本发明涉及基因工程领域，特别地涉及适用于转染细胞系和原代细胞(如t细胞)的基于转座子的转染试剂盒，其包含编码转座酶的mrna，或用于产生编码所述转座酶的mrna的试剂，以及包含转座子的小环dna。本发明还涉及包含转座子的核酸，优选dna小环，其中所述转座子编码至少一种蛋白质和至少一种mirna，其中编码mirna的序列位于内含子中，并且所述蛋白质和mirna的表达受相同启动子的调节。本发明还提供了可用本发明方法获得的细胞群。还提供了转染方法以及例如在免疫疗法(特别是使用t细胞受体(tcr)基因修饰的t细胞(tcr基因疗法)或嵌合抗原受体(car)基因修饰的t细胞(car基因疗法)的继承性t细胞疗法(adoptivetcelltherapy))中的医疗用途。
背景技术：
：：继承性t细胞疗法(adoptivetcelltherapy)(att)是一种治疗癌症、慢性感染和自身免疫疾病的有前途的免疫治疗策略。att需要制备识别并根除患病细胞的大量抗原特异性t细胞。att一方面涉及将天然存在的抗原特异性t细胞分离、扩增和再输注到患者体内以治疗所述疾病。然而，就癌症而言，大多数患者缺乏适量的天然存在的抗原特异性t细胞(肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocyte)，til)，并且这些细胞很难从许多肿瘤实体中分离出来。因此，att另一方面使用宿主细胞，所述宿主细胞已经用抗原受体基因(tcr，car)进行工程改造以赋予所述细胞以新的抗原特异性。使用car-和tcr-工程改造的t细胞的att已成功用于治疗癌症和病毒相关性疾病，对于其他治疗顽固的疾病(vonderheideetal.,2014；robbinsetal.,2015)。tcr和car基因疗法需要基因工程化大量的原代人类t细胞。这可以使用病毒载体系统有效地完成。然而，该技术费力、耗时且昂贵。相比之下，使用基于质粒dna的转座子载体系统具有多个优点。gmp级载体的生产(特别是大规模载体生产)速度更快、劳动强度更低、成本更低并且减少了官僚政治负担。此外，与病毒载体相比，转座子载体的转基因能力较大，并且一些转座子显示出不偏爱活性基因的随机整合模式。使用由两个dna质粒组成的常规转座子载体系统(图1中的a)进行原代细胞的遗传修饰的主要缺点是由dna转染诱导的高细胞死亡率(图2中的a)，这阻碍了转染细胞的快速扩增并且需要根本性的优化。尽管存在这个缺点，基于转座子的方法已成功应用于原代细胞(例如t细胞)的基因工程化。然而，常规方法效率较低，这是因为大多数t细胞在转染后死亡，只有小百分比存活细胞稳定地表达转基因。在使用常规方法转染细胞后，应用两种策略来获得所需数量的遗传修饰的t细胞以用于治疗。首先，借助于呈递转移的抗原受体的特异性配体的刺激细胞系选择性地扩增细胞(singhetal.,2013)。因此，需要产生对于每种抗原受体的新刺激细胞系(具有新特异性)。另外，在转移的抗原受体的特异性未知或转座子不编码抗原受体的情况下，不能诱导这种修饰的细胞的选择性生长。第二种策略是在特异性抗体的帮助下，分选出用于表面表达转移的tcr的转染细胞。然后，使用同种刺激(allostimulation)扩增分选的细胞(deningeretal.,2016)。该策略需要转染具有全长小鼠恒定区的tcr(其在人类中为免疫原性的)以及批准用于临床方案的抗体。此外，在该方案中通过其内源性tcr刺激分选的t细胞。其中转移的tcr完全取代内源性tcr的细胞不能以这种方式扩增。因此，同种异体刺激(allogeneicstimulation)内在地与产生用于疗法的细胞的意图不相容，所述用于疗法的细胞在其表面上尽可能多地表达转移的tcr。最后，选择性扩增和转染细胞的分选都不能直接解决低转染率和高细胞死亡率的问题。总之，非常需要为这些细胞(特别是原代细胞和难以以合理的功效转染的其它细胞)的基因工程化提供更有效的方法和试剂盒。通过本发明，特别是通过权利要求的主题，解决了这一问题。技术实现要素：本发明提供了试剂盒，其包含：a)编码能够移动转座子的转座酶的核酸，其中所述核酸选自包括以下各项的组：(i)编码所述转座酶的mrna；或(ii)功能性地连接到启动子的编码所述转座酶的dna，其中所述试剂盒可选地进一步包含适用于体外转录的试剂，该试剂包含三磷酸核糖核苷酸、适用于转录的缓冲液和适用于转录的rna聚合酶；和b)包含所述转座子的小环dna，其中所述转座子编码蛋白质和/或mirna，其中所述蛋白质和/或mirna的表达受启动子调节。在本发明的上下文中，“一种(a)”不仅仅指“一个(one)”，而是涵盖“两个或更多个”。因此，转座子可以编码一种或多种蛋白质和/或一种或多种mirna。例如，转座子可编码两种蛋白质和一种mirna。优选地，它编码一种蛋白质和两种(或更多种)mirna。当然，它还可以编码两种蛋白质和两种mirna。在一个实施方式中，a)的核酸是已经在体外转录的mrna，即ivtrna(图1中的b)。也可以使用纯化的rna。rna应该具有高质量和高浓度，例如，与常规获得的ivtrna相当。(a)通过以5'帽类似物形成的mrna的量，(b)poly(a)尾和(c)rna的纯度来确定质量。发明人可以证明，包含编码转座酶的ivtrna的本发明试剂盒的使用导致比编码转座酶的dna更高的转染效率(图3)以及改善的人类t细胞活力(图4)。在可替代的实施方式中，编码转座酶的核酸是适合体外转录的dna。优选地，在所述实施方式中，该试剂盒还包含用于体外转录的试剂和可选的说明书，诸如含有5'帽类似物的核糖核苷酸三磷酸、适合转录的缓冲液和适用于体外转录的rna聚合酶，例如t7rna聚合酶。dna可以是用于rna生产的载体，例如pcdna3.1+(hygro)(thermofisherscientific,waltham,美国)。该试剂盒可包含兔网织红细胞裂解物，其包含用于体外转录的所有试剂。这样的试剂盒用于生产ivtrna，然后根据本发明，将该ivtrna用于制备转染的细胞，特别是转染的原代细胞，优选原代t细胞或干细胞。已知这种细胞特别难以转染。由所述核酸编码的转座酶可以是在脊椎动物细胞中(特别是在人类细胞中)起作用的转座酶。它选自包含以下各项的ii类可转座元件的组：睡美人(sleepingbeauty)转座酶、青蛙王子(frogprince)、piggybac、tol2和其它tc1/mariner-type(水手型)转座酶，优选睡美人转座酶，例如ivicsetal.,1997中所公开的，最优选sb100x(mátésetal.,2009)。本发明的试剂盒，还包含含有转座子的小环dna作为第二核酸，其可通过转座酶来移动(图1中的c)。