实施方案中，如果ecd源自cd40l而icd源自cd28，则tmd源自cd28(cd40l:cd28tm)或cd40l(cd28:cd40ltm)。例如，融合蛋白包含seqidno:27、28或29中所示的氨基酸序列或由seqidno:27、28或29中所示的氨基酸序列组成。tmd一般可为任何来源，但优选为鼠源或人源，更优选为人源。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白的tmd不是源自cd8(α)和/或icos。如果ecd源自pd-1而icd来自4-1bb，在一个实施方案中，tmd也不源自cd28。在本发明的一个实施方案中，特别是当ecd来自pd-1而icd来自4-1bb时，融合蛋白的tmd包含源自pd-1、4-1bb(例如，人或鼠)的多肽，或者特别是当ecd来自cd40l而icd来自cd28(例如，如在图1的seqidno:27或28中突出显示的)时，tmd源自cd28。在本发明的一个特定实施方案中，融合蛋白的tmd包含源自pd-1例如人或鼠pd-1、特别是人pd-1的多肽。在该上下文中，术语“源自”特别指tmd中所含的多肽包含pd-1、4-1bb(例如，人或鼠、优选人pd-1或4-1bb)或cd28的至少一部分，优选pd-1或4-1bb(例如，pd-1)的tmd，尤其是当ecd来自pd-1而icd来自4-1bb时。如本文所用，术语“源自”pd-1、4-1bb或cd28还允许与pd-1、4-1bb(人或鼠、优选人pd-1或4-1bb)或cd28或其部分(例如，tmd)的天然序列相比，多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸置换、删除和/或插入。如本发明的上下文中已示出的，与具有源自cd28的icd和源自pd-1的ecd的相似构建体相比，具有源自4-1bb的icd的融合蛋白通常显示出宿主细胞(例如，t细胞如cd8+t细胞)的优越增殖率。此外，与包含源自4-1bb的tmd的融合蛋白相比，包含源自pd-1的tmd的融合蛋白在转导的t细胞中导致细胞因子(例如，ifnγ或il-2)的甚至更高的分泌率。因此，在本发明的特定实施方案中，融合蛋白的tmd包含源自pd-1、例如人或鼠pd-1、特别是人pd-1的多肽或由源自pd-1例如人或鼠pd-1、特别是人pd-1的多肽组成。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包含tmd，该tmd包含源自4-1bb的多肽，与人或鼠4-1bb、如seqidno:6中所示的人4-1bb的tmd的氨基酸序列相比，该多肽包含具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(优选保守或高度保守置换)、缺失和/或插入的氨基酸序列；其中，如本文所述和例证的，所述融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到cd8+t细胞中时，能够在所述cd8+t细胞用pd-l1/2+靶细胞刺激时提高所述cd8+t细胞的增殖率。增殖可以通过cfse染料稀释来定量，即通过流式细胞术测量的cfse荧光强度的降低(如图5和方法描述“tcr-d115t细胞在……中的增殖”中所例示)，或者通过本领域已知的测定增殖的任何其它适当方法，例如，h3胸苷掺入法、brdu掺入法等。如果经逆转录病毒方式被给定融合蛋白转导的cd8+t细胞的增殖与未被融合蛋白转导的cd8+t细胞相比为大于1.0倍，例如至少1.2倍、优选至少1.3倍、更优选至少1.5倍高，则所述融合蛋白被认为能够增加增殖。利用cfse稀释法，可以将增殖差计算为没有嵌合受体(模拟)的t细胞与表达pd-1:bb或pd-1:cd28变体的t细胞之间的平均荧光活性(mfi)的比率。mfi比率为1.0表示增殖没有差异，而大于1.0的mfi比率表示增殖。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包含tmd，该tmd包含根据seqidno:6的4-1bb的tmd的氨基酸序列或由根据seqidno:6的4-1bb的tmd的氨基酸序列组成，特别是当ecd源自pd-1而icd源自4-1bb时。在本发明的一个实施方案中，特别是当n-端的ecd源自cd40l而c-端的icd源自cd28时，融合蛋白包含tmd，该tmd(其可位于icd的n-或c-端，优选位于icd的n-端)包含源自cd28的多肽，与如在图1的seqidno:27或28中突出显示的cd28的tmd的氨基酸序列相比，所述多肽包含具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、缺失和/或插入的氨基酸序列(优选保守或高度保守置换)，其中，如图10所示，所述融合蛋白在tcr-t58细胞上表达时能够提高b细胞的活化率。如果与未被融合蛋白转导的tcr-t58细胞的b细胞活化率相比，b细胞的活化提高为大于1.2倍，优选至少1.3倍、更优选至少1.5倍，则所述融合蛋白被认为能够提高活化。在本发明的另一个实施方案中，特别是当c-端的ecd源自cd40l而n-端的icd源自cd28时，融合蛋白包含tmd(该tmd可优选位于icd和ecd之间)，该tmd包含源自cd40l的多肽，与如在图1的seqidno:29中突出显示的cd40l的tmd的氨基酸序列相比，所述多肽包含具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(优选保守或高度保守置换)、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中，如图10所示，所述融合蛋白在tcr-t58细胞上表达时能够提高b细胞的活化率。如果与未被融合蛋白转导的tcr-t58细胞的b细胞活化率相比，b细胞的活化提高为大于1.2倍，优选至少1.3倍、更优选至少1.5倍，则所述融合蛋白被认为能够提高活化。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包含tmd，该tmd包含源自pd-1的多肽，与人或鼠pd-1、例如如seqidno:8中所示的人pd-1的tmd的氨基酸序列相比，所述多肽包含具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(优选保守或高度保守置换)、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中，所述融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到cd8+t细胞中时，能够在所述cd8+t细胞用pd-l1/2+靶细胞刺激时增加ifnγ和/或il-2的分泌。给定融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到cd8+t细胞中时是否能够在所述cd8+t细胞用pd-l1/2+靶细胞刺激时增加ifnγ和/或il-2的分泌的评价，可以通过本领域已知的方法进行，也可以如本文中描述和示例的(也参见下文所示例的“共培养和细胞因子测定”)。为了评价给定融合蛋白是否能够增加ifnγ和/或il-2的分泌，将用所述融合蛋白以逆转录病毒方式转导的cd8+t细胞的ifnγ和/或il-2分泌水平与未用所述融合蛋白转导的可比较cd8+t细胞的ifnγ和/或il-2分泌水平进行比较。为此，用如本文所描述和示例的pd-l1/2+靶细胞刺激两种cd8+t细胞(一种用融合蛋白转导，另一种未转导)，然后测量ifnγ和/或il-2的分泌水平。用融合蛋白转导的cd8+t细胞和未转导的对照cd8+t细胞通常来自同一供体。例如，转基因人t细胞可以逆转录病毒方式转导以表达包含所述源自4-1bb的多肽的融合蛋白，然后以1:2的比率与hek/tyr或hek/tyr/pd-l1细胞一起培养。然后共培养上清液可在16h后收获，并根据制造商的说明通过夹心elisa(bd)或bio-plex(bio-rad)进行分析。在转导的tcr仅在cd8+t细胞中起作用并且cd8+/cd4+t细胞比率有变化时，则可以应用以下公式将测量的细胞因子的量归一化为细胞悬浮液内tcr+cd8+t细胞的百分比(通过流式细胞术测定)：用于测量ifnγ和il-2分泌水平的方法在本领域是众所周知的，并且本文也举例说明，特别包括elisa、bio-plex、细胞内流式细胞术(ics)，或类似的方法。如果用给定融合蛋白以逆转录病毒方式转导的cd8+t细胞的ifnγ和/或il-2分泌水平与未用融合蛋白转导的cd8+t细胞相比为至少1.2倍，优选至少高1.3倍、更优选至少1.5倍高，则所述融合蛋白被认为能够增加ifn-γ和/或il-2的分泌。在本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白包含tmd，该tmd包含根据seqidno:8的pd-1的tmd的氨基酸序列或由根据seqidno:8的pd-1的tmd的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，特别是当n-端的ecd源自cd40l而c-端的icd源自cd28时，所述融合蛋白包含tmd(其可位于icd的n-或c-端，优选位于icd的n-端)，所述tmd包含如在图1的seqidno:27或28中突出显示的cd28的tmd的氨基酸序列或由如在图1的seqidno:27或28中突出显示的cd28的tmd的氨基酸序列组成。在本发明的又一个实施方案中，特别是当c-端的ecd源自cd40l而n-端的icd源自cd28时，所述融合蛋白包含tmd(该tmd可优选位于icd和ecd之间)，所述tmd包含如在图1的seqidno:29中突出显示的cd40l的tmd的氨基酸序列或由如在图1的seqidno:29中突出显示的cd40l的tmd的氨基酸序列组成。本文提供的融合蛋白进一步包含可操作地连接到tmd的c-端的icd(特别是对于ecd来自pd-1而icd来自4-1bb的融合蛋白)、或者可操作地连接到tmd的c-或n-端的icd(特别是对于ecd来自cd40l而icd来自cd28的融合蛋白)。本发明融合蛋白的icd包含源自4-1bb(cd137)或cd28的多肽。在该上下文中，术语“源自”特别指icd中包含的多肽包含4-1bb(例如，人或鼠、优选人4-1bb)的至少一部分，优选(人)4-1bb的icd，或cd28的至少一部分。如本文所使用的，术语“源自”4-1bb或cd28还允许与4-1bb(人或小鼠、优选人4-1bb)或cd28天然序列或其部分(例如，icd)相比，多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸被置换、删除和/或插入。在本发明的特定实施方案中，融合蛋白的icd包含源自4-1bb例如人或鼠4-1bb、特别是人4-1bb的icd的多肽。在本发明的另一个实施方案中，特别是当ecd源自cd40l而icd源自cd28时，融合蛋白包含源自cd28的icd的多肽，所述多肽例如包含如在图1的seqidno:seqidno:27、28、或29中突出显示的氨基酸序列或由在图1的seqidno:seqidno:27、28、或29中突出显示的氨基酸序列组成(特别是对于ecd位于融合蛋白的n-端而icd位于融合蛋白的c-端(tmd的c-端或n-端，优选tmd的c-端)的情况，则根据seqidno:27或28；以及特别是对于icd位于融合蛋白的n-端而ecd位于融合蛋白的c-端的情况，则根据seqidno:29)。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包含icd，该icd包含源自4-1bb的多肽，与人或鼠4-1bb、例如如seqidno:4中所示的人4-1bb的icd的氨基酸序列相比，所述多肽包含具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(优选保守或高度保守置换)、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中，如本文所描述和示例的，所述融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到cd8+t细胞中时，能够在所述cd8+t细胞用pd-l1/2+靶细胞刺激时提高cd8+t细胞的增殖率。在本发明的另一个实施方案中，融合蛋白包含icd，该icd包含源自cd28的多肽，与如在图1的seqidno:seqidno:27、28、或29中突出显示的cd28的icd的氨基酸序列相比，所述多肽包含具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(优选保守或高度保守置换)、缺失和/或插入的氨基酸序列(特别是对于ecd位于融合蛋白的n-端而icd位于融合蛋白的c-端(tmd的c-端或n-端，优选tmd的n-端)的情况，则根据seqidno:27或28；以及特别是对于icd位于融合蛋白的n-端而ecd位于融合蛋白的c-端的情况，则根据seqidno:29)，其中，如图10所示，所述融合蛋白在tcr-t58细胞上表达时能够提高b细胞的活化率。如果与未被融合蛋白转导的tcr-t58细胞的b细胞活化率相比，b细胞的活化提高为大于1.2倍，优选至少1.3倍、更优选至少1.5倍，则所述融合蛋白被认为能够提高活化。在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包含icd，所述icd包含根据seqidno:4的4-1bb的icd的氨基酸序列或由根据seqidno:4的4-1bb的icd的氨基酸序列组成。在本发明的一个实施方案中，本文提供和描述的融合蛋白包含源自pd-1的ecd、源自4-1bb的tmd和源自4-1bb的icd，或由源自pd-1的ecd、源自4-1bb的tmd和源自4-1bb的icd组成。在一个实施方案中，所有结构域都源自相应的人结构域。在一个特定的实施方案中，本发明的融合蛋白包含这样的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成：与seqidno:22的氨基酸序列(具有或不具有如图1中对于seqidno:22所示的信号肽)相比，所述氨基酸序列具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(优选保守或高度保守置换)、缺失和/或插入，其中，所述融合蛋白显示出如本文所述的pd-l1/2结合亲和力，并且其中，如本文描述和举例说明的，所述融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到cd8+t细胞中时，能够在所述cd8+t细胞用pd-l1/2+靶细胞刺激时提高所述cd8+t细胞的增殖率。在本发明的另一个具体实施方案中，融合蛋白包含根据seqidno:22的氨基酸序列(具有或不具有如图1中对于seqidno:22所示的信号肽)或由根据seqidno:22的氨基酸序列组成。在本发明的另一个实施方案中，本文提供和描述的融合蛋白包含下述或由下述组成：源自cd40l的ecd、源自cd28或cd40l(当ecd位于融合蛋白的n-端而icd位于融合蛋白的c-端(tmd的c-或n端，优选tmd的n-端)时，为cd28；当icd位于融合蛋白的n-端而ecd位于融合蛋白的c-端时，为cd40l)的tmd和源自cd28的icd。在一个实施方案中，所有结构域都源自相应的人结构域。在一个特定的实施方案中，本发明的融合蛋白包含这样的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成：与seqidno:27、28或29的氨基酸序列(对于seqidno:27和28：具有或不具有如图1中对于27或28所示的信号肽；对于seqidno:29：根据seqidno:29的完整多肽或其根据seqidno:29的氨基酸113-261的可溶片段)相比，所述氨基酸序列具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(优选保守或高度保守置换)、缺失和/或插入，其中，所述融合蛋白显示出如本文所述的cd40结合亲和力，并且其中，如图10所示，所述融合蛋白在tcr-t58细胞上表达时能够提高b细胞的激活率。在本发明的另一个具体实施方案中，所述融合蛋白包含seqidno:27、28或29的氨基酸序列(具有或不具有如图1中对于27、28或29所示的信号肽)或由seqidno:27、28或29的氨基酸序列组成。在本发明的一个实施方案中，本文提供和描述的融合蛋白包含源自pd-1的ecd、源自pd-1的tmd和源自4-1bb的icd或由源自pd-1的ecd、源自pd-1的tmd和源自4-1bb的icd组成。在一个实施方案中，所有的结构域都源自相应的人结构域。在一个具体的实施方案中，本发明的融合蛋白包含这样的氨基酸序列或由这样的氨基酸序列组成：与seqidno:24的氨基酸序列(具有或不具有如图1中对于seqidno:24所示的信号肽)相比，所述氨基酸序列具有多至0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换(优选保守或高度保守置换)、缺失和/或插入；其中，所述融合蛋白显示出如本文所述的pd-l1/2结合亲和力，并且其中如本文所述和示例说明的，所述融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到cd8+t细胞中时，能够在所述cd8+t细胞用pd-l1/2+靶细胞刺激时增加ifnγ和/或il-2的分泌。在该上下文中，为了评价给定融合蛋白是否能够提高cd8+t细胞的增殖率以及提高被所述融合蛋白以逆转录病毒方式转导的所述cd8+t细胞的ifnγ和/或il-2分泌水平，与未用所述融合蛋白转导的可比较cd8+t细胞的增殖率/ifnγ和/或il-2分泌水平进行比较。用于评价增殖和ifnγ/il-2分泌率的方法是本领域已知的，并且在上文和下文中描述和举例说明。在本发明的一个进一步的具体实施方案中，所述融合蛋白包含根据seqidno:24的氨基酸序列(具有或不具有如图1中对于seqidno:24所示的信号肽)或由根据seqidno:24的氨基酸序列组成。必须注意，如本文中所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种这种不同的试剂，提及“所述/该方法”包括提及本领域普通技术人员已知的可用来修改或替代本文描述的方法的等效步骤和方法。除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员能辨别出，或者使用不超过常规的实验能够确定许多与本文描述的具体实施方案的等效物。这些等效物意在被本发明涵盖。本文使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的所有或任何其他组合”的含义。本文所使用的术语“大约”或“近似”是指在给定值或范围的20％以内，优选在10％以内，更优选在5％以内。在本说明书及其后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括(comprise)”和诸如“包含/包括(comprises)”和“包含/包括(comprising)”之类的变体将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或整数的组或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数的组或步骤的组。在本文中使用时，术语“包含/包括(comprising)”可以用术语“含有(containing)”或“包括(including)”代替，或者有时在本文中使用时用术语“有/具有(having)”代替。在本文中使用时，“由……组成”(“consistingof”)排除在要求的元素中未指定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”不排除不实质性影响权利要求的基本特征和新颖特征的物质或步骤。在本文的每个实例中，术语“包括/包含”(“comprising”)、“基本上由……组成(consistingessentiallyof)”和“由……组成(consistingof)”中的任何一个都可以用其他两个术语中的任何一个替换。应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、操作指南和试剂等，因此可以变化。本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。本说明书文本中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、操作指南等)，不论是前文或后文，均以引用方式全部并入本文。本文的任何内容都不应被解释为承认本发明无权由于在先的发明早于这种披露。在通过引用并入的材料与本说明书相抵触或不一致时，本说明书将取代任何此类材料。如本文中所用，“保守”置换是指如下表1中列出的“示例性置换”的置换。本文中使用的“高度保守”置换是指如下表i的“优选的置换”标题下所示的置换。表i氨基酸置换初始示例性置换优选的置换ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；asp，lys；argglnasp(d)glu；asnglucys(c)ser；alasergln(q)asn；gluasnglu(e)asp；glnaspgly(g)alaalahis(h)asn；gln；lys；arg；argile(i)leu；val；met；ala；phe；leuleu(l)正亮氨酸；ile；val；met；ala；ilelys(k)arg；gin；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrtyrpro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；ala；leu术语“多肽”在本文中与术语“蛋白质”等同使用。蛋白质(包括其片段，优选地是生物活性片段，以及肽，通常具有少于30个氨基酸)包含经由共价肽键(形成氨基酸链)彼此连接的一个或多个氨基酸。本文所用的术语“多肽”描述了一组通常包含超过10个氨基酸的分子。多肽可进一步形成多聚体，例如二聚体、三聚体和更高级的寡聚物，即由多于一个的多肽分子组成。形成这种二聚体、三聚体等的多肽分子可以是相同的或不相同的。因此，这种多聚体的相应更高阶结构被称为同或异二聚体、同或异三聚体等。异多聚体的一个例子是抗体分子，以其天然存在形式，所述抗体分子由两个相同的轻多肽链和两个相同的重多肽链组成。术语“多肽”和“蛋白质”也指天然修饰的多肽/蛋白质，其中修饰例如通过翻译后修饰(如糖基化、乙酰化、磷酸化等)来实现。这种修饰在本领域中是众所周知的。本文所使用的术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常指具有其现有公认定义的氨基酸，例如选自下述的蛋白原性氨基酸：丙氨酸(ala或a)；精氨酸(arg或r)；天冬酰胺(asn或n)；天冬氨酸(asp或d)；半胱氨酸(cys或c)；谷氨酰胺(gln或q)；谷氨酸(glu或e)；甘氨酸(gly或g)；组氨酸(his或h)；异亮氨酸(he或i)：亮氨酸(leu或l)；赖氨酸(lys或k)；蛋氨酸(met或m)；苯丙氨酸(phe或f)；脯氨酸(pro或p)；丝氨酸(ser或s)；苏氨酸(thr或t)；色氨酸(trp或w)；酪氨酸(tyr或y)；和缬氨酸(val或v)，尽管可以根据需要使用修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常，氨基酸可归类为具有非极性侧链(例如，ala、cys、he、leu、met、phe、pro、val)；带负电荷侧链(例如，asp、glu)；带正电荷侧链(例如，arg、his、lys)；或不带电的极性侧链(例如，asn、cys、gln、gln、gly、his、met、phe、ser、thr、trp和tyr)。通常，如本文所用，术语“融合蛋白”涉及由来自不同来源的多肽部分构成的蛋白质。因此，它也可以被理解为“嵌合蛋白”、“嵌合构建体”、“融合构建体”等。通常，融合蛋白是通过两个或更多个基因(或优选为cdna)的结合产生的蛋白质，所述基因最初编码单独的蛋白质。该融合基因(或融合cdna)的翻译产生单个多肽，优选具有源自每个初始蛋白的功能特性。重组融合蛋白是通过重组dna技术人工创造的，用于生物研究或治疗学。生产本发明的融合蛋白的进一步细节是本领域已知的，并在本文中描述和举例说明。本发明还涉及编码本文提供和描述的所述融合蛋白的核酸分子。本发明还涉及仅编码本文描述和提供的融合蛋白的部分的核酸分子，例如，其仅编码融合蛋白的ecd、tmd和/或icd。例如，本发明涉及根据seqidno:1、3、5、7、21或23的核酸分子或其通过核酸键连接的组合，只要编码根据本发明的融合蛋白或其一部分(例如，ecd、tmd和/或icd)即可。本发明还涉及这样的核酸分子：与根据seqidno:1、3、5、7、21或23的核酸分子或其通过核酸键连接的组合相比，所述核酸分子中的30、27、24、21、18、15、12、9、6、3或0个核苷酸已被置换(优选不导致翻译的氨基酸变化的沉默突变)、缺失或插入，只要编码根据本发明的融合蛋白或其一部分(例如，ecd、tmd和/或icd)即可。原则上，本发明优选涉及编码本文中具体描述和实施的融合蛋白的核酸。一般来说，seqidno:13和14分别显示了cd28的人核酸和氨基酸序列，其中描述了cd28的主要转录物。然而，鉴于cd28也以进一步的剪接变体(例如，整框供体剪接变体或缺乏整框编码外显子的变体)存在，这种变体或其部分(特别是其tmd)也作为本文描述和提供的融合蛋白的一部分被涵盖。一般来说，seqidno:13和14分别显示了cd28的人核酸和氨基酸序列，其中描述了cd28的主要转录物。如本文所用，除非另有特别定义，术语“核酸”或“核酸分子”与“寡核苷酸”、“核酸链”、“多核苷酸”等同义使用，并且表示包含一个、两个或更多个核苷酸的聚合物。术语“核酸分子”涉及包含嘌呤和嘧啶碱基的由多核苷酸组成的碱基序列，由此所述碱基代表核酸分子的一级结构。本文中，术语“核酸分子”包括所有种类的核酸，包括dna、cdna、基因组dna、rna、dna的合成形式以及包含两个或更多个这些分子的混合聚合物，并且优选地涉及dna和cdna。如本领域技术人员容易理解的，本文提供的核酸序列表示dna序列，并且还包括相应的rna序列，其中t被u代替。术语“核酸分子”一般包括正义链和反义链。“核酸分子”还可包括非天然或衍生的核苷酸碱基以及天然或人工核苷酸类似物，例如，为了保护核酸分子免受本领域技术人员容易理解的内切酶和/或外切酶的影响。本发明还涉及包含本文描述和提供的核酸分子的载体。本文所使用的术语“载体”一般包括所有种类的能够在适合的宿主细胞中自主复制的线性或环形核酸分子。此类载体包括但不限于质粒、黏粒、噬菌体、病毒(例如，腺-、腺相关-、慢-或优选逆转录病毒载体)和本领域已知的其他载体或穿梭载体，它们适合携带并将基因转移到宿主细胞中，以便允许本发明融合蛋白在宿主细胞中稳定或瞬时翻译以及组成型或条件型表达。所述载体通常不整合到细胞基因组中，但也可以被整合。根据本发明包含本文所述和提供的核酸分子的载体优选地允许本发明的融合蛋白在宿主细胞中稳定表达(表达载体)。本发明的载体还可以包含标记物基因、启动子和/或增强子序列(可操作地连接到本发明的核酸分子)、适合于相应宿主细胞的复制起点、限制性定位、多克隆位点、标记和如本领域已知的进一步的功能性单位。这些载体尤其可以通过穿梭载体如病毒(它本身可以被认为是载体)转移到宿主细胞中，或者裸转化或转导到宿主细胞中。优选地，该载体被改造以适应其被转化或转导到的相应的宿主细胞。本领域技术人员会很容易理解不同的宿主细胞需要不同种类的载体。例如，如本文所示，载体(质粒)pgem是适合转化到细菌细胞中的载体，而逆转录病毒载体pmp71则适合转导到真核细胞(例如，t细胞)中。在本发明的一个实施方案中，本发明的载体是病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，例如逆转录病毒载体。适合的逆转录病毒载体的实例在本领域中是已知的，并且包括例如pmp71-pre(leisegang,kmolmed(2008),86(5):573-583)、samencmv/sra、lzrs-id3-ihres(heemskerk等,j.exp.med.186(1997),1597-1602)、felv(neil等.nature308(1984),814-820)、sax(kantoff等.proc.natl.acad.sei.usa83(1986),6563-6567)、pdol(desiderio,j.exp.med.167(1998),372-388)、n2(kasid等.proc.natl.acad.sei.usa87(1990),473-477)、lnl6(tiberghien等.blood84(1994),1333-1341)、pzipneo(chen等.j.immunol.153(1994),3630-3638)、lasn(mullen等.hum.genether.7(1996),1123-1129)、pgixsna(taylor等.j.exp.med.184(1996),2031-2036)、lcnx(sun等.hum.genether.8(1997),1041-1048)、sfg(gallardo等.blood90(1007))、lxsn(sun等.hum.genether.8(1997),1041-1048)、sfg(gallardo等.blood90(1007),952-957)、hmb-hb-hu(vieillard等.proc.natl.acad.sei.usa94(1997),11595-11600)、pmv7(cochlovius等.cancerimmunol.immunother.46(1998),61-66)、pstitch(weitjens等.genether5(1998),1195-1203)、plzr(yang等.hum.genether.10(1999),123-132)、pbag(wu等.hum.genether.10(1999),977-982)、rkat.43.267bn(gilham等.j.immunother.25(2002),139-151)、plgsn(engels等.hum.genether.14(2003),1155-1168)、pmp71(engels等.hum.genether.14(2003),1155-1168)、pgcsam(morgan等.j.immunol.171(2003),3287-3295)、pmsgv(zhao等.j.immunol.174(2005),4415-4423)或pmx(dewitte等.j.immunol.181(2008),5128-5136)。在本发明的一个特定的实施方案中，所述载体是pmp71-pre或pmp71。本发明进一步涉及包含本文所描述和提供的所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。在一个实施方案中，用本文所描述和提供的核酸分子或载体来转导或转化本发明的宿主细胞。一般来说，除非另有特定定义，本文所用的“转导(transduced)”或“转化(transformed)”(以及“转导(transduction)”或“转化(transformation)”)或类似的词可以互换使用，并且通常意指核酸分子和/或载体到宿主细胞中的任意种类的转移，不论宿主细胞的种类，不论转移方式(例如，(化学)转化、(病毒)转导、电穿孔、转染等)。核酸分子和/或载体可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或者是染色体外的(即瞬时表达)。适用于实现在宿主细胞中瞬时表达的方法的示例是本领域已知的，包括mrna转染。在一个实施方案中，核酸分子和/或载体稳定地整合到基因组中。在本发明的上下文中描述和提供的包含本文所描述和提供的核酸分子或载体的宿主细胞优选能够稳定或瞬时(例如，稳定)(组成型或条件型)表达本发明的融合蛋白。宿主细胞通常可以用任何适合的核酸分子或载体通过任何方法转导或转化。在一个实施方案中，宿主细胞用逆转录病毒或慢病毒(例如逆转录病毒)载体转导，该载体包含编码如上所述的本发明的融合蛋白或其部分(例如，ecd、tmd和/或icd)的核酸分子。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞用逆转录病毒载体转导，所述载体包含编码如上文所述的本发明的融合蛋白或其部分(例如，ecd、tmd和/或icd)的核酸分子，并稳定(组成型或条件型)表达所述融合蛋白或其部分。优选地，所述宿主细胞然后在其膜中稳定表达所述融合蛋白，其中本发明的融合蛋白的ecd指向表面，tmd(大部分)嵌入膜中，而icd指向细胞质。在本发明的上下文中，包含如本文所描述和提供的所述核酸分子或所述载体的宿主细胞涉及一种基因改造的细胞，其中所述核酸分子或所述载体被转导、转化或以其他方式被引导到宿主细胞中。如前所述，本发明的宿主细胞可以是瞬时或稳定表达本发明的融合蛋白的细胞。例如，编码本发明的融合蛋白的核酸分子可以通过逆转录病毒或慢病毒(例如，逆转录病毒)转导稳定地整合到细胞的基因组中。pd-1-bb融合蛋白在本文所提供的转导的细胞的细胞膜中表达。融合蛋白的pd-1部分的ecd位于细胞表面上，而tmd和胞内icd结合至膜，但在细胞表面上检测不到。pd-1多肽的ecd的检测可以通过使用如本文所述的特异性结合pd-1的ecd的抗体或其他结合分子来进行，例如通过elisa或通过流式细胞术或显微术。本发明的转导的细胞可以是，例如，cd8+t细胞、cd4+t细胞、双阴性α/βt细胞、nk(自然杀伤)细胞、γδt细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及适合存储和/或复制本发明的核酸分子或载体的细胞，包括细菌细胞(例如大肠杆菌)，还进一步包括真核细胞。在一个实施方案中，本发明的所述宿主细胞是t细胞，例如，cd8+t细胞。本发明的宿主细胞可以用如本文所描述和提供的编码融合蛋白的核酸分子或载体进行转导。优选地，本文所提供和描述的宿主细胞可以与其他核酸分子共转导，例如与编码t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)的核酸分子共转导。这种共转导(或如本文所描述和示例的用于将核酸分子引导到细胞中的其他方法)在本领域是已知的，并且也在本文中描述和示例。根据本发明的适合的宿主细胞的例子包括但不限于t细胞，例如cd8+t细胞、cd4+t细胞、tcr如(但不限于)tcr-t58或tcr-d115t细胞、双阴性α/βt细胞、nk(自然杀伤)细胞、γδt细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及适合储存和/或复制本发明的核酸分子或载体的细胞，包括细菌细胞(例如大肠杆菌)，还进一步包括真核细胞。所述细胞可以是自体的或非自体的，但优选是自体的。此外，对于本领域技术人员来说，所述细胞可以是同种异体的或非同种异体的。在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是cd8+t细胞。本发明还涉及制备如本文所述和提供的本发明的宿主细胞的方法，所述方法包括：(1)用本文所述和提供的核酸分子或载体转导或转化如上所述的宿主细胞；(2)在允许细胞生长和表达由所述核酸分子或所述载体编码的融合蛋白的适合的培养基中培养步骤(1)的转导的宿主细胞；和(3)从培养基中收集所述宿主细胞。在本发明的一个优选实施方案中，宿主细胞在人体外转导或转化。用于从供体(例如，人捐献者)获得、分离和培养细胞(例如，t细胞(如cd8+t细胞、cd4+t细胞)、tcr(如(但不限于)tcr-t58或tcr-d115t细胞))的方法是本领域已知的，并且特别包括抽血或移除骨髓。根据本发明的方法，通过本领域已知的任何方法，宿主细胞可以用如本文中所描述和提供的核酸分子或载体转导或转化，或者以其他方式来提供。这些方法尤其包括(化学)转化、(病毒)转导、电穿孔、转染等。在一个实施方案中，所述宿主细胞用逆转录病毒载体转导。根据本发明制备的宿主细胞可以是本文所述的任何宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是t细胞(如cd8+t细胞、cd4+t细胞)、tcr(如(但不限于)tcr-t58或tcr-d115t细胞)。本发明还涉及通过本文提供的制备方法可获得的宿主细胞。本发明还涉及一种药物组合物，该药物组合物包含如本发明描述和提供的融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞。这种药物组合物适于给患者(优选地，人患者)，特别是如上所述的宿主细胞的供体施用。因此，本发明还涉及用于通过施用药物组合物来治疗疾病或障碍的方法，所述药物组合物包含由本发明描述和提供的融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞。本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体和其它组分，例如用于galenic。所述药物组合物特别可用于治疗与pd-1配体(例如，pd-l1或pd-l2)和/或cd40的表达相关的疾病或障碍。这些疾病和障碍是本领域技术人员已知的，尤其包括(但不限于)不同类型的癌症，如肺癌、胃癌、肾细胞癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、尿路上皮癌、黑色素瘤、胰腺癌、骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、宫颈癌、食管癌、胶质瘤、非霍奇金淋巴瘤、肝细胞癌、口腔癌等。本文所提供的药物组合物可治疗的其他疾病和障碍包括(慢性)病毒感染和(慢性)炎症，特别是pd-l1/l2和/或cd40表达的情况。本发明还涉及一种包含本发明的上下文中描述和提供的融合蛋白、核酸分子、载体和/或宿主细胞的试剂盒或试剂盒组件(kit-in-parts)。本发明还涉及以下项：(1)一种融合蛋白，其包含(a)细胞外结构域，所述细胞外结构域包含位于其n-端的源自pd-1的多肽；(b)跨膜结构域；和(c)细胞内结构域，所述细胞内结构域包含位于其c-端的源自4-1bb的多肽。(2)项1的融合蛋白，其中，所述跨膜结构域包含源自pd-1或4-1bb、优选源自pd-1的多肽。(3)前述项中任一项的融合蛋白，其进一步包含cd3δ结构域。(4)前述项中任一项的融合蛋白，其中，所述细胞外结构域不包含接头或铰链结构域。(5)前述项中任一项的融合蛋白，其中，由所述细胞外结构域和/或由所述跨膜结构域包含的所述源自pd-1的多肽是源自人pd-1的多肽。(6)前述项中任一项的融合蛋白，其中，由所述跨膜结构域和/或由所述细胞内结构域包含的所述源自4-1bb的多肽是源自人4-1bb的多肽。(7)前述项中任一项的融合蛋白，其中，包含源自pd-1的多肽的所述细胞外结构域包含与seqidno:2的氨基酸序列相比具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中，所述融合蛋白显示出pd-l1/2结合亲和力。(8)前述项中任一项的融合蛋白，其中，包含源自4-1bb的多肽的所述细胞内结构域包含与seqidno:4的氨基酸序列相比具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中，所述融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到cd8+t细胞中时，能够在所述cd8+t细胞用pd-l1/2+靶细胞刺激时提高所述cd8+t细胞的增殖率。(9)项2至8中任一项的融合蛋白，其中，包含源自pd-1的多肽的所述跨膜结构域包含与seqidno:8的氨基酸序列相比具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、缺失和/或插入的氨基酸序列，其中，所述融合蛋白在经逆转录病毒方式转导到cd8+t细胞中时，能够在所述cd8+t细胞用pd-l1/2+靶细胞刺激时增加ifnγ和/或il-2的分泌。(10)前述项中任一项的融合蛋白，其中，所述细胞外结构域包含seqidno:2的氨基酸序列。(11)前述项中任一项的融合蛋白，其中，所述细胞内结构域包含seqidno:4的氨基酸序列。(12)前述项中任一项的融合蛋白，其中，所述跨膜结构域包含seqidno:8的氨基酸序列。(13)一种编码前述项中任一项的融合蛋白的核酸分子。(14)一种包含项13的核酸分子的载体。(15)一种包含项13的核酸分子或项14所述的载体的宿主细胞。(16)项15的宿主细胞，所述宿主细胞用项13的核酸分子或项14的载体转导。(17)项15或16的宿主细胞，其中，所述核酸分子或所述载体稳定地整合到宿主细胞的基因组中。(18)项16或17的宿主细胞，所述宿主细胞经由逆转导病毒转导被转导。(19)项15至18中任一项的宿主细胞，所述宿主细胞稳定地表达项13的核酸分子编码的融合蛋白。(20)项15至19中任一项的宿主细胞，所述宿主细胞是cd8+t细胞。(21)一种制备项15至20中任一项的宿主细胞的方法，所述方法包括：(1)用项13的核酸分子或项14的载体转导宿主细胞；(2)在允许细胞生长和表达由所述核酸分子或所述载体编码的所述融合蛋白的适合的培养基中培养步骤(1)的转导的宿主细胞；(3)从所述培养基中收集所述宿主细胞。(22)通过项21的方法可获得的宿主细胞。(23)一种包含项1至12中任一项的融合蛋白、项13的核酸分子、项14的载体和/或项15至20或项22中任一项的宿主细胞的药物组合物。(24)项1至12中任一项的融合蛋白、项13的核酸分子、项14的载体、项15至20或项22中任一项的宿主细胞或项23的药物组合物，用于在治疗癌症和慢性病毒感染中应用。(25)一种包括项1至12中任一项的融合蛋白、项13的核酸分子、项14的载体和/或项15至20或22中任一项的宿主细胞的试剂盒或试剂盒组件。附图说明除非另有说明，序列的一般图例：粗体：信号肽(通常在成熟蛋白中切掉)；带下划线：tmd；斜体和粗体：icd；核苷酸序列的大写字母：密码子优化序列图1：seqidno1：ecd人pd-1核酸序列seqidno:2：ecd人pd-1氨基酸序列seqidno:3：icd人4-1bb核酸序列seqidno:4：icd人4-1bb氨基酸序列seqidno:5：tmd人4-1bb核酸序列seqidno:6：tmd人4-1bb氨基酸序列seqidno:7：tmd人pd-1核酸序列seqidno:8：tmd人pd-1氨基酸序列seqidno:9：人pd-1核酸序列seqidno:10：人pd-1氨基酸序列seqidno:11：人4-1bb核酸序列seqidno:12：人4-1bb氨基酸序列seqidno:13：人cd28核酸序列seqidno:14：人cd28氨基酸序列seqidno:15：鼠pd-1核酸序列seqidno:16：鼠pd-1氨基酸序列seqidno:17：鼠4-1bb核酸序列seqidno:18：鼠4-1bb氨基酸序列seqidno:19：鼠cd28核酸序列seqidno:20：鼠cd28氨基酸序列seqidno:21：人pd-1:bbtm核酸序列seqidno:22：人pd-1:bbtm氨基酸序列seqidno:23：人pd-1tm:bb核酸序列seqidno:24：人pd-1tm:bb氨基酸序列seqidno:25：人pd-1:cd28tm核酸序列seqidno:26：人pd-1:cd28tm氨基酸序列seqidno:27：具有gly/ser(g/s)接头和iggfc间隔区的cd40l:cd28tm氨基酸序列:·pd1sp(来自pd-1的信号肽，第一个带下划线的分)·来自cd40l的ecd(seqidno:30的氨基酸(aa)113-261)·gs-接头(第二个带下划线的序列部分)·(粗体的间隔区)·cd28tm(第三个带下划线的序列部分)·来自cd28的(氨基酸(aa)148-220，粗斜体)seqidno:28：具有gly/ser(g/s)接头和fil3间隔区的cd40l:cd28tm氨基酸序列：·pd1sp(来自pd-1的信号肽，第一个带下划线的序列部分)·来自cd40l的ecd(seqidno:30的氨基酸(aa)113-261)·gs-接头(第二个带下划线的序列部分)·(粗体的间隔区)·cd28tm(第三个带下划线的序列部分)·来自cd28的(氨基酸(aa)148-220，粗斜体)seqidno:29：具有位于n-端的反向的cd28icd、短cd40icd-片段、来自cd40l的tmd和位于c-端的来自cd40l的ecd的cd28:cd40ltm·cd40l(seqidno:30的氨基酸(aa)14-261)·反向的cd28(粗斜体；氨基酸(aa)180-220)seqidno:30：天然cd40l序列·(粗斜体)·tm(带下划线)·ecd图2：嵌合pd-1共刺激受体的设计氨基酸(aa)对应于各自的人亲本蛋白质。值得注意的是，对于pd-1ecd，信号肽序列被除去，因此示出成熟蛋白质。图3：逆转录病毒转导后在tcr-t58+cd8+t细胞上的嵌合受体表达将稳定表达hla-a2限制性酪氨酸酶特异性t细胞受体tcr-t58的人t细胞用编码所指示的嵌合受体的载体以逆转录病毒方式进行转导。t细胞在转导后15天冷冻，备用。在t细胞解冻后且在t细胞用于共培养实验(在含50u/mlil-2的培养基中培养3天)前，用流式细胞术评估t细胞表面上的受体表达。示出的是代表性facs直方图，显示了通过抗pd-1染色测定的pd-1:28tm、pd-1:bbtm和pd-1tm:bb的表面表达。数字是受体阳性细胞的百分比(％)和相应的mfi。黑线直方图和黑色数字对应于同种型染色，红线直方图和红色数字对应于pd-1染色。图4：嵌合受体对tcr诱导的细胞因子分泌的影响表达所指示的嵌合受体的tcr-t58+t细胞(见图3)与(hek/tyr)或hek/tyr/pd-l1共培养16小时。去除上清液，用elisa测定ifn-γ和il-2的含量。图形显示嵌合受体表达对ifnγ(左)和il-2(右)分泌的影响。对于每个实验，计算与hek/tyr和hek/tyr/pd-l1共培养之间的细胞因子的x-倍数变化。从所有进行的实验(n＝2-3)中确定x-倍变化的平均值并用条形图呈现。误差条是sem。统计分析采用双因素方差分析(acc到sidak)。*p<0.02***p<0.0002；****p<0.0001；ns＝不显著。图5：在nsg小鼠中嵌合受体对人黑色素瘤异种移植物环境中t细胞增殖的影响将表达对于tcr-d115t细胞(hla-a2/酪氨酸酶)的肽-mhc复合物(pmhc)的sk-mel23人黑色素瘤细胞皮下注射到免疫缺陷nsg小鼠的侧腹。将cfse标记的不具有共受体表达的tcr-t58+t细胞(模拟转导的)和表达嵌合受体pd-1tm:bb或pd-1:cd28tm的那些分别瘤内注射到已建立的异种移植物(802mm3，sem±83，约17天)。t细胞注射后1天、2天、4天、6天和11天收集肿瘤，解离成单细胞悬液，并用于流式细胞术。作为探讨其在肿瘤环境中的增殖历史的手段，在t细胞(cd8+、cd4+和cd4-cd8-双阴性(dbl-)细胞)上评价cfse染色强度。tcr-d115+cd8+t细胞可被肿瘤细胞激活，并由于激活而获得一种dbl-表型。cd8+和dbl-t细胞表现出相当的cfse稀释，并表示为一个群体。cd4+t细胞不能识别黑色素瘤细胞，因此不能进行pmhc特异性增殖。cd4+t细胞中的cfse稀释直到t细胞注射后6天才出现，并且很可能是由于活化的cd8+t细胞产生的细胞因子所致(未示出)。示出的是瘤内注射1天和2天后cd8+/dbl-t细胞cfse染色的代表性直方图。每个直方图对应于一个小鼠的一个肿瘤。数字表示cfse的平均荧光强度。垂直线表示初始csfe强度，指示尚未开始增殖的细胞。观察到，第1天和第2天时，共表达嵌合受体pd-1tm:bb的cd8+/dbl-t细胞分别与无嵌合受体或表达pd-1:cd28tm受体的cd8+/dbl-t细胞相比cfse强度较低。第4天，cd8+dbl-t细胞显示出相当的与嵌合受体表达无关的cfse稀释(未示出)。表达pd-1tm:bb的t细胞的cfse早期稀释表明这些t细胞与肿瘤细胞的反应比无嵌合受体的t细胞或表达嵌合受体pd-1:cd28tm的t细胞更强烈，增殖开始得更早。上面2条线(绿色)代表tcr-d115/pd-1tm:bb中间2条线(红色)代表下面2条线(蓝色)代表tcr-d115模拟(对照)图6：将表达对于tcr-d115和tcr-t58t细胞(hla-a2/酪氨酸酶)的肽-mhc复合物(pmhc)的sk-mel23人黑色素瘤细胞皮下注射到免疫缺陷nsg小鼠的侧腹。将cfse标记的无共受体表达的tcr-d115t细胞(模拟)和表达嵌合受体pd-1tm:bb的那些瘤内注射到已建立的异种移植物(802mm3，sem±83，约17天)中。在t细胞注射前和注射后第2天和第7天用卡尺测量肿瘤体积：用改进的椭球公式计算肿瘤体积；体积＝(长度×宽度2)×0.52。处死小鼠，将肿瘤解离成单细胞悬液，用流式细胞术计数每个肿瘤的t细胞(cd45+细胞(g肿瘤))。n＝3只小鼠/时间点和t细胞。如a)中所示，tcr-d115/pd-1tm:bbt细胞的瘤内细胞数在第2天比没有嵌合受体的t细胞高得多，在第7天细胞数仍升高。伴随着更高的细胞数目，tcr-d115/pd-1tm:bbt细胞取得了良好的肿瘤控制，与第2天初始体积相比，肿瘤体积缩小，第7天时肿瘤控制得更好(相比第2天，第7天肿瘤体积平均倍数变化为1.7)(b)。图7：在人t细胞中表达的cd40l:28嵌合蛋白的投射效应。1)对转基因t细胞的顺式活性支持效应：融合蛋白在t细胞上的结合诱导cd28信号传导，从而支持tcr信号、ctl效应子功能和存活，从而产生更好的肿瘤杀伤。2)对抗原呈递细胞(apc)的反式效应：apc上的cd40激活将刺激apc分泌细胞因子(il-12)和趋化因子，这将增强ctl效应子功能。3)对内皮细胞的反式效应：表达在肿瘤内皮细胞上的cd40的结合将导致内皮细胞凋亡，从而破坏肿瘤的血管支持。4)对肿瘤细胞的反式效应：表达在肿瘤细胞上的cd40的结合将导致肿瘤细胞凋亡。图8：用不同的接头和结构域定向建立3种不同的构建体。1)cd40lfc:28；2)cd40lfil:28；3)cd40l:28i图9：稳定逆转录病毒转导后，cd40l:28构建体在人t细胞上的表达特征。人t细胞以逆转录病毒方式转导以表达所述嵌合蛋白，在第7天和第17天分析表面蛋白表达。尽管表面表达在第7天被检测到，直到第17天表达消失，与此同时t细胞达到休眠状态(图9a)。在tcr特异性激活后再次实现表面表达(图9b)。因此，这些嵌合蛋白以适应需要t细胞支持的时间和地点的方式显示出可诱导的表面存在。图10：在t细胞上表达的嵌合cd40l:28蛋白能够激活b细胞(反式效应)。t细胞与原代b细胞按照1:1的比率共培养24h。此后，收集细胞并通过流式细胞术分析cd86和fas。条形描绘了b细胞上分析的标记物的平均荧光强度。如通过观察到b细胞上cd86和fas的更高表达所证明的，嵌合蛋白的cd40l-ecd具有功能活性。对于cd83，b细胞活化的另一个标记物，也观察到类似的效应(未示出)。所述3种不同的构建体显示出分等级的活性，类似于或高于天然cd40l蛋白。图11：在tcr-t58t细胞上表达的嵌合cd40l:28蛋白支持t细胞功能(顺式效应)。逆转录病毒转导后，将无嵌合蛋白的tcr-t58转基因t细胞(对照(crtl))或表达天然cd40l或嵌合蛋白的tcr-t58转基因t细胞与黑色素瘤细胞系(tcr配体和cd40阳性的sk-mel23、fm86)共培养。a)测量共培养48h的上清液中的ifn-γ。b)共培养4h后测量对黑色素瘤肿瘤细胞的细胞毒性(铬释放试验)。所描述的结果来自5:1的效应子:靶标比率。如在两个测定中都可以看到的，与对照(ctrl.)相比，表达嵌合蛋白的t细胞分泌更多的ifn-γ，并且对肿瘤细胞显示出的细胞毒性更高。因此，嵌合蛋白的cd23-icd具有功能活性，即增强表达嵌合蛋白的t细胞的效应子活性。通过下面的实施例进一步说明本发明。然而，其中描述的实施例和特定实施方案不是必须被解释为将本发明限制于这些特定实施方案。具体实施方式编码嵌合受体的质粒嵌合受体序列在geneart,lifetechnologies定制。它们以冻干粉末形式被运来，并以0.5μg/μl的浓度溶解于无核酸酶的水中。为了扩增，遵循标准质粒制备方法，用geneart构建体对top10或mach1大肠杆菌进行化学转化。用ivtrna对人原代t细胞电穿孔将嵌合受体序列克隆到pgem中以制备ivtrna。利用hindiii或hindii和ecori(newenglandbiolabs)实现了到pgem载体(由s.milosevic,medigenegmbh,martinsried，德国提供)中的克隆。根据制造商的操作指南使用mmessagemmachine试剂盒(ambion)从pgem质粒产生ivtrna。利用genepulserxcell(bio-rad)用20μgivtrna在900v下对人原代t细胞电穿孔2.3ms。人原代t细胞的逆转录病毒转导将嵌合受体序列克隆到pmp71-per载体(leisegang2008，参见上文，用于逆转录病毒转导)中。如上所述(leisegang2008，参见上文)，实现了t细胞的逆转录病毒转导。以在rpmi1640中每孔1×106/ml的细胞密度将来自健康供体的人pbmc铺到24孔板中，所述rpmi1640添加了10％人血清、1％l-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠和1％青霉素/链霉素(全部来自invitrogen)以及100u/mlil-2(cancernova)，并用5μg/mlokt3(由e.kremmer,helmholtzcentermunich,德国提供)和1μg/ml抗cd28(bdpharmingen)活化2天。根据制造商的操作指南，如所述(leisegang等,clincancerres(2010),16(8):2333-2343)使用-lt1试剂(mirus)产生编码两性(amphotrophic)嵌合受体的逆转录病毒。病毒上清液在48h后收获，并通过离心结合到(10μg/ml，takara)包被的板上。将活化2天的pbmc加入病毒包被的板中24h，然后分到新鲜病毒包被的板中，再培养3天。将转导的pbmc转移到未包被的板上，并至少再培养12天，将il-2的量减少到50u/ml。在用抗pd-1抗体(biolegend)转导后的第12天测定受体表达。细胞培养通过转导hla-a2+hek293细胞来表达酪氨酸酶(hek/tyr)或酪氨酸酶和pd-l1(hek/tyr/pd-l1)，产生了hek/tyr和hek/tyr/pd-l1。转导后，hek293细胞进行单细胞克隆，并筛选出hla-a2和酪氨酸酶表达具有可比性的克隆。sk-mel23(m.c.panelli,nih,bethesda,美国的馈赠)、hek/tyr和hek/tyr/pd-l1在rpmi-1640中培育，所述rpmi-1640添加了1％l-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、1％青霉素/链霉素(基础rmpi)和12％fcs。多参数流式细胞术测定嵌合受体表达和t细胞增殖对lsrii(bd)进行流式细胞术分析。细胞在添加了2％人血清、0.1％叠氮化钠和2mmedta(均采购自sigma-aldrich)的pbs(invitrogen)中染色。用抗cd3-pe-cy7、抗小鼠tcrβ-恒定区-pb(都采购自biolegend)、抗cd4-apc-a780、抗pd-1-apc(都采购自ebioscience)、抗cd8-v500(bd)和7-aad(sigma-aldrich)分析人嵌合受体和转基因tcr的表达。用抗hla-a2(atcchb54)加上抗小鼠igg1-a488(invitrogen)、抗pd-l1-fitc(bd)、抗酪氨酸酶(upstate)加上抗小鼠igg2a-a647(invitrogen)和7-aad分析hek293细胞。用cfse、抗cd45-pe-cy7、抗cd8-pb(bd)、cd4-apc-a780、抗pd-1-apc和7-aad分析注射到异种移植肿瘤中后的t细胞。对活细胞和单个细胞进行门控后，选择cd45+白细胞，并在cd8+、cd4+和dbl-细胞中分析cfse强度。采用flowjo8.8.7软件对数据进行分析。共培养和细胞因子测定评估融合蛋白对t细胞的影响将tcr-t58或tcr-d115转基因人t细胞用ivtrna电穿孔或用逆转录病毒载体转导来表达嵌合受体，然后以1:2的比率与hek/tyr或hek/tyr/pd-l1细胞一起培养。16h后收获共培养上清液，并根据制造商的操作指南用夹心elisa(bd)或bio-plex(bio-rad)进行分析。由于转导的tcrst58和d115仅在cd8+t细胞中起作用，而且cd8+/cd4+t细胞比率在实验之间有变化，因此将测量的细胞因子的量归一化为细胞悬浮液中tcr+cd8+t细胞的百分比(通过流式细胞术测定)。采用如下公式：nsg小鼠nsg小鼠获自charlesriver。nod/scidil2rgnull(nsg)小鼠是在非肥胖糖尿病(nod)小鼠的遗传背景上培育的，其特点是先天免疫力低下。nsg小鼠携带prkdcscid突变，这是prkdc基因中的一种功能缺失突变，导致在b细胞和t细胞发展中的v(d)j重组过程中dna链断裂的修复有缺陷。这种重症联合免疫缺陷(scid)的特征是t细胞和b细胞的大量减少。另外，nsg小鼠在il-2受体γ链中携带一个无效突变(il2rgnull)，该突变阻断nk细胞分化。先天免疫的损伤和缺乏获得性免疫使nsg小鼠成为人肿瘤异种移植物的过继性t细胞治疗的良好模型体系。人黑色素瘤异种移植模型动物实验经当地主管部门批准，按照法律规定进行。7-11周龄雄性小鼠皮下注射5×106hla-a2+酪氨酸酶+人黑色素瘤细胞sk-mel23(monicac.panelli,nih,bethesda,美国的馈赠)。选择这个黑色素瘤系是因为它表达pd-l1/l2以及hla-a2和酪氨酸酶，这些是形成tcr-d115和tcr-t58的配体所必需的(wilde等,blood(2009),114:2131-2139)。选择表达tcr-d115的t细胞进行小鼠实验，因为它们可以以弱的亲合力识别sk-mel23，该亲合力不足以摧毁已建立的肿瘤。肿瘤生长约16天，直到其尺寸达到802mm3(sem＝±83)。肿瘤体积(mm3)用测定椭球体积的公式计算：π/6×长×宽×高。tcr-d115t细胞在人sk-mel23异种移植物的肿瘤环境中的增殖细胞示踪染料，即cfda-se，用于评价细胞增殖。它们穿过细胞膜并转化为发荧光的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(即cfse)。随着每次细胞分裂，cfse的荧光强度减半，从而允许监测t细胞增殖。本实验中，37℃下，用0.15μm的cfda-se标记具有或不具有嵌合受体表达的tcr-d115t细胞8分钟。用fcs终止反应，t细胞用pbs洗涤两次，并以10×107细胞/ml的浓度重新悬浮在pbs中。将50μl的t细胞悬液瘤内注射到已建立的皮下sk-mel23异种移植物(802mm3，sem＝±83)中。瘤内注射后1、2、4、6和11天收获肿瘤。通过机械和酶促消化制备单细胞悬液(prinz等,jimmunol(2012),188:5990-6000)，并用于流式细胞术分析。铬释放试验将51cr标记的黑色素瘤细胞用作靶标，在96孔v形底板中每孔固定2000个细胞的细胞数。以效应细胞四步滴定的重复测量进行实验。在平行孔中，靶细胞在没有t细胞存在下孵育，以测定[51cr]的自发释放。4h后收获上清液，并转移到计数板(perkinelmer)用于cpm测量。通过直接将标记的靶细胞转化为cpm测量的计数来确定最大cpm。如下计算特异性裂解的百分比：％特异性裂解＝(实验cpm-自发cpm)/(最大cpm-自发cpm)×100。统计统计检验，如附图说明所述，采用graphpadprism6软件进行。结果结果如附图所示。序列表<110>德国亥姆霍兹慕尼黑中心健康与环境研究中心（有限公司）<120>pd-1和4-1bb的融合蛋白<130>lc18310016p<150>lu93006<151>2016-03-23<160>30<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>495<212>dna<213>人(human)<400>1atgcagattcctcaggccccttggcctgtcgtgtgggctgtgctccagctgggatggcgg60cctggctggtttctggacagccccgacagaccctggaacccccctacattttcccctgcc120ctgctggtcgtgaccgagggcgacaatgccaccttcacctgtagcttcagcaacaccagc180gagagcttcgtgctgaactggtacagaatgagccccagcaaccagaccgacaagctggcc240gccttccccgaggatagatctcagcccggccaggattgccggttcagagtgacccagctg300cccaacggccgggacttccacatgtctgtcgtgcgggccagacggaacgacagcggcaca360tatctgtgcggcgccatcagcctggcccccaaggcccagatcaaagagagcctgagagcc420gagctgagagtgaccgagagaagggccgaagtgcctaccgcccaccctagcccatctcca480agacctgccggccag495<210>2<211>165<212>prt<213>人(human)<400>2metglnileproglnalaprotrpprovalvaltrpalavalleugln151015leuglytrpargproglytrppheleuaspserproaspargprotrp202530asnproprothrpheserproalaleuleuvalvalthrgluglyasp354045asnalathrphethrcysserpheserasnthrsergluserpheval505560leuasntrptyrargmetserproserasnglnthrasplysleuala65707580alapheprogluaspargserglnproglyglnaspcysargphearg859095valthrglnleuproasnglyargaspphehismetservalvalarg100105110alaargargasnaspserglythrtyrleucysglyalaileserleu115120125alaprolysalaglnilelysgluserleuargalagluleuargval130135140thrgluargargalagluvalprothralahisproserproserpro145150155160argproalaglygln165<210>3<211>129<212>dna<213>人(human)<400>3aagcggggcagaaagaagctgctgtacatcttcaagcagcccttcatgcggcccgtgcag60accacccaggaagaggacggctgctcctgccggtttcccgaggaagaagaggggggctgc120gagctctaa129<210>4<211>42<212>prt<213>人(human)<400>4lysargglyarglyslysleuleutyrilephelysglnprophemet151015argprovalglnthrthrglnglugluaspglycyssercysargphe202530proglugluglugluglyglycysgluleu3540<210>5<211>81<212>dna<213>人(human)<400>5attatctcattcttcctggccctgacctctaccgccctgctgtttctgctgttctttctg60accctgcggttcagcgtcgtg81<210>6<211>27<212>prt<213>人(human)<400>6ileileserphepheleualaleuthrserthralaleuleupheleu151015leuphepheleuthrleuargpheservalval2025<210>7<211>78<212>dna<213>人(human)<400>7ttccagacactggtcgtgggagtcgtgggcggcctgctgggatctctggtgctgctcgtg60tgggtgctggccgtgatc78<210>8<211>26<212>prt<213>人(human)<400>8pheglnthrleuvalvalglyvalvalglyglyleuleuglyserleu151015valleuleuvaltrpvalleualavalile2025<210>9<211>866<212>dna<213>人(human)<400>9atgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgggcggtgctacaactgggctggcgg60ccaggatggttcttagactccccagacaggccctggaacccccccaccttctccccagcc120ctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcg180gagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggcc240gccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactg300cccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacc360tacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggca420gagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgcccacagcccaccccagcccctcaccc480aggccagccggccagttccaaaccctggtggttggtgtcgtgggcggcctgctgggcagc540ctggtgctgctagtctgggtcctggccgtcatctgctcccgggccgcacgagggacaata600ggagccaggcgcaccggccagcccctgaaggaggacccctcagccgtgcctgtgttctct660gtggactatggggagctggatttccagtggcgagagaagaccccggagccccccgtgccc720tgtgtccctgagcagacggagtatgccaccattgtctttcctagcggaatgggcacctca780tcccccgcccgcaggggctcagctgacggccctcggagtgcccagccactgggcctgagg840atggacactgctcttggcccctctga866<210>10<211>288<212>prt<213>人(human)<400>10metglnileproglnalaprotrpprovalvaltrpalavalleugln151015leuglytrpargproglytrppheleuaspserproaspargprotrp202530asnproprothrpheserproalaleuleuvalvalthrgluglyasp354045asnalathrphethrcysserpheserasnthrsergluserpheval505560leuasntrptyrargmetserproserasnglnthrasplysleuala65707580alapheprogluaspargserglnproglyglnaspcysargphearg859095valthrglnleuproasnglyargaspphehismetservalvalarg100105110alaargargasnaspserglythrtyrleucysglyalaileserleu115120125alaprolysalaglnilelysgluserleuargalagluleuargval130135140thrgluargargalagluvalprothralahisproserproserpro145150155160argproalaglyglnpheglnthrleuvalvalglyvalvalglygly165170175leuleuglyserleuvalleuleuvaltrpvalleualavalilecys180185190serargalaalaargglythrileglyalaargargthrglyglnpro195200205leulysgluaspproseralavalprovalpheservalasptyrgly210215220gluleuasppheglntrpargglulysthrprogluproprovalpro225230235240cysvalprogluglnthrglutyralathrilevalpheprosergly245250255metglythrserserproalaargargglyse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