聚羟基链烷酸的制造方法与流程

本发明涉及聚羟基链烷酸的制造方法，该方法包括在微生物的菌体内生物合成聚羟基链烷酸。

背景技术：

聚羟基链烷酸酯(以下简称为pha)是在多种微生物的细胞内作为能量积蓄物质而生成、积蓄的热塑性聚酯，具有生物分解性。目前，由于对环保的意识的提高，已着眼于非石油来源的塑料，其中，纳入自然界的物质循环、且分解产物无害的pha这样的生物分解性塑料备受关注，并热切地期望其实用化。特别是可以预想，微生物在菌体内生成积蓄的pha纳入自然界的碳循环过程对生态系统的不良影响小。

微生物生产的pha由于通常积蓄在该微生物的菌体内，因此为了使pha作为塑料利用，需要从微生物的菌体内分离取出pha的工序。在取出后，希望进一步提高pha的纯度，降低菌体构成成分等夹杂物的含量。

例如，专利文献中1公开了通过在对生成积蓄了pha的微生物细胞实施生物学处理及化学处理后进行物理破碎处理来回收高纯度pha的方法。专利文献2中公开了用过氧化氢、臭氧等氧化剂对pha进行处理来除去来自于菌体的杂质的方法，专利文献3及4中公开了在使pha溶解于特定的溶剂后从溶液中回收pha的方法。另外，作为在含有pha的水性悬浮液中形成pha凝聚体的方法，专利文献5中公开了将含有pha的水性悬浮液调节为酸性条件的方法，专利文献6中公开了对含有pha的水性悬浮液进行加热的方法。如上所述，关于pha的纯化，正在进行技术积累，且报道了大量专利、论文。

另一方面，为了在商业规模上实现利用微生物的pha的生产，除了培养工序及纯化工序以外，排水处理工序也变得重要。为了制造pha而在微生物培养中使用的培养基中含有氮成分，因此pha的制造过程中产生的排水中也大量含有氮成分。特别是作为产物的pha的主成分为碳，因此，排水中的碳/氮比与培养基中的碳/氮比相比，具有降低的倾向。由此，在pha生产中，产生的排水的氮变得过多，因此在排水处理工序中要求高除氮能力。

排水中含有的氮成分的主成分是氨态氮。在对氨态氮进行生物学处理时，需要将氨态氮氧化而形成硝酸的工序(硝化工序)、以及将硝酸还原成氮分子并以氮气的形式排放出体系外的工序(脱氮工序)这2个工序。在上述的硝化工序中，需要驯化被称为硝化细菌的特殊细菌，该菌的增殖慢，因此驯化需要很长的时间，而且存在为了确保停留时间而扩大排水处理设备的规模的倾向。

另一方面，作为对氨态氮进行物理化学处理的方法，已知有氨汽提法，但该方法存在由于使用蒸气而增加能量消耗的问题。

如上所述，关于pha的纯化已有大量的报告，但未对包括排水处理在内的生产设备总体进行探讨。因此，以往在pha生产设备总体中，排水处理设备所占的成本比例极大。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2010/116681号

专利文献2：美国专利第6245537号说明书

专利文献3：日本特表平10-504460号公报

专利文献4：日本特开平07-79788号公报

专利文献5：国际公开第2010/067543号

专利文献6：日本特表平7-509131号公报

技术实现要素：

发明要解决的课题

以往，为了从微生物生产的pha中除去杂质而提高pha的纯度，进行了研究，这些研究是以改善pha的纯化度及收率为目的的，但并未进行对包含排水处理在内的生产设备总体的研究。因此，在进行pha的大规模商业生产时，考虑到包括排水处理在内的生产设备总体，存在设备成本增高的课题。

本发明的目的在于提供一种pha的制造方法，该方法在实施利用了微生物的pha生产时，可以抑制包括排水处理工序在内的全部生产设备成本。解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现，在使微生物生产pha、并对在使其纯化或成型的过程中产生的排水中含有的氨态氮进行生物学处理时，如果排水中含有pha，则硝化速度及除氮速度提高。另外发现，通过在排水中混入作为产品的pha的一部分，可以缩小排水处理设备的规模，从而完成了本发明。

即，本发明涉及聚羟基链烷酸的制造方法，该方法包括：制造工序，对微生物的菌体内生物合成的聚羟基链烷酸进行纯化或成型；排出工序，从所述制造工序中排出含有含氮杂质的排水；除氮工序，对所述排水进行生物学处理，从所述排水中除去所述含氮杂质，其中，将该制造工序中的聚羟基链烷酸的残留率设为99重量％以下，在所述除氮工序中，在待进行生物学处理的所述排水中不仅含有所述含氮杂质，还含有聚羟基链烷酸。