在本发明的上下文中，转座子不编码转座酶本身。所述转座子编码蛋白质和/或mirna，其中所述蛋白质和/或mirna的表达受启动子调节。小环是小的环状质粒衍生物，其已经大部分或完全不含非必需的原核载体部分。特别地，小环不含有编码细菌序列(如抗生素抗性基因或ori)的dna。本发明的小环dna优选包含小于5kb，更优选小于4kb，小于3kb或小于2kb。发明人发现最小尺寸的dna小环提高了效率。小环编码表达盒，该表达盒包含启动子、内含子和poly(a)信号以及转座子的tir(末端反向重复)和间隔物，它们总共包含约1.75kb。小环的最终尺寸取决于编码区的尺寸。de102011118018a1或garrelsetal.,2016中描述了小环及它们与睡美人转座酶的结合使用。发明人可以证明，包含编码转座酶的mrna和包含转座子的小环dna的组合的本发明的试剂盒使用令人惊讶地导致高转染效率和细胞活力(图5)。这对转染脆弱的或难以转染的细胞特别重要，例如t细胞、b细胞、干细胞和许多其他细胞类型，特别是原代细胞(图12)。因此，本发明还提供了用于以高转染效率和高活力生产转染的细胞的方法，特别是转染的原代细胞或干细胞，优选原代t细胞，如原代人类t细胞。高或改善的活力优选高于30％，更优选高于35％或高于40％。例如，可以在转染后第4天评估活力。高转染效率优选高于活细胞的50％，或更优选高于60％。所述方法包括使用本发明的试剂盒。特别地，其包含其中使细胞与以下物质接触的步骤：a)编码能够移动转座子的转座酶(优选睡美人(sleepingbeauty))的mrna，b)包含所述转座子的小环dna，其中所述转座子编码至少一种蛋白质和/或至少一种mirna，其中所述蛋白质和/或mirna的表达受启动子调节。优选地，所述转座子编码蛋白质和至少一种优选两种mirna，其中所述蛋白质和mirna的表达受相同启动子的调节。优选地，所述接触包括电穿孔。在本发明优选的实施方式中，所述转座子编码蛋白质和mirna(图1中的d)。优选地，编码蛋白质的转座子包含内含子，所述内含子包含编码mirna的序列，其中所述蛋白质和mirna的表达受相同启动子的调节(图6中的a)。在优选的实施方式中，编码蛋白质的转座子包含内含子，所述内含子包含编码至少两种mirna的序列，其中所述蛋白质和mirna的表达受相同启动子的调节。因此，本发明还提供了一种包含转座子的核酸，其中所述转座子编码至少一种蛋白质和至少一种mirna，其中编码蛋白质的核酸包含内含子，所述内含子包含编码mirna的序列，其中蛋白质和mirna的表达受相同启动子的调节。所述核酸选自包含质粒或小环dna的组，优选小环dna。如果核酸不是小环dna，则其适合生产小环dna，因为其包括整合盒外的重组位点，这允许在适于产生小环的特定细菌菌株中在繁殖期间生产小环载体(kayetal.,2010)，例如zycy10p3s2t.(systembiosciences,mountainview,usa)。这种菌株例如能够表达phic31整合酶和i-scei核酸内切酶。所述核酸可以例如是本发明试剂盒生产中的中间产物。在本发明的转座子中使用的优选内含子是嵌合内含子，其包含来自人类β-球蛋白基因的第一内含子的5'-剪接供体位点和来自免疫球蛋白基因重链可变区的3'-剪接受体位点，例如us20070190617中公开的。在pci和psi哺乳动物表达载体promega7/09的数据表中描述了内含子的优选特征，并且优选地，使用包含在所述载体中的内含子。choietal.,2014,molbrain7:17提及了包含所述内含子的载体的序列。在现有技术中，mirna通常由不同的启动子表达，或置于转基因的3'或5'。已经显示，将mirna掺入到内含子中改善了转基因表达(chungetal.,2006)。值得注意的是，病毒载体不允许应用高效的内含子。利用本发明的转座子，发明人能够通过掺入多种mirna来沉默靶细胞的多种细胞因子并同时获得高的转基因表达水平。掺入到γ-逆转录病毒载体的类似基因沉默方法将导致转基因表达水平降低。转座子相对于病毒载体的附加优点是，根据本发明，在转座子的背景下，可以使用包含相同mirna骨架并且例如甚至具有相同的完整mirna序列的两种或更多种mirna，而不会损害稳定性。这提高了靶的下调效率，而不需要优化序列(图8)。相比之下，amendolaatal.,2009表明，在病毒载体中使用相同的mirna两次导致所述载体不稳定和重排。因此，在病毒系统中，有必要在mirna的最佳效率之间找到折衷，这取决于mirna骨架和靶序列之间的相互作用以及防止相同或相似mirna之间重组的必要性。相反，在根据本发明所述的转座子系统中，没有必要找到这样的折衷。本发明进一步提供了一种包含转座子的核酸，其中所述转座子编码至少一种蛋白质和两种或更多种mirna，优选三种或更多种mirna，四种或更多种mirna，五种或更多种mirna或者六种或更多种mirna，其中编码蛋白质的核酸包含内含子，所述内含子包含编码mirna的序列，其中蛋白质和mirna的表达受相同启动子的调节。可选地，在所述mirna中，两种或更多种mirna，优选地，三种或更多种mirna，四种或更多种mirna，五种或更多种mirna或者六种或更多种mirna，例如所有mirna，包含相同的骨架。优选地，为了在att中使用，由转座子编码的蛋白质是tcr或car构建体。tcr构建体可包含一个tcrα链构建体和一个tcrβ链构建体，或单链tcr构建体或car构建体。优选地，tcr构建体包含tcrα链构建体和tcrβ链构建体。优选地，car构建体包含抗体(scfv)构建体的单链可变片段、间隔区(spacerregion)构建体和信号区构建体。可选地，可以优化tcrα链构建体和tcrβ链构建体的密码子使用以增强tcr在重组t细胞中的表达。人类可变区可以与以下各项组合：鼠恒定区(cohenetal.,2006)或最小鼠恒定区，即仅含有来自鼠恒定区的限定氨基酸(sommermeyeretal.,2010；bialeretal.,2010)并且附加地包含附加半胱氨酸桥(cohenetal.,2007；kuballetal.,2007)的人类恒定区域，其增加了转基因tcr链彼此的优先结合，并减少了与由受体t细胞表达的内源性tcr链的配对。发明人已经证明，最佳地，tcr构建体包含被优化用于彼此配对的tcrα链和tcrβ链，其中tcrα和β链构建体各自优选在恒定区包含(a)相对于天然人类tcr的附加cys残基和(b)鼠氨基酸序列，其中另外地，tcr链是人源的。在优选的实施方式中，tcr构建体包含seqidno:23。包括单链(sc)tcr构建体以及异二聚体tcr构建体。sctcr可以包含第一tcr链构建体的可变区(例如α链)和整个(全长)第二tcr链(例如β链)，反之亦然。另外，sctcr可以可选地包含一个或多个接头，其将两个或更多个多肽连接在一起。接头可以是例如肽，其将两条单链连接在一起。还可以编码与细胞因子(例如人类细胞因子，例如il-2、il-7、il-15或il-21)融合的sctcr。另外，可以产生可溶性受体分子和融合蛋白，它们含有tcrα和tcrβ链基因的可变区和例如抗体结构域。这些可以是ig结构域，例如igg恒定结构域。另外，可以将tcr链的可变区与例如本发明的融合蛋白中的抗-cd3抗体结构域融合，例如以向靶恶性细胞提供可溶性单克隆tcr试剂以向靶细胞提供效应子功能，所述靶恶性细胞在细胞表面表达相应的肽-主要组织相容性复合物(pmhc)并且通过例如抗-cd3靶向结构域接合t细胞(liddyetal.,2012)。tcr构建体能够特异性结合抗原，优选地是由癌细胞和/或病毒感染的细胞以及参与自身免疫性疾病的细胞特异性表达或过表达的抗原。如本文所用，术语“能够特异性结合给定抗原”或“识别给定抗原”或“对于给定抗原具有特异性”，意指tcr构建体可以，优选以高亲和力并通过其可变结构域，特异性结合并免疫学识别表位。可以通过本领域技术人员熟知的方法分析亲和力，例如通过biacore。在优选的实施方式中，转座子进一步编码至少两种mirna，可选地，三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种mirna(图6中的a,b)。与编码的蛋白质组合(是tcr构建体或car构建体)，优选的是，由转座子编码的mirna能够抑制tcrα和/或tcrβ链的表达，特别是t细胞的两种内源性tcr链的表达。因此防止了tcr链的错配。然而，编码的蛋白质的表达未被沉默，特别是mirna不能沉默tcr链或tcr构建体或car(由转座子编码)的表达。优选地，由转座子编码的tcr链或tcr构建体是密码子优化的，因此序列与内源性tcr序列显著不同。例如，为了预防gvhd(移植物抗宿主病)或减少gvhd(参考us9,181,527)，其中由转座子编码的mirna能够抑制tcrα和/或tcrβ链(特别是t细胞的两种内源性tcr链)的表达的实施方案也可以是令人感兴趣的。发明人能够证明，本发明的小环dna转座子构建体适用于共表达转基因和甚至多种mirna，而不会消除转基因的表达。内源性tcr表达的抑制减少了由一个内源性和一个转基因tcr链组成的潜在危险的混合tcr的产生。另外，内源性tcr的沉默(图6中的c)促进转基因，治疗性tcr的表达，所述转基因，治疗性tcr需要用于表面表达的细胞辅因子。因此，本发明的基于转座子的载体提供了功能性tcr的有效表达(图6中的d，图7中的a，b)和关键的安全性特征。转座子优选编码两种能够沉默tcrα链和tcrβ链表达的mirna。mirna通常能够沉默要被遗传修饰的t细胞的内源性tcr链的表达。seqidno:15和seqidno:16或seqidno:19中提供了合适的编码mirna的示例性序列。在一个实施方式中，转座子编码两种或更多种，优选两种具有相同骨架序列的mirna，或两种或更多种具有相同序列的mirna。可替代地或附加地，由转座子编码的mirna能够沉默能限制转移细胞的治疗效率的蛋白质的表达。在癌症或病毒相关性疾病的免疫疗法的情况下，能够下调效应子功能和/或t细胞增殖的蛋白质选自于包含ctla4、pdcd1、lag3、havcr2和tigit的抑制性表面受体的组，选自于负调节tcr或共刺激路径包含cblb、cish、dgk和tnfaip3的细胞内蛋白质的组，选自于限制细胞因子的生产包含spry2和crem的细胞内蛋白质的组，或选自于稳定功能失调t细胞表型包含maf、egr3、ndrg1和dtx1的蛋白质的组。在att的背景下，调节蛋白质和/或mirna表达的启动子具有在t细胞中表达的功能。优选地，mpsv启动子可用于t细胞工程化。替代性启动子是ef1a、pgk、cmv、cag等。在一个实施方式中，本发明提供psb-mir-t1367(seqidno:22)，或根据seqidno:14所述的用于产生本发明的小环的亲本质粒。当然，质粒或小环可以替代地编码不同的tcr构建体。在优选的实施方式中，在整个本发明中，转座子包括货物(cargo)核酸，其侧翼为左和右反向重复/直接重复(ir/dr)，其中(i)转座子能够被睡美人转座酶蛋白质移动(mobilize)；(ii)左ir/dr包括外左dr基序和内左dr基序，其中外左dr基序包含seqidno：1的核苷酸序列，并且内左dr基序包含seqidno：2的核苷酸序列；和(iii)右ir/dr包括外右dr基序和内右dr基序，其中外右dr基序包含seqidno：1的核苷酸序列的反向序列并且内右dr基序包含seqidno：2的核苷酸序列的反向序列。所述货物核酸包含本发明的至少一种蛋白质和至少一种mirna。优选地，所述外左dr基序包含seqidno：3的核苷酸序列和/或所述外右dr基序包含seqidno：4的核苷酸序列的反向序列。优选地，内左dr基序包含seqidno：5的核苷酸序列，和/或内右dr基序包含seqidno：6的核苷酸序列的反向序列。优选地，左ir/dr包含能够用作增强子的hdr区，该hdr区在外dr和内dr之间包含seqidno：7的核苷酸序列，其中可选地，右ir/dr还包含所述hdr区的反向互补。优选地，左ir/dr包含选自于seqidno：8和seqidno：9组成的组的核苷酸序列。优选地，右ir/dr包含选自于seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12和seqidno：13组成的组的反向互补核苷酸序列。已经表明，这种称为pt4或pt5转座子的转座子具有高转座效率，因此可以有利地用于本发明的上下文中。表1：优选的ir/dr序列具有hdr的pt4的左ir/dr：左外drseqidno：1cagttgaagtcggaagtttacatacacytwag左内drseqidno：2yccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkcthdrseqidno：7gtktacakacasd框架：ptseqidno：8tacagttgaagtcggaagtttacatacacytwagttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttggcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtktacakacasdttatttcacttataattcactgtatcacaatyccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkct具有hdr的pt5的左ir/dr：左外drseqidno：1cagttgaagtcggaagtttacatacacytwag左内drseqidno：2yccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkcthdrseqidno：7gtktacakacasd框架：pt2seqidno：9tatacagttgaagtcggaagtttacatacacytwagttggagtcattaaaactcgtttttcaactactccacaaatttcttgttaacaaacaatagttttggcaagtcagttaggacatctactttgtgcatgacacaagtcatttttccaacaattgtktacakacasdttatttcacttataattcactgtatcacaatyccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkct不具有hdr的pt4的右ir/dr(右ir/dr包含给定序列的反向互补)：右外drseqidno：1cagttgaagtcggaagtttacatacacytwag右内drseqtdno：2yccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkct框架：ptseqidno：10tacagttgaagtcggaagtttacatacacytwagccaaatacatttaaactcactttttcacaattcctgacatttaatccgagtaaagattccctgtcttaaggtcagttaggatcaccactttattttaagaatgtgaaatatcagaataatagtagagagaatgattcatttcagcttttatttctttcatcacattyccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkct不具有hdr的pt5的右ir/dr(右ir/dr包含给定序列的反向互补)：右外drseqidno：1cagttgaagtcggaagtttacatacacytwag右内drseqidno：2yccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkct框架：pt2seqidno：11tatacagttgaagtcggaagtttacatacacytwagccaaatacatttaaactcactttttcacaattcctgacatttaatcctagtaaaaattccctctcttaggtcagttaggatcaccactttattttaagaatgtgaaatatcagaataatagtagagagaatgattcatttcagcttttatttctttcatcacattyccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkct具有hdr的pt4的右ir/dr(右ir/dr包含给定序列的反向互补)：右外drseqidno：1cagttgaagtcggaagtttacatacacytwag右内drseqidno：2yccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkcthdrseqidno：7gtktacakacasd框架：ptseqidno：12tacagttgaagtcggaagtttacatacacytwagccaaatacatttaaactcactttttcacaattcctgacatttaatccgagtaaagattccctgtcttaaggtcagttaggatcaccactttattttaagaatgtgaaatatcagaataatagtagagagaatgatgtktacakacasdtcatttcagcttttatttctttcatcacattyccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkct具有hdr的pt5的右ir/dr(右ir/dr包含给定序列的反向互补)：右外drseqidno：1cagttgaagtcggaagtttacatacacytwag右内drseqidno：2yccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkcthdrseqidno：7gtktacakacasd框架：pt2seqidno：13tatacagttgaagtcggaagtttacatacacytwagccaaatacatttaaactcactttttcacaattcctgacatttaatcctagtaaaaattccctgtcttaggtcagttaggatcaccactttattttaagaatgtgaaatatcagaataatagtagagagaatgatgtktacakacasdtcatttcagcttttatttctttcatcacattyccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkcty＝c/t，其中y在左dr中优选为t并且在右dr中优选为c；w＝a/t，其中w在左dr中优选为a且在右dr中优选为t；v＝a/g/c，其中v优选为c；k＝g/t，其中k优选为g；s＝c/g，d＝a/t/g。最优选地，y在左dr中为t且在右dr中为c；w在左dr中为a且在右dr中为t；v为c；s为c，d为g且k为g。在转座子的优选实施方式中，左ir/dr包含seqidno：8的核苷酸序列且右ir/dr包含seqidno：10或seqidno：12的反向互补核苷酸序列。在这些多核苷酸中，框架区对应于pt，并且本发明的多核苷酸被指定为pt4。在转座子的另一个优选实施方式中，左ir/dr包含seqidno：9的核苷酸序列并且右ir/dr包含seqidno：11或seqidno：13的反向互补核苷酸序列。在这些多核苷酸中，框架区对应于pt2，并且本发明的多核苷酸被指定为pt5。包含例如以上及实施例中所述的转座子的小环dna优选地被包含在本发明的试剂盒中。本发明还包括一种制备转染细胞的方法，其中所述被转染的细胞优选为原代细胞，最优选为原代t细胞，所述方法包含使用本发明试剂盒的核酸转染细胞，所述核酸包含a)编码能够移动转座子的转座酶的mrna；和b)包含所述转座子的小环dna，其中所述转座子编码蛋白质和/或mirna，其中蛋白质和/或mirna的表达受一个启动子调节。优选地，通过电穿孔来转染细胞，然而，其它非病毒转染方法也是可以的，例如物理方法，如细胞挤压(cellsqueezing)、声孔效应(sonoporation)、流体动力学输送(hydrodynamicdelivery)，使用用磷酸钙、树枝状聚合物、脂质体或阳离子聚合物的基于化学品的转染方法，或基于颗粒的方法，如使用基因枪。在本发明的方法中，优选地，被转染(例如通过电穿孔)的细胞是从患者分离的原代人类t细胞。在这种情况下，所述方法可选地进一步包含使用选自于包含抗-cd3抗体、抗-cd28抗体、抗-cd137抗体、抗-cd134抗体、抗-cd357抗体、il-2、il-7、il-15和il-21的组中的一种或多种刺激物刺激t细胞。然而，发明人可以证明，在本发明的方法中，即使没有这样的刺激，转染的t细胞也能存活并且可以扩增。在一个实施方式中，本发明的方法不包括转染细胞的选择和/或富集。因此，本发明的方法还构成一种制备具有增强活力的转染细胞的方法。使用编码tcr构建体的本发明的优选转座子和能够下调内源性tcr链的表达的mirna，本发明的方法特别适用于制备具有降低的内源性tcr链表达的转染tcr转基因细胞，和/或用于减少转基因和内源性tcr链的配对。使用本发明的试剂盒和方法，通过表达编码tcr构建体的核酸，可以产生对来自主要组织相容性复合物(mhc)上呈现的限定抗原的表位特异的t细胞。如果这种t细胞要用于治疗患者，则优选使用自体t细胞。可替代地，使用免疫抑制可以实现同种异体设定。本发明还提供了一种遗传修饰的细胞(例如t细胞)的群体，所述细胞包含如上或实施例中所述的编码至少一种蛋白质和至少一种mirna的转座子，其中编码蛋白质的核酸包含含有编码mirna的序列的内含子，其中蛋白质和mirna的表达受相同启动子的调节。所述遗传修饰的细胞群体优选可通过本发明的方法获得。本发明还提供了一种药物组合物，其包含如上所述的遗传修饰的细胞群体，其例如包含以上或实施例中所述的编码至少一种蛋白质和至少一种mirna的转座子，其中编码蛋白质的核酸包含含有编码mirna的序列的内含子，其中蛋白质和mirna的表达受相同启动子的调节。优选地，所述药物组合物用于通过继承性t细胞疗法治疗患者，其中所述患者选自包括癌症患者和/或感染病毒或细菌病原体的患者和/或患有自身免疫性疾病的患者的组，并且其中细胞包含表达tcr或car构建体且优选地抑制t细胞内源性tcr表达的mirna的t细胞。所述药物组合物可以用于预防或减少病原体诸如病毒(例如cmv、ebv、hiv或hpv)的感染，其中采用了适合的tcr或car构建体。本发明还教导了一种治疗有需求的患者(例如感染病毒，或患有癌症，例如与病毒有关的癌症，例如患有自身免疫性疾病)的方法，或一种减少病毒感染或减少所述感染的症状的方法，包含向所述患者给药本发明的合适药物组合物。在整个本发明中，t细胞可以是cd8+或cd4+t细胞，优选cd8+细胞或调节性t细胞。药物组合物还可以包含转基因cd4+和cd8+t细胞，其中各自的tcr优选针对相同抗原的不同表位。优选地，t细胞是人类t细胞，并且待治疗的患者是人类患者。通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例旨在举例说明本发明，而不是限制其范围。本文引用的所有参考文献均在此完全引入。本文公开的本发明的所有实施方式均可以组合。附图说明图1本发明中应用的基于睡美人转座子的基因转移系统的改进的示意图。与常规的睡美人转移系统(a)相比，本发明的试剂盒包含编码睡美人转座酶的mrna(ivtrna)(b)、包含编码转基因的转座子的小环dna(c)和沉默内源性基团的mirna(d)，所述内源性基团阻碍有效转基因(例如tcr)的表达和治疗功效。图2将质粒dna转染到人类t细胞中导致剂量依赖性t细胞死亡率。使用编码gfp的质粒dna(psb-gfp)转染的人类t细胞显示出剂量依赖性死亡率，而相似量的转染的gfp-mrna仅显示t细胞计数的轻微减少(a)。与psb-gfp的转染相比，gfp-ivtrna的转染更有效并且产生更多的gfp+t细胞。另外，转染后三至四天，高dna量(>10μg)的转染导致了gfp+t细胞减少(b)。图3以ivtrna及以编码转座酶的质粒的形式递送转座酶产生了相似的基因转移效率。使用常规的基于睡美人转座子的基因转移系统将转座酶作为dna质粒(sbts-co)递送和使用本发明的基于睡美人转座子的基因转移系统将转座酶作为ivtrna(sbts-ir)递送，在人类t细胞中的gfp表达的比较。所显示的是第1天(瞬时表达)和第12天(稳定表达)的gfp+cd3+t细胞百分比。图4将转座酶作为ivtrna递送的基于睡美人转座子的基因转移增加了细胞活力(viability)。如图2所示，采用sbts-co和sbts-ir，使用编码gfp的转座子转染人类t细胞。显示了使用不同量的转座子质粒和dna转座酶或ivtrna转座酶转染后24小时存活t细胞的百分比。图5使用小环dna转座子的基于睡美人转座子的基因转移提高了转染效率。含有编码转座酶的ivtrna以及转座子质粒dna(psb)或转座子小环dna(msb)的基于睡美人转座子的基因转移系统的比较，转座子质粒dna(psb)和转座子小环dna(msb)这两者均编码gfp(a)。示出了平均荧光强度、mfi(b)和gfp+人类t细胞的百分比(c)。pmax-gfp表示无ivtrna转座酶的瞬时转染对照，无tf(non-tf)表示未使用核酸的转染条件。图6递送编码工程化的tcr的小环转座子dna和用于内源性tcr沉默的mirna的基于睡美人转座子的基因转移系统导致治疗性tcr的表达改善。携带(harboring)mirna(mir)和在mage-a1反应性tcrt1367序列中的修饰的小环转座子载体(a)。包含具有不同修饰的tcrt1367的小环转座子载体。1：优化的tcr密码子；2：1加mirna盒(mir)；3：优化的tcr密码子，附加的半胱氨酸键，最小的鼠源化c-区(opt)；4：3加mirna盒(miropt)(b)。mirna的表达减少了治疗性和内源性tcr链之间形成的错配tcr的形成(c)。通过mhc多聚体(multimer)结合测量的，mirna的表达增加了tcr-工程化的人类t细胞的功能(d)。图7使用基于完全优化的睡美人转座子的基因转移系统工程化的人类t细胞显示出改善的功能。使用基于完全优化的睡美人转座子的基因转移系统(编码转座酶的ivtrna、含有mirna以敲除(knowndown)内源性tcr表达的小环转座子dna、优化的治疗性tcr)转染人类t细胞，响应于肽载指示剂细胞(peptide-loadedindicatorcells)(a)和mage-a1+hla-a*02:01+(mage-a1+,a2+)肿瘤细胞系显示出改善的ifn-γ释放，而a2-和mage-a1-细胞系并未确认(b)。图8使用本发明的系统，可以在一个载体中组合相同的mirna(2x相同的mirna)。使用转座酶质粒和编码gfp的sb转座子质粒以及一个(b)或两个相同的(c)人类tcrα链(trac,seqidno:15)特异性的mirna或不使用mirna(a)，对jurkat细胞进行电穿孔，并在8天后通过流式细胞术分析cd3表面表达。一个mirna盒的敲除率为74％，而两次结合至转座子载体中的相同mirna盒的敲除率为84％。图9原代人类t细胞(htc)：质粒(p)vs.小环(mc)。使用15μgsb转座酶rna和2.5μgsb转座子载体(作为质粒或小环)对原代人类t细胞进行电穿孔，并且4天后通过流式细胞术进行分析。代替常规质粒，将sb转座子提供为小环大幅提高了转染效率(b)，而不会损害t细胞活力(viability)(a)。图10原代人类t细胞(htc)：sbrnavs.sb质粒。使用2.5μg编码gfp的sb转座子小环以及15μgsb转座酶(作为体外转录的rna(sbrna)或作为质粒(sb质粒))对原代人类t细胞进行电穿孔，并且4天后通过流式细胞术进行分析。代替质粒dna，将sb转座酶提供为rna降低了转染后的t细胞死亡率，即提高了t细胞活力(a)。其还提高了转染效率(b)。图11原代人类t细胞(htc)：常规双质粒(p)系统vs.小环(mc)/rna。使用常规的sb双质粒系统(使用2.5μg转座子载体和2.5μg转座酶载体)或者使用2.5μg转座子小环和15μgsbrna对原代人类t细胞进行电穿孔，并且在4天后通过流式细胞术进行分析。代替常规的双质粒系统，应用小环和rna大幅提高了转染效率(b)，而不会损害t细胞活力(a)。图12jurkat细胞与原代人类t细胞(htc)的比较：常规双质粒(p)系统vs.小环(mc)/rna。替代方法使用大量质粒dna来实现类似的效率。然而，这些大量质粒dna的使用导致高细胞死亡率，阻碍用于临床应用的大规模t细胞生成。尽管这种方法适用于细胞系的转染，但原代t细胞很少能经受大量dna的转染。另外，dna转染的原代t细胞显示出t细胞活化的延迟，因此难以扩展。此处，我们将使用转座子小环和转座酶rna的我们的方法与使用大量质粒dna的常规方法进行了比较。使用据报道可以达到很高的转染效率的常规sb双质粒系统(使用大量dna(10μg/10μg或20μg/10μg)，或使用我们的小环/rna方法，对原代人类t细胞(a)或jurkat细胞系细胞(b)进行电穿孔，并在4天后通过流式细胞术分析。尽管jurkat细胞耐受大量dna，但原代t细胞几乎不能经受使用20μg或30μg总dna。然而，我们的小环/rna方法能够有效转染原代t细胞，确保电穿孔后t细胞存活(viable)(30-40％活力(viability))。具体实施方式实施例1常规睡美人基因转移系统(sbts-co)的生产将睡美人pt2/hb转座子质粒(cuietal.,2002)修饰以携带mp71逆转录病毒载体的mpsv启动子(engelsetal.,2003)、嵌合内含子和psicheck2的polya信号(promega,madison,usa)。然后，分别将增强的绿色荧光蛋白(gfp)和mage-a1特异性人tcrt1367转基因(obenausetal.,2015)克隆到经修饰的pt2载体中，以分别获得psb-gfp和psb-t1367。为了有效的tcr表达，tcrt1367序列经密码子优化(geneart,darmstadt,germany)并且通过pcr经由猪捷申病毒(porcineteschovirus)的2a元素(p2a)连接tcrα-和tcrβ-链(leisegangetal.,2008)。通过含有附加半胱氨酸桥的最小鼠源化对应物(sommermeyeranduckert,2010)替代tcrt1367人类恒定区(kuballetal.,2007；rosenbergetal.,2008),(t1367opt)。最终的tcr构建体对应于seqidno:23(专利wo2014118236a2,highavidityantigenrecognizingconstructs(高亲和力抗原识别构建体))。使用endofreeplasmidmaxi试剂盒(qiagen,hilden,germany)生产转座子质粒dna(psb-gfp,psb-t1367)。转座子质粒与睡美人sb100x转座酶(mátésetal.,2009)配合使用，所述睡美人sb100x转座酶作为dna质粒递送，通过电穿孔转染人类t细胞。实施例2使用体外转录的(ivt)rna转座酶生产睡美人基因转移系统(sbts-ir)使用mmessagemmachinet7试剂盒(thermofischer,waltham,usa)根据制造商的指示，由pcdna3.1/hygro(+)(invitrogen,carlsbad,usa)制备编码睡美人sb100x转座酶或gfp的ivtrna。使用poly(a)-加尾试剂盒(poly(a)-tailingkit)(thermofischer,waltham,usa)添加poly(a)-尾，并且使用rneasy试剂盒(qiagen)在柱上纯化rna。将ivtrna转座酶与经修饰的睡美人pt2/hb转座子质粒(实施例1)配合使用以通过电穿孔来转染人类t细胞。实施例3睡美人转座子小环dna的生产为了生成亲本小环载体(parentalminicirclevector)，经由bamhi限制性位点，将含有启动子、内含子、转基因和polya信号的盒插入到质粒pmc.bespx-mcs2(systembiosciences,mountainview,usa)。在小环重组位点attb和左反向重复之间插入210bp的间隔物(spacer)。最终质粒对应于seqidno:14。使用mc-easy小环dna生产试剂盒(systembiosciences,paloalto,usa)和endofreeplasmidmega试剂盒(qiagen)根据制造商的指示，生产睡美人转座子小环dna(msb-gfp,msb-t1367)。使用poly(a)-加尾试剂盒(thermofischer)添加poly(a)-尾，并且使用rneasy试剂盒(qiagen)在柱上纯化rna。将转座子小环dna与ivtrna转座酶(实施例2)配合使用以通过电穿孔来转染人类t细胞。实施例4用于沉默内源性tcr的微(mi)rna的生产如我们针对小鼠tcr所描述的，设计人类tcr特异性mirna盒(bunseetal.,2014)。将tcrα-特异性反义序列tgaaagtttaggttcgtatctg(seqidno:15)和tcrβ-特异性反义序列tctgatggctcaaacacagcga(seqidno:16)分别整合到mirna环境mir-155(chungetal.,2006),seqidno:17和人工mirna(etal.,2006),seqidno:18中，获得seqidno:19。然后，将mirna插入到tcr转座子质粒的内含子中，获得psb-mir-t1367co(seqidno:22)。实施例5t细胞的分离和电穿孔以及jurkat细胞的电穿孔通过在biocoll(biochrom,berlin,germany)上离心，随后使用easysep人类t细胞富集试剂盒(stemcelltechnologies,germany)进行富集，由新鲜分离的pbmc制备t细胞。在tcr转移的情况下，通过用pe标记的抗-vβ3抗体(克隆jovi-3,ancell,bayport,usa)温育，随后用抗-pe珠(stemcelltechnologies,vancouver,kanada)选择，从细胞级分中耗尽(deplete)vβ3-阳性细胞。根据制造商的指示，对t细胞使用amaxa人类t细胞nucleofector试剂盒(lonza,basel,schweiz)且对jurkat细胞使用amaxa细胞系nucleofector试剂盒v进行电穿孔。将6-10x106个t细胞或5-10x106个jurkat细胞悬浮于100μl核转染缓冲液和1.25μg至20μg转座子载体dna中，并且转移到比色皿中。然后，对t细胞应用程序u-14，并且对jurkat细胞应用程序x-01，立即向细胞提供2mlt细胞培养基(tcm:rpmi1640,10％胎牛血清,1mm丙酮酸钠,1x非必需氨基酸)并且培养过夜。电穿孔后一天，将t细胞重悬浮于2ml补充有400u/ml重组人类白细胞介素-2(il-2,chiron,marburg,germany)的新鲜tcm中，并且通过将它们接种在覆盖有抗-cd3(克隆okt3,5μg/ml)和抗-cd28(克隆cd28.2,1μg/ml)抗体的24-孔板上以进行活化。然后将细胞扩增最长达18天。在功能分析前三至四天，il-2的浓度降至40u/ml。实施例6分析测量：流式细胞术在4℃下使用针对cd8(hit8α)、vβ3(jovi-3,ancell)、cd25(bc96)、cd28和cd3(ucht1)的mab，在50μlpbs中进行t细胞表面染色30分钟。抗体购自biolegend(sandiego,usa)、ebioscience、bd或beckmancoulter。mage-a1/hla-a2多聚体(multimer)(mblinternational,woburn,usa)染色在4℃下进行30分钟。通过sytoxblue(lifetechnologies,carlsbad,usa)的死细胞染色和fsc/ssc淋巴细胞门(gate)确定t细胞活力(viability)。在facscantoii(bd)或macsquant(miltenyibiotec,bergischgladbach,germany)上采集数据，并且使用flowjo软件(treestar,ashland,usa)进行分析。由biosyntan(berlin,germany)生成mage-a1278-特异性肽(kvleyvikv,seqidno:20)和不相关的酪氨酸酶-特异性对照肽tyr369(ymdgtmsqv,seqidno:21)。细胞因子释放试验为了检测分泌的细胞因子，将tcr-修饰的t细胞(每孔104)与mage-a1278-加载的t2细胞或肿瘤细胞系一起以1:1的效应子:靶(e:t)比率接种在96-孔圆底板中。24小时后收获上清液，并通过elisa或细胞计数珠阵列分析(两者均来自bd)。参考文献amendolaatal，regulatedandmmultiplcmirnaandsirnadelivcryinfoprimarycellsbyalcntiviralplatform.mol.therapy2009jun；17(6)：1039-1052.bialerg，horovitz-friedm，ya′acobis，morganra，cohencj.selcctedmurineresiduesendowhumantcrwithenhancedtumorrecognition.jimmunol.2010jun1；184(11)：6232-41.bunsem，bendlegm，linnemannc，biesl，schulzs，schumachertn，uckertw.rnai-mediatedtcrknockdownpreventsautoimmunityinmicccauscdbymixedtcrdimersfollowingtcrgenetransfer.molther.2014nov：22(11)：1983-91.choictal.，optimizationofaavexpressioncasscttcstoimprovcpackagingcapacityandtransgcneexpressioninneurons.2014molbrain7：17-27.chungkh，hartcc，al-bassams，avcrya，taylorj，patclpd，vojtckab，turncrdlpolycistronicrnapolymcraseiiexpressionvcctorsforrnaintcrferencebasedonbic/mir-155.nucleicacidsres.2006apr13；34(7)：c53.cohencj，zhaoy，zhengz，rosenbergsa，morganra.enhancedantitumoractivityofmurine-humanhybridt-cellreceptor(tcr)inhumanlymphocytesisassociatedwithimprovedpairingandtcr/cd3stability.canccrrcs.2006scp1；66(17)：8878-86.cohencj.liyf，el-gamilm，robbinspf，roscnbergsa，morganra.enhancedantitumoractivityoftccllscnginceredtoexpresst-cellreccptorswithasccconddisulfidcbond.cancerres.2007apr15；67(8)：3898-903.cui，z.，geurts.a.m.，liu，g.，kaufman，c.d.，&hackett，p.b.(2002).structure-functionanalysisoftheinvertedterminalrepeatsofthesleepingbeautytransposon.journalofmolecularbiology，318(5)，1221-1235.datashcetforpciandpsimammalianexpressionvcctors，promega7/09deniger.d.c..pasetto，a.，tran，e..parkhurst，m.r.，cohen.c.j.，robbins，p.f.，etal.(2016).stablc，non-viralexpressionofmutatedtumorneoantigen-specifict-cellreceptorsusingthesleepingbeautytransposon/transposasesystem.moleculartherapy.engcls，b.，cam，h.，schüler，t.，indracccolo，s.，gladow，m.，baum，c.，ctal.(2003).rctroviralvccctorsforhigh-leveltraransgcnccxprcssionintlymphocytes.humangenetherapy，14(12)，1155-1168.garrelsctal.，cytoplasmicinjectionofmurinezygoteswithsleepingbeautytransposonplasmidsandminicirclesresultsintheefficientgenerationofgermlinetraransge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rtificialsequence）<220><221>misc_feature<223>不具有hdr的pt5的右ir/dr（右ir/dr包含给定序列的反向互补）:<400>11tatacagttgaagtcggaagtttacatacacytwagccaaatacatttaaactcactttt60tcacaattcctgacatttaatcctagtaaaaattccctgtcttaggtcagttaggatcac120cactttattttaagaatgtgaaatatcagaataatagtagagagaatgattcatttcagc180ttttatttctttcatcacattyccagtgggtcagaagtgtacatacacgvkct233<210>12<211>245<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><221>misc_feature<223>具有hdr的pt4的右ir/dr(右ir/dr包含给定序列的反向互补)<400>12tacagttgaagtcggaagtttacatacacytwagccaaatacatttaaactcactttttc60acaattcctgacatttaatccgagtaaagattccctgtcttaaggtcagttaggatcacc120actttattttaagaatgtgaaatatcagaataatagtagagagaatgatgtktacakaca180sdtcatttcagcttttatttctttcatcacattyccagtgggtcagaagtgtacatacac240gvkct245<210>13<211>246<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><221>misc_feature<223>具有hdr的pt5的右ir/dr(右ir/dr包含给定序列的反向互补)<400>13tatacagttgaagtcggaagtttacatacacytwagccaaatacatttaaactcactttt60tcacaattcctgacatttaatcctagtaaaaattccctgtcttaggtcagttaggatcac120cactttattttaagaatgtgaaatatcagaataatagtagagagaatgatgtktacakac180asdtcatttcagcttttatttctttcatcacattyccagtgggtcagaagtgtacataca240cgvkct246<210>14<211>6461<212>dna<213>人工序列（artificialsequence）<220><221>misc_feature<223>用于小环生产的质粒<400>14ttgcagaagatcctgaacgtgcagaagaagctgcctatcatccagaagatcatcatcatg60gactctaagaccgactaccagggcttccagagcatgtacacattcgtgacatctcatctg120cctcctggcttcaacgagtacgacttcgtgccagagtctttcgacagggacaaaaccatt180gccctgatcatgaacagctctgggtctaccgagatctgatatctctagagtcgagctagc240ttcgaatttaaatcggatccctatacagttgaagtcggaagtttacatacaccttagcca300aatacatttaaactcactttttcacaattcctgacatttaatcctagtaaaaattccctg360tcttaggtcagttaggatcaccactttattttaagaatgtgaaatatcagaataatagta420gagagaatgattcatttcagcttttatttctttcatcacattcccagtgggtcagaagtt480tacatacactcaattagtatttggtagcattgcctttaaattgtttaacttgggtcaaac540atttcgagtagccttccacaagctagatcctgggaataaatggcggtaