新型基因重组牛痘病毒的制作方法

本发明涉及新型基因重组牛痘病毒。

背景技术：

近年来，已开发出将病毒用于癌症治疗的各种技术，作为癌症治疗中使用的病毒之一，有牛痘病毒。对于牛痘病毒，作为将治疗用基因送向癌细胞的载体、作为在癌细胞中增殖并破坏癌细胞的肿瘤溶解性病毒、或者作为表达癌抗原或免疫调节分子的癌疫苗，以癌症治疗为目的进行了研究(expertopiniononbiologicaltherapy,2011,vol.11,p.595-608)。

据报道，按照通过编码白细胞介素-12(il-12)或白细胞介素-21(il-21)的外源基因的插入使n1l基因失活、并且通过lacz报告基因和萤火虫荧光素酶基因的插入使胸苷激酶(tk)基因发生缺陷的方式进行操作而得到的牛痘病毒在荷瘤小鼠中带来肿瘤生长的抑制或存活率的改善(专利文献1)。

关于使作为病毒蛋白的牛痘病毒生长因子(vgf)和o1l的功能缺陷、在癌细胞内特异性增殖而破坏癌细胞的重组牛痘病毒，报道了要将其用于癌症治疗的技术。还说明了在该病毒中可以将标记基因、编码具有细胞毒性或免疫激活效果的产物的治疗用基因等外源基因导入到非牛痘病毒的生命周期所必须的基因中，在实施例中具体验证的是作为标记基因的荧光素酶-绿色荧光蛋白(gfp)融合基因或dsred表达盒的导入。未验证治疗用基因的导入。也没有关于将多个治疗用基因组合的启示(专利文献2)。

另一方面，在使用重组蛋白的研究中，有如下报道：作为对单离的cd8⁺t细胞的作用，单独的人重组白细胞介素-7(il-7)蛋白对cd8⁺t细胞不会诱发可检测水平的干扰素-γ(ifn-γ)产生，但人重组il-7蛋白与人重组il-12蛋白的组合协同地促进该ifn-γ产生(thejournalofimmunology,1995,vol.154,p.5093-5102)。关于表达免疫刺激分子的肿瘤溶解性牛痘病毒，报道了有可能通过强免疫应答早期地清除病毒。还说明了强免疫应答对于牛痘病毒介导的癌症治疗法而言亦敌亦友(moleculartherapy,2005,vol.11,no.2,p.180-195)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2015/150809号

专利文献2：国际公开第2015/076422号

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的课题在于提供用于治疗或预防癌症的基因重组牛痘病毒(特别是肿瘤溶解性的牛痘病毒)、药物组合物和组合试剂盒。

用于解决问题的方法

本发明人在牛痘病毒的制作中反复进行了大量的创见研究，结果，制作了包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒或包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒、以及包含编码il-7的多核苷酸和编码il-12的多核苷酸这两种多核苷酸的牛痘病毒(实施例2)，并发现1)包含编码il-7的多核苷酸和编码il-12的多核苷酸这两种多核苷酸的牛痘病毒、以及2)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒与包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒这两种牛痘病毒的混合物对各种人癌细胞显示出细胞溶解作用(实施例3)，从而完成了本发明。

1)包含编码il-7的多核苷酸和编码il-12的多核苷酸这两种多核苷酸的牛痘病毒在荷瘤人源化小鼠模型中显示出肿瘤缩减作用(实施例6)，在同系荷瘤小鼠模型中显示出完全缓解(实施例7)，进而诱导获得性免疫而持续得到抗肿瘤效果(实施例8)。另外，2)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒与包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒这两种牛痘病毒的混合物在同系荷瘤小鼠模型中显示出完全缓解(实施例7)，进而诱导获得性免疫而持续得到抗肿瘤效果(实施例8)。

即，本发明可以包含作为医学上或产业上有用的物质或方法的下述发明。

[1]一种牛痘病毒，其包含下述(1)和(2)：

(1)编码白细胞介素-7(il-7)的多核苷酸；和

(2)编码白细胞介素-12(il-12)的多核苷酸。

[2]一种药物组合物，其选自下述(1)或(2)：

(1)用于与含有包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用的、含有包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物；或者

(2)用于与含有包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用的、含有包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物。

[3]一种组合试剂盒，其含有下述(1)和(2)的牛痘病毒：

(1)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒；和

(2)包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒。

[4]如[1]所述的牛痘病毒，其牛痘病毒生长因子(vgf)的功能发生了缺陷。

[5]如[1]所述的牛痘病毒，其o1l的功能发生了缺陷。

[6]如[1]所述的牛痘病毒，其vgf和o1l的功能发生了缺陷。

[7]如[1]所述的牛痘病毒，其缺失b5r胞外区的scr(短共有重复序列，shortconsensusrepeat)结构域。

[8]如[1]所述的牛痘病毒，其vgf和o1l的功能发生了缺陷，并且缺失b5r胞外区的scr结构域。

[9]如[1]和[4]～[8]中任一项所述的牛痘病毒，其为lc16mo株。

[10]一种药物组合物，其包含[1]和[4]～[9]中任一项所述的牛痘病毒和药学上可接受的赋形剂。

[11]如[2]所述的药物组合物或[3]所述的试剂盒，其中，牛痘病毒的vgf的功能发生了缺陷。

[12]如[2]所述的药物组合物或[3]所述的试剂盒，其中，牛痘病毒的o1l的功能发生了缺陷。

[13]如[2]所述的药物组合物或[3]所述的试剂盒，其中，牛痘病毒的vgf和o1l的功能发生了缺陷。

[14]如[2]所述的药物组合物或[3]所述的试剂盒，其中，牛痘病毒缺失b5r胞外区的scr结构域。

[15]如[2]所述的药物组合物或[3]所述的试剂盒，其中，牛痘病毒的vgf和o1l的功能发生了缺陷，并且缺失b5r胞外区的scr结构域。

[16]如[2]和[11]～[15]中任一项所述的药物组合物或[3]和[11]～[15]中任一项所述的试剂盒，其中，牛痘病毒为lc16mo株。

[17]如[2]和[11]～[16]中任一项所述的药物组合物或[3]和[11]～[16]中任一项所述的试剂盒，其中，包含药学上可接受的赋形剂。

[18]如[10]～[17]中任一项所述的药物组合物或试剂盒，其用于癌症的预防或治疗。

[19]如[18]所述的药物组合物或试剂盒，其中，癌症为恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌或胃癌。

[20]一种预防或治疗癌症的方法，其包括对需要癌症的预防或治疗的对象施用[1]和[4]～[9]中任一项所述的牛痘病毒的步骤。

[21]如[20]所述的方法，其中，癌症为恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌或胃癌。

[22]如[1]和[4]～[9]中任一项所述的牛痘病毒，其用于在癌症的预防或治疗中使用。

[23]如[22]所述的牛痘病毒，其中，癌症为恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌或胃癌。

[24][1]和[4]～[9]中任一项所述的牛痘病毒在制造癌症的预防或治疗用药物组合物中的应用。

[25]如[24]所述的应用，其中，癌症为恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌或胃癌。

[26]一种预防或治疗癌症的方法，其包括：对需要癌症的预防或治疗的对象施用(1)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒和(2)包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒的步骤。

[27]如[26]所述的方法，其中，癌症为恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌或胃癌。

[28]一种牛痘病毒，其选自下述(1)或(2)：

(1)用于与含有包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用而在癌症的预防或治疗中使用的、包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒；或者

(2)用于与含有包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用而在癌症的预防或治疗中使用的、包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒。

[29]如[28]所述的牛痘病毒，其中，癌症为恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌或胃癌。

[30]一种牛痘病毒的应用，其选自下述(1)或(2)：

(1)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒在制造与含有包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用的癌症的预防或治疗用药物组合物中的应用；或者

(2)包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒在制造与含有包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用的癌症的预防或治疗用药物组合物中的应用。

[31]如[30]所述的应用，其中，癌症为恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌或胃癌。

[32](1)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒和(2)包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒在制造用于癌症的预防或治疗的组合试剂盒中的应用。

[33]如[32]所述的应用，其中，癌症为恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌或胃癌。

发明效果

本发明的牛痘病毒、以及本发明的药物组合物和组合试剂盒中含有的牛痘病毒显示出肿瘤溶解作用，在癌细胞中使搭载于病毒中的多核苷酸所编码的il-12多肽和il-7多肽表达，带来完全缓解和获得性免疫，本发明的牛痘病毒、药物组合物和组合试剂盒能够用于癌症的预防或治疗。