优选所述制造工序包括以下工序：通过物理学、化学或生物学方法将含聚羟基链烷酸微生物破碎，分解和/或除去除聚羟基链烷酸以外的杂质，将聚羟基链烷酸进行纯化。

优选所述含氮杂质由水溶性或水分散性的成分构成，所述水溶性或水分散性的成分是来自于所述微生物的蛋白质、脂质及核酸中的任一种成分通过所述纯化工序分解而得到的。

优选从所述排出工序中排出的排水中含有的聚羟基链烷酸的体积平均粒径为5000μm以下。优选在所述除氮工序中待处理的排水中的溶解氧浓度为1.5ppm以上。优选在所述除氮工序中待处理的排水的温度为10摄氏度以上且60摄氏度以下。优选在所述除氮工序中待处理的排水的ph为3以上且10以下。

发明的效果

根据本发明，在使微生物生产pha、并对在使其纯化或成型的过程中产生的排水中含有的氨态氮进行生物学处理时，可促进氨态氮处理中必需的硝化反应。因此，能够使硝化槽小型化。另外，为了能够使硝化反应与脱氮反应共存，可以在1个槽内实施硝化反应和脱氮反应。因此，也可以减少排水处理所需要的槽。另外，由于排水的除氮速度提高，因此能够缩短处理槽中的停留时间，可以使处理槽小型化。另外，可以提高排水的除氮速度而不附带其它处理工序、不添加添加剂。由此，根据本发明可以减少排水处理设备的成本，结果是可以抑制以pha的大规模商业生产为目的的生产设备总体的成本。

附图说明

图1涉及参考例1-3及比较参考例1，是示出了体系中的除氮速度的图表。

图2涉及参考例1-3及比较参考例1，是示出了体系中的硝化速度的图表。

图3涉及实施例1及比较例1，是示出了体系中的氨态氮浓度(n-nh3)的经时变化、亚硝态氮浓度与硝态氮浓度之和(n-nox)的经时变化、以及总氮浓度(t-n)的经时变化的图表。

具体实施方式

以下，对本发明进一步更详细地进行说明。

本发明的pha的制造方法包括：制造工序，对微生物的菌体内生物合成的聚羟基链烷酸(以下简称为pha)进行纯化或成型；排出工序，从所述制造工序中排出含有含氮杂质的排水；除氮工序，对所述排水进行生物学处理，从所述排水中除去所述含氮杂质。

(pha)

在本发明中，pha是指以羟基链烷酸作为单体单元的聚合物的总称。作文羟基链烷酸，没有特别限定，可以列举例如：3-羟基丁酸酯、4-羟基丁酸酯、3-羟基己酸酯、3-羟基丙酸酯、3-羟基戊酸酯、3-羟基己酸酯、3-羟基庚酸酯、3-羟基辛酸酯等。另外，这些聚合物可以是均聚物，也可以是包含2种以上单体单元的共聚物，可以列举例如：聚-3-羟基丁酸酯均聚物、作为聚-3-羟基丁酸酯共聚物的聚-3-羟基丁酸酯-共-3-羟基己酸酯(phbh)、聚-3-羟基丁酸酯-共-3-羟基戊酸酯(phbv)、聚-3-羟基丁酸酯-共-4-羟基丁酸酯等。在本发明中，pha可以仅为1种，也可以混合2种以上。

(制造工序)

在本发明的优选的实施方式的制造工序中，可以进行培养具有在菌体内生物合成pha的能力的微生物的工序、以及用物理学、化学或生物学方法破碎该微生物而分解和/或除去除pha以外的杂质来对pha进行纯化的工序。在纯化工序之后，可以根据需要进行将pha成型为希望的形状的成型工序。

本发明中使用的产pha微生物只要是具有在菌体内生物合成pha的能力的微生物即可，没有特别限定。可以使用从天然分离的微生物、保藏于菌株的保藏单位(例如ifo、atcc等)的微生物、或由它们制备得到的突变体、转化体等。可以列举例如：贪铜菌(cupriavidus)属、产碱菌(alcaligenes)属、罗尔斯通氏菌(ralstonia)属、假单胞菌(pseudomonas)属、芽孢杆菌(bacillus)属、固氮菌(azotobacter)属、诺卡氏菌(nocardia)属、气单胞菌(aeromonas)属的菌等。特别优选为解脂产碱菌(a.lipolytica)、广泛产碱菌(a.latus)、豚鼠气单胞菌(a.caviae)、嗜矿泉气单胞菌(a.hydrophila)、杀虫贪铜菌(c.necator)等的菌株。另外，在微生物原本不具有pha生产能力的情况、或产量低的情况下，也可以使用在该微生物中导入作为目标的pha的合成酶基因和/或其突变体而得到的转化体。作为用于制备这样的转化体的pha的合成酶基因，没有特别限定，优选为来自豚鼠气单胞菌的pha合成酶基因。通过在适当的条件下培养这些微生物，可以得到菌体内含有pha的微生物。对于其培养方法，没有特别限定，可以使用例如日本特开平05-93049号公报等列举的方法。

在上述培养工序之后进行纯化工序，在所述纯化工序中，用物理学、化学或生物学方法破碎该微生物(含有pha的微生物(含pha微生物))，分解和/或除去除pha以外的杂质，对pha进行纯化。作为这样的纯化工序，没有特别限定，可以列举例如：在含pha微生物的培养液或水性悬浮液中添加酶而进行酶处理的工序、在含pha微生物的培养液或水性悬浮液中添加酸或碱而进行破碎的工序、对含pha微生物进行物理破碎处理的工序等。通过这些处理得到的含pha水性悬浮液中含有含氮杂质。在该悬浮液中，通过从水相中分离固体pha，可以将pha纯化而分离。

也可以根据需要对这样分离得到的pha加入水而实施第二次纯化，从而进一步提高pha的纯度。在这样的第二次纯化后，可以通过从水相中分离pha来分离出高纯度的pha。该第二次纯化也可以包含于上述纯化工序。

经过上述纯化工序分离得到的pha可以在干燥后根据需要成型为各种形状。例如，可以在160℃下进行熔融压制而成型为片的形状，另外，也可以成型为颗粒形状。

(排出工序)

排出工序是从上述制造工序排出含有含氮杂质的排水的工序。在制造pha的过程中，含有含氮杂质的排水主要在上述的纯化工序及成型工序中产生，但在本发明中，也可以是在任意工序中产生的排水，没有特别限定。其中，含有含氮杂质的排水大多在纯化工序中产生。在纯化工序中，从pha中分离出水相，在排出工序中，将该水相以排水的形式排出。排出的排水被输送至排水处理槽。

排水中含有的含氮杂质的大部分为来自于培养的微生物的成分，蛋白质、脂质及核酸等由通过上述纯化工序分解得到的水溶性或水分散性成分构成。

根据本发明的制造方法，使上述制造工序中的pha的残留率为99重量％以下，在上述排水中，不仅含有上述含氮杂质，还含有pha。在以往的制造方法中，为了提高成品率而进行调节，使得作为产品的pha不从生产过程中排出(即，将残留率设为100重量％)，与此相对，本发明的特征在于设定为排水中含有一部分pha(相对于生成的pha总体为1重量％以上的pha)而排出这一点。通过在排水中含有含氮杂质和pha，可以提高随后的除氮工序中的含氮杂质的硝化反应及脱氮反应的速度，能够从排水中高效率地除去含氮杂质。

这里，pha的残留率是指，经过纯化和/或成型工序获得的pha产品的重量相对于通过微生物的培养而生物合成的pha的重量的比例。残留率超过99重量％时，排水中含有的pha的量减少，因此难以获得由pha混入带来的除氮速度提高的本发明效果。残留率优选为99重量％以下，更优选为98重量％以下，进一步优选为97重量％以下。残留率的下限值没有特别限定，残留率越低，排水中的pha混入量越增加，因此优选，但相反，pha的生产收率降低，反而存在pha的生产成本增高的不良情况。因此，优选为50重量％以上，更优选为60重量％以上，进一步优选为70重量％以上，特别优选为80重量％以上。

排水中含有的固体pha可以是微生物内积蓄的初级粒子的pha，也可以是该初级粒子凝聚而成的颗粒体的pha，还可以是颗粒形状的pha。颗粒形状的pha可以包含于成型工序中将pha成形为颗粒形状后排出的排水中。为了易于提高硝化反应及脱氮反应的速度，最优选为初级粒子的pha。另外，从相同的观点考虑，优选固体pha较小，排水中含有的pha的体积平均粒径优选为5000μm以下，更优选为1000μm以下，进一步优选为500μm以下，最优选为100μm以下。需要说明的是，在体积平均粒径的测定中，例如可以使用nikkiso公司制造的microtracmt3300ii等。

在纯化工序中将水相与固体pha进行分离的分离操作中最容易产生含有含氮杂质和pha的排水。这里，从pha分离出的水相以含有含氮杂质和一部分pha的排水的形式排出。因此，通过控制该分离操作的工序收率，可容易地控制上述残留率。这里，分离操作的工序收率是指，分离操作中分离得到的pha的重量相对于进行分离操作前的含pha水性悬浮液中含有的pha的重量的比例。为了在排水中混入pha而提高除氮速度，分离操作的工序收率优选为99.5重量％以下，更优选为98.5重量％以下，进一步优选为97.5重量％以下。另外，其下限值没有特别限定，为了不使pha的生产收率过度降低，优选为60重量％以上，更优选为70重量％以上，进一步优选为80重量％以上。

作为分离水相与pha的分离操作的具体方式，没有特别限定，具体可以列举：压滤机、管压机、板压机、矫正压力机、带式压力机、螺旋压力机、圆板压力机等具有压榨功能的过滤装置；利用了离心力的离心沉降机、离心分离机；分离膜等。另外，分离操作可以是使用了单一方式的操作，也可以是组合使用多种方式的操作。该分离操作可以在pha处于初级粒子的形状时实施，也可以在使pha凝聚而提高粒度后实施。通过调节分离操作中的实施条件，可以容易地调节为待分离的水相中含有一部分pha。

(除氮工序)

在除氮工序中，对于含有从上述排出工序中排出的含氮杂质和pha的排水进行生物学处理，从上述排水中除去上述含氮杂质。在对排水进行生物学处理时，将该排水供给至处理槽，所述处理槽包含：具有生物分解性树脂分解能力的菌体、具有硝化能力的菌体、以及具有脱氮能力的菌体。可以将包含具有硝化能力的菌体的处理槽(厌氧处理槽)和包含具有脱氮能力的菌体的处理槽(好氧处理槽)分离而分别设置，根据本发明，可以使硝化反应和脱氮反应在1个体系中共存，因此，在1个排水处理槽内使具有生物分解性树脂分解能力的菌体、具有硝化能力的菌体、以及具有脱氮能力的菌体共生，可以在该处理槽中对上述排水进行处理。此时，可以使用通常的活性污泥的处理槽(曝气槽)。这是由于，在通常的活性污泥中，上述的微生物群以浓缩的状态存在。

在利用本发明除去氮时，优选保持在输送至处理槽的排水中溶解有氧的状态。因此，优选将氧供给至处理槽中的排水，更优选将该排水中的溶解氧浓度保持为一定以上。从除氮速度的观点考虑，排水中的溶解氧浓度优选为1.5ppm以上，更优选为2ppm以上。溶解氧浓度的上限值没有特别限定，考虑到强制供给氧，从成本的观点考虑，优选保持在必要的最低限度。具体而言，优选为4ppm以下，优选为2.5ppm以下。在供给氧的情况下，优选一边进行在线监测，一边控制氧供给量。作为强制供给氧的方法，可以优选利用本领域技术人员能够想到的方法。例如，可以优选利用可用于通常的活性污泥处理的供氧系统。为了向排水中供给氧，可以利用空气，也可以使用纯氧。

如上所述，本发明优选在好氧条件下实施，在好氧条件下也可以高效率地进行作为还原反应的脱氮反应。可以认为这是由于，通过利用具有生物分解性树脂分解能力的菌体分解pha，使pha的附近局部处于厌氧状态，pha对于具有脱氮能力的菌体作为氢供体而发挥作用，因此即使在好氧条件下也可高效率地进行脱氮反应。

实施本发明时的排水的温度没有特别限定，优选为适于相关的微生物的生长温度的温度条件。最优的温度范围的下限通常优选为10摄氏度以上，更优选为摄氏15度以上，进一步优选为摄氏20度以上，另外，作为上限的温度，优选为60摄氏度以下，更优选为55摄氏度以下，进一步优选为50摄氏度以下，但由于依赖于相关的微生物，因此并不限定于此。另外，由于硝化反应、脱氮反应的温度依赖性高，因此优选一边将排水的温度控制为最优温度，一边实施本发明。

实施本发明时的排水的ph没有特别限定，与温度同样地优选为适于相关微生物的生长ph的ph条件。最优ph范围的下限通常优选为3以上，更优选为4以上，进一步优选为5以上，另外，最优ph范围的上限优选为10以下，更优选为9以下，进一步优选为8以下，但由于依赖于相关的微生物，因此并不限定于此。另外，硝化反应、脱氮反应的ph依赖性高，因此优选一边将排水的ph控制为最优ph，一边实施本发明。需要说明的是，用于调整ph的试剂没有特别限定，例如，可以优选利用氢氧化钠、硫酸等本领域技术人员能够想到的试剂。

如上所述实施除氮工序时，在排水中进行pha的分解反应、以及含氮杂质的硝化反应及脱氮反应，含氮杂质被还原为氮分子，以氮气的形式从排水中排放。结果是可以减少排水中含有的含氮杂质的量。另外，在该过程中，由于排水中含有的pha也被分解，因此也可以减少排水中的pha量。另外，对于排水中残留的pha而言，可以根据需要使其凝聚、沉降而从排水中除去。

实施例

以下，示出实施例对本发明更具体地进行说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。

(参考例1)假设pha初级粒子混入的验证

首先，将柠檬酸1mm、磷酸二氢钾2mm、七水合硫酸镁0.5mm、氯化钠20mm、二水合氯化钙0.02mm、七水合硫酸锌0.01mm、七水合硫酸亚铁(ii)0.03mm、五水合硫酸铜0.01mm、edta5mg/l、以及氯化铵20mm溶解于蒸馏水中。将添加30％浓度的氢氧化钠进行ph调整，使得到的溶液的ph为8.5，将该溶液作为模拟排水在以下实验中使用。需要说明的是，该模拟排水中的溶解性碳量/溶解性氮量(重量比)为0.25。

接下来，从株式会社钟化工厂内的综合排水处理设备的曝气槽、硝化槽及脱氮槽中混合采集污泥，对该污泥进行3000g、10分钟的离心分离，废弃上清，分离了沉淀污泥。在该沉淀污泥中混合与废弃的上清等量的蒸馏水，使其悬浮。对该悬浮污泥再次进行3000g、10分钟的离心分离，并再次废弃上清，得到了清洗污泥。将该清洗污泥混合于上述制成的模拟排水，使其为与最初的采集污泥相同的浓度，将使其再悬浮，得到了污泥悬浮液。对该污泥悬浮液的上清中含有的氨态氮的浓度进行了测定，结果为280mg/l。

对于该污泥悬浮液添加3重量％的phbh初级粒子(体积平均粒径：1～2μm、3hhmol比率：11mol％)，在30±2℃的环境下进行了曝气。此时，使用30％浓度的氢氧化钠进行ph调整，使得污泥悬浮液的ph满足8～8.5的范围，并且调整通气量，使得污泥悬浮液的溶解氧浓度(do)为5ppm以上，进行了曝气。

在曝气开始后经过了给定时间之后，从污泥悬浮液中采集样品，对该样品进行9000g、10分钟的离心分离，对于得到的上清，测定了氨态氮、亚硝态氮及硝态氮的各浓度。需要说明的是，氨态氮、亚硝态氮及硝态氮的各浓度的测定中使用了hach公司制造的dr6000及对应试剂(tnt832、tnt835、tnt840)。

根据氨态氮浓度、亚硝态氮浓度、硝态氮浓度的总和的经时变化计算出除氮速度，将结果示于图1。根据氨态氮浓度的经时变化计算出硝化速度，将结果示于图2。需要说明的是，对于速度的计算，以曝气开始作为0小时，以后，使用10小时后、20小时后、30小时后、40小时后得到的各浓度的测定值，根据通过最小二乘法得到的斜率进行计算。

(参考例2)假设pha颗粒体混入的验证

按照参考例1的记载，准备用模拟排水悬浮有清洗污泥的污泥悬浮液，在其中以与参考例1等量地添加phbh颗粒体(体积平均粒径：100～350μm、3hhmol比率：11mol％)来代替phbh初级粒子，进行曝气，经时地测定了各氮浓度。需要说明的是，其它实验条件及分析条件按照参考例1中记载的方法。与参考例1同样地计算出除氮速度及硝化速度，将得到的结果示于图1及图2。

(参考例3)假设pha颗粒混入的验证

按照参考例1的记载，准备用模拟排水悬浮有清洗污泥的污泥悬浮液，在其中以与参考例1等量地添加phbh颗粒(直径3mm、高度3mm的圆柱状、3hhmol比率：11mol％)来代替phbh初级粒子，进行曝气，经时地测定了各氮浓度。需要说明的是，其它实验条件及分析条件按照参考例1中记载的方法。与参考例1同样地计算出除氮速度及硝化速度，将得到的结果示于图1及图2。

(比较参考例1)

按照参考例1的记载，准备用模拟排水悬浮有清洗污泥的污泥悬浮液，在其中未添加phbh初级粒子等pha，进行曝气，经时地测定了各氮浓度。需要说明的是，其它实验条件及分析条件按照参考例1中记载的方法。与参考例1同样地计算出除氮速度及硝化速度，将得到的结果示于图1及图2。

根据图1所示的结果可知，与污泥悬浮液中完全未混入pha的比较参考例1相比，在污泥悬浮液中混入了pha初级粒子、pha颗粒体或pha颗粒的参考例1～3中，除氮速度及硝化速度两者均有所提高。因此可知，通过在排水中混入pha，排水中的硝化反应和脱氮反应易于同时进行，可以高效率地除去排水中含有的氮成分。为了提高除氮速度，通过在排水中混入pha，可以使排水处理设备中的处理槽小型化。

(实施例1)使用实际排水的验证

使用pha制造工序中产生的实际排水进行了验证。需要说明的是，作为验证中使用的实际排水，使用了在将pha与含有除此以外的杂质的水相进行分离的分离工序中排出的水相。具体而言，在从用国际公开第2010/067543号的[0048]～[0050]段中记载的方法得到的phbh悬浮液中通过离心分离将phbh与水相分离而回收phbh的工序中，为了调整排水中含有的phbh的量，使用了对离心分离中的停留时间和/或离心加速度进行调整而得到的排水。需要说明的是，此时的分离工序中的phbh残留率为98.5重量％。

为了计算出使用的实际排水中含有的phbh量，以10000g对实际排水进行10分钟的离心分离，回收了实际排水中含有的phbh。用ph11的碱性水将该回收的phbh清洗数次后，使其干燥，确认了phbh量。其结果是确认了验证所使用的实际排水中含有约1重量％的phbh。需要说明的是，该phbh的3hhmol比率为6mol％。

另一方面，从株式会社钟化工厂内的综合排水处理设备的曝气槽、硝化槽及脱氮槽中混合采集污泥，对该污泥进行3000g、10分钟的离心分离，废弃上清，分离了沉淀污泥。在该沉淀污泥中混合与废弃的上清等量的蒸馏水，使其悬浮。对该悬浮污泥再次进行3000g、10分钟的离心分离，并再次废弃上清，得到了清洗污泥。将该清洗污泥混合于上述实际排水，使其为与最初的采集污泥相同的浓度，将其再悬浮，得到了污泥悬浮液。

一边对通气量进行调整，使得该污泥悬浮液的溶解氧浓度(do)为5ppm以上，一边进行了曝气。然后，经时地进行取样，测定了各氮浓度。需要说明的是，曝气条件及测定方法按照参考例1中记载的方法实施。将该结果以图3中的实线表示。在图3中，n-nh3表示氨态氮的浓度，n-nox表示亚硝态氮(n-no2)浓度与硝态氮(n-no3)浓度之和，t-n(总氮)表示氨态氮浓度、亚硝态氮浓度、硝态氮浓度的总和。

(比较例1)

对于实施例1中使用的实际排水，以10000g进行10分钟的离心分离，从实际排水中除去phbh。使用了该不含phbh的排水来代替实施例1的实际排水，除此以外，与实施例1同样地得到污泥悬浮液，进行曝气，经时地测定了各氮浓度。将该结果以图3中的虚线表示。

根据图3所示的结果可知，与对不含phbh的排水进行生物学处理的比较例1相比，在对含有phbh的排水进行生物学处理的实施例1中，氨态氮浓度(n-nh3)、亚硝态氮浓度与硝态氮浓度之和(n-nox)、以及总氮浓度(t-n)均经时地大幅减少。

在比较例1中，亚硝态氮浓度与硝态氮浓度之和(n-nox)经时地增加，总氮浓度(t-n)基本上没有减少，与此相对，在实施例1中，亚硝态氮浓度与硝态氮浓度之和(n-nox)虽然暂时增加，但随后转为减少，总氮浓度(t-n)始终持续减少，在这一点上特别明显。由此可知，在实施例1中，硝化反应与脱氮工序共存。

如上所述可以证实，通过设定为在pha的制造过程中产生的排水中含有pha，可以高效率地生物学除去排水中含有的氮成分。