BAFF-R抗体及其用途的制作方法
本申请要求2016年6月6日提交的美国临时申请号62/346,324的优先权，所述临时申请以全文引用的方式并入本文中。
背景技术：
抗体疗法是临床上用于治疗血液学恶性肿瘤的最成功的免疫疗法之一。示例性案例是利妥昔单抗，其靶向cd20并引发针对b细胞淋巴瘤的细胞毒性作用。然而，关于利妥昔单抗的主要问题是出现利妥昔单抗抗体，其被认为是由于cd20的下调，因此阻碍抗体结合靶细胞。
技术实现要素：
本文提供包括轻链可变区和重链可变区的b细胞活化因子受体(baff-r)抗体。轻链可变区包括如seqidno:1中所示的cdrl1、如seqidno:2中所示的cdrl2和如seqidno:3中所示的cdrl3。并且重链可变区包括如seqidno:4中所示的cdrh1、如seqidno:5中所示的cdrh2和如seqidno:6中所示的cdrh3。在另一个方面中，轻链可变区包括如seqidno:7中所示的cdrl1、如seqidno:8中所示的cdrl2和如seqidno:9中所示的cdrl3。并且重链可变区包括如seqidno:10中所示的cdrh1、如seqidno:11中所示的cdrh2和如seqidno:12中所示的cdrh3。任选地，抗体是人源化抗体。还提供公开抗体的功能片段。
提供一种能够以小于约4nm的kd结合baff-r的人源化b细胞活化因子受体(baff-r)抗体或其功能片段。
还提供一种以小于约4nm的kd结合至baff-r的人源化b细胞活化因子受体(baff-r)抗体。
还提供包括本文所提供的抗体或其功能片段的嵌合抗原受体(car)。
本文提供编码baff-r抗体或所述抗体的功能片段的分离核酸。
还提供药物组合物，其包括治疗有效量的如本文所公开的baff-r抗体或其功能片段和药学上可接受的赋形剂。
提供一种表达人类baff-r蛋白或其功能片段的小鼠成纤维细胞，并且所述人类baff-r蛋白或其功能片段在细胞的细胞表面上表达。
提供治疗有需要的受试者的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所提供的嵌合抗原受体，从而治疗所述受试者的癌症。
还提供治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所公开的抗体或其功能片段，从而治疗所述受试者的癌症。
提供治疗有需要的受试者的自身免疫疾病的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的抗体或其功能片段，从而治疗所述受试者的自身免疫疾病。
还提供抑制细胞增殖的方法。所述方法包括将细胞与如本文所公开的baff-r抗体或其功能片段接触，从而形成接触细胞。使baff-r抗体或其功能片段结合接触细胞上的baff-r蛋白，从而抑制细胞增殖。任选地，细胞是淋巴细胞。
提供产生抗人类baff-r抗体或其功能片段的方法。所述方法包括向小鼠施用表达如本文所提供的baff-r蛋白或其片段的小鼠成纤维细胞，从而形成免疫baff-r小鼠。将免疫baff-r小鼠的脾细胞与人类骨髓瘤细胞融合，从而形成baff-r杂交瘤细胞。然后使baff-r杂交瘤细胞表达baff-r抗体，从而产生抗baff-r抗体。
附图简述
图1a、图1b、图1c、图1d和图1e是facs图像，其显示针对人类baff-r的新型单克隆抗体的产生和特异性。图1a是在小鼠成纤维l细胞中hbaff-r-gfp融合蛋白的细胞表面表达的facs分析。对gfp阳性细胞进行设门，将工程化l细胞克隆(右图)与亲本l细胞(左图)进行比较。选择克隆d2c进行进一步研究。图1b、图1c、图1d和图1e是结合细胞系和患者样品的抗baff-r抗体的荧光计数的facs迹线。图1b显示在0.05μgmab/106个细胞的浓度下结合baff-r阳性人类mcl系(包括mino、jeko-1、rec-1、jvm-13和z-138)的亲和纯化的杂交瘤mab(c90、c67、c55和c53)。将baff-r阴性293t胚胎肾细胞系用作对照。图1c显示在高和低浓度下结合表达hbaff-r的l细胞中的嵌合抗体c55和c90。将亲本l细胞和仅二级抗higg-apc抗体作为对照。图1d显示结合一组nhl细胞系的alexafluor488缀合的嵌合抗体。图1e显示结合三种类型的nhl原代患者样品的嵌合抗体。数据代表三次独立实验。对于图1b至图1e的所有图，如图中所示的从上到下的迹线与附图之下或旁边从上到下使用的变量(例如，抗体类型或细胞型)相关。
图2a、图2b和图2c是显示baff-r单克隆抗体表现出针对b细胞肿瘤系的特异性体外细胞毒性的图。在与c55、c90或利妥昔单抗和效应物(nk细胞或含有补体的血清)温育后，通过铬-51释放测量抗体诱导的细胞毒性。nk效应细胞对靶标的比(e:t)为20:1。在不同的抗体浓度的情况下，靶细胞的细胞特异性溶解的百分比：第一组显示表达baff-r的l细胞或对照亲本l细胞；第二组和第三组显示baff-r阳性jeko-1mcl或baff-r阴性u266多发性骨髓瘤细胞，显示为剂量反应曲线。图2b显示与针对cdc敏感(raji)和抗性(raji-2p)的含有活性补体的人类血清(1:3稀释)混合的抗体的特异性溶解。图2c显示在nhl系jeko-1、su-dhl-6、raji和rl上具有或不具有nk效应细胞(e:t＝20:1)的baff-r嵌合抗体的adcc作用。数据显示为一式三份样品的平均值±标准偏差。*p<0.05，与nk细胞相比(通过双尾学生t检验)。
图3a和图3b是显示baff-r单克隆抗体诱导针对原代b细胞肿瘤的体外抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的图。在与c55、c90或利妥昔单抗和效应物(nk细胞)温育后，通过铬-51释放测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)作用。靶细胞的细胞特异性溶解百分比：图3a显示nhl患者样品(e:t＝20:1或10:1)；图3b显示来自利妥昔单抗处理的难治性患者的原代mcl和cll样品(e:t＝20:1)。数据显示为一式三份样品的平均值±标准偏差。*p<0.05，与nk细胞相比(通过双尾学生t检验)。
图4a是显示在第0天以最小致死剂量的肿瘤的肿瘤攻击后的处理方案的示意图。通过iv尾静脉注射给予处理。图4b和图4c是显示靶向人类baff-r的嵌合抗体在体内引发针对b细胞肿瘤的治疗效果的图像。用以下表达荧光素酶的肿瘤攻击小鼠的生物发光图像：jeko-1(mcl)(图4b)或rs4；11(all)(图4c)。实验组接受嵌合baff-rmab(c55或c90，如所示)的处理。对照组小鼠以相同的方案接受pbs、单独nk细胞或利妥昔单抗。数据代表三次独立的实验。
图5a、图5b和图5c是显示嵌合baff-r抗体在药物抗性淋巴瘤模型上体外诱导adcc的图像或图表。图5a是facs分析的散点图，其显示在crispr/hdr敲除cd20基因之后cd20在jeko-1细胞上结合。与wtjeko-1相比，在选定的cd20-/-克隆25号上的cd20表达。在与c55、c90或利妥昔单抗和效应nk细胞(e:t＝20:1)温育后，通过铬-51释放测量adcc作用。以下靶细胞的细胞特异性溶解的百分比：利妥昔单抗抗性jeko-1-cd20-ko(图5b)和依鲁替尼抗性z-138和sp49-ir(图5c)。所有数据均代表两个或多个相同的实验。数据显示为一式三份样品的平均值±标准偏差。*p<0.05，与nk细胞相比(通过双尾学生t检验)。
图6a和图6b是显示靶向人类baff-r的嵌合抗体在体内引发针对药物抗性b细胞肿瘤的治疗效果的图像，并且图6c是其图。用表达荧光素酶的肿瘤jeko-1-cd20-ko细胞(图6a)或依鲁替尼抗性z-138细胞(图6b)攻击小鼠，之后进行如图4中的抗体处理的生物发光图像。对照组小鼠以相同的方案接受pbs、单独nk细胞或利妥昔单抗。图6c分别显示(a)和(b)中所示小鼠的80天无肿瘤和总体存活曲线。通过对数-秩检验分析实验组与所有对照组之间的无肿瘤率和存活差异(**p<0.001)。数据代表三次独立的实验。
图7a和图7b显示抗人类baff-r单克隆抗体产生和克隆选择。图7a是显示将l细胞克隆d2c用于根据所示的方案免疫balb/c小鼠的示意图，l细胞克隆d2c在细胞内结构域上稳定表达具有c末端gfp标签的人类hbaff-r。在第20天收获脾组织并建立b细胞杂交瘤克隆。图7b是显示使用抗小鼠igg-hrp的五种杂交瘤上清液的elisa结果的表。克隆53、55、67和90产生baff-r特异性mab，而克隆37不产生(代表其他阴性克隆)。
图8是流式细胞术结果，显示选定的杂交瘤克隆结合mcl细胞的验证。通过用抗小鼠igg-apc进行的流式细胞术评估杂交瘤克隆53、55、67和90上清液(1/10、1/50和1/200稀释)与mino(套细胞淋巴瘤)和293t(阴性对照)细胞系的结合。
图9是显示纯化的mab与人类baff-r的剂量依赖性结合的图。通过蛋白a亲和色谱纯化来自杂交瘤克隆53、55、67、90的小鼠mab。通过用抗小鼠igg-apc二级抗体的流式细胞术评估连续稀释的(1μg/106个细胞–1.6ng/106个细胞)纯化小鼠mab与mino细胞的结合。
图10是facs分析的结果，其显示hbaff-rmab在体外识别非霍奇金氏淋巴瘤细胞系。小鼠mab克隆55和90以高剂量(2μgmab/106个细胞)和低剂量(0.05μgmab/106个细胞)结合另外的细胞系：jeko-1(套细胞淋巴瘤)、su-dhl-6(弥漫性大b细胞淋巴瘤)、raji(伯基特氏淋巴瘤)和rl(滤泡淋巴瘤)。用抗小鼠igg-apc进行流式细胞术分析。如图中所示的从上到下的迹线与附图旁边从上到下使用的变量(例如，抗体类型或细胞型)相关。
图11是显示hbaff-rmab识别淋巴瘤患者样品的图。将套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤和滤泡淋巴瘤患者样品用小鼠mabc55和c90以高剂量(2μg/106个细胞)和低剂量(0.05μg/106个细胞)染色。用抗小鼠igg-apc进行流式细胞术分析。如图中所示的从上到下的迹线与附图下方从左到右使用的变量(例如，抗体类型或细胞型)相关。
图12是显示嵌合抗体诱导针对表达baff-r的l细胞的adcc的图。将表达baff-r的d2cl细胞(靶标)用铬-51标记，之后进行与嵌合mab+nk细胞(效应物对靶标的比，20:1)温育过夜。分析培养上清液中释放的铬。
图13是显示就针对肿瘤细胞的细胞毒性来说，嵌合抗体需要nk细胞的图。将jeko-1细胞(靶标)用铬-51标记。将细胞与嵌合mab(c55、c90或利妥昔单抗)并且与或不与nk细胞(效应物)(效应物对靶标的比为20:1)一起孵育。在50至0.005μg/ml的浓度下添加嵌合抗体。分析培养上清液中释放的铬。
图14是facs结果，其显示hbaff-rmab阻断baff/baff-r相互作用。在4℃下将表达baff-r的d2cl细胞克隆与c90温育45min(0-1000ng/106个细胞)，接着在4℃下与重组baff配体(0.5μg/106个细胞)温育90min。进行流式细胞术并对抗baff-pe进行设门。信号图显示在每种mab浓度存在下baff/baff-r结合信号。信号图中显示的浓度显示在每个facs结果的顶部。
图15是facs结果，其显示用baff-rmab观察到有限的内化。在4℃下将mino细胞与mabc90(0.05μg/106个细胞)温育20分钟，接着在37℃下温育1小时。用抗小鼠igg-apc进行流式细胞术分析。针对表面定位抗体(out)和细胞表面染色(in)损失对细胞进行设门。
图16a是facs结果，并且图16b是显示用crispr产生的cd20敲除克隆的凝胶图像。用商购的在cd20基因座处取代rfp的crispr/hdr系统产生jeko-1的cd20敲除克隆。对于图16a，筛选克隆并通过流式细胞术针对cd20-/rfp+表达进行分选。对于图16b，对来自cd20-/rfp+克隆的总细胞溶解物进行以抗cd20抗体的蛋白质印迹。将β-肌动蛋白印迹为负载对照。图16c显示针对baff-r/rfp+表达对如图16a中的克隆进行筛选以确认baff-r表达不受cd20的crispr/hdr操纵影响的facs结果。
图17是facs结果，其显示baff-r与正常b细胞结合的表征。将来自健康供体的pbmc与apc缀合的c90嵌合抗体和(a)淋巴细胞标记物组(抗cd20-pe、抗cd3-pacificblue和抗cd56-fitc)或(b)骨髓细胞标记物组(抗cd45-pe、抗cd15-percp-cy5.5和抗cd14-pacificblue)共染色。每个特定免疫细胞亚群进行设门并分析其与baff-r抗体的结合。
图18a和图18b是facs结果，其显示了来自外周血的正常免疫细胞中hbaff-rmab的表征。测试小鼠mab克隆55和90与分离的人类免疫细胞亚群的结合。用商购的特定细胞型分离试剂盒分离b细胞、t细胞和nk细胞，并且用c55和c90(0.05μgmab/106个细胞)染色。用抗小鼠igg进行流式细胞术分析。针对cd66b+对来自pbmc的骨髓细胞进行设门并且分析mabc55和c90染色。如图中所示的从上到下的迹线与附图旁边从上到下使用的变量(例如，抗体类型或细胞型)相关。
图19a和图19b是免疫组织化学图像。对于图19a，进行免疫组织化学以识别抗baff-r抗体的组织特异性。将1:150稀释的1mg/ml抗体用于染色组织样品。c55mab对人类baff-r的组织特异性(20x物镜)：1:150稀释的1mg/ml原液。对于图19b，对额外扁桃体组织和乳腺组织进行免疫组织化学以识别抗baff-r抗体的组织特异性。将1:150稀释的1mg/ml抗体用于染色组织样品。mab对人类baff-r的组织特异性(上图：扁桃体组织；下图：乳腺组织；20x物镜)。
图20a和图20b是显示对人源化变体进行的功能性体外测定的图。对于图20a，对c90的九种人源化变体进行elisa测定。将人类baff-r的重组细胞外结构域用作抗原。在0.78至100ng/ml变化的浓度下施用抗体，并且在450nm处去的它们的吸光度。对于图20b，在铬释放测定中针对jeko-1细胞测试人源化变体。使细胞摄取铬，接着用人源化c90变体和效应nk细胞处理。将细胞温育6小时，并对其上清液的铬含量进行取样。
图21a和图21b是显示分析人源化抗体c90-4和c90-5的各种淋巴瘤品系的特异性细胞毒性的图。对于图21a，用人源化抗体c90-4和c90-5使jeko-1、z138和rs4经历铬释放测定。在0至5μg/ml之间的浓度下将抗体施用于细胞系，并在20:1的e:t比率下与nk细胞一起温育6小时。分析细胞上清液的铬含量。对于图21b，用人源化抗体c90-4和c90-5使ly-10、mec-2、rl和raji淋巴瘤系经历铬释放测定。在5μg/ml下将抗体施用于细胞系，并在20:1的e:t比率下与nk细胞一起温育6小时。分析细胞上清液的铬含量。
图22a和图22b是facs结果和图，其显示针对原代mcl样品的结合和细胞毒性测试的人源化c90抗体先导候选者。对于图22a，将三个原代mcl肿瘤样品与cd20-apc和生物素化的人源化c90共染色，接着使用pe-缀合的链霉抗生物素蛋白进行信号检测。对于图22b，用铬释放测定评估人源化c90对原代肿瘤样品的细胞毒性。将细胞与铬-51一起温育，接着用抗体和效应nk细胞处理。温育过夜后，对上清液进行取样并确定铬含量。
图23是显示生物素化的人源化c90-4和c90-5的流式细胞术分析的facs结果。将抗体用于染色pbmc，接着用荧光pe链霉抗生物素蛋白探针检测。还用粒细胞标记物cd66b-percp-cy5.5、单核细胞标记物cd14-pe-cy7、b细胞标记物cd20-apc、t细胞标记物cd3-pe-cy5和nk细胞标记物cd56-fitc标记pbmc。通过流式细胞术分析pbmc。
图24是显示baff-r嵌合抗原受体(car)t细胞体内肿瘤处理的图像。将供体t细胞工程化成将嵌合c55抗baff-r单链(sfv)表达到具有4-1bb基序的t细胞受体信号传导结构域上。用最小致死剂量的nhljeko-1-luci细胞(1×106个细胞)攻击nsg小鼠。使肿瘤细胞移植直至可通过生物发光成像检测到肿瘤(第9天)。在肿瘤攻击后第9天和第15天向小鼠施用t细胞疗法(5×106个car-t细胞)或对照。密切监测小鼠并且每三天成像以跟踪肿瘤发展。
发明详述
本文尤其提供baff-r抗体，其包括轻链可变区和重链可变区。还提供抗体的功能片段。本文所提供的baff-r抗体和其功能片段能够结合至人类baff-r蛋白并在表达baff-r的细胞(例如，b细胞)上诱导抗体依赖性细胞毒性(adcc)。任选地，本文所提供的抗体的轻链可变区和重链可变区形成嵌合抗原受体(car)的一部分。因此，本文所提供的组合物和方法可尤其用于治疗癌症(例如，b细胞恶性肿瘤)或自身免疫疾病。
如本文所提及的baff-r、baff受体或baff-r蛋白包括任何重组或天然存在的形式的b细胞活化因子受体(baff-r)，也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员13c(tnfrsf13c)或其维持baff-r活性(例如，与baff-r相比在至少50％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％活性内)的变体或同源物。任选地，与天然存在的baff-r相比，变体或同源物在整个序列或序列的一部分(例如，具有50、100、150或200个连续氨基酸的部分)上具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。任选地，baff-r与通过uniprot参考标号q96rj3识别的蛋白或与所述蛋白具有实质同一性的变体或同源物大致上相同。任选地，baff-r与由uniprot参考标号q9d8d0识别的蛋白或与所述蛋白具有实质同一性的变体或同源物大致上相同。任选地，baff-r与通过ncbi参考标号gi:16445027识别的蛋白或与所述蛋白具有实质同一性的变体或同源物大致上相同。任选地，baff-r与通过ncbi参考标号gi:16306481识别的蛋白或与所述蛋白具有实质同一性的变体或同源物大致上相同。
提供包括轻链可变区和重链可变区的b细胞活化因子受体(baff-r)抗体。轻链可变区包括如seqidno:1中所示的cdrl1、如seqidno:2中所示的cdrl2和如seqidno:3中所示的cdrl3。并且重链可变区包括如seqidno:4中所示的cdrh1、如seqidno:5中所示的cdrh2和如seqidno:6中所示的cdrh3。任选地，轻链可变区包括如seqidno:7中所示的cdrl1、如seqidno:8中所示的cdrl2和如seqidno:9中所示的cdrl3。并且重链可变区包括如seqidno:10中所示的cdrh1、如seqidno:11中所示的cdrh2和如seqidno:12中所示的cdrh3。任选地，抗体是人源化抗体。还提供公开抗体的功能片段。
如本文所提供的人源化抗体能够结合baff-r蛋白并且包括本文所提供的baff-r抗体的至少一个小鼠cdr或其功能片段或变体(例如，seqidno:1或7的cdrl1、seqidno:2或8的cdrl2、seqidno:3或9的cdrl3、seqidno:4或10的cdrh1、seqidno:5或11的cdrh2、seqidno:7或13的cdrh3)。cdr的功能片段是完整cdr氨基酸序列的一部分，而含有功能片段的抗体或其片段仍能够结合至抗原(例如，baff-r)。cdr的功能变体是具有所述cdr序列的一处或多处变化的cdr，而含有所述功能变体的抗体或其功能片段仍能够结合至抗原(例如，baff-r)。例如，编码cdr的核酸序列的功能变体可包括一处或多处变化，而仍编码所述cdr的相同氨基酸序列。另外，cdr的多肽序列的功能变体可包括一个或多个氨基酸变化，只要抗体或其功能片段结合至抗原即可。因此，cdr的功能片段或变体通常包括抗体结合至抗原(例如，baff-r)所需的氨基酸残基。在人源化抗体包括至少一个cdr的情况下，所述至少一个cdr或其功能片段来源于供体抗体。任选地，供体抗体是小鼠抗体。本领域的技术人员应立即认识到，包括至少一个小鼠cdr的人源化抗体是具有至少一个来源于供体抗体的小鼠cdr的人源化抗体，并且额外cdr来源于受体抗体(例如，在轻链包括总共三个cdr并且重链包括总共三个cdr的情况下)。
在本文所提供的baff-r抗体是人源化抗体的情况下，抗体可包括人源化人源化重链可变区和/或人源化轻链可变区。任选地，人源化轻链可变区和人源化重链可变区包括组合的一个小鼠cdr或小鼠cdr的功能片段或变体。因此，人源化轻链可变区和人源化重链可变区可包括组合的六个cdr，其中这六个cdr中的至少一个是小鼠cdr。在人源化轻链可变区和人源化重链可变区包括组合的一个小鼠cdr的情况下，人源化轻链可变区或人源化重链可变区包括一个小鼠cdr。例如，人源化抗体可包括来源于供体抗体的cdrl3(例如，小鼠，在本文中也称为小鼠cdrl3)和来源于受体抗体(即，人类)的cdrl1、cdrl2、cdrh1、cdrh2和cdrh3。
任选地，人源化轻链可变区和人源化重链可变区包括组合的两个小鼠cdr。在人源化轻链可变区和人源化重链可变区包括组合的两个小鼠cdr的情况下，人源化轻链可变区和人源化重链可变区各自包括一个小鼠cdr(i)，人源化轻链可变区包括两个小鼠cdr(ii)，或人源化重链可变区包括两个小鼠cdr(iii)。例如，人源化抗体可包括来源于供体抗体的cdrl3和cdrh3(在本文中也分别称为小鼠cdrl3和小鼠cdrh3)和来源于受体抗体(即，人类)的cdrl1、cdrl2、cdrh1和cdrh2。
任选地，人源化轻链可变区和人源化重链可变区包括组合的三个小鼠cdr。在人源化轻链可变区和人源化重链可变区包括组合的三个小鼠cdr的情况下，人源化轻链可变区可包括一个小鼠cdr并且人源化重链可变区可包括两个小鼠cdr(i)，人源化轻链可变区包括两个小鼠cdr并且人源化重链可变区包括一个小鼠cdr(ii)，人源化轻链可变区包括三个小鼠cdr(iii)，或者人源化重链可变区包括三个小鼠cdr(iv)。例如，人源化抗体可包括来源于供体抗体的cdrl3、cdrh3和cdrl2(例如，小鼠，在本文中也分别称为cdrl3、小鼠cdrh3和小鼠cdrl2)和来源于受体抗体(即，人类)的cdrl1、cdrh1和cdrh2。
人源化轻链可变区和人源化重链可变区可包括组合的四个小鼠cdr。在人源化轻链可变区和人源化重链可变区包括组合的四个小鼠cdr的情况下，人源化轻链可变区包括一个小鼠cdr并且人源化重链可变区包括三个小鼠cdr(i)，人源化轻链可变区包括三个小鼠cdr并且人源化重链可变区包括一个小鼠cdr(ii)，或者人源化轻链可变区包括两个小鼠cdr并且人源化重链可变区包括两个小鼠cdr(iii)。例如，人源化抗体可包括来源于供体抗体的cdrl3、cdrh3、cdrl2和cdrl1(例如，小鼠，在本文中也分别称为小鼠cdrl3、小鼠cdrh3、小鼠cdrl2和小鼠cdrl1)和来源于受体抗体(即，人类)的cdrh1和cdrh2。
人源化轻链可变区和人源化重链可变区可各自包括至少一个小鼠cdr。在人源化轻链可变区和人源化重链可变区各自包括至少一个小鼠cdr的情况下，人源化轻链可变区包括至少一个小鼠cdr并且人源化重链可变区包括至少一个小鼠cdr。因此，人源化轻链可变区可包括小鼠cdrl1并且人源化重链包括小鼠cdrh1。任选地，小鼠cdrl1包括氨基酸序列seqidno:1并且小鼠cdrh1包括氨基酸序列seqidno:4。任选地，小鼠cdrl1是氨基酸序列seqidno:1并且小鼠cdrh1是氨基酸序列seqidno:4。任选地，人源化轻链可变区包括小鼠cdrl2并且人源化重链可变区包括小鼠cdrh2。任选地，小鼠cdrl2包括氨基酸序列seqidno:2并且小鼠cdrh2包括氨基酸序列seqidno:5。任选地，小鼠cdrl2是氨基酸序列seqidno:2并且小鼠cdrh2是氨基酸序列seqidno:5。任选地，人源化轻链可变区包括小鼠cdrl3并且人源化重链可变区包括小鼠cdrh3。任选地，小鼠cdrl3包括氨基酸序列seqidno:3并且小鼠cdrh3包括氨基酸序列seqidno:6。任选地，cdrl3是氨基酸序列seqidno:3并且小鼠cdrh3是氨基酸序列seqidno:6。
任选地，小鼠cdrl1包括氨基酸序列seqidno:7并且小鼠cdrh1包括氨基酸序列seqidno:10。任选地，小鼠cdrl1是氨基酸序列seqidno:7并且小鼠cdrh1是氨基酸序列seqidno:10。任选地，人源化轻链可变区包括小鼠cdrl2并且人源化重链可变区包括小鼠cdrh2。任选地，小鼠cdrl2包括氨基酸序列seqidno:8并且小鼠cdrh2包括氨基酸序列seqidno:11。任选地，小鼠cdrl2是氨基酸序列seqidno:8并且小鼠cdrh2是氨基酸序列seqidno:11。任选地，人源化轻链可变区包括小鼠cdrl3并且人源化重链可变区包括小鼠cdrh3。任选地，小鼠cdrl3包括氨基酸序列seqidno:9并且小鼠cdrh3包括氨基酸序列seqidno:12。任选地，cdrl3是氨基酸序列seqidno:9并且小鼠cdrh3是氨基酸序列seqidno:12。
小鼠cdrl3和小鼠cdrh3的存在可足以将人源化抗体结合到baff-r。因此，人源化抗体可不包括小鼠cdrl1、小鼠cdrl2、cdrh1或小鼠cdrh2。在人源化抗体不包括小鼠cdrl1、小鼠cdrl2、小鼠cdrh1或小鼠cdrh2的情况下，人源化抗体包括来源于受体抗体(即，人类)的cdrl1、cdrl2、cdrh1或cdrh2。因此，不包括小鼠cdrl1、小鼠cdrl2、小鼠cdrh1或小鼠cdrh2的人源化抗体不包括来自供体抗体(例如，小鼠、大鼠、兔)的cdrl1、cdrl2、cdrh1或cdrh2，但是包括来自受体抗体(即，人类)的cdrl1、cdrl2、cdrh1或cdrh2。因此，人源化轻链可变区可不包括小鼠cdrl1或小鼠cdrl2并且人源化重链可变区不包括小鼠cdrh1或小鼠cdrh2。任选地，人源化轻链可变区不包括小鼠cdrl1和小鼠cdrl2并且人源化重链可变区不包括小鼠cdrh1和小鼠cdrh2。
任选地，人源化轻链可变区不包括小鼠cdrl2和小鼠cdrl3并且人源化重链可变区包括小鼠cdrh2和小鼠cdrh3。任选地，人源化轻链可变区包括小鼠cdrl1、小鼠cdrl2和小鼠cdrl3并且人源化重链可变区包括小鼠cdrh1、小鼠cdrh2和小鼠cdrh3。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:1中所示的小鼠cdrl1、如seqidno:2中所示的小鼠cdrl2和如seqidno:3中所示的小鼠cdrl3，并且人源化重链可变区包括如seqidno:4中所示的小鼠cdrh1、如seqidno:5中所示的小鼠cdrh2和如seqidno:6中所示的小鼠cdrh3。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:7中所示的小鼠cdrl1、如seqidno:8中所示的小鼠cdrl2和如seqidno:9中所示的小鼠cdrl3，并且人源化重链可变区包括如seqidno:10中所示的小鼠cdrh1、如seqidno:11中所示的小鼠cdrh2和如seqidno:12中所示的小鼠cdrh3。
cdr和fr的位置可通过kabat编号系统定义(kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,u.s.governmentprintingoffice(1991))。同样，抗体的轻链或重链内个别残基的位置可通过kabat编号系统定义。因此，在人源化抗体的人源化轻链和人源化重链内结合所需的残基位置可通过根据在本领域中是已知的kabat编号系统的残基位置定义。如上文所述，人源化抗体可以是具有来自供体抗体(例如，小鼠)的cdr和来自人类抗体的可变区框架(fr)的抗体。据称框架区(fr)将cdr保持在人源化抗体中的适当位置。从氨基末端开始，分别地，轻链的这些区被命名为frl1、frl2、frl3和frl4并且重链的这些区被命名为frh1、frh2、frh3和frh4。本文提供在框架区内包括一个或多个残基的人源化抗体。任选地，这些残基对于人源化抗体的表位结合来说是重要。表位结合(例如，baff-r结合)所涉及(或对于其来说重要)的框架区残基在本文中被称为结合框架区残基。结合框架区残基可存在于人源化轻链可变区的框架区(即，frl1、frl2、frl3、frl4)中，或者它们可存在于人源化重链可变区的框架区(即，frh1、frh2、frh3、frh4)中。存在于人源化轻链的frl3区中的结合框架残基在本文中被称为frl3结合框架区残基。因此，存在于人源化重链的frh3区中的结合框架区残基在本文中被称为frh3结合框架区残基。
任选地，人源化抗体包括至少一个结合框架区残基。任选地，人源化轻链可变区包括至少一个结合框架区残基。任选地，人源化轻链可变区包括一个或多个frl1、frl2、frl3或frl4结合框架区残基。任选地，人源化轻链可变区包括一个或多个frl1结合框架区残基。任选地，人源化轻链可变区包括一个或多个frl2结合框架区残基。任选地，人源化轻链可变区包括一个或多个frl3结合框架区残基。任选地，人源化轻链可变区包括一个或多个frl4结合框架区残基。任选地，人源化重链可变区包括一个或多个frh1、frh2、frh3或frh4结合框架区残基。任选地，人源化重链可变区包括一个或多个frh1结合框架区残基。任选地，人源化重链可变区包括一个或多个frh2结合框架区残基。任选地，人源化重链可变区包括一个或多个frh3结合框架区残基。任选地，人源化重链可变区包括一个或多个frh4结合框架区残基。
人源化轻链可变区可包括至少一个结合框架区残基(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50或更多个残基)并且人源化重链可变区包括至少一个结合框架区残基(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50或更多个残基)。人源化抗体内结合框架区残基的位置可与cdr残基的位置类似通过kabat编号系统定义。
任选地，轻链可变区在对应于kabat位置7的位置包括丝氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置8的位置包括脯氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置15的位置包括缬氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置22的位置包括苏氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置24的位置包括谷氨酰胺。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置41的位置包括甘氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置42的位置包括赖氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置43的位置包括丙氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置44的位置包括脯氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置56的位置包括苏氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置72的位置包括苏氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置73的位置包括苯丙氨酸。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置79的位置包括谷氨酰胺。任选地，轻链可变区在对应于kabat位置104的位置包括缬氨酸。
任选地，轻链可变区在对应于kabat位置7的位置包括丝氨酸，在对应于kabat位置8的位置包括脯氨酸，在对应于kabat位置15的位置包括缬氨酸，在对应于kabat位置22的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置24的位置包括谷氨酰胺或丝氨酸，在对应于kabat位置41的位置包括甘氨酸，在对应于kabat位置42的位置包括赖氨酸，在对应于kabat位置43的位置包括丙氨酸或苏氨酸，在对应于kabat位置44的位置包括脯氨酸，在对应于kabat位置56的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置72的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置73的位置包括苯丙氨酸或赖氨酸，在对应于kabat位置79的位置包括谷氨酰胺或在对应于kabat位置104的位置包括缬氨酸。
任选地，轻链可变区在对应于kabat位置7的位置包括丝氨酸，在对应于kabat位置8的位置包括脯氨酸，在对应于kabat位置15的位置包括缬氨酸，在对应于kabat位置22的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置24的位置包括谷氨酰胺或丝氨酸，在对应于kabat位置41的位置包括甘氨酸，在对应于kabat位置42的位置包括赖氨酸，在对应于kabat位置43的位置包括丙氨酸或苏氨酸，在对应于kabat位置44的位置包括脯氨酸，在对应于kabat位置56的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置72的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置73的位置包括苯丙氨酸或赖氨酸，在对应于kabat位置79的位置包括谷氨酰胺并且在对应于kabat位置104的位置包括缬氨酸。
任选地，轻链可变区包括以下结合框架区残基：在对应于kabat位置7的位置的丝氨酸、在对应于kabat位置8的位置的脯氨酸、在对应于kabat位置15的位置的缬氨酸、在对应于kabat位置22的位置的苏氨酸、在对应于kabat位置24的位置的谷氨酰胺或丝氨酸、在对应于kabat位置41的位置的甘氨酸、在对应于kabat位置42的位置的赖氨酸、在对应于kabat位置43的位置的丙氨酸或苏氨酸、在对应于kabat位置44的位置的脯氨酸、在对应于kabat位置56的位置的苏氨酸、在对应于kabat位置72的位置的苏氨酸、在对应于kabat位置73的位置的苯丙氨酸或赖氨酸、在对应于kabat位置79的位置的谷氨酰胺或在对应于kabat位置104的位置的缬氨酸。
任选地，重链可变区在对应于kabat位置10的位置包括苏氨酸或丙氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置11的位置包括赖氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置12的位置包括缬氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置15的位置包括苏氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置19的位置包括苏氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置23的位置包括苏氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置41的位置包括脯氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置44的位置包括丙氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置61的位置包括脯氨酸或苏氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置66的位置包括精氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置70的位置包括苏氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置75的位置包括赖氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置79的位置包括缬氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置81的位置包括苏氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置82的位置包括甲硫氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置82b的位置包括天冬酰胺。任选地，重链可变区在对应于kabat位置82c的位置包括甲硫氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置84的位置包括脯氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置85的位置包括缬氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置108的位置包括赖氨酸。任选地，重链可变区在对应于kabat位置109的位置包括缬氨酸。
任选地，重链可变区在对应于kabat位置10的位置包括苏氨酸或丙氨酸，在对应于kabat位置11的位置包括赖氨酸，在对应于kabat位置12的位置包括缬氨酸，在对应于kabat位置15的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置19的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置23的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置41的位置包括脯氨酸，在对应于kabat位置44的位置包括丙氨酸，在对应于kabat位置61的位置包括脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，在对应于kabat位置66的位置包括精氨酸，在对应于kabat位置70的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置75的位置包括赖氨酸，在对应于kabat位置79的位置包括缬氨酸，在对应于kabat位置81的位置包括苏氨酸或赖氨酸，在对应于kabat位置82的位置包括甲硫氨酸，在对应于kabat位置82b的位置包括天冬酰胺，在对应于kabat位置82c的位置包括甲硫氨酸，在对应于kabat位置84的位置包括脯氨酸，在对应于kabat位置85的位置包括缬氨酸，在对应于kabat位置108的位置包括赖氨酸或在对应于kabat位置109的位置包括缬氨酸。
任选地，重链可变区早对应于kabat位置10的位置包括苏氨酸或丙氨酸，在对应于kabat位置11的位置包括赖氨酸，在对应于kabat位置12的位置包括缬氨酸，在对应于kabat位置15的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置19的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置23的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置41的位置包括脯氨酸，在对应于kabat位置44的位置包括丙氨酸，在对应于kabat位置61的位置包括脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，在对应于kabat位置66的位置包括精氨酸，在对应于kabat位置70的位置包括苏氨酸，在对应于kabat位置75的位置包括赖氨酸，在对应于kabat位置79的位置包括缬氨酸，在对应于kabat位置81的位置包括苏氨酸或赖氨酸，在对应于kabat位置82的位置包括甲硫氨酸，在对应于kabat位置82b的位置包括天冬酰胺，在对应于kabat位置82c的位置包括甲硫氨酸，在对应于kabat位置84的位置包括脯氨酸，在对应于kabat位置85的位置包括缬氨酸，在对应于kabat位置108的位置包括赖氨酸并且在对应于kabat位置109的位置包括缬氨酸。
任选地，重链可变区包括以下结合框架区残基：在对应于kabat位置10的位置的苏氨酸或丙氨酸，在对应于kabat位置11的位置的赖氨酸，在对应于kabat位置12的位置的缬氨酸，在对应于kabat位置15的位置的苏氨酸，在对应于kabat位置19的位置的苏氨酸，在对应于kabat位置23的位置的苏氨酸，在对应于kabat位置41的位置的脯氨酸，在对应于kabat位置44的位置的丙氨酸，在对应于kabat位置61的位置的脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，在对应于kabat位置66的位置的精氨酸，在对应于kabat位置70的位置的苏氨酸，在对应于kabat位置75的位置的赖氨酸，在对应于kabat位置79的位置的缬氨酸，在对应于kabat位置81的位置的苏氨酸或赖氨酸，在对应于kabat位置82的位置的甲硫氨酸，在对应于kabat位置82b的位置的天冬酰胺，在对应于kabat位置82c的位置的甲硫氨酸，在对应于kabat位置84的位置的脯氨酸，在对应于kabat位置85的位置的缬氨酸，在对应于kabat位置108的位置的赖氨酸或在对应于kabat位置109的位置的缬氨酸。
提供一种人源化baff-r抗体，其包括人源化轻链可变区和人源化重链可变区的，所述人源化轻链可变区包括小鼠cdrl1、小鼠cdrl2或小鼠cdrl3并且所述人源化重链可变区包括小鼠cdrh1、小鼠cdrh2或小鼠cdrh3。人源化轻链可变区可包括如seqidno:1中所示的小鼠cdrl1、如seqidno:2中所示的小鼠cdrl2或如seqidno:3中所示的小鼠cdrl3。人源化轻链可变区可包括如seqidno:1中所示的小鼠cdrl1、如seqidno:2中所示的小鼠cdrl2和如seqidno:3中所示的小鼠cdrl3。人源化重链可变区可包括如seqidno:4中所示的小鼠cdrh1、如seqidno:5中所示的小鼠cdrh2或如seqidno:6中所示的小鼠cdrh3。人源化重链可变区可包括如seqidno:4中所示的小鼠cdrh1、如seqidno:5中所示的小鼠cdrh2和如seqidno:6中所示的小鼠cdrh3。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:1中所示的小鼠cdrl1。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:2中所示的小鼠cdrl2。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:3中所示的小鼠cdrl3。任选地，人源化重链可变区包括如seqidno:4中所示的小鼠cdrh1。任选地，人源化重链可变区包括如seqidno:5中所示的小鼠cdrh2。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:6中所示的小鼠cdrh3。在另外实施方案中，人源化轻链可变区包括至少一个结合框架区残基。在其他另外实施方案中，人源化重链可变区包括至少一个结合框架区残基。
提供一种人源化baff-r抗体，其包括人源化轻链可变区和人源化重链可变区的，所述人源化轻链可变区包括小鼠cdrl1、小鼠cdrl2或小鼠cdrl3并且所述人源化重链可变区包括小鼠cdrh1、小鼠cdrh2或小鼠cdrh3。人源化轻链可变区可包括如seqidno:7中所示的小鼠cdrl1、如seqidno:8中所示的小鼠cdrl2或如seqidno:9中所示的小鼠cdrl3。人源化轻链可变区可包括如seqidno:7中所示的小鼠cdrl1、如seqidno:8中所示的小鼠cdrl2和如seqidno:9中所示的小鼠cdrl3。人源化重链可变区可包括如seqidno:10中所示的小鼠cdrh1、如seqidno:11中所示的小鼠cdrh2或如seqidno:12中所示的小鼠cdrh3。人源化重链可变区可包括如seqidno:10中所示的小鼠cdrh1、如seqidno:11中所示的小鼠cdrh2和如seqidno:12中所示的小鼠cdrh3。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:7中所示的小鼠cdrl1。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:8中所示的小鼠cdrl2。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:9中所示的小鼠cdrl3。任选地，人源化重链可变区包括如seqidno:10中所示的小鼠cdrh1。任选地，人源化重链可变区包括如seqidno:11中所示的小鼠cdrh2。任选地，人源化轻链可变区包括如seqidno:12中所示的小鼠cdrh3。在另外实施方案中，人源化轻链可变区包括至少一个结合框架区残基。在其他另外实施方案中，人源化重链可变区包括至少一个结合框架区残基。
任选地，轻链可变区包括序列seqidno:18、seqidno:20或seqidno:22。任选地，轻链可变区包括序列seqidno:18。任选地，轻链可变区包括序列seqidno:20。任选地，轻链可变区包括序列seqidno:22。任选地，轻链可变区是序列seqidno:18。任选地，轻链可变区是序列seqidno:20。任选地，轻链可变区是序列seqidno:22。任选地，重链可变区包括序列seqidno:24、seqidno:26或seqidno:28。任选地，重链可变区包括序列seqidno:24。任选地，重链可变区包括序列seqidno:26。任选地，重链可变区包括序列seqidno:28。任选地，重链可变区是序列seqidno:24。任选地，重链可变区是序列seqidno:26。任选地，重链可变区是序列seqidno:28。因此，在另一个方面中，提供一种人源化baff-r抗体，其包括人源化轻链可变区和人源化重链可变区，其中所述人源化轻链可变区包括序列seqidno:18并且所述重链可变区包括序列seqidno:24。在另一个方面中，提供一种人源化baff-r抗体，其包括人源化轻链可变区和人源化重链可变区，其中所述人源化轻链可变区包括序列seqidno:20并且所述重链可变区包括序列seqidno:26。在另一个方面中，提供一种人源化baff-r抗体，其包括人源化轻链可变区和人源化重链可变区，其中所述人源化轻链可变区包括序列seqidno:22并且所述重链可变区包括序列seqidno:28。
任选地，抗体是嵌合抗体。任选地，轻链可变区包括序列seqidno:14。任选地，重链可变区包括序列seqidno:16。任选地，轻链可变区是序列seqidno:14。任选地，重链可变区是序列seqidno:16。因此，在另一个方面中，提供一种嵌合baff-r抗体，其包括轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包括序列seqidno:14并且所述重链可变区包括序列seqidno:16。
任选地，轻链可变区包括序列seqidno:30。任选地，重链可变区包括序列seqidno:32。任选地，轻链可变区是序列seqidno:30。任选地，重链可变区是序列seqidno:32。因此，在另一个方面中，提供一种嵌合baff-r抗体，其包括轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包括序列seqidno:30并且所述重链可变区包括序列seqidno:32。
在本文所述的抗体的各情况下，可使用功能片段。因此，例如，提供fab’片段可包括重链(例如，包括恒定区和可变区)和轻链(例如，包括恒定区和可变区)。任选地，fab’片段包括人源化重链(例如，包括恒定区和可变区)和人源化轻链(例如，包括恒定区和可变区)。
任选地，baff-r抗体或其片段包括人类恒定区。任选地，baff-r抗体或其片段是igg。任选地，baff-r抗体或其片段是igg1。任选地，baff-r抗体或其片段是igg2。任选地，baff-r抗体或其片段是igg3。任选地，baff-r抗体或其片段是igg4。任选地，baff-r抗体或其片段是iga。任选地，baff-r抗体或其片段是igm。
任选地，baff-r抗体或其片段是单链抗体。单链抗体包括可变轻链和可变重链。本领域的技术人员应立即认识到，单链抗体包括单一轻链和单一重链，与免疫球蛋白抗体不同，免疫球蛋白抗体包括相同的两对多肽链，每一对具有一个轻链和一个重链。每个轻链和重链继而由以下两个区组成：可变(“v”)区(即，可变轻链和可变重链)，其涉及结合靶抗原；和恒定(“c”)区，其与免疫系统的其他组成部分相互作用。单链抗体中的可变轻链和可变重链可通过接头肽连接。单链抗体的接头肽的示例描述于bird,r.e.,等人,science.242(4877):423-6(1988)。已描述了制备scfv抗体的方法。参见，huse等人,science246:1275-1281(1989)；ward等人,nature341:544-546(1989)；和vaughan等人,naturebiotech.14:309-314(1996)。简而言之，分离出免疫动物b细胞的mrna并且制备cdna。使用特异于免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的引物扩增cdna。纯化pcr产物并且接合核酸序列。如果接头肽是需要的，那么将编码所述肽的核酸序列插入在重链核酸序列与轻链核酸序列之间。将编码scfv的核酸插入到载体中并且在宿主细胞中表达。
抗体或其功能片段结合具体表位(例如，baff-r)的能力可通过平衡解离常数(kd)来描述。如本文所定义的平衡解离常数(kd)是解离速率(k-off)对baff-r抗体与baff-r蛋白缔合速率(k-on)的比。其通过下式描述：kd＝k-off/k-on。任选地，baff-r抗体能够以小于约5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体能够以小于约4.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体能够以小于约4nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体能够以小于约3.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体能够以小于约3nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体能够以小于约2.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体能够以小于约2nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体能够以小于约1.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体能够以小于约1nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体能够以小于约0.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。
任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约0.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约1nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约1.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约2nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约2.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约3nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约3.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约4nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约4.5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。任选地，baff-r抗体或其功能片段能够以约0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5nm的平衡解离常数(kd)结合baff-r蛋白。
任选地，所提供的人源化b细胞活化因子受体(baff-r)抗体能够以小于约4nm的kd结合baff-r。任选地，提供以小于约4nm的kd结合至baff-r的人源化b细胞活化因子受体(baff-r)抗体。任选地，抗体不诱导baff-r活性。
任选地，baff-r抗体结合至baff-r蛋白。任选地，baff-r蛋白是人类baff-r蛋白。任选地，baff-r蛋白通过由ncbi基因id编号115650识别的核酸序列编码。任选地，baff-r蛋白形成细胞的一部分。任选地，baff-r蛋白在所述细胞的表面上表达。任选地，细胞是淋巴细胞。任选地，细胞是b细胞。任选地，细胞是癌细胞。任选地，癌细胞是淋巴瘤细胞。
各种各样的诊断和治疗部分及其组合可并入到本文所提供的baff-r抗体或其功能片段，包括其实施方案，从而，提供高稳定性和/或多用途的药物递送和/或诊断组合物。任选地，baff-r抗体或其功能片段包括治疗部分或诊断部分。任选地，治疗部分或诊断部分通过化学接头结合到baff-r抗体或其功能片段。任选地，化学接头是共价接头或非共价接头。用于将治疗部分缀合至抗体的技术是熟知的(参见例如，arnon等人,monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy,monoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeld等人(编),第243-56页(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等人,antibodiesfordrugdeliveryincontrolleddrugdelivery(第2版),robinson等人(编),第623-53页(marceldekker,inc.1987)；thorpe,antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areviewinmonoclonalantibodies‘84:biologicalandclinicalapplications,pinchera等人(编),第475-506页(1985)；以及thorpe等人,thepreparationandcytotoxicpropertiesofantibody-toxinconjugates,immunol.rev.,62:119-58(1982))。如本文所述，术语抗体-药物缀合物或adc是指治疗部分缀合或以其他方式共价结合至抗体或其功能片段。
如本文所提供的术语治疗部分根据其平常、普通的意义使用并且是指当向有需要的受试者给予时具有治疗益处(例如，预防、根除、改善正治疗的潜在病症)的单价化合物。如本文所提供的治疗部分可包括但不限于肽、蛋白、核酸、核酸类似物、小分子、抗体、酶、前药、细胞毒性剂(例如毒素)包括但不限于蓖麻蛋白、多柔比星、道诺比星、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟基炭疽菌素二酮、放线菌素d、白喉毒素、假单胞菌外毒素(pe)a、pe40、相思豆毒素和糖皮质激素。任选地，治疗部分是如本文所述的抗癌剂或化疗剂。任选地，治疗部分是核酸部分、肽部分或小分子药物部分。任选地，治疗部分是核酸部分。任选地，治疗部分是抗体部分。任选地，治疗部分是肽部分。任选地，治疗部分是小分子药物部分。任选地，治疗部分是核酸酶。任选地，治疗部分是免疫刺激剂。任选地，治疗部分是毒素。任选地，治疗部分是核酸酶。
本文还提供包括本文所提供的抗体或其功能片段的嵌合抗原受体(car)。
提供一种分离核酸，其编码本文所提供的baff-r抗体或其功能片段，包括其实施方案。由分离核酸编码的baff-r抗体或其功能片段详细描述于本申请通篇(包括上文描述和实施例部分中)。例如，核酸可编码至少一个cdr、涉及结合表位的具体残基或结合框架残基。例如，核酸可编码包括序列seqidno:1的轻链。
任选地，分离核酸包括序列seqidno:13、seqidno:15、seqidno:29或seqidno:31。任选地，分离核酸包括序列seqidno:13和序列seqidno:15。任选地，分离核酸包括序列seqidno:29和序列seqidno:31。
任选地，分离核酸包括序列seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25或seqidno:27。任选地，分离核酸包括序列seqidno:17和序列seqidno:23。任选地，分离核酸包括序列seqidno:19和序列seqidno:25。任选地，分离核酸包括序列seqidno:21和序列seqidno:27。
提供一种药物组合物，其包括治疗有效量本文所提供的baff-r抗体或其功能片段和药学上可接受的赋形剂。
如本文所提供的治疗有效量是指有效实现意欲目的的量。对于特定应用有效的实际量将尤其取决于正在治疗的病状。当在方法中施用以治疗疾病时，本文所述的药物组合物将含有有效实现期望结果的活性人源化抗体的量，例如，调节靶分子(例如，baff-r)的活性和/或减少、消除疾病症状(例如，癌症、自身免疫疾病)或减慢疾病症状的进展。本文所提供的baff-r抗体的治疗有效量的确定完全在本领域的技术人员的能力范围内，尤其是按照本文的详细公开。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括：缓冲液，诸如磷酸盐、柠檬酸盐或乙酸盐，ph通常为5.0至8.0，任选地6.0至7.0；实现等渗的盐，诸如氯化钠、氯化钾等等；抗氧化剂；防腐剂；低分子量多肽；蛋白；亲水性聚合物，诸如聚山梨醇酯80；氨基酸，诸如甘氨酸；碳水化合物；螯合剂；糖；以及本领域的技术人员已知的其他标准成分(remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第22版,loydv.allen等人编,pharmaceuticalpress(2012))。mab可在0.1-100mg/ml，例如1-10mg/ml或10-50mg/ml，例如5、10、20、30、40、50或60mg/ml的浓度下存在。
包括如本文所述的抗体(例如，人源化抗体)或其功能片段的药物组合物可通过多种本领域中已知的方法施用。施用途径和/或模式根据期望的结果而变化。任选地，施用是静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用，或者靠近目标部位施用。药学上可接受的赋形剂可合适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。
抗体或其功能片段的药物组合物可根据本领域中熟知并且通常实践的方法制备。参见例如,remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第22版,loydv.allen等人编,pharmaceuticalpress(2012)；以及sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems,j.r.robinson编,marceldekker,inc.,newyork,1978。药物组合物优选在gmp条件下制造。通常，治疗有效剂量或有效剂量的人源化抗体用于药物组合物中。所提供的人源化抗体可通过本领域的技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，随着时间推移可以施用若干分剂量或如由治疗情况的紧急状态指示，剂量可按比例减少或增加。将人源化抗体与其他疗法或试剂组合配制可能是有利的。以易于施用和实现剂量均匀性的剂量单位形式配制肠胃外组合物可以是有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理上离散单位；每个单位含有经计算与所需药物赋形剂联合产生期望治疗效果的预定量的人源化抗体。
药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可改变以便获得对于特定患者、组合物以及施用模式有效实现期望治疗反应，而对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药代动力学因素，包括：采用的特定组合物的活性；施用途径；施用时间；采用的特定抗体的排泄速率；治疗的持续时间；与采用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；正治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状态和先前的病史；以及类似因素。
医师或兽医可在比实现期望治疗效果所需的水平低的水平下开始药物组合物中采用的抗体或其功能片段的剂量，并逐步增加剂量直至实现期望的效果。一般来讲，组合物的有效剂量可根据许多不同的因素而变化，包括待治疗的具体疾病或病状、施用手段、目标部位、患者的生理状态、患者是人类还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性还是治疗性的。需要滴定治疗剂量以使安全性和功效最优化。对于用抗体施用，剂量的范围是从约0.0001至100mg/kg宿主体重，并且更通常是0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每两周、或三周施用一次或每月施用一次、或每3至6个月施用一次。
本文所提供的baff-r抗体或其功能片段可以在多个时机时施用。单个剂量之间的间隔可为每周、每月或每年。间隔也可以是无规律的，如通过测量患者的人源化抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量以实现1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中是25-300μg/ml。可替代地，可将抗体以缓释制剂形式施用，在这种情况下，需要较低的施用频率。剂量和频率根据患者抗体的半衰期而变化。一般来讲，人源化抗体显示长于嵌合抗体和非人类抗体的半衰期。施用剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性而变化。在预防性应用中，在长时间段内在相对不频繁的间隔下施用相对低的剂量。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性的应用中，有时需要在相对短的时间间隔下施用相对高的剂量，直到疾病的进展减弱或终止，并且优选地直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。然后，可以向患者施用预防性方案。
提供表达人类baff-r蛋白或其片段的小鼠成纤维细胞，并且人类baff-r蛋白或其片段在细胞的细胞表面上表达。任选地，人类baff-r蛋白或其片段包括可检测的部分。任选地，可检测的部分是荧光部分。任选地，可检测的部分是增强的绿荧光蛋白(egfp)。
提供治疗有需要的受试者的癌症的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所提供的嵌合抗原受体，从而治疗所述受试者的癌症。
在另一个方面中，提供一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所提供的抗体或其功能片段，从而治疗所述受试者的癌症。任选地，癌症是淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。任选地，癌症是淋巴瘤。任选地，淋巴瘤是套细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤或伯基特氏淋巴瘤。任选地，淋巴瘤是套细胞淋巴瘤。任选地，淋巴瘤是滤泡淋巴瘤。任选地，淋巴瘤是弥漫性大b细胞淋巴瘤。任选地，淋巴瘤是边缘区淋巴瘤。任选地，淋巴瘤是伯基特氏淋巴瘤。
任选地，癌症是白血病。任选地，白血病是淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或毛细胞白血病。任选，白血病是淋巴母细胞白血病。任选地，白血病是慢性淋巴细胞白血病。任选地，白血病是毛细胞白血病。
任选地，癌症是骨髓瘤。任选地，骨髓瘤是多发性骨髓瘤。
任选地，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂。任选地，所述治疗剂是能够结合cd20抗原的嵌合单克隆抗体。任选地，治疗剂是利妥昔单抗。术语“利妥昔单抗”以惯例意义指针对通过atc代码l01xc02识别的蛋白cd20的单克隆抗体。
还提供治疗有需要的受试者的自身免疫疾病的方法。所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文所提供的抗体或其功能片段，从而治疗所述受试者的自身免疫疾病。任选地，自身免疫疾病是类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、肾小球肾炎、舍格伦综合征或自身免疫性溶血性贫血。任选地，自身免疫疾病是类风湿性关节炎。任选地，自身免疫疾病是全身性红斑狼疮。任选地，自身免疫疾病是多发性硬化症。任选地，自身免疫疾病是肾小球肾炎。任选地，自身免疫疾病是舍格伦综合征。任选地，自身免疫疾病是自身免疫性溶血性贫血。任选地，所述方法还包括向受试者施用第二治疗剂。
在另一个方面中，提供一种抑制细胞增殖的方法。所述方法包括将细胞与如本文所提供的baff-r抗体或其功能片段包括其实施方案接触，从而形成接触细胞。使baff-r抗体或其功能片段结合接触细胞上的baff-r蛋白，从而抑制细胞增殖。任选地，细胞是淋巴细胞。任选地，细胞是b细胞。任选地，细胞是癌细胞。任选地，细胞是淋巴瘤细胞。
在另一个方面中，提供一种产生抗人类baff-r抗体的方法。所述方法包括向小鼠施用如本文所提供的小鼠成纤维细胞，从而形成免疫baff-r小鼠。将免疫baff-r小鼠的脾细胞与人类骨髓瘤细胞融合，从而形成baff-r杂交瘤细胞。然后使baff-r杂交瘤细胞表达baff-r抗体，从而产生抗baff-r抗体。任选地，抗baff-r抗体是如本文所提供的抗体。
虽然本文示出并描述本各种实施方案和方面，但是本领域的技术人员显而易知此类实施方案和方面仅作为举例来提供。本领域的技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应了解可爱用本文所述的实施方案的各种替代方案。
抗体是具有复杂内部结构的大的复合分子(分子量是约150,000da或约1320个氨基酸)。天然抗体分子含有相同的两对多肽链，每对具有一个轻链和一个重链。每个轻链和重链继而由以下两个区组成：可变(“v”)区，其涉及结合靶抗原；和恒定(“c”)区，其与免疫系统的其他组成部分相互作用。轻链可变区和重链可变区聚集在3维空间中以形成结合抗原(例如，细胞表面上的受体)的可变区。在每个轻链可变区或重链可变区内，有三个短区段(长度平均为10个氨基酸)，称为互补决定区(“cdr”)。抗体可变结构域中的六个cdr(三个来自轻链并且三个来自重链)在3维空间中折叠在一起以形成实际抗体结合位点(互补位)，其接到靶抗原(表位)上。cdr的位置和长度先前已由kabat,e.等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,u.s.departmentofhealthandhumanservices,1983,1987定义。不含在cdr中的可变区的部分称为框架(“fr”)，其形成cdr的环境。
术语抗体根据其在本领域中通常已知的含义使用。抗体例如呈完整的免疫球蛋白存在。但是，可使用一个或多个功能抗体片段，不管本文何时描述术语一个或多个抗体。例如，可通过用各种肽酶进行消化来产生许多良好表征的功能抗体片段。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中的二硫键下方的抗体以产生f(ab)'2，即本身是通过二硫键接合至vh-ch1的轻链的fab二聚体。f(ab)'2可在温和条件下还原以打破铰链区中的二硫键，从而将f(ab)'2二聚物转化为fab'单体。fab'单体基本上是具有铰链区的一部分的fab(参见fundamentalimmunology(paul编,第3版(1993))。虽然根据完整抗体的降解定义各种抗体片段，但是本领域的技术人员应认识到此类片段可以化学方法或通过使用重组dna方法来从头合成。因此，如本文所用，术语抗体是示例性的，并且通过全抗体的修饰产生的抗体片段、或使用重组dna方法(例如，单链fv)从头合成的那些、或使用噬菌体展示文库(参见例如，mccafferty等人,nature348:552-554(1990))识别的那些可如所述用于抗体。
为了制备单克隆抗体或多克隆抗体，可使用本领域已知的任何技术(参见例如，kohler和milstein,nature256:495-497(1975)；kozbor等人,immunologytoday4:72(1983)；cole等人,第77-96页,monoclonalantibodiesandcancertherapy(1985))。单克隆抗体(mab)指来源于单一克隆的抗体。用于产生单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)可适于产生本文所述的多肽的抗体。而且，转基因小鼠或其他生物体诸如其他哺乳动物可用于表达人源化抗体。可替代地，噬菌体展示技术可用于识别特异性结合至选定抗原的抗体和异聚fab片段(参见例如，mccafferty等人,nature348:552-554(1990)；marks等人,biotechnology10:779-783(1992))。
mab的表位是mab结合至其抗原的区域。如果两种抗体各自竞争性抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，那么两种抗体结合至相同或重叠表位。即，1x、5x、10x、20x或100x过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合达至少30％但是优选地50％、75％、90％或甚至99％，如竞争结合测定中所测量(参见例如，junghans等人,cancerres.50:1495,1990)。可替代地，如果抗原中的减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有相同表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有重叠表位。
配体是指能够结合至受体分子(例如，抗体)的试剂，例如多肽或其他分子。
标记或可检测部分是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理方式检测的组合物。例如，有用的标记包括32p、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在elisa中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质或可例如通过将放射性标记并入至与靶肽具有特异性反应的肽或抗体。可采用本领域中已知的用于将抗体与标记缀合的任何适当方法，例如使用hermanson,bioconjugatetechniques1996,academicpress,inc.,sandiego中所述的方法。
接触根据其简单普通的含义使用并且是指允许至少两个不同的物质(例如包括生物分子的化学化合物或细胞)变得足够近以反应、相互作用或物理碰触的过程。然而，应认识到，所得到的反应产物可以直接由所添加的试剂之间的反应产生或由可以在反应混合物中产生的来自一种或多种所添加的试剂的中间体产生。
术语接触可包括使两种物质反应、相互作用或物理碰触，其中所述两种物质可例如为如本文所述的抗体和baff-r蛋白。接触包括例如使如本文所述的人源化抗体与baff-r相互作用。
如本文所用，治疗(treating或treatment)病状、疾病或病症或者与病状、疾病或病症相关联的症状是指获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。有益或所需临床结果可包括但不限于：缓解或改善一个或多个症状或病状；减轻病状、病症或疾病的程度；稳定病状、病症或疾病的状态；预防病状、病症或疾病的发展；预防病状、病症或疾病的蔓延；延缓或减慢病状、病症或疾病进展；延缓或减慢病状、病症或疾病发作；改善或缓和病状、病症或疾病状态；以及好转，不管是部分还是全部。治疗还可意味延长受试者的存活，超过在不存在治疗的情况下预期的存活。治疗还可意味抑制病状、病症或疾病的进展，暂时减慢病状、病症或疾病的进展，但是在一些情况下，其涉及永久地停止病状、病症或疾病的进展。如本文所用，术语治疗(treatment、treat或treating)是指减少特征在于蛋白酶的表达的疾病或病状的一个或多个症状的作用或者特征在于蛋白酶的表达的疾病或病状的症状。因此，在公开的方法中，治疗可指确立的疾病、病状或者疾病或病状的症状的严重程度的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％减少。例如，如果与对照相比，受试者疾病的一个或多个症状减少10％，那么认为治疗疾病的方法是一种治疗。因此，与天然或对照水平相比，减少可为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或10％与100％之间的任何减少百分比。应理解，治疗不必指治愈或完全消除疾病、病状或者疾病或病状的症状。此外，如本文所用，对降低、减少或抑制的提及包括与对照水平相比10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的变化，并且此类术语可包括但不必包括完全消除。
术语多肽、肽和蛋白在本文可互换用于指氨基酸残基的聚合物，其中所述聚合物可缀合至不由氨基酸组成的部分。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。融合蛋白是指编码两个或更多个重组地表达为单一部分的单独蛋白序列的嵌合蛋白。术语肽基和肽基部分意指单价肽。
术语氨基酸是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后期修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即，结合至氢的α-碳、羧基、氨基和r基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这类类似物具有修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。术语非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸是指自然界中不存在的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。
氨基酸可以在本文中由其通常已知的三字母符号或由iupac-iub生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码来表示。
保守修饰的变体适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸。由于遗传密码的简并性，许多核酸序列将编码任何给定的蛋白。例如，密码子gca、gcc、gcg和gcu皆编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置上，密码子可以变成所描述的相应密码子中的任一个，而不改变所编码的多肽。所述核酸变异为沉默变异，其为一种经过保守修饰的变异。本文中编码多肽的每个核酸序列还说明每种可能的核酸沉默变异。技术人员将认识到在核酸(除了通常为甲硫氨酸仅有的密码子的aug和通常为色氨酸仅有的密码子的tgg)中的每个密码子都可以被修饰以便产生功能上一致的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异均暗含于每个描述的序列中。
至于氨基酸序列，本领域的技术人员将认识到，核酸、肽、多肽或蛋白质序列中改变、添加或缺失所编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或添加是保守性修饰变体，其中所述改变导致氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表在本领域中是熟知的。所述保守性修饰变体附加于并且不排除多态变体、种间同源物和等位基因。
以下八个组各自含有互为彼此的保守性取代的氨基酸：
1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；
2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；
3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；
4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；
5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；
6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；
7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；以及
8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)
(参见例如，creighton,proteins(1984))。
序列同一性百分比通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定，其中比较窗中的多核苷酸或多肽序列的部分与参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即空位)以用于两个序列的最佳比对。所述百分比通过以下进行计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语一致或百分比同一性是指当如使用以下序列比较算法或通过人工比对和目视检查所测量比较和比对与比较窗或指定区相比的最大对应性时，二或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，与例如多肽序列或多肽个别结构域的指定区具有60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)。然后据称此类序列大致上相同。这个定义还指测试序列的补体。任选地，该同一性存在于长度至少约50个核苷酸的区域，或更优选长度为100至500或1000或更多个核苷酸的区域。本说明书包括与seqidno:30-51中任一个大致上相同的多肽。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，将其与测试序列比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参比序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数或可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列相同百分比。
如本文所用，比较窗口包括涉及多个邻接位置中任一个的区段，所述邻接位置选自由例如具有约20至约600、约50至约200、或约100至约150个氨基酸或核苷酸的全长序列组成的组，其中在两个序列进行最佳比对之后，可将一个序列与具有相同数目的邻接位置的参考序列比较。比对用于比较的序列的方法为本领域中熟知的。例如可通过以下进行用于比较的序列的最佳比对：smith和waterman(1970)adv.appl.math.2:482c的局部同源性算法；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443的同源性比对算法；pearson和lipman(1988)proc.nat’l.acad.sci.usa85:2444的相似性方法研究；这些算法计算机实现(wisconsin遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta,遗传学计算机组,575sciencedr.,madison,wi)；或手动比对和目测检查(参见例如，ausubel等人.,currentprotocolsinmolecularbiology(1995supplement))。
合适于确定百分比序列同一性和序列类似性的算法的示例是blast和blast2.0算法，其分别描述于altschul等人(1977)nuc.acidsres.25:3389-3402和altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-410。用于执行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为w的短词来鉴定高分数序列对(hsp)，所述短词在与数据库序列中具有相同长度的词比对时匹配或满足某些正值的阈值分数t。t称为相邻字评分阈值(altschul等人，同上)。这些初始邻域词命中作为种子启动搜索，用以寻找含有它们的较长hsp。只要累积序列比对分值可以增加，那么字串命中则在两个方向上沿每个序列延伸。对于核苷酸序列，利用参数m(一对匹配残基的奖励分数，通常>0)和n(非配对残基的罚分，通常<0)计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积评分。字命中在每个方向上的延伸在下列情况时停止：累积比对评分由其达到的最大值降低数量x；由于一个或者多个负评分残基比对的积累而使累积评分降至0或者以下；或者达到任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定所述比对的灵敏度和速度。blastn程序(对于核苷酸序列)使用字长度(w)11、期望(e)10、m＝5、n＝-4和两条链比较作为默认。对于氨基酸序列，blastp程序使用如下默认值：字长为3，并且期望值(e)为10，和blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff(1989)proc.natl.acad.sci.usa89:10915)，比对(b)为50，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4，以及两条链都比较。
blast算法还执行两个序列之间的相似性的统计分析(参见例如，karlin和altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787)。blast算法提供的一种相似性测定是最小总和概率(p(n))，其表示通过两个核苷酸或者核酸序列之间偶然发生配对的概率。例如，如果在测试核酸与参比核酸的比较中，最小和概率小于约0.2、更优选地小于约0.01并且最优选地小于约0.001，认为核酸与参比序列相似。
两个核酸序列或多肽大致上相同的指示为：如下所述，由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽而产生的抗体具有免疫交叉反应。因此，多肽通常与第二多肽大致上相同，例如，在两种多肽仅因保守取代而不同的情况下。两个核酸序列大致上相同的另一个指示为：如下所述，两个分子或其补体在严格条件下互相杂交。两个核酸序列大致上相同的又另一指示为：相同引物可用于扩增序列。
当抗体中的氨基酸残基在抗体内占据与给定残基相同的基本结构位置时，它对应于给定残基。例如，如使用本领域中的适用方法所评定，当比较抗体中的所选残基占据与kabat位置48相同的基本空间或结构关系时，所选残基对应于位置48(根据如本文所述的kabat编号系统)。例如，可以比对比较抗体与本文所提供的抗体的最大序列同源性，并且可以确定与kabat位置48对齐的比对比较抗体中的位置对应于它。可替代地，代替如上文所述的一级序列比对(或除此之外)，还可以使用三维结构比对，例如，在比对比较抗体的结构与本文所提供的抗体和所比较的总体结构的最大对应性的情况下。在这种情况下，可以说在结构模型中占据与kabat位置48相同的基本位置的氨基酸是对应的。
术语分离当应用于蛋白时表示所述蛋白基本上不含与天然状态相关的其他细胞组分。它优选处于均相状态，但是它可以是干式溶液或水溶液。纯度和均匀性通常使用分析化学技术诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白是基本上纯化的。术语纯化的表示蛋白在电泳凝胶中基本上产生一条带。特别地，它意味蛋白至少85％纯，更优选至少95％纯，并且最优选至少99％纯。
短语特异性(或选择性)结合至抗体或与……特异性(或选择性)免疫反应在涉及蛋白质或肽时，是指确定在蛋白质和其他生物制剂的异质群体中的蛋白的存在的结合反应。因此，在特指的免疫测定条件下，指定抗体与特定蛋白的结合至少两倍于背景，并且不以显著量实质上结合至样品中存在的其他蛋白。通常，特异性或选择性反应将是至少两倍背景信号或背景噪声，并且更通常大于10倍至100倍背景。
如本文所用，细胞是指进行足以保存或复制其基因组dna的代谢或其他功能的细胞。细胞可以通过本领域熟知的方法识别，所述方法包括例如完整膜的存在、特定染料的染色、产生子代的能力或者在配子的情况下与第二配子组合以产生活后代的能力。细胞可包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和来源于植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如，蛾)和人类细胞。
如本文所定义，关于蛋白-抑制剂(例如，本文所提供的baff-r抗体)相互作用的术语抑制(inhibition、inhibit、inhibiting等)意指相对于不存在抑制剂(例如，baff-r抗体)的情况下蛋白的活性或功能负面地影响(例如，降低)蛋白的活性或功能(例如，降低baff-r的活性)。抑制包括减少疾病或疾病的症状(例如，癌症或自身免疫疾病)。因此，抑制包括、至少部分包括、部分包括或完全包括阻断刺激，降低、预防、延缓活化，失活，脱敏或下调信号转导或酶活性或蛋白的量。类似地，抑制剂是抑制baff-r活性的化合物或蛋白，例如通过结合、部分或完全阻断、减少、预防、延缓、失活、脱敏或下调活性(例如，baff-r信号传导活性)。
本文所提供的试剂，例如抗体，常以包含活性治疗剂和多种其他药学上可接受的组分的药物组合物的形式施用。参见,remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第22版edition,loydv.allen等人编,pharmaceuticalpress(2012).优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。所述组合物还可根据所要制剂而包括药学上可接受的无毒载剂或稀释剂，它们定义为通常用于配制用于动物或人类施用的药物组合物的媒剂。对稀释剂进行选择以免影响组合的生物活性。此类稀释剂的示例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(ringer'ssolution)、右旋糖溶液和亨克氏溶液(hank'ssolution)。此外，药物组合物或制剂也可包括其他载剂、佐剂或无毒非治疗性非免疫原性稳定剂等。
可以施用组合物用于治疗性或预防性治疗。在治疗性应用中，将组合物以治疗有效剂量的形式向罹患疾病(例如，癌症)的患者施用。对这种使用有效的量将取决于疾病的严重程度和患者健康的一般状态。可以根据患者所需和耐受的剂量和频率施用组合物的单次或多次施用。患者或受试者包括人类和其他动物，特别是哺乳动物。因此，所述方法可适用于人类疗法和兽医学应用。任选地，患者是哺乳动物、灵长类动物或人类。
适用于口服施用的制剂可由以下组成：(a)液体溶液，诸如有效量的悬浮于稀释剂诸如水、盐水或peg400中本文所提供的抗体；(b)胶囊、小药囊或片剂，各自含有预定量的活性成分，以液体、固体、颗粒或明胶的形式；(c)适当液体中的混悬液；以及(d)合适的乳剂。片剂形式可包括以下一个或多个：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、土豆淀粉、微晶纤维素、明胶、胶态二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿润剂、防腐剂、调味剂、染料、崩解剂以及药学上相容的载剂。锭剂形式可在例如蔗糖的调味剂中包含活性成分并且软锭剂可在惰性基质中包含活性成分，惰性基质的示例诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳液、凝胶等，其中除所述活性成分外还包含本领域已知的载剂。
药物组合物也可包括大型缓慢代谢的巨分子，诸如蛋白、多糖(诸如聚葡萄胺糖)、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(诸如乳胶官能化琼脂糖(tm)、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(诸如油滴或脂质体)。另外，这些载剂可充当免疫刺激性试剂(即佐剂)。
用于直肠施用的合适的制剂包括例如栓剂，其由包装的核酸与栓剂基质组成。合适的栓剂基质包括天然或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，还可能使用明胶直肠胶囊，其由所选的化合物与基质的组合组成，所述基质包括例如液体甘油三酯、聚乙二醇和石蜡烃。
适用于肠胃外例如像通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、瘤内、皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。组合物可例如通过静脉内输注、口服、局部、腹膜内、膀胱内或鞘内施用。肠胃外施用、口服施用以及静脉内施用是优选的施用方法。化合物的制剂可以单位剂量或多剂量密封容器(诸如安瓿和小瓶)的形式呈现。
注射溶液和混悬液可从先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。如上所述，通过核酸转导的用于离体治疗的细胞也可以静脉内或肠胃外施用。
药物制剂可呈单位剂型。在此类形式中，制剂被细分成含有适当量的活性组分的单位剂量。单位剂型可为包装制剂，所述包装含有离散量的制剂，诸如在小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉剂。此外，单位剂型可为胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂自身，或它可为适当数目的呈包装形式的任何这些单位剂型。如果需要，组合物还可含有其他相容的治疗剂。
组合施用考虑使用单独的制剂或单一药物制剂共同施用，以及以任何顺序连续施用，其中优选存在两种(或所有)活性剂同时发挥其生物活性的时间段。
本文所提供的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者为人类还是动物、所施用的其他药物和治疗为预防性还是治疗性。然而，本领域的普通技术人员应立即认识到适当和/或等效剂量考虑用于治疗和预防癌症的批准组合物的剂量以便指导。
术语疾病或病状是指能够用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的患者或受试者的状态或健康状态。任选地，疾病是癌症(例如肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、子宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如，麦克尔细胞癌)、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳癌、成神经细胞瘤)。疾病可以是自身免疫疾病、炎性疾病、癌症、感染、代谢疾病、发育疾病、心血管疾病、肝病、肠病、内分泌疾病、神经疾病或其他疾病。
如本文所用，术语癌症是指哺乳动物中存在的所有类型的癌症、赘瘤或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、癌和肉瘤。可用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、子宫颈癌、结肠癌、食管癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳癌(例如，三阴性乳癌、er阳性乳癌、er阴性乳癌、化疗抗性乳癌、赫赛汀抗性乳癌、her2阳性乳癌、多柔比星抗性乳癌、他莫昔芬抗性乳癌、导管癌、小叶癌、原发性乳癌、转移性乳癌)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如，肝细胞癌)、肺癌(例如，非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌瘤、肉瘤)、多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、前列腺癌、去势抗性前列腺癌、乳癌、三阴性乳癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如，头部、颈部或食管)、结肠直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、b细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。额外示例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食管癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或髓母细胞瘤、霍奇金氏病(hodgkin'sdisease)、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌瘤、泌尿膀胱癌、恶化前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、成神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高血钙症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺赘瘤、髓状甲状腺癌、髓状甲状腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌、佩吉特乳头病(paget'sdiseaseofthenipple)、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
术语白血病是指造血器官的进行性、恶性疾病，并且通常通过白细胞及其前体在血液和骨髓中的异常增殖和生长来表征。通常根据(1)疾病的持续时间和特征—急性或慢性；(2)所涉及的细胞类型；骨髓(骨髓性)、淋巴(淋巴性)或单核细胞性；以及(3)血液中异常细胞数量的增加或非增加-白血病性或非白血病性(亚白血病性)在临床上对白血病进行分类。可用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性白血病包括例如：急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、成人t-细胞白血病、非白血性白血病、白血性白血病、嗜碱性白血病、母细胞白血病、牛白血病、慢性髓细胞白血病、皮肤白血病、干细胞性白血病，嗜酸细胞性白血病、格罗斯白血病(gross'leukemia)、毛细胞性白血病、成血性白血病、成血细胞性白血病、组织细胞性白血病、干细胞白血病、急性单核细胞白血病、白细胞减少白血病、淋巴性白血病、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、淋巴性白血病、淋巴白血病、淋巴肉瘤细胞白血病、肥大细胞白血病、巨核细胞白血病、小原粒型白血病、单核细胞白血病、成髓细胞白血病、髓细胞白血病、骨髓性粒细胞性白血病、骨髓单核细胞性白血病、内格利白血病(naegelileukemia)、浆细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、瑞登氏细胞性白血病(riedercellleukemia)、希林氏性白血病(schilling’sleukemia)、干细胞白血病、亚白血病性白血病或未分化细胞性白血病。
如本文所用，术语转移和转移性癌症可以互换使用并且是指来自一个器官或另一个非相邻器官或身体部位的增殖性疾病或病症(例如癌症)的蔓延。癌症发生在起始部位，例如乳腺，所述部位被称为原发性肿瘤，例如原发性乳癌。原发性肿瘤或起始部位中的一些癌细胞具有穿透并渗透局部区域中周围正常组织的能力和/或穿透淋巴系统或血管系统壁通过系统循环到体内其他部位和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二临床上可检测的肿瘤被称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，假定转移性肿瘤及其细胞与起始肿瘤的那些相似。因此，如果肺癌转移到乳腺，那么所述部位的继发性肿瘤由异常的肺细胞组成而不是异常的乳腺细胞。乳腺中的继发性肿瘤被称为转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指受试者患有或已患有原发性肿瘤并且具有一种或多种继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或伴有非转移性癌症的受试者是指受试者患有原发性肿瘤但不具有一种或多种继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌是指具有原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤病史并且在第二位置或多个位置(例如在乳腺中)具有一个或多个继发性肿瘤的受试者的疾病。
与疾病(例如，癌症(例如白血病、淋巴瘤、b细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤))相关联的物质或物质活性或功能的情境中术语相关联或与……相关联意指所述疾病(例如癌症(例如白血病、淋巴瘤、b细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤))(全部或部分)由所述物质或物质活性或功能引起，或者所述疾病的症状(全部或部分)由所述物质或物质活性或功能引起。
如本文所用，自身免疫疾病是指由受试者的免疫系统例如对抗通常存在于受试者体内的物质、组织和/或细胞的免疫反应改变引起的疾病或病症。自身免疫疾病包括但不限于关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、幼年特发性关节炎、硬皮病、全身性硬皮病、多发性硬化症、全身性红斑狼疮(sle)、重症肌无力、幼年型糖尿病、1型糖尿病、格-巴二氏综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、强直性脊柱炎、牛皮癣、舍格伦综合征、血管炎、肾小球肾炎、自身免疫甲状腺炎、白塞氏病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、大疱性类天疱疮、结节病、牛皮癣、鱼鳞病、格雷氏眼病、炎性肠病、艾迪生氏病、白癜风、哮喘和过敏性哮喘。
如本文所用，炎性疾病是指与炎症异常或改变相关联的疾病或病症。炎症是由免疫系统引发的生物反应，作为响应于病原体、受损细胞或组织或刺激物的愈合过程的一部分。慢性炎症可引起多种疾病。炎性疾病包括但不限于动脉粥样硬化、过敏症、哮喘、类风湿性关节炎、移植排斥、乳糜泻、慢性前列腺炎、炎性肠病、盆腔炎和炎性肌病。
人源化抗体是一种遗传工程抗体，其中至少一个来自小鼠抗体(“供体抗体”，其也可以是大鼠、仓鼠或其他非人类物种)的cdr(或其功能片段或变体)被移植到人类抗体框架(“受体抗体”)。任选地，移植多于一个小鼠cdr(例如，移植所有六个小鼠cdr)。受体抗体的序列可以是例如成熟人类抗体序列(或其片段)、人类抗体序列(或其片段)的共有序列或种系区序列(或其片段)。因此，人源化抗体可以是具有一个或多个来自供体抗体的cdr和可变区框架(fr)的抗体。fr可以形成人类抗体内的恒定区和/或可变区的一部分。此外，为了保留高结合亲和力，人类受体序列中的氨基酸可以被来自供体序列的对应氨基酸置换，例如，其中(1)氨基酸在cdr中或者(2)氨基酸在人类框架区中(例如，氨基酸紧邻一个cdr)。参见美国专利号5,530,101和5,585,089，所述专利以引用方式并入本文，提供人源化抗体的构建的详细说明。虽然人源化抗体常并入所有六个来自小鼠抗体的cdr(例如，如kabat所定义，但也常包括高变环h1，如chothia所定义)，但是它们也用较少小鼠cdr和/或不太完整的小鼠cdr序列(例如，cdr的功能片段)制成(例如，pascalis等人,j.immunol.169:3076,2002；vajdos等人,journalofmolecularbiology,320:415-428,2002；iwahashi等人,mol.immunol.36:1079-1091,1999；tamura等人,journalofimmunology,164:1432-1441,2000)。
通常，如本文所提供的人源化抗体可包括(i)轻链可变区，其包含至少一个来自小鼠抗体的cdr(常常是三个cdr)(在本文中也称为小鼠cdr)和人类可变区框架；以及(ii)重链可变区，其包含至少一个来自小鼠抗体的cdr(常常是三个cdr)和人类可变区框架(fr)。轻链可变区框架和重链可变区框架(fr)可各自是成熟人类抗体可变区框架序列(或其片段)、种系可变区框架序列(与j区序列组合)(或其片段)或人类抗体可变区框架序列(或其片段)的共有序列。任选地，人源化抗体包括如(i)中所述的轻链可变区、如(ii)中所述的重链可变区以及轻链人类恒定区和重链人类恒定区。
嵌合抗体是其中小鼠(或其他啮齿动物)抗体的可变区与人类抗体的恒定区组合的抗体；通过基因工程构建嵌合抗体是众所周知的。此类抗体保留小鼠抗体的结合特异性，同时为约三分之二的人类序列。存在于小鼠抗体、嵌合抗体和人源化抗体中的非人类序列的比例表明，嵌合抗体的免疫原性介于小鼠抗体与和人源化抗体之间。相对于小鼠抗体可具有降低的免疫原性的其他类型的遗传工程抗体包括使用噬菌体展示方法(dower等人,wo91/17271；mccafferty等人,wo92/001047；winter,wo92/20791；和winter,febslett.23:92,1998，其各自以引用方式并入本文)或使用转基因动物(lonberg等人,wo93/12227；kucherlapatiwo91/10741，其各自以引用方式并入本文)制成的人类抗体。
其他设计人源化抗体的方法也可用于实现与美国专利号5,530,101和5,585,089中的方法相同的结果。例如，如tan等人j.immunol.169:1119,2002和美国专利号6,881,557中所述的超人源化或studnicak等人,proteineng.7:805,1994的方法。此外，其他生产遗传工程免疫原性降低的单克隆抗体的方法包括重塑(reshaping)、超嵌合(hyperchimerization)和镶饰/表面重修(veneering/resurfacing)，如例如vaswami等人,annalsofallergy,asthmaandimmunology81:105,1998；roguska等人proteineng.9:895,1996；以及美国专利号6,072,035和5,639,641中所述。
公开了材料、组合物和组分，其可以用于所公开的方法和组合物的产物、可以与所述产物结合使用，可以用于制备所述产物；以及所公开的方法和组合物的产物。本文公开了这些材料及其他材料，并且应理解，若公开了这些材料的组合、子组、相互作用、群组等，而没有明确地具体提及各种个体和集体组合的每一种组合以及这些化合物的排列方式，则每种情况均具体地涵盖并描述在本文中。例如，如果公开并讨论了方法并且讨论了可以对包括所讨论的方法的多个分子进行的多种修改，除非明确地相反指示，否则明确涵盖了所述方法的每一种组合和排列以及可能的修改。同样地，还具体地涵盖并公开了这些分子的任何子组或组合。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果有多种额外步骤可以进行，则应理解，这些额外步骤中的每一个可与所公开的方法的任何具体方法步骤或方法步骤的组合一起进行，并且具体地涵盖每种此类组合或组合的子组并应将其视为得到公开。
以下实施例意图进一步说明本文所描述的方法和组合物的某些方面，并且不意图限制权利要求书的范围。
实施例
实施例1.天然折叠重组蛋白的新型baff受体抗体在体内消除药物抗性人类b细胞恶性肿瘤。
在细菌中产生的用于开发mab的常规重组免疫原蛋白缺乏翻译后修饰并且是简单折叠的，因为与真核生物相比，原核生物缺乏伴侣蛋白和氧化环境。因此，此类蛋白的构象结构可能与对应质膜锚定的天然蛋白不同。此外，可以针对脱靶结构域(诸如靶蛋白的跨膜结构域或细胞内结构域)而产生抗体。如本文所述，应用产生针对在真核细胞上表达的天然折叠糖基化免疫原的mab的策略。具体地，人类baff-r作为小鼠成纤维细胞上的天然蛋白，并且使用工程化细胞克隆作为小鼠中的免疫原。本文描述新型mab的产生，所述mab在体外特异性结合并溶解人类恶性b细胞系和原发性淋巴瘤，并且在体内抑制异种肿瘤模型中的药物抗性淋巴瘤细胞系的生长。
材料和方法
动物、细胞系和远代人类肿瘤样品。用于抗体开发的balb/c小鼠和nodscidγ(nsg)繁殖对购自thejacksonlaboratory(barharbor,me)。nsg繁殖群由希望之城动物资源中心维护。根据制度指南将小鼠圈养在无病原体的动物设施中。所有动物研究皆由实验动物管理和使用委员会(institutionalanimalcareandusecommittee)批准(iacuc：15020)。jeko-1、su-dhl-6、raji、u266和rl购自atcc(manassas,va)。z-138系由michaelwang博士(md安德森癌症中心(mdandersoncancercenter))提供。jianguotao博士(南佛罗里达大学)开发并提供依鲁替尼抗性sp49-ir系。通过用递增剂量的依鲁替尼处理细胞来建立依鲁替尼抗性sp49细胞系(sp49-ir)。亲本sp49的ic50为5nm，而sp49-ir的ic50为>100nm。在100nm依鲁替尼下，约5％的sp49细胞有活力，而>90％的sp49-ir细胞有活力。人类nk-92176v细胞购自conkwest公司(sandiego,ca)。对于人类血液和肿瘤样品，根据机构审查委员会(institutionalreviewboard)批准的方案(irb：2005-0656)，从md安德森癌症中心的淋巴瘤卫星组织库(lymphomasatellitetissuebank)以冷藏保存的在10％dmso中的活细胞悬浮液的形式获得非培养的原代人类淋巴瘤。原代患者样品包括来自具有套细胞淋巴瘤(mcl)或慢性淋巴细胞白血病(cll)的患者的白细胞除去法或血液，以及来自具有弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)或滤泡淋巴瘤(fl)的患者的切除淋巴结。白细胞除去法或血液的每个样品中的肿瘤细胞的范围为80％至98％，并且淋巴结活组织检查的每个样品中的肿瘤细胞的范围为50％至60％。外周血单核细胞(pbmc)由希望之城的迈克尔阿米尼输血医学中心(michaelaminitransfusionmedicinecenter)提供(irb：15283)。
表达人类baff-r的小鼠成纤维细胞的产生。人类baff-r(hbaff-r)cdna来自人类b细胞，并在pegfp-n1载体(takara/clotech,mountainview,ca)上与gfp基因框内克隆。针对ncbi基因序列数据库确认hbaff-rcdna序列(基因id：115650)。随后将编码hbaff-r-gfp融合体的cdna克隆到慢病毒基因递送系统(plenti6/v5-destgateway载体试剂盒,lifetechnologies,grandisland,ny)中，以当转导到小鼠成纤维(l)细胞时产生hbaff-r-gfp融合蛋白。由分选的gfp阳性l细胞建立单细胞克隆，并且将表达(h)baff-r-gfp的l细胞克隆d2c用于进一步研究。
产生抗体的杂交瘤。通过每三天在足垫皮下注射一次持续五次，用d2c细胞免疫两只6周龄balb/c小鼠。从两只小鼠获得血液样品以通过elisa测量针对d2c的血清抗体。在第20天收获脾组织。将收获的脾细胞与sp2/0骨髓瘤融合以建立杂交瘤，并且使用d2c或亲本l细胞涂布的盘进行elisa筛选。免疫和杂交瘤程序在md安德森癌症中心的抗体核心设施进行。
嵌合抗体产生。将来自编码抗体轻链和重链的可变区的选定杂交瘤的cdna工程化到含有相应的人类igg1恒定区的表达载体上。根据制造商的指导，将载体共转染到freestyle293表达系统(lifetechnologies,carlsbad,ca)中。根据制造商的指导，通过hitrap蛋白a亲和色谱柱(gehealthcare,marlborough,ma)纯化培养上清液中的抗体。
细胞毒性测定。靶细胞(l细胞、人类肿瘤品系、原代患者样品)用铬-51(51cr,perkinelmer,waltham,ma)标记以用于51cr释放测定。简而言之，将抗体和效应物(nk细胞或补充血清标准品[sigmaaldrich,st.louis,mo])添加到标记的靶细胞中并孵育至多18小时。从pbmc(nk细胞富集试剂盒,stemcelltechnologies,vancouver,canada)富集nk细胞。用wizardautomaticγ计数器(perkinelmer)检测释放到上清液中的51cr。
jeko-1-cd20-ko的产生。根据制造商的指导，使用cd20-crispr/cas9和hdr质粒系统(santacruzbiotechnology,santacruz,ca)产生facs分选的稳定jeko-1-cd20-ko。通过流式细胞术和蛋白质印迹验证cd20敲除。
体内研究。对于肿瘤模型，建立稳定的表达荧光素酶的肿瘤品系以用于小鼠模型中的生物发光成像。简而言之，通过慢病毒基因递送系统(plenti7.3/v5-destgateway载体试剂盒,lifetechnologies,carlsbad,ca)将荧光素酶基因引入到肿瘤品系中。通过剂量滴定确定每种肿瘤细胞系的每只小鼠的最小致死剂量。静脉(iv)注射肿瘤细胞，并且通过在体内生物发光成像来监测小鼠的最小肿瘤剂量以确保移植。最小致死肿瘤剂量为：1×106个jeko-1、5×105个rs4；11、5×105个jeko-1-cd20-ko或2.5×104个z-138细胞。
生物发光成像：用异氟烷麻醉小鼠，并且在成像前10分钟通过腹膜内(ip)注射施用150mg/kgd-荧光素(lifetechnologies,carlsbad,ca)。在amix成像系统(spectralinstrumentsimaging,tucson,az)上进行成像。
抗体研究：在四次的每五天一次治疗之前三天，对小鼠(每组n＝5)进行iv肿瘤攻击。处理为300μliv注射：200μg处理抗体、10×106个效应人类nk-92-176v细胞和5×104iuil-2(prometheuslaboratories,sandiego,ca)。对照组接受相同体积的用对照抗体或不用抗体和/或nk细胞的注射。每周进行生物发光成像直至80天。在肿瘤攻击后追踪存活直至100天。
结果
针对人类baff-r的单克隆抗体的产生。为了产生针对baff-r的生物学相关表位的治疗性抗体，使用真核细胞表面表达系统，其中内源细胞表面蛋白以其天然构象伴有适当的翻译后修饰而呈现。将小鼠成纤维(l)细胞克隆工程化成表达细胞表面gfp标记的人类baff-r。产生表达baff-r的l细胞克隆并表征其gfp表达(图1a)。根据图7a中的方法和免疫方案，扩大克隆d2c并成功用于免疫balb/c小鼠。
在产生并筛选杂交瘤克隆后，识别出四个克隆(53、55、67和90)产生特异性结合表达baff-r但不是亲本的l细胞的抗体(图7b)。所有四个克隆的上清液都含有以剂量依赖性方式结合表达baff-r的mino细胞系(mcl)的抗体。在baff-r阴性对照细胞系293t中未检测到抗体结合(图8)。
通过蛋白a亲和色谱纯化来自四份杂交瘤上清液的抗体。纯化的抗体以剂量依赖性方式结合mino细胞(图9)，以及其他人类mcl系，包括jeko-1、rec-1和依鲁替尼抗性jvm-13和z-138(图1b)。
四种抗体的互补决定区(cdr)的分析显示，克隆53、55和67具有几乎相同的序列，而克隆90是独特的。因此，选择克隆55和90用于进一步研究。在高(2μg/106个细胞)和低(0.05μg/106个细胞)浓度下，克隆55和90均有效结合jeko-1(mcl)、su-dhl-6(dlbcl)、raji(伯基特淋巴瘤)和rl(fl)(图10)。
针对人类baff-r的嵌合mab在体外和体内均诱导抗肿瘤作用。将克隆55和90进一步发育成其相应的含有人类igg1恒定区(称为c55和c90)的嵌合mab。嵌合抗体保留了与表达baff-r的l细胞的特异性剂量依赖性结合(图1c)。c55和c90与alexafluor488缀合，并且表现出与非霍奇金淋巴瘤(nhl)系jeko-1、su-dhl-6、raji和rl的直接结合(图1d)。重要的是，嵌合mab易于结合mcl、dlbcl和fl患者原代肿瘤样品(图1e和图11)。
c55和c90对表达baff-r的细胞和jeko-1特异性引发抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，但对baff-r阴性l细胞和baff-r阴性人类多发性骨髓瘤系u266不引发(图2a、图12)。相反，抗体在体外不引发补体依赖性细胞毒性(cdc，图2b)。细胞毒性需要添加nk细胞，如针对su-dhl-6、raji和rl淋巴瘤细胞系所示(图2c和图13)，表明adcc为抗体介导的细胞毒性的主要机制。重要的是，嵌合抗体引发针对原代患者肿瘤样品的adcc(图3a)。
抗体以剂量依赖性方式抑制baff/baff-r结合(图14)，表明肿瘤细胞中baff/baff-r存活信号传导的潜在破坏。此外，c55和c90在结合baff-r时表现出有限的内化(图15)。
在体内，用荧光素酶敲入jeko-1mcl细胞系攻击nsg小鼠，然后进行抗体处理。治疗遵循图4a中的方案。与单独pbs或nk细胞对照组相比，接受c55或c90的小鼠显示出显著的肿瘤生长延迟(图4b)。类似地，c55和c90也显著延迟rs4；11(急性淋巴母细胞白血病，all)攻击nsg小鼠中的肿瘤生长，而利妥昔单抗或对照没有抑制(图4c)。
嵌合mab在体外和体内诱导针对药物抗性淋巴瘤的有效抗肿瘤作用。针对先前用利妥昔单抗治疗的患者的原代cll(n＝3)和mcl(n＝2)样品进一步测试抗体。所有五个原代样品均对通过以c55和c90的adcc的杀死敏感，表明它们对暴露于利妥昔单抗后临床上有进展的肿瘤的有效性(图3b)。
为了产生药物抗性淋巴瘤的模型，使用crispr/hdr系统产生稳定的jeko-1的cd20敲除(ko)克隆。通过流式细胞术和蛋白质印迹证实cd20-ko克隆不存在cd20表面表达(图5a以及图16a和图16b)，并且通过流式细胞术证实存在baff-r表面表达(图16c)。jeko-1-cd20-ko克隆25被选择用于进一步研究，其保留对c55介导和c90介导的adcc的敏感性，但对通过抗cd20利妥昔单抗介导的细胞毒性不敏感(图5b)。
作为药物抗性淋巴瘤的第二模型，针对天然依鲁替尼抗性人类mcl系z-138和已在体外诱导对依鲁替尼抗性的诱导依鲁替尼抗性mcl系sp49-ir测试baff-rmab的adcc(参见方法)。用针对两种依鲁替尼抗性品系的抗体观察到显著的体外adcc(图5c)。
最后，在体内用jeko-1-cd20-ko肿瘤细胞进行iv攻击后三天，nsg小鼠(每组n＝5)接受baff-r抗体处理(c55或c90)或利妥昔单抗，如方法中所述并根据图4a中的方案。第20天的生物发光成像显示对照和利妥昔单抗处理的小鼠具有显著的肿瘤负荷，但在baff-r抗体处理组中没有可见的肿瘤(图6a)。监测无肿瘤和长期总体存活证实baff-r抗体(但不是利妥昔单抗)的显著抗肿瘤作用(图6c)。类似地，与对照(仅pbs或nk)相比，用任一baff-r抗体处理携带依鲁替尼抗性z-138肿瘤小鼠后观察到显著作用(图6b-c)。
baff-rmab也结合正常b细胞。当针对正常pbmc进行测试时，如所预期，抗baff-r抗体c90表现出对b细胞的特异性结合，而不染色任何t细胞、nk细胞、粒细胞或单核细胞(图17)。在纯化的b细胞上验证阳性染色结果(图18)。同样，纯化的t细胞、nk细胞和设门骨髓细胞显示无结合。
扩大我们的范围，免疫组织化学研究显示我们的抗体在扁桃体和脾样品上的阳性染色，而所有其他重要器官包括心脏、肺、肾和脑不受影响(图19a和图19b)。
讨论
所提供的baff-rmab作为针对多种b细胞肿瘤类型(包括nhl、cll和all)的单一药剂引发强大的体内抗肿瘤作用。此外，抗体根除已建立的肿瘤，这在体内导致长期的无肿瘤存活。
baff-rmab的显著特征可能是由于用于产生它们的方法。所提供的方法是将人类bafff-r表达为小鼠成纤维细胞上的天然表面蛋白以用于免疫，增加呈现天然折叠糖基化免疫原的可能性。因此，很可能的是，抗体结合与所述的其他抗体不同的可接近的人类baff-r表位。因此，说明了用于产生针对能够在体内特异性结合、溶解和抑制b细胞肿瘤的、天然折叠的、真核糖基化人类baff-r的单克隆抗体的技术策略。结果表明我们的mab的主要抗肿瘤机制是adcc，因为体外活性除了mab之外还需要nk细胞(图2)；没有观察到cdc的证据。两种抗体均能够竞争性地抑制baff配体与baff-r的结合(图14)。
一种临床上相关的利妥昔单抗抗性机制是cd20的下调。这种药物抗性的现象用crispr编辑的mcl系jeko-1建模，jeko-1缺乏cd20。c55或c90(但不是利妥昔单抗处理)对这种品系的和类似地对天然依鲁替尼抗性z-138mcl的显著体内抗肿瘤作用表明对抗药物抗性淋巴瘤的功效(图5)。结合这些抗体对来自先前用利妥昔单抗处理并且响应于利妥昔单抗有进展的淋巴瘤患者的原代肿瘤的体外细胞毒性，这些数据表明c55和c90是克服药物抗性的潜在治疗策略(图3)。
实施例2.人源化baff-rmab。
将嵌合抗体克隆90人源化，同时保留其结合特异性和细胞毒性作用。通过对cdr和预测结构的计算分析，产生重链的三种变体和轻链的三种变体，其与人类抗体具有不同程度的相似性。从人源化重链和轻链构建了共计九种组合变体。所有这些变体均证明与亲本嵌合抗体的结合亲和力相当，其中kd值范围为2.6至5.0nm(表1)。
表1.人源化baff-r抗体变体的结合亲和力
进一步评定九种候选抗体，并且确定主要候选者。观察到人源化抗体的结合对baff-r具有特异性，并且所有都具有相似的以剂量依赖性方式的相对结合(图20a)。另外，评估了人源化抗体的adcc作用。同样，发现人源化候选物保持其特异性细胞毒性，并且与嵌合对照和利妥昔单抗相比同样良好表现(图20b)。
选择人源化克隆90变体4和5用于进一步体外测试。将人源化抗体变体生物素化并用荧光链霉抗生物素蛋白探针可视化。评估了它们与各种非霍奇金氏淋巴瘤、淋巴母细胞白血病和多发性骨髓瘤品系的结合，包括jeko-1、ly-10、mec-2、rl、rs4、raji、z138和u266(图22a)。流式细胞术结果显示与这些细胞系中的每一种的显著结合。用针对正常pbmc的人源化变体进行的进一步流动分析显示结合的特异性。当评估正常健康pbmc中粒细胞、单核细胞、b细胞、t细胞和nk细胞的结合时，抗体仅结合b细胞群(图22b)。
进一步评估了这两种变体的引发adcc的能力。在铬摄取一段时间后，向jeko-1、z138和rs4系施用不同的浓度抗体。将细胞和抗体与效应nk细胞一起温育。处理后6小时分析上清液(图21a)。抗体对肿瘤品系具有明显的细胞毒性作用，并且在每10倍稀释的情况下显示剂量依赖性。结果与利妥昔单抗的结果相当，但也可见于rs4急性淋巴母细胞淋巴瘤，其中利妥昔单抗不具有活性。用ly-10、mec-2、rl和raji进行的进一步测定(图21b)继续说明人源化抗体处理的效力。发现的所有结果均与目前使用利妥昔单抗的常规治疗相当。
实施例3.嵌合抗原受体t细胞。
将具有高结合亲和力和生物活性的抗体用于构建嵌合抗原受体(car)t细胞以用于体内研究。将重链和轻链可变结构域的dna序列排列成单链(sfv)形式，并将其与4-1bb基序一起工程化为t细胞信号传导结构域(δ链)。将工程化的car基因与通过慢病毒共表达的gfp一起引入到纯化的健康供体来源的cd8+t细胞中。针对gfp的表达对car-t细胞进行分选，并在体外用cd3和cd28珠粒扩大以用于动物研究。用表达jeko-1mcl系(jeko-1-luci)的荧光素酶攻击nsg小鼠。使肿瘤发展并通过生物发光成像进行监测，直至观察到可见的肿瘤细胞群；肿瘤攻击后约9天。在肿瘤攻击后第9天和第15天向小鼠施用两剂量5×106个car-t细胞(抗baff-r和抗cd19)。对照组接受未处理的t细胞或盐水(pbs)。密切监测小鼠并每3天成像以跟踪肿瘤发展从而评估car-t疗法的治疗性抗肿瘤作用。
针对原代患者肿瘤样品进一步评估人源化抗baff-rmab的结合和细胞毒性。用大多数表达baff-r的肿瘤细胞表征三个套细胞淋巴瘤患者样品。流式细胞术结果显示由我们的人源化抗体结合的这些原代肿瘤细胞的不同群体(图22a)。此外，与对照相比，对相同原代肿瘤样品进行的铬释放细胞毒性测定显示高特异性杀伤。结果与利妥昔单抗的作用相当，并且与较早开发的嵌合抗体一致(图22b)。通过评估与正常pbmc的结合来确定人源化抗体的细胞型特异性。对于包括粒细胞、单核细胞、t细胞和nk细胞的主要pbmc组没有观察到明显的结合。b细胞群是唯一可检测的由所述抗体结合的群体(图23)。测定结果也与先前表征的嵌合抗体一致。
将抗baff-rmab进一步用于产生嵌合抗原受体(car)t细胞。实验利用工程化为单链(sfv)形式的嵌合c55可变区。将抗baff-rc55sfv连接到含有4-1bb基序的t细胞受体信号传导结构域，并成功地引入到从pbmc分离的健康正常人类供体cd8+t细胞中。将car-t细胞施用到具有明显肿瘤负荷的荷瘤小鼠(图24)。与盐水或非工程化t细胞对照组相比，用抗baff-rcar-t细胞处理的小鼠具有显著的肿瘤清除率。另外，我们的car-t细胞的抗肿瘤作用与抗cd-19car-t处理组的抗肿瘤作用相当。
将嵌合抗baff-r抗体c90用若干变体人源化。人源化过程考虑并分析可变区，并且特别是嵌合抗体的cdr。由此，开发出每个重链和轻链的三个变体，其具有从1最像人类至3最保守于嵌合的不同程度的人类相似性。将变体组合以产生9种变体。对每种变体以及嵌合亲本c90进行biacore分析以确定它们的平衡解离常数kd。抗原是商购的人类baff-r的重组细胞外结构域。
序列表
<110>得克萨斯州大学系统董事会，希望之城(boardofregents,theuniversityoftexassystem
cityofhope)
<120>baff-r抗体及其用途
<130>095058-1047581(002wo1)
<150>62/346,324
<151>2016-06-06
<160>32
<170>patentin3.5版
<210>1
<211>10
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>1
gluservalaspasntyrglyileserphe
1510
<210>2
<211>3
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>2
alaalaser
1
<210>3
<211>9
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>3
glnglnserlysgluvalprotrpthr
15
<210>4
<211>8
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>4
glyaspserilethrserglytyr
15
<210>5
<211>7
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>5
ilesertyrserglyserthr
15
<210>6
<211>12
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>6
alaserproasntyrprophetyralametasptyr
1510
<210>7
<211>6
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>7
glnaspileserasntyr
15
<210>8
<211>3
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>8
tyrthrser
1
<210>9
<211>7
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>9
phesergluleuprotrpthr
15
<210>10
<211>10
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>10
glypheserleuserthrserglymetgly
1510
<210>11
<211>7
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>11
iletrptrpaspaspasplys
15
<210>12
<211>10
<212>prt
<213>小家鼠(musmusculus)
<400>12
alaargserpheglytyrglyleuasptyr
1510
<210>13
<211>411
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>13
atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacgaattca60
gacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccacc120
atctcctgcagagccagcgaaagtgttgataattatggcattagttttatgaactggttc180
caacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatgctgcatccaaccaaggatcc240
ggggtccctgccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcagcctcaacatccat300
cctatggaggaggatgatactgcaatgtatttctgtcagcaaagtaaggaggttccgtgg360
acgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaaaccatggaaatcaaacgt411
<210>14
<211>137
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>14
mettyrargmetglnleuleusercysilealaleuserleualaleu
151015
valthrasnseraspilevalleuthrglnserproalaserleuala
202530
valserleuglyglnargalathrilesercysargalasergluser
354045
valaspasntyrglyileserphemetasntrppheglnglnlyspro
505560
glyglnproprolysleuleuiletyralaalaserasnglnglyser
65707580
glyvalproalaargpheserglyserglyserglythrasppheser
859095
leuasnilehisprometglugluaspaspthralamettyrphecys
100105110
glnglnserlysgluvalprotrpthrpheglyglyglythrlysleu
115120125
gluilelysthrmetgluilelysarg
130135
<210>15
<211>420
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>15
atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacgaattcg60
gaggtgcagctgcaggagtctggacctagcctcgtgaaaccttctcagactctgtccctc120
acctgttctgtcactggcgactccatcaccagtggttactggaactggatccggaaattc180
ccagggaataaacttgagtacatggggtacataagctacagtggtagcacttactacaat240
ccatctctcaaaagtcgaatctccatcactcgagacacatccaagaaccagtactacctg300
cagttaaattctgtgacacctgaggacacagccacatattactgtgcaagccccaattac360
cccttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagatatc420
<210>16
<211>140
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>16
mettyrargmetglnleuleusercysilealaleuserleualaleu
151015
valthrasnsergluvalglnleuglngluserglyproserleuval
202530
lysproserglnthrleuserleuthrcysservalthrglyaspser
354045
ilethrserglytyrtrpasntrpilearglyspheproglyasnlys
505560
leuglutyrmetglytyrilesertyrserglyserthrtyrtyrasn
65707580
proserleulysserargileserilethrargaspthrserlysasn
859095
glntyrtyrleuglnleuasnservalthrprogluaspthralathr
100105110
tyrtyrcysalaserproasntyrprophetyralametasptyrtrp
115120125
glyglnglythrservalthrvalserseraspile
130135140
<210>17
<211>403
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>17
atggagaccgacaccctgctgctctgggtgctgctgctctgggtgcccggctccaccgga60
gagatcgtgctgacccagagccctgccaccctgtctctgagccctggcgagagagctacc120
ctgtcctgcagagcctccgagtccgtggacaactacggcatctccttcctgaactggttc180
cagcagaagcccggccaggcccccagactgctgatctacgccgcctctaatcgggccacc240
ggcatccctgccagattctccggatctggctccggcaccgactttaccctgaccatctcc300
agcctggaacccgaggacttcgccgtgtactactgccagcagtccaaagaggtgccctgg360
acctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcggaccgtgg403
<210>18
<211>134
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>18
metgluthraspthrleuleuleutrpvalleuleuleutrpvalpro
151015
glyserthrglygluilevalleuthrglnserproalathrleuser
202530
leuserproglygluargalathrleusercysargalasergluser
354045
valaspasntyrglyileserpheleuasntrppheglnglnlyspro
505560
glyglnalaproargleuleuiletyralaalaserasnargalathr
65707580
glyileproalaargpheserglyserglyserglythraspphethr
859095
leuthrileserserleugluprogluaspphealavaltyrtyrcys
100105110
glnglnserlysgluvalprotrpthrpheglyglyglythrlysval
115120125
gluilelysargthrval
130
<210>19
<211>403
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>19
atggagaccgacaccctgctgctctgggtgctgctgctctgggtgcccggctccaccgga60
gacatcgtgctgacccagagccctgccaccctgtctctgagccctggcgagagagctacc120
ctgtcctgcagagcctccgagtccgtggacaactacggcatctccttcatgaactggttc180
cagcagaagcccggccaggcccccagactgctgatctacgccgcctctaatcgggccacc240
ggcatccctgccagattctccggatctggctccggcaccgactttaccctgaccatctcc300
agcctggaacccgaggacttcgccgtgtactactgccagcagtccaaagaggtgccctgg360
acctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcggaccgtgg403
<210>20
<211>134
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>20
metgluthraspthrleuleuleutrpvalleuleuleutrpvalpro
151015
glyserthrglyaspilevalleuthrglnserproalathrleuser
202530
leuserproglygluargalathrleusercysargalasergluser
354045
valaspasntyrglyileserphemetasntrppheglnglnlyspro
505560
glyglnalaproargleuleuiletyralaalaserasnargalathr
65707580
glyileproalaargpheserglyserglyserglythraspphethr
859095
leuthrileserserleugluprogluaspphealavaltyrtyrcys
100105110
glnglnserlysgluvalprotrpthrpheglyglyglythrlysval
115120125
gluilelysargthrval
130
<210>21
<211>403
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>21
atggagaccgacaccctgctgctctgggtgctgctgctctgggtgcccggctccaccgga60
gacatcgtgatgacccagagcccctccagcctgtctgcctctgtgggcgacagagtgacc120
atcacctgtcgggcctccgagtccgtggacaactacggcatctccttcatgaactggttc180
cagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgcctctaatctgggctct240
ggcgtgccctctagattctccggatctggctccggcaccgactttaccctgaccatctcc300
agcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgccagcagtccaaagaggtgccctgg360
acctttggccagggcaccaaggtggaaatcaagcggaccgtgg403
<210>22
<211>134
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>22
metgluthraspthrleuleuleutrpvalleuleuleutrpvalpro
151015
glyserthrglyaspilevalmetthrglnserproserserleuser
202530
alaservalglyaspargvalthrilethrcysargalasergluser
354045
valaspasntyrglyileserphemetasntrppheglnglnlyspro
505560
glylysalaprolysleuleuiletyralaalaserasnleuglyser
65707580
glyvalproserargpheserglyserglyserglythraspphethr
859095
leuthrileserserleuglnprogluaspphealathrtyrtyrcys
100105110
glnglnserlysgluvalprotrpthrpheglyglnglythrlysval
115120125
gluilelysargthrval
130
<210>23
<211>426
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>23
atggaccccaagggcagcctgagctggagaatcctgctgttcctgagcctggccttcgag60
ctgagctacggccaggtgcagctgcaggaatctggccctggcctcgtgaagccttcccag120
accctgtccctgacctgcaccgtgtccggcgactctatcacctccggctactggaactgg180
atccggcagcatcctggcaagggcctggagtatatcggctacatctcctactccggctcc240
acctactacaaccccagcctgaagtccagagtgaccatctcccgggacacctccaagaac300
cagttctccctgaagctgtcctccgtgaccgctgctgataccgccgtgtactactgcgcc360
tcccccaactaccccttctacgccatggactactggggccagggcaccctcgtgaccgtg420
tcctct426
<210>24
<211>142
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>24
metaspprolysglyserleusertrpargileleuleupheleuser
151015
leualaphegluleusertyrglyglnvalglnleuglnglusergly
202530
proglyleuvallysproserglnthrleuserleuthrcysthrval
354045
serglyaspserilethrserglytyrtrpasntrpileargglnhis
505560
proglylysglyleuglutyrileglytyrilesertyrserglyser
65707580
thrtyrtyrasnproserleulysserargvalthrileserargasp
859095
thrserlysasnglnpheserleulysleuserservalthralaala
100105110
aspthralavaltyrtyrcysalaserproasntyrprophetyrala
115120125
metasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser
130135140
<210>25
<211>426
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>25
atggaccccaagggcagcctgagctggagaatcctgctgttcctgagcctggccttcgag60
ctgagctacggcgaagtgcagctgcaggaatctggccctggcctcgtgaagccttcccag120
accctgtccctgacctgcaccgtgtccggcgactctatcacctccggctactggaactgg180
atccggcagcatcctggcaagggcctggagtatatcggctacatctcctactccggctcc240
acctactacaaccccagcctgaagtccagagtgaccatctcccgggacacctccaagaac300
cagtactccctgaagctgtcctccgtgaccgctgctgataccgccgtgtactactgcgcc360
tcccccaactaccccttctacgccatggactactggggccagggcaccctcgtgaccgtg420
tcctct426
<210>26
<211>142
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>26
metaspprolysglyserleusertrpargileleuleupheleuser
151015
leualaphegluleusertyrglygluvalglnleuglnglusergly
202530
proglyleuvallysproserglnthrleuserleuthrcysthrval
354045
serglyaspserilethrserglytyrtrpasntrpileargglnhis
505560
proglylysglyleuglutyrileglytyrilesertyrserglyser
65707580
thrtyrtyrasnproserleulysserargvalthrileserargasp
859095
thrserlysasnglntyrserleulysleuserservalthralaala
100105110
aspthralavaltyrtyrcysalaserproasntyrprophetyrala
115120125
metasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser
130135140
<210>27
<211>426
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>27
atggaccccaagggcagcctgagctggagaatcctgctgttcctgagcctggccttcgag60
ctgagctacggcgaagtgcagctgcaggaatctggccctggcctcgtgaagccttccgag120
accctgtccctgacctgctccgtgtccggcgactctatcacctccggctactggaactgg180
atccggcagcctcctggcaagggcctggagtatatcggctacatctcctactccggctcc240
acctactacaaccccagcctgaagtccagagtgaccatctcccgggacacctccaagaac300
cagtactccctgcggctgtcctccgtgaccgctgctgataccgccctgtactactgcgcc360
tcccccaactaccccttctacgccatggactactggggccagggcacaagagtgaccgtg420
tcctct426
<210>28
<211>142
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>28
metaspprolysglyserleusertrpargileleuleupheleuser
151015
leualaphegluleusertyrglygluvalglnleuglnglusergly
202530
proglyleuvallysprosergluthrleuserleuthrcysserval
354045
serglyaspserilethrserglytyrtrpasntrpileargglnpro
505560
proglylysglyleuglutyrileglytyrilesertyrserglyser
65707580
thrtyrtyrasnproserleulysserargvalthrileserargasp
859095
thrserlysasnglntyrserleuargleuserservalthralaala
100105110
aspthralaleutyrtyrcysalaserproasntyrprophetyrala
115120125
metasptyrtrpglyglnglythrargvalthrvalserser
130135140
<210>29
<211>387
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>29
atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacgaattca60
gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcacc120
atcagttgcagtgcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaacca180
gatggaactgttaaactcctgatctattacacatcaagtttacactcaggagtcccatca240
aggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagcagcctggaacct300
gaagatattgccacttactattgtcatcagtttagtgagcttccgtggacgttcggtgga360
ggcaccaagctggaaataaaacgtacg387
<210>30
<211>129
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>30
mettyrargmetglnleuleusercysilealaleuserleualaleu
151015
valthrasnseraspileglnmetthrglnthrthrserserleuser
202530
alaserleuglyaspargvalthrilesercysseralaserglnasp
354045
ileserasntyrleuasntrptyrglnglnlysproaspglythrval
505560
lysleuleuiletyrtyrthrserserleuhisserglyvalproser
65707580
argpheserglyserglyserglythrasptyrserleuthrileser
859095
serleugluprogluaspilealathrtyrtyrcyshisglnpheser
100105110
gluleuprotrpthrpheglyglyglythrlysleugluilelysarg
115120125
thr
<210>31
<211>420
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>31
atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacgaattcg60
caggttactctgaaagagtctggccctgggatattgaagccctcacagaccctcagtctg120
acttgttctttctctgggttttcactgagcacttctggtatgggtgtaggctggattcgt180
cagccttcagggaagggtctggagtggctggcacacatttggtgggatgatgataaatac240
tataactcatccctgaagagtcacctcacaatctccaaggatacctccagaaaccaggta300
ttcctcaagatcaccagtgtggacactgcagatactgccacttactactgtgctcgaagc360
tttggttacggtcttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagctagc420
<210>32
<211>140
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>
<222>
<223>合成构建体
<400>32
mettyrargmetglnleuleusercysilealaleuserleualaleu
151015
valthrasnserglnvalthrleulysgluserglyproglyileleu
202530
lysproserglnthrleuserleuthrcysserpheserglypheser
354045
leuserthrserglymetglyvalglytrpileargglnprosergly
505560
lysglyleuglutrpleualahisiletrptrpaspaspasplystyr
65707580
tyrasnserserleulysserhisleuthrileserlysaspthrser
859095
argasnglnvalpheleulysilethrservalaspthralaaspthr
100105110
alathrtyrtyrcysalaargserpheglytyrglyleuasptyrtrp
115120125
glyglnglythrthrleuthrvalserseralaser
130135140
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！