附图说明

图1示出本发明中使用的转移载体质粒dna的一例。图1上示出将以能够工作的方式与启动子连接的bfp基因并入到vgf基因内的例子。图1下示出将以能够工作的方式与启动子连接的bfp基因并入到o1l基因内的例子。

图2示出各种重组牛痘病毒(lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-lacz和在该病毒载体制作的过程中构建的各种病毒)的基因组结构的示意图。

图3示出各种重组牛痘病毒(lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-lacz、lc16moδscrvgf-sp-il7/o1l-sp-lacz)的基因组结构的示意图。

图4示出重组牛痘病毒(lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-il7)的基因组结构的示意图。

图5-1示出重组牛痘病毒(lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-il7)的肿瘤溶解性。纵轴表示癌细胞存活率(％)。误差棒表示标准偏差。

图5-2示出重组牛痘病毒(lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-il7)的肿瘤溶解性。纵轴表示癌细胞存活率(％)。误差棒表示标准偏差。图5-1和图5-2是除了所测定的细胞种类不同以外在相同的实验条件下得到的图。

图5-3示出两种重组牛痘病毒的混合物(lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-lacz与lc16moδscrvgf-sp-il7/o1l-sp-lacz的混合物)的肿瘤溶解性。纵轴表示癌细胞存活率(％)。误差棒表示标准偏差。

图5-4示出两种重组牛痘病毒的混合物(lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-lacz与lc16moδscrvgf-sp-il7/o1l-sp-lacz的混合物)的肿瘤溶解性。纵轴表示癌细胞存活率(％)。误差棒表示标准偏差。图5-3和图5-4是除了所测定的细胞种类不同以外在相同的实验条件下得到的图。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。

<本发明的牛痘病毒、用于组合使用的药物组合物和组合试剂盒>

本发明提供一种牛痘病毒，其包含下述(1)和(2)：

(1)编码il-7的多核苷酸；和

(2)编码il-12的多核苷酸。

(本说明书中，将该牛痘病毒也称为“本发明的牛痘病毒”)

另外，本发明提供一种药物组合物，其选自下述(1)或(2)：

(1)用于与含有包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用的、含有包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物；或者

(2)用于与含有包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用的、含有包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物。

(本说明书中，将该药物组合物也称为“本发明的用于组合使用的药物组合物”，将上述(1)或(2)所述的本发明的用于组合使用的药物组合物中分别含有的包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒或包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒也称为“用于组合使用的牛痘病毒”)

另外，本发明提供一种组合试剂盒，其含有下述(1)和(2)的牛痘病毒：

(1)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒；和

(2)包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒。

(本说明书中，将该组合试剂盒也称为“本发明的组合试剂盒”，将本发明的组合试剂盒中含有的各牛痘病毒也称为“组合试剂盒用牛痘病毒”)

本发明的组合试剂盒是指为了施用(1)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒和(2)包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒这两种牛痘病毒而使用的一种或多种药物组合物。在同时施用两种牛痘病毒的情况下，组合试剂盒可以将上述两种组合试剂盒用牛痘病毒一起含有在粉末剂这样的单一的药物组合物中、或者分别含有在多个药物组合物中。因此，本发明的组合试剂盒包含下述药物组合物，该药物组合物含有包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒和包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒这两种牛痘病毒。在不同时施用两种组合试剂盒用牛痘病毒的情况下，组合试剂盒在单独的药物组合物中分别含有上述两种组合试剂盒用牛痘病毒。例如，组合试剂盒在单一包装中的单独的药物组合物中、或者在单独的包装中的单独的药物组合物中含有上述两种组合试剂盒用牛痘病毒。本发明的组合试剂盒可以含有药学上可接受的赋形剂。

本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒、以及组合试剂盒用牛痘病毒中使用的牛痘病毒是属于痘病毒科正痘病毒属的病毒。本发明中使用的牛痘病毒株没有限定，可以列举例如lister株、纽约市卫生委员会(newyorkcityboardofhealth)(nybh)株、wyeth株、哥本哈根株、westernreserve(wr)株、改良型牛痘病毒安卡拉(modifiedvacciniaankara，mva)株、em63株、池田株、大连株、tiantan株等，lister株、mva株可由美国典型培养物保藏中心获得(分别为atccvr-1549和atccvr-1508)。此外，作为本发明中使用的牛痘病毒，也可以使用以这些株作为来源而建立的牛痘病毒株。例如，作为本发明中使用的牛痘病毒，也可以使用由lister株建立的lc16株、lc16m8株和lc16mo株。lc16mo株是将lister株作为亲本株进行低温传代、经由lc16株而制作出的株。lc16m8株是将lc16mo株进一步低温传代而制作出的株，该株在作为编码病毒膜蛋白的基因的b5r基因中确认到移码突变，该蛋白质不再表达和发挥功能，由此进行了减毒化(蛋白质核酸酶,2003,vol.48,p.1693-1700)。作为lister株、lc16m8株和lc16mo株的全基因组序列，例如分别已知有登录号ay678276.1、登录号ay678275.1和登录号ay678277.1。因此，可以由lister株利用公知的同源重组或定点诱变法制作lc16m8株和lc16mo株。

在一个实施方式中，本发明中使用的牛痘病毒为lc16mo株。

作为本发明中使用的牛痘病毒，可以使用减毒化和/或肿瘤选择性牛痘病毒。在本说明书中，“减毒化”是指对正常细胞(例如非肿瘤细胞)的毒性(例如细胞溶解性)低。在本说明书中，“肿瘤选择性”是指与正常细胞(例如非肿瘤细胞)相比对肿瘤细胞的毒性(例如肿瘤溶解性)高。作为本发明中使用的牛痘病毒，可以使用施加了使特定蛋白的功能缺陷、或者抑制特定基因或蛋白的表达这样的基因改变的牛痘病毒(expertopiniononbiologicaltherapy,2011,vol.11,p.595-608)。例如，为了提高牛痘病毒的肿瘤选择性，可以使用使tk的功能缺陷的牛痘病毒(cancergenetherapy,1999,vol.6,p.409-422)、使vgf的功能缺陷的牛痘病毒(cancerresearch,2001,vol.61,p.8751-8757)、包含修饰tk基因和修饰血凝素(ha)基因以及修饰f3基因或中断的f3基因座的牛痘病毒(国际公开第2005/047458号)、使vgf和o1l的功能缺陷的牛痘病毒(国际公开第2015/076422号)、在b5r基因的3’非翻译区内插入有在癌细胞中表达降低的小分子rna的靶序列的牛痘病毒(国际公开第2011/125469号)、使vgf和tk的功能缺陷的牛痘病毒(cancerresearch,2001,vol.61,p.8751-8757)、使tk和ha以及f14.5l的功能缺陷的牛痘病毒(cancerresearch,2007,vol.67,p.10038-10046)、使tk和b18r的功能缺陷的牛痘病毒(plosmedicine,2007,vol.4,p.e353)、使tk和核糖核苷酸还原酶的功能缺陷的牛痘病毒(plospathogens,2010,vol.6,p.e1000984)、使spi-1和spi-2的功能缺陷的牛痘病毒(cancerresearch,2005,vol.65,p.9991-9998)、使spi-1、spi-2和tk的功能缺陷的牛痘病毒(genetherapy,2007,vol.14,p.638-647)、或者在e3l和k3l区域具有突变的牛痘病毒(国际公开第2005/007824号)。另外，可以使用使o1l的功能缺陷的牛痘病毒(journalofvirology,2012,vol.86,p.2323-2336)。另外，期待在生物体内减弱因抗牛痘病毒抗体的中和效果所致的病毒的排除，可以使用使b5r的胞外区缺陷的牛痘病毒(virology,2004,vol.325,p.425-431)或者使a34r区域缺陷的牛痘病毒(moleculartherapy,2013,vol.21,p.1024-1033)。另外，期待由牛痘病毒产生的免疫细胞活化作用，可以使用使白细胞介素-1b(il-1b)受体缺陷的牛痘病毒(国际公开第2005/030971号)。这些外源基因的插入或基因的缺失、突变可以利用例如公知的同源重组或定点诱变法来进行。另外，在本发明中，作为牛痘病毒，可以使用具有这些基因改变的组合的牛痘病毒。在本说明书中，“缺陷”是指由该术语特别限定的基因区域不具有功能，以包括缺失了由该术语特别限定的基因区域的含义使用。例如，“缺陷”可以是在由特别限定的基因区域构成的区域中发生了缺失，也可以是在包含特别限定的基因区域的周围的基因区域发生了缺失。

在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒的vgf的功能发生了缺陷。在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒的o1l的功能发生了缺陷。在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒的vgf和o1l的功能发生了缺陷。可以基于国际公开第2015/076422号中记载的方法使牛痘病毒发生vgf和/或o1l的功能缺陷。

vgf是与表皮生长因子(egf)具有高度的氨基酸序列同源性的蛋白质，与egf同样地与表皮生长因子受体结合，引起ras、raf、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase、mapk)/细胞外信号调节激酶(theextracellularsignal-regulatedkinase、erk)激酶(mapk/erk激酶、mek)、以及与erk相连的信号级联的活化，促进细胞分裂。

o1l维持erk的活化，与vgf一同有助于细胞的分裂。

牛痘病毒的vgf和/或o1l的功能的缺陷是指，不表达编码vgf的基因和/或编码o1l的基因；或者即使表达，其表达蛋白质也不保持vgf和/或o1l的正常功能。为了使牛痘病毒的vgf和/或o1l的功能缺陷，使编码vgf的基因和/或编码o1l的基因全部或部分缺失即可。另外，也可以通过碱基的置换、缺失、插入或添加使基因发生突变，以使其无法表达正常的vgf和/或o1l。另外，也可以在编码vgf的基因和/或编码o1l的基因中插入外源基因。本发明中，在因基因的置换、缺失、插入或添加等突变而不表达正常的基因产物的情况下，称为基因缺陷。

关于本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒的vgf和/或o1l的功能是否发生了缺陷，可以使用公知的方法来判断。例如可以通过下述方法来判断：进行vgf和/或o1l的功能评价；利用使用抗vgf的抗体或抗o1l的抗体的免疫化学方法来确认vgf或o1l的存在；利用聚合酶链式反应(pcr)来确定编码vgf的基因或编码o1l的基因的存在。

b5r(登录号aaa48316.1)是存在于牛痘病毒的包膜上的i型膜蛋白，当病毒感染、传播到相邻的细胞或宿主体内的其他部位时，其发挥提高感染效率的作用。在b5r的胞外区存在4个称为scr结构域的结构(journalofvirology,1998,vol.72,p.294-302)。在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒缺失了b5r的胞外区的scr结构域。

牛痘病毒的b5r胞外区的scr结构域的缺失包括b5r胞外区的4个scr结构域的一部分或全部的缺失，是指编码b5r胞外区内的4个scr结构域的一部分或全部的基因区域不进行表达，或者所表达的b5r蛋白未保持胞外区的4个scr结构域中的一部分或全部。在一个实施方式中，在本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒中，b5r的4个scr结构域全部缺失。在一个实施方式中，在本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒中缺失的4个scr结构域为上述登录号aaa48316.1的氨基酸序列中第22位的氨基酸至第237位的氨基酸所对应的区域。

关于本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒是否缺失b5r胞外区的scr结构域，可以使用公知的方法来判断。例如可以通过下述方法来判断：利用使用针对scr结构域的抗体的免疫化学方法来确认scr结构域的存在；利用pcr来确定编码scr结构域的基因的存在或大小。

在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒为vgf和o1l的功能发生了缺陷、并且缺失b5r胞外区的scr结构域的牛痘病毒。

在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒为vgf和o1l的功能发生了缺陷、并且缺失b5r胞外区的scr结构域的lc16mo株牛痘病毒。

在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒为包含编码il-7的多核苷酸和编码il-12的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷的牛痘病毒。

在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒为包含编码il-7的多核苷酸和编码il-12的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷的lc16mo株牛痘病毒。

在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒为包含编码il-7的多核苷酸和编码il-12的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷、并且缺失b5r胞外区的scr结构域的牛痘病毒。

在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒为包含编码il-7的多核苷酸和编码il-12的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷、并且缺失b5r胞外区的scr结构域的lc16mo株牛痘病毒。

在一个实施方式中，用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒为包含编码il-7的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷的牛痘病毒，或者为包含编码il-12的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷的牛痘病毒。

在一个实施方式中，用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒为包含编码il-7的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷的lc16mo株牛痘病毒，或者为包含编码il-12的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷的lc16mo株牛痘病毒。

在一个实施方式中，用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒为包含编码il-7的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷、并且缺失b5r胞外区的scr结构域的牛痘病毒，或者为包含il-12的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷、并且缺失b5r胞外区的scr结构域的牛痘病毒。

在一个实施方式中，用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒为包含编码il-7的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷、并且缺失b5r胞外区的scr结构域的lc16mo株牛痘病毒，或者为包含编码il-12的多核苷酸、vgf和o1l的功能发生了缺陷、并且缺失b5r胞外区的scr结构域的lc16mo株牛痘病毒。

il-7是作为激动剂对il-7受体发挥功能的分泌性蛋白质。据报道，il-7有助于t细胞、b细胞等的存活、增殖和分化(currentdrugtargets,2006,vol.7,p.1571-1582)。本发明中，il-7包含天然存在的il-7和具有其功能的变体。在一个实施方式中，il-7为人il-7。本发明中，人il-7包含天然存在的人il-7和具有其功能的变体。在一个实施方式中，人il-7选自由下述(1)～(3)组成的组：

(1)包含登录号np_000871.1所示的氨基酸序列、并且具有人il-7的功能的多肽、

(2)由在登录号np_000871.1所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列构成、并且具有人il-7的功能的多肽、以及

(3)包含与登录号np_000871.1所示的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列、并且具有人il-7的功能的多肽。

在此，人il-7的功能是指对人免疫细胞的各种存活、增殖和分化作用。

优选本发明中使用的人il-7为由登录号np_000871.1所示的氨基酸序列构成的多肽。

il-12为il-12亚基p40与il-12亚基α的杂二聚体。据报道，il-12具有活化并分化诱导t细胞和nk细胞的功能(cancerimmunologyimmunotherapy,2014,vol.63,p.419-435)。本发明中，il-12包含天然存在的il-12和具有其功能的变体。在一个实施方式中，il-12为人il-12。本发明中，人il-12包含天然存在的人il-12和具有其功能的变体。在一个实施方式中，人il-12选自由作为人il-12亚基p40与人il-12亚基α的组合的下述(1)～(3)组成的组：

(1)包含(1-a)登录号np_002178.2所示的氨基酸序列的多肽、(1-b)由在登录号np_002178.2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的多肽、或者(1-c)包含与登录号np_002178.2所示的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列的多肽、以及

(2-a)包含登录号np_000873.2所示的氨基酸序列的多肽、(2-b)由在登录号np_000873.2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的多肽、或者(2-c)包含与登录号np_000873.2所示的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列的多肽、

并且具有人il-12的功能的多肽；

(2)包含(1-a)由登录号np_002178.2所示的氨基酸序列构成的多肽、以及

(2-a)包含登录号np_000873.2所示的氨基酸序列的多肽、(2-b)由在登录号np_000873.2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的多肽、或者(2-c)包含与登录号np_000873.2所示的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列的多肽、

并且具有人il-12的功能的多肽；以及

(3)包含(1-a)包含登录号np_002178.2所示的氨基酸序列的多肽、(1-b)由在登录号np_002178.2所示的氨基酸序列中缺失、置换、插入和/或添加1～10个氨基酸而得到的氨基酸序列构成的多肽、或者(1-c)包含与登录号np_002178.2所示的氨基酸序列的一致性为90％以上的氨基酸序列的多肽、以及

(2-a)由登录号np_000873.2所示的氨基酸序列构成的多肽、

并且具有人il-12的功能的多肽。

在此，人il-12的功能是指t细胞、nk细胞的活化作用和/或分化诱导作用。il-12亚基p40和il-12亚基α可以通过直接结合而形成il-12。另外，可以借助接头使il-12亚基p40和il-12亚基α结合。

优选本发明中使用的人il-12为包含由登录号np_002178.2所示的氨基酸序列构成的多肽和由登录号np_000873.2所示的氨基酸序列构成的多肽的多肽。

本说明书中的“一致性”是指通过needle程序(journalofmolecularbiology,1970,vol.48,p.443-453)检索使用默认参数而得到的值identity。上述参数如下所示。

gappenalty(空位罚分)＝10

extendpenalty(延伸罚分)＝0.5

matrix(矩阵)＝eblosum62

本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒具有肿瘤溶解活性。作为评价被测病毒是否具有肿瘤溶解活性的方法，可以列举对病毒添加所致的癌细胞存活率降低进行评价的方法。作为评价中使用的癌细胞，可以列举例如恶性黑色素瘤细胞rpmi-7951(例如atcchtb-66)、肺腺癌细胞hcc4006(例如atcccrl-2871)、肺癌细胞a549(例如atccccl-185)、小细胞肺癌细胞dms53(例如atcccrl-2062)、肺鳞癌细胞nci-h226(例如atcccrl-5826)、肾癌细胞caki-1(例如atcchtb-46)、膀胱癌细胞647-v(例如dsmzacc414)、头颈癌细胞detroit562(例如atccccl-138)、乳腺癌细胞jimt-1(例如dsmzacc589)、乳腺癌细胞mda-mb-231(例如atcchtb-26)、食道癌细胞oe33(例如ecacc96070808)、胶质母细胞瘤u-87mg(例如ecacc89081402)、神经母细胞瘤goto(例如jcrbjcrb0612)、骨髓瘤rpmi8226(例如atccccl-155)、卵巢癌细胞sk-ov-3(例如atcchtb-77)、卵巢癌细胞ovmana(例如jcrbjcrb1045)、大肠癌细胞rko(例如atcccrl-2577)、大肠癌细胞hct116(例如atccccl-247)、胰腺癌细胞bxpc-3(例如atcccrl-1687)、前列腺癌细胞lncapclonefgc(例如atcccrl-1740)、肝癌细胞jhh-4(例如jcrbjcrb0435)、间皮瘤nci-h28(例如atcccrl-5820)、宫颈癌细胞siha(例如atcchtb-35)和胃癌细胞katoiii(例如rikenbrcrcb2088)。作为具体的评价方法，可以使用例如后述实施例3中记载的方法。

本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒产生il-7和/或il-12多肽。使用本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒时，通过产生il-7和il-12多肽，抗肿瘤效果显著提高。il-7和il-12的产生可以使用该领域中公知的方法来确认。例如，可以通过下述方法确认：将导入有编码il-7和il-12各多肽的多核苷酸的牛痘病毒与癌细胞进行培养后，测定培养上清中的il-7和il-12浓度；细胞的免疫染色或细胞溶解物的蛋白免疫印迹分析或者测定细胞溶解物中的il-7和il-12的浓度。il-7和il-12的各浓度例如可以分别使用humanil-7elisa试剂盒(raybiotech公司)、humanil-12p70duosetelisa(r&dsystems公司)来测定。作为具体评价培养上清中或细胞溶解物中的各种多肽浓度的方法，可以使用后述实施例4中记载的方法。细胞的免疫染色或细胞溶解物的蛋白免疫印迹分析可以分别使用市售的抗il-7抗体、抗il-12抗体来进行。

分别编码il-7和il-12的多核苷酸可以基于公众可利用的序列信息，利用该领域中公知的多核苷酸合成方法进行合成。另外，若先取得各多核苷酸，也可以通过使用定点诱变法(currentprotocolsinmolecularbiologyedition,1987,johnwiley&sonssection8.1-8.5)等本领域技术人员公知的方法在规定的位点导入突变来制作具有各多肽的功能的变体。

分别编码il-7和il-12的多核苷酸可以利用公知的同源重组或定点诱变法导入到牛痘病毒中。例如，可以制作在要导入的位点的碱基序列中导入有该多核苷酸的质粒(也称为转移载体质粒dna)，并导入到感染了牛痘病毒的细胞中。优选作为外源基因的分别编码il-7和il-12的多核苷酸的导入区域为非牛痘病毒的生命周期所必需的基因区域。例如，在某一方式中，关于il-7和/或il-12的导入区域，在vgf功能缺陷牛痘病毒中可以设定为该vgf基因的内部，在o1l功能缺陷牛痘病毒中可以设定为该o1l基因的内部，在具有vgf功能缺陷和o1l功能缺陷这两种缺陷的牛痘病毒中可以设定为该vgf基因和该o1l基因中的任一者或两者的内部。上述中，外源基因可以按照与vgf和o1l基因的转录方向同向或反向地进行转录的方式导入。

转移载体质粒dna向细胞中的导入方法没有特别限定，可以使用例如磷酸钙法、电穿孔法等。

在导入作为外源基因的分别编码il-7和il-12的多核苷酸时，可以在外源基因的上游以能够工作的方式连接适当的启动子。由此，在本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒中，外源基因可与能够在肿瘤细胞中表达的启动子连接。作为这些启动子，可以列举例如psfj1-10、psfj2-16、p7.5k启动子、p11k启动子、t7.10启动子、cpx启动子、hf启动子、h6启动子和t7杂合启动子等。

在一个实施方式中，本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒不具有药剂选择标记基因。

本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒的表达和/或增殖可以通过使牛痘病毒感染宿主细胞、并对感染的宿主细胞进行培养来进行。牛痘病毒的表达和/或增殖可以利用该领域中公知的方法进行。作为为了使本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒进行表达或增殖而使用的宿主细胞，只要是表达本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒并能够增殖的宿主细胞，则没有特别限制。作为这样的宿主细胞，可以列举例如bs-c-1、a549、rk13、htk-143、hep-2、mdck、vero、hela、cv-1、cos、bhk-21和原代兔肾脏细胞等动物细胞，优选可以使用bs-c-1(atccccl-26)、a549(atccccl-185)、cv-1(atccccl-70)或rk13(atccccl-37)。宿主细胞的培养条件例如适当选择温度、培养基的ph和培养时间。

生产本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒的方法中，除了包括使本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒感染宿主细胞，对感染的宿主细胞进行培养，使其表达本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒的步骤以外，还可以进一步包括对本发明的牛痘病毒、用于组合使用的牛痘病毒或组合试剂盒用牛痘病毒进行回收、优选进行纯化的步骤。作为纯化方法，可以采用使用benzonase核酸酶的dna消化、蔗糖梯度离心分离法、碘克沙醇密度梯度离心分离法、超滤法和渗滤法等。

<本发明的药物组合物>

本发明的药物组合物包含含有本发明的牛痘病毒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物还包含本发明的用于组合使用的药物组合物。在一个实施方式中，本发明的用于组合使用的药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。

本发明的药物组合物可以使用该领域中通常使用的赋形剂即药剂用赋形剂或药剂用载体等利用通常使用的方法来制备。作为这些药物组合物的剂型的例子，可以列举例如注射剂和点滴用剂等非口服剂，可以通过静脉内施用、皮下施用或肿瘤内施用等来施用。制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与这些剂型相应的赋形剂、载体或添加剂等。

有效施用量根据患者的症状的程度、年龄、所使用的制剂的剂型或病毒的效价等而有所不同，例如，以病毒单独的有效施用量计、以组合试剂盒中的两种病毒的总有效施用量计、或者以组合施用时两种病毒的总有效施用量计，可以使用约10²～约10¹⁰噬菌斑形成单位(pfu)。作为组合试剂盒中的两种病毒施用量的比率，例如可以以约1:10～约10:1、约1:5～约5:1、约1:3～约3:1、约1:2～约2:1或约1:1来使用。

<癌症的预防或治疗用途>

本发明的药物组合物能够用作癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的预防或治疗剂。

本发明中包括包含本发明的牛痘病毒或用于组合使用的牛痘病毒的药物组合物，该药物组合物为癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的预防或治疗用药物组合物。

本发明中包括包含各组合试剂盒用牛痘病毒的组合试剂盒，该组合试剂盒为癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的预防或治疗用组合试剂盒。

另外，本发明中包括预防或治疗癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的方法，该方法包括对需要癌症的预防或治疗的对象(例如患者)施用本发明的牛痘病毒的步骤。

另外，本发明中包括预防或治疗癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的方法，该方法包括对需要癌症的预防或治疗的对象(例如患者)施用下述(1)和(2)的步骤。

(1)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒；和

(2)包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒。

该两种牛痘病毒可以同时分别连续地、或隔开间隔施用于对象。

另外，本发明中包括用于在癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的预防或治疗中使用的本发明的牛痘病毒。

另外，本发明中包括用于在癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的预防或治疗中使用的、选自下述(1)或(2)中的牛痘病毒。

(1)用于与含有包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用而在癌症的预防或治疗中使用的、包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒；或者

(2)用于与含有包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用而在癌症的预防或治疗中使用的、包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒。

此外，本发明中包括本发明的牛痘病毒在制造癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的预防或治疗用的药物组合物中的应用。

此外，本发明中包括一种牛痘病毒在制造癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的预防或治疗用的药物组合物中的应用，该应用选自下述(1)或(2)：

(1)包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒在制造与含有包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用的癌症的预防或治疗用药物组合物中的应用；或者

(2)包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒在制造与含有包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒的药物组合物组合使用的癌症的预防或治疗用药物组合物中的应用。

此外，本发明中包括包含编码il-7的多核苷酸的牛痘病毒和包含编码il-12的多核苷酸的牛痘病毒在制造癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症的预防或治疗用的组合试剂盒中的应用。

在本说明书中，“预防用”的含义与“用于在预防中使用”相同，“治疗用”的含义与“用于在治疗中使用”相同。

本发明的药物组合物或组合试剂盒可以与对癌症、例如选自由恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小细胞肺癌、肺鳞癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、乳腺癌、食道癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、间皮瘤、宫颈癌和胃癌等组成的组中的癌症显示出有效性的各种治疗剂组合使用。关于该组合使用，可以同时施用，或者分别地连续或间隔所期望的时间间隔来施用。在同时施用的情况下，本发明的药物组合物也可以为配合剂，也可以分别地制剂化。

本发明的牛痘病毒、本发明的药物组合物、本发明的组合试剂盒、本发明的预防或治疗癌症的方法、或者适用本发明的应用的癌症也包括向原发灶以外的脏器、例如淋巴结、肝脏等的转移性癌症等。

关于本发明进行了全面的记述，为了得到进一步理解，在此提供用于参考的特定实施例，但这些实施例的目的在于例示，并不对本发明进行限定。

实施例

关于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，只要没有特别声明，则按照附带的操作规程进行实验。

(实施例1：转移载体质粒dna的构建)

如下制作为了利用同源重组法制作重组牛痘病毒而使用的转移载体质粒dna。

(1)ptn-vgf-p-dsred转移载体质粒dna的构建

基于国际公开第2015/076422号，制作puc19-vgf载体。更具体而言，为了制作puc19-vgf载体，使用lc16mo株的基因组dna(登录号ay678277.1)作为模板，并使用invitrogen公司的puc19载体(产品编码：54357)。将所制作的puc19-vgf载体用限制酶acci切断后，将末端平滑化。在其切断位点插入包含p7.5k启动子和dsred片段的dna片段(序列号22)，由此构建转移载体质粒dna。将所构建的质粒dna称为ptn-vgf-p-dsred。

(2)ptn-vgf-sp-il12和ptn-vgf-sp-il7转移载体质粒dna的构建

以ptagbfp-n载体(fp172、evrogen公司)的dna作为模板，利用两个引物(序列号1和序列号2)对bfp基因区域进行扩增。将该pcr产物用限制酶sfii和ecori切断，克隆至ptk-sp-lg载体(国际公开第2015/076422号。其中，使用lc16mo株的基因组dna(登录号ay678277.1)作为模板，并使用invitrogen公司的puc19载体(产品编码：54357)。另外，pvnc110-luc/ires/egfp质粒使用国际公开第2011/125469号中记载的pvnc110-luc/ires/egfp。)的相同的限制酶位点，构建在合成牛痘病毒启动子(journalofvirologicalmethods,1997,vol.66,p.135-138)下连接有bfp的ptk-sp-bfp。接着，将ptk-sp-bfp用限制酶sphi和ecori切断，将末端平滑化。将这样得到的dna片段克隆至将puc19-vgf载体用限制酶acci切断并将末端平滑化而得到的位点，由此构建ptn-vgf-sp-bfp(图1)。接着，将编码人il-12的多核苷酸(包含人il-12亚基p40、内部核糖体导入位点和人il-12亚基α的多核苷酸；序列号7)和编码人il-7的多核苷酸(序列号8)(各多核苷酸在5’侧包含限制酶位点accggtcgccacc(序列号16)，在3’侧包含限制酶位点gctagcgaattc(序列号17))用限制酶agei和nhei切断。将各多核苷酸片段克隆至ptn-vgf-sp-bfp的相同的限制酶位点，由此构建转移载体质粒dna。将所构建的质粒dna分别称为ptn-vgf-sp-il12和ptn-vgf-sp-il7。

(3)ptn-o1l-sp-bfp、ptn-o1l-sp-lacz、ptn-o1l-sp-il12和ptn-o1l-sp-il7转移载体质粒dna的构建

利用与上述(2)同样的方法，将ptk-sp-bfp用限制酶sphi和ecori切断并将末端平滑化，将所得到的dna片段克隆至将puc19-o1l载体(国际公开第2015/076422号。其中，与puc19-vgf载体制作同样地，使用lc16mo株的基因组dna(登录号ay678277.1)作为模板，并使用invitrogen公司的puc19载体(产品编码：54357)。o1l基因区域插入至puc19载体的xbai位点。)用限制酶xbai切断并将末端平滑化而得到的位点，由此制作转移载体质粒dna(图1)。将所制作的质粒dna称为ptn-o1l-sp-bfp。接着，将包含针对人进行了密码子优化的大肠杆菌lacz基因的多核苷酸(序列号9)、编码人il-12的多核苷酸(序列号7)和编码人il-7的多核苷酸(序列号8)用限制酶agei和nhei切断。将编码lacz、il-12或il-7的各多核苷酸片段克隆至ptn-o1l-sp-bfp载体的相同的限制酶位点(agei位点和nhei位点)，由此构建转移载体质粒dna。将所构建的质粒dna分别称为ptn-o1l-sp-lacz、ptn-o1l-sp-il12和ptn-o1l-sp-il7。

(4)ptn-dsred(b5r-)和ptn-b5rδ1-4转移载体质粒dna的构建

以pb5r(国际公开第2011/125469号。其中，使用lc16mo株的基因组dna(登录号ay678277.1)作为模板)的dna作为模板，利用两个引物(序列号3和序列号4)对b4r基因区域进行扩增。另外，以pdsred-express-n1(clontech公司)的dna作为模板，利用两个引物(序列号5和序列号6)对dsred基因区域进行扩增。将前者的pcr产物用限制酶noti和fspi切断，将后者的pcr产物用限制酶fspi和mfei切断。将这两种dna片段克隆至用限制酶noti和mfei切断的pb5r中，由此制作转移载体质粒dna。将所制作的质粒dna称为ptn-dsred(b5r-)。另一方面，将pb5r用限制酶noti和nspi切断、或者用限制酶nspi和saci切断。将这两种dna片段克隆至用限制酶noti和saci切断的pb5r中，由此构建转移载体质粒dna。将所制作的质粒dna称为ptn-b5rδ1-4。ptn-b5rδ1-4编码缺失了4个scr结构域的b5r蛋白。该氨基酸序列为序列号18所示的序列。

(实施例2：基因重组牛痘病毒的构建)

由牛痘病毒lc16mo株制作使vgf和o1l的功能缺陷的重组牛痘病毒(称为lc16movgf-sp-lucgfp/o1l-p7.5-dsred)。对于该病毒，使用二代测序仪pacbiorsii(pacificbioscience公司)进行测序，由所得到的序列信息利用sprai[bmcgenomics.2014aug21；15:699.]软件进行病毒基因组的重构来确定碱基序列，结果其具有序列号21所表示的碱基序列。另外，在该碱基序列的两末端添加有环序列，两末端环序列为序列号19或20所表示的碱基序列。

(1)回收具有图2所示的病毒基因组的重组牛痘病毒。以下，对回收步骤进行具体说明。使lc16movgf-sp-lucgfp/o1l-p7.5-dsred以moi(感染复数，multiplicityofinfection)＝0.02～0.1感染在6孔培养皿中培养至80％融合的cv1细胞(atccccl-70)或rk13细胞(atccccl-37)，在室温下使细胞贴壁1小时。将实施例1(3)中构建的ptn-o1l-sp-bfp与fugene(注册商标)hd转染试剂(roche)混合，按照手册添加至细胞中使细胞进行摄取，在5％co2存在下在37℃下培养2～5天。将细胞冻融后，进行超声波处理，利用opti-mem(invitrogen)稀释至通过下述操作能够取得单个的噬菌斑的程度。将所得到的稀释液100μl添加、接种至在6孔培养皿中达到亚融合的bs-c-1细胞(atccccl-26)或rk13细胞中。添加含有0.8％甲基纤维素(和光纯药、136-02155)、5％胎牛血清、0.225％碳酸氢钠(和光纯药、195-16411)和glutamax(tm)supplementi(gibco、35050-061)的伊格尔mem培养基(日水、05900)2ml，在5％co2存在下在37℃下培养2～5天。除去培养基，以bfp表达为指标用枪头尖刮取噬菌斑，悬浮于opti-mem中。利用bs-c-1细胞或rk13细胞进一步重复3次以上该操作，进行噬菌斑纯化，回收病毒噬菌斑(本实施例中，以下将到此为止的步骤称为“回收”)。使所回收的噬菌斑悬浮于opti-mem中，施加超声波。使用高纯度病毒核酸试剂盒(roche)，按照手册从上述超声波溶液200μl中提取基因组dna，供于通过pcr进行的筛选。关于vgf，利用两个引物(序列号10和序列号11)进行pcr，关于o1l，利用两个引物(序列号12和序列号13)进行pcr，关于b5r，利用两个引物(序列号14和序列号15)进行pcr。在检测到规定大小的pcr产物的克隆中选择出通过直接测序确认到pcr产物的碱基序列正确的病毒克隆(称为lc16movgf-sp-lucgfp/o1l-sp-bfp；图2)，使其在a549细胞(atccccl-185)或rk13细胞中增殖后，利用rk13细胞测定病毒效价。使用lc16movgf-sp-lucgfp/o1l-sp-bfp和实施例1(4)中制作的ptn-dsred(b5r-)，代替bfp表达以dsred表达作为指标，利用与上述同样的方法回收重组病毒。将所回收的病毒称为lc16moδ-dsredvgf-sp-lucgfp/o1l-sp-bfp(图2)。

(2)回收缺失了b5r蛋白的4个scr结构域的重组病毒。具体而言，使用实施例2(1)中制作的lc16moδ-dsredvgf-sp-lucgfp/o1l-sp-bfp和实施例1(4)中构建的ptn-b5rδ1-4，代替bfp表达以dsred表达消失作为指标，利用与实施例2(1)同样的方法回收重组病毒。将所回收的病毒称为lc16moδscrvgf-sp-lucgfp/o1l-sp-bfp(图2)。另外，使用所制作的lc16moδscrvgf-sp-lucgfp/o1l-sp-bfp和实施例1(1)中构建的ptn-vgf-p-dsred，代替bfp表达以dsred表达作为指标，利用与实施例2(1)同样的方法回收重组病毒。将所回收的病毒称为lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-bfp(图2)。接着，使用所制作的lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-bfp和实施例1(3)中构建的ptn-o1l-sp-lacz，代替bfp表达以bfp表达消失作为指标，利用与实施例2(1)同样的方法回收重组病毒。将所回收的病毒称为lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-lacz(图2)。

(3)回收具有图3所示的病毒基因组的表达治疗基因和标记基因的scr区域缺失重组牛痘病毒。具体而言，分别使用实施例2(2)中制作的lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-lacz以及实施例1(2)中构建的转移载体质粒dna(ptn-vgf-sp-il12和ptn-vgf-sp-il7)，代替bfp表达以dsred表达消失作为指标，利用与实施例2(1)同样的方法回收各重组病毒。将所回收的各病毒称为lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-lacz(以下称为“hil12搭载牛痘病毒”)、lc16moδscrvgf-sp-il7/o1l-sp-lacz(以下称为“hil7搭载牛痘病毒”)(图3)。为了进行纯化，使各重组病毒感染a549细胞或rk13细胞。在5％co2存在下在37℃下培养2～5天后，回收感染细胞。将细胞冻融，进行超声波处理。使用optiprep(axisshield公司)利用密度梯度离心分离法进行纯化。然后，利用rk13细胞测定各病毒的病毒效价。

(4)回收具有图4所示的病毒基因组的表达编码人il-7的多核苷酸和编码人il-12的多核苷酸的scr结构域缺失重组牛痘病毒。

(4-1)具体而言，使用实施例2(2)中制作的lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-bfp和实施例1(2)中构建的转移载体质粒dnaptn-vgf-sp-il12，代替bfp表达以dsred表达消失作为指标，利用与实施例2(1)同样的方法回收各重组病毒。将所回收的病毒称为lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-bfp。

(4-2)接着，使用实施例2(4-1)中制作的lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-bfp和实施例1(3)中构建的转移载体质粒dnaptn-o1l-sp-il7，代替bfp表达以bfp表达消失作为指标，利用与实施例2(1)同样的方法回收各重组病毒。将所回收的病毒称为lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-il7(以下，在后述实施例中也称为“hil12和hil7搭载牛痘病毒”)(图4)。将各重组病毒用实施例2(3)的方法纯化后，利用rk13细胞测定各病毒的病毒效价。

(实施例3：基因重组牛痘病毒的肿瘤溶解性)

对于实施例2中制作的hil12和hil7搭载牛痘病毒，评价在各种人癌细胞中的溶解能力(细胞死亡能力)。另外，对于实施例2中制作的hil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒这两种病毒的组合混合物，也同样地评价在各种人癌细胞中的溶解能力。

具体而言，首先，在96孔板(agctechnoclass公司)中添加利用培养基(含有10％胎牛血清(gehealthcare公司)和1％青链霉素(lifetechnology公司)的下述记载的培养基)以达到1×10⁴个/ml的方式悬浮的各细胞各100μl。培养一晚后，使用opti-mem(lifetechnology公司)将1)hil12和hil7搭载牛痘病毒和2)将hil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒以1:1的浓度组合而成的混合物(以下，称为“hil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物”)分别稀释至5×10⁴pfu/ml、5×10⁵pfu/ml和5×10⁶pfu/ml。在各孔中分别添加20μl各病毒溶液，以moi＝1.0、10、100的方式进行感染。作为对照，制作不添加细胞的孔、和添加opti-mem来代替病毒的孔(moi＝0)。然后，在设定为co2浓度5％、37℃的co2温箱中培养5天。使用celltiter-glo发光法细胞活力检测试剂盒(promega公司)测定5天后的细胞存活率。具体而言，按照上述检测试剂盒的操作规程，在各孔中分别添加100μlcelltiter-glo试剂并静置30分钟后，将全部量移至96孔黑色酶标板(康宁公司)中，使用enspire(perkinelmer公司)测定各孔的发光强度。在各孔中的细胞存活率的计算中，将未接种细胞的孔的值作为0％存活，将接种了细胞而未添加病毒的孔作为100％存活。

所评价的细胞为恶性黑色素瘤细胞rpmi-7951(atcchtb-66)、肺腺癌细胞hcc4006(atcccrl-2871)、肺癌细胞a549(atccccl-185)、小细胞肺癌细胞dms53、肺鳞癌细胞nci-h226(atcccrl-5826)、肾癌细胞caki-1(atcchtb-46)、膀胱癌细胞647-v(dsmzacc414)、头颈癌细胞detroit562(atccccl-138)、乳腺癌细胞jimt-1(dsmzacc589)、乳腺癌细胞mda-mb-231(atcchtb-26)、食道癌细胞oe33(ecacc96070808)、胶质母细胞瘤u-87mg(ecacc89081402)、神经母细胞瘤goto(jcrbjcrb0612)、骨髓瘤rpmi8226(atccccl-155)、卵巢癌细胞sk-ov-3(atcchtb-77)、卵巢癌细胞ovmana(jcrbjcrb1045)、大肠癌细胞rko(atcccrl-2577)、大肠癌细胞hct116、胰腺癌细胞bxpc-3(atcccrl-1687)、前列腺癌细胞lncapclonefgc(atcccrl-1740)、肝细胞癌jhh-4(jcrbjcrb0435)、间皮瘤nci-h28(atcccrl-5820)、宫颈癌细胞siha(atcchtb-35)和胃癌细胞katoiii(rikenbrcrcb2088)。

作为培养基，在rpmi-7951、hcc4006、dms53、nci-h226、caki-1、647-v、detroit562、jimt-1、oe33、u-87mg、goto、rpmi8226、sk-ov-3、ovmana、rko、hct116、bxpc-3、lncapclonefgc、jhh-4、nci-h28和katoiii的情况下使用rpmi1640培养基(sigma-aldrich公司、r8758)，在a549和mda-mb-231的情况下使用dmem培养基(sigma-aldrich公司、d6429)，在siha的情况下使用emem培养基(atcc30-2003)。结果如图5-1～5-4所示。在此，由hil12和hil7搭载牛痘病毒产生的效果分为图5-1和5-2来记载，由hil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物产生的效果分为图5-3和5-4来记载。

其结果表明，hil12和hil7搭载牛痘病毒在进行试验的全部人癌细胞中具有使细胞死亡的能力(图5-1和5-2)。另外可知，关于hil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物，也在进行试验的全部人癌细胞中具有使细胞的能力(图5-3和5-4)。需要说明的是，在图5-1至图5-4中，每种细胞株从左起以moi＝0、1、10、100的顺序显示出肿瘤溶解性。

(实施例4：由感染了基因重组牛痘病毒的癌细胞的蛋白质产生)

在使hil12和hil7搭载牛痘病毒感染癌细胞时，测定由癌细胞产生的人il-7蛋白和人il-12蛋白的浓度。此外，对于hil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物，也同样地在感染癌细胞时测定由癌细胞产生的人il-7蛋白和人il-12蛋白的浓度。

在人il-7蛋白的测定中，具体而言，首先，将利用含有10％胎牛血清和1％青链霉素的rpmi1640培养基以达到1×10⁴个/ml的方式悬浮的sk-ov-3卵巢癌细胞100μl接种到96孔板中。培养一晩后，利用opti-mem制备1)hil12和hil7搭载牛痘病毒、或2)hil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物，以moi＝1.0的方式分别添加20μl使其感染细胞。然后，在设定为co2浓度5％、37℃的co2温箱中培养24小时，回收培养上清。使用表1中列出的elisa试剂盒和enspire测定培养上清中含有的蛋白质浓度。

在人il-12蛋白的测定中，将利用含有10％胎牛血清和1％青链霉素的rpmi1640培养基以达到1×10⁵个/ml的方式悬浮的sk-ov-3卵巢癌细胞100μl接种到96孔板中。培养一晩后，利用opti-mem制备1)hil12和hil7搭载牛痘病毒、或2)hil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物，以moi＝1.0的方式分别添加20μl使其感染细胞。然后，在设定为co2浓度5％、37℃的co2温箱中培养48小时，回收培养上清。使用表1中列出的elisa试剂盒和enspire测定培养上清中含有的蛋白质浓度。

表1：实施例4中使用的elisa试剂盒

[表1]

其结果表明，由添加了hil12和hil7搭载牛痘病毒的细胞、以及添加了hil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物的细胞可以产生人il-12蛋白和人il-7蛋白(表2-1和2-2)。

表2-1：培养上清中的人il-12蛋白浓度

[表2-1]

表2-2：培养上清中的人il-7蛋白浓度

[表2-2]

(实施例5：搭载编码小鼠il-12的多核苷酸的转移载体质粒dna的构建和搭载编码小鼠il-12的多核苷酸的基因重组牛痘病毒的构建)

(1)按照实施例1(2)记载的方法，构建转移载体质粒dnaptn-vgf-sp-mil12。在实施例1(2)记载的方法中，使用包含编码小鼠il-12的多核苷酸(包含小鼠il-12亚基p40、内部核糖体导入位点和小鼠il-12亚基α的多核苷酸；序列号23)来代替编码人il-12的多核苷酸(序列号7)，将该多核苷酸片段克隆至ptn-vgf-sp-bfp中。

(2)按照实施例1(3)记载的方法，构建转移载体质粒dnaptn-o1l-sp-luc2。在实施例1(3)记载的方法中，使用编码荧光素酶luc2基因的多核苷酸(登录号dq188840的第100位至第1752位)来代替包含大肠杆菌lacz基因的多核苷酸(序列号9)，将该多核苷酸片段克隆至ptn-o1l-sp-bfp中。

(3)按照实施例2(2)的方法回收重组病毒。在实施例2(2)的方法中，使用lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-bfp和代替ptn-o1l-sp-lacz的实施例5(2)中制作的ptn-o1l-sp-luc2。将所回收的病毒称为lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-luc2称为(以下将本病毒也称为“对照牛痘病毒”)。

(4)按照实施例2(3)的方法回收重组病毒。在实施例2(3)的方法中，使用代替lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-lacz的实施例5(3)中制作的lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-luc2和代替ptn-vgf-sp-il12的实施例5(1)中制作的ptn-vgf-sp-mil12。将所回收的病毒称为lc16moδscrvgf-sp-mil12/o1l-sp-luc2(以下也称为“mil12搭载牛痘病毒”)。

(5)按照实施例2(4-1)的方法回收重组病毒。在实施例2(4-1)的方法中，使用lc16moδscrvgf-p7.5-dsred/o1l-sp-bfp和代替ptn-vgf-sp-il12的实施例5(1)中制作的ptn-vgf-sp-mil12。将所回收的病毒称为lc16moδscrvgf-sp-mil12/o1l-sp-bfp。

此外，按照实施例2(4-2)的方法回收重组病毒。在实施例2(4-2)的方法中，使用代替lc16moδscrvgf-sp-il12/o1l-sp-bfp的上述中制作的lc16moδscrvgf-sp-mil12/o1l-sp-bfp和ptn-o1l-sp-il7。将所回收的病毒称为lc16moδscrvgf-sp-mil12/o1l-sp-il7(以下也称为“mil12和hil7搭载牛痘病毒”)。

(实施例6：荷瘤人源化小鼠中的基因重组牛痘病毒的抗肿瘤效果)

对于hil12和hil7搭载牛痘病毒，使用移植了人癌细胞的人源化小鼠(通过在重度免疫缺陷小鼠中移入人造血干细胞而将免疫系统置换为人免疫细胞的小鼠)，对在生物体内的抗肿瘤效果进行评价。

具体而言，首先，为了制作人源化小鼠，对于使用x射线照射装置以2.0戈瑞的强度进行了x射线照射的nog小鼠(nod/shi-scidil-2rγkojic、雌性、6周龄、日本clea株式会社)，从尾静脉注射移入3×10⁴个人脐带血来源的造血干细胞(lonza公司)。移入13周后，在小鼠的右背侧皮下注射移植以3×10⁷个/ml悬浮在pbs中的人肺癌细胞nci-h1373(atcccrl-5866)100μl。癌细胞移植后使用游标卡尺测定肿瘤径，按照各组的肿瘤体积(短径mm×短径mm×长径mm×0.52)的平均值为37mm³至47mm³的方式进行分组。在同一天向肿瘤内注射用pbs稀释至1.0×10⁸pfu/ml的浓度的hil12和hil7搭载牛痘病毒20μl(表中记作“hil12和hil7搭载vv施用组”)。将在肿瘤内施用了pbs20μl的组作为溶剂(pbs)施用组。对于各小鼠，每2～4天使用游标卡尺测定肿瘤径，基于上式算出肿瘤体积，利用下式算出每个个体在病毒施用后14天的肿瘤体积变化率(％)(n＝7～8)：

病毒施用后14天的肿瘤体积变化率(％)＝100(％)×病毒施用后14天的肿瘤体积(mm³)/病毒施用日的肿瘤体积(mm³)。

在病毒施用后14天的肿瘤体积变化率(％)的各组的平均值小于100、并且利用配对t检验对各组的病毒施用后14天的肿瘤体积与病毒施用日的肿瘤体积进行检验并确认到显著差异(将p值<0.05作为有显著差异)的情况下，判定为具有肿瘤缩减效果。

需要说明的是，在本实施例中，作为与hil12和hil7搭载牛痘病毒(2×10⁶pfu/个体)相对比的比较病毒，以相同的注射量(20μl)和稀释溶液(pbs)使用对照牛痘病毒(2×10⁶pfu/个体)、hil12搭载牛痘病毒(2×10⁶pfu/个体)或hil7搭载牛痘病毒(2×10⁶pfu/个体)(表中，分别记作“对照vv施用组”、“hil12搭载vv施用组”、“hil7搭载vv施用组”)。

其结果，在施用hil12和hil7搭载牛痘病毒的组中，显示出病毒施用后14天的肿瘤体积变化率的平均值小于100％。此外，利用配对t检验对病毒施用后14天的肿瘤体积与病毒施用日的肿瘤体积进行检验的结果确认到显著差异，由此判定为具有肿瘤缩减效果(表3)。因此表明，hil12和hil7搭载牛痘病毒的施用具有肿瘤缩减效果。另一方面，在施用hil12搭载牛痘病毒或hil7搭载牛痘病毒中的任意一者的组中，未确认到肿瘤缩减效果(表3)。

表3：hil12和hil7搭载牛痘病毒在荷瘤人源化小鼠中引起的肿瘤体积变化率(％)

[表3]

(实施例7：同系荷瘤小鼠模型中的基因重组牛痘病毒的完全缓解导入效果)

(1)关于mil12和hil7搭载牛痘病毒

关于mil12和hil7搭载牛痘病毒，使用皮下移植了同系小鼠癌细胞株的小鼠(同系荷瘤小鼠)，对生物体内的完全缓解导入效果进行评价。需要说明的是，已知人il-12对小鼠的免疫细胞无反应，因此使用搭载有编码小鼠il-12的多核苷酸来代替编码人il-12的多核苷酸的基因重组牛痘病毒(在实施例5中制作)。

具体而言，首先，在c57bl/6j小鼠(雄性、5-7周龄、日本查尔斯河公司)的右腹侧皮下移植用pbs制备为4×10⁶个/ml的小鼠肺癌细胞ll/2(llc1)(atcccrl-1642)(以下称为llc1)50μl。利用与实施例6同样的方法算出肿瘤体积，按照各组的肿瘤体积的平均值为50mm³至60mm³的方式进行分组。次日，对12只小鼠进行用pbs稀释为6.7×10⁸pfu/ml的浓度的mil12和hil7搭载牛痘病毒30μl的肿瘤内注射(2×10⁷pfu、表中记作“mil12和hil7搭载vv施用组”)。在初次施用的2天后和4天后也实施同样的病毒的肿瘤内注射。将代替病毒而进行pbs30μl肿瘤内施用的组作为溶剂(pbs)施用组。

使用游标卡尺每周两次测定肿瘤径，算出肿瘤体积。将最终在病毒初次施用的27天后的观察时通过触诊确认不到肿瘤的情况定义为完全缓解，计测显示出完全缓解的个体的数量。关于在试验期间中组的平均肿瘤体积超过1700mm³的组，从动物伦理上的观点出发使其安乐死。需要说明的是，在本实施例中，作为与mil12和hil7搭载牛痘病毒(2×10⁷pfu/次、施用3次)相对比的比较病毒，以相同的注射量(30μl/一次施用)和稀释溶液(pbs)使用对照牛痘病毒、mil12搭载牛痘病毒或hil7搭载牛痘病毒(分别为2×10⁷pfu/次、施用3次)(表中，分别记作“对照vv施用组”、“mil12搭载vv施用组”、“hil7搭载vv施用组”)。

其结果，在施用mil12和hil7搭载牛痘病毒的组中，最终3例个体达到完全缓解。另一方面，在施用比较病毒的组中，未得到完全缓解的个体(表4-1)。因此表明，在同系荷瘤小鼠模型中，施用mil12和hil7搭载牛痘病毒时，与hil7搭载牛痘病毒或mil12搭载牛痘病毒相比具有更高的完全缓解导入效果。

表4-1：通过施用mil12和hil7搭载牛痘病毒而达到完全缓解的小鼠个体数

[表4-1]

(2)关于mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物

关于mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的1:1混合物(以下，记作“mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物”)，使用同系荷瘤小鼠对生物体内的完全缓解导入效果进行评价。

与(1)同样地实施。但是，移植以达到8×10⁶个/ml的方式悬浮的小鼠肺癌细胞llc1。此外，代替稀释为6.7×10⁸pfu/ml的浓度的mil12和hil7搭载牛痘病毒30μl(2×10⁷pfu)，使用mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物(在pbs中将各病毒稀释为6.7×10⁸pfu/ml)30μl(各2×10⁷pfu/次、施用3次)(表中，记作“mil12搭载vv与hil7搭载vv的混合物的施用组”)。小鼠的个体数使用7只。作为比较病毒，分别以30μl的注射量使用对照牛痘病毒(4×10⁷pfu/次、施用3次)、mil12搭载牛痘病毒与对照牛痘病毒的1:1混合物(各2×10⁷pfu/次、施用3次)、或者hil7搭载牛痘病毒与对照牛痘病毒的1:1混合物(各2×10⁷pfu/次、施用3次)(表中，分别记作“对照vv施用组”、“mil12搭载vv与对照vv的混合物的施用组”、“hil7搭载vv与对照vv的混合物的施用组”)。

其结果，在施用mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物的组中，4例个体达到完全缓解。在施用mil12搭载牛痘病毒与对照牛痘病毒的混合物的组中，仅一例完全缓解，在施用其他比较病毒的组中，无完全缓解例(表4-2)。因此表明，在同系荷瘤小鼠模型中，与包含hil7搭载牛痘病毒或mil12搭载牛痘病毒中的任意一者的混合物相比，mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物具有更高的完全缓解导入效果。

表4-2：通过施用mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物而达到完全缓解的小鼠个体数

[表4-2]

(实施例8：同系荷瘤小鼠模型中的基因重组牛痘病毒的获得性免疫效果(由获得性免疫产生的肿瘤排斥效果))

(1)关于mil12和hil7搭载牛痘病毒：

对于进行了mil12和hil7搭载牛痘病毒处置的结果完全缓解的小鼠，进行相同癌细胞的再移植实验，评价由病毒引起的获得性免疫效果。

具体而言，首先，按照实施例7制作llc1荷瘤小鼠，对其进行mil12和hil7搭载牛痘病毒的肿瘤内施用(但是，关于病毒的肿瘤内注射，除了在初次施用的2天后和4天后以外，在1天后、3天后也实施病毒的肿瘤内注射(总计5次)；表中称为“mil12和hil7搭载vv施用组”)。对于在病毒最终施用的23天后确认到完全缓解并在最终施用的51天后仍维持完全缓解状态的个体、以及与这些个体周龄相符的非病毒接种小鼠(对照组)，将用pbs悬浮至8×10⁶个/ml的llc1癌细胞50μl移植于皮下。按照实施例6算出肿瘤体积，计测最终在llc1移植后第14天的观察时通过目视和触诊确认到肿瘤形成的个体的数量，求出肿瘤植活的小鼠的个体数/接种了癌细胞的小鼠的个体数的比例。在本实施例中，在对照组与病毒施用组中进行费舍尔精确检验，在有显著差异(小于5％)情况下评价为具有获得性免疫效果。

其结果，在对照组中，所有10例中在10例中全部形成了皮下肿瘤，而在mil12和hil7搭载病毒施用组中，所有10例中在6例中无论通过目视还是触诊均未确认到再移植的llc1癌细胞的肿瘤形成(表5-1)(p<0.05、费舍尔精确检验)。因此，通过本实施例确认到由mil12和hil7搭载牛痘病毒的施用产生的获得性免疫效果。

表5-1：完全缓解小鼠中的癌细胞移植试验的结果

[表5-1]

(2)关于mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物：

对于进行mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物处置的结果完全缓解的小鼠，进行相同癌细胞的再移植实验，评价获得性免疫效果。

具体而言，与(1)同样地实施。但是，代替通过施用mil12和hil7搭载牛痘病毒而完全缓解的小鼠，使用按照实施例7(2)施用mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物(分组的1天后、3天后、5天后、总计3次)而完全缓解的小鼠(表中，称为“mil12搭载vv与hil7搭载vv的混合物的施用组”)。癌细胞的再移植在病毒最终施用后74天后(在最终施用的24天后判定完全缓解)进行。

其结果，在癌细胞再移植14天后，在对照组中，8例中全部形成了皮下肿瘤，而在mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物施用组中，10例中在8例中无论通过目视还是触诊均未确认到再移植的llc1癌细胞的肿瘤形成(表5-2)(p<0.05、费舍尔精确检验)。

因此，通过本实施例确认到由mil12搭载牛痘病毒与hil7搭载牛痘病毒的混合物的施用产生的获得性免疫效果。

表5-2：完全缓解小鼠中的癌细胞移植试验的结果

[表5-2]

产业上的可利用性

本发明的牛痘病毒、药物组合物和组合试剂盒对各种癌症的预防或治疗有用。

序列表自由文本

序列表的数字标题<223>中记载了“人工序列(artificialsequence)”的说明。

序列号1～6和10～15所表示的核苷酸序列为引物。

序列号7、8和9所表示的碱基序列分别为包含人il-12基因的多核苷酸、包含人il-7基因的多核苷酸和包含大肠杆菌lacz基因的多核苷酸。序列号7中，第14位～第1000位的碱基序列对应于il-12的编码p40亚基的区域，第1606位～第2367位的碱基序列对应于il-12的编码亚基α的区域。

序列号16和17所表示的核苷酸序列为与序列号7～9的各基因编码区域连接的限制酶位点。

序列号18所表示的氨基酸序列为缺失了4个scr结构域的b5r蛋白。

序列号19、20所表示的碱基序列为lc16movgf-sp-lucgfp/o1l-p7.5-dsred的两末端环序列的序列。

序列号21所表示的碱基序列为lc16movgf-sp-lucgfp/o1l-p7.5-dsred的除两末端环序列以外的序列。

序列号22所表示的碱基序列为包含p7.5k启动子和dsred片段的dna片段。

序列号23所表示的碱基序列为包含小鼠il-12基因的多核苷酸。

序列表

<110>安斯泰来制药株式会社（astellaspharmainc.）

国立大学法人鸟取大学（nationaluniversitycorporationtottoriuniversity）

<120>新型基因重组牛痘病毒（novelgeneticallyengineeredvacciniaviruses）

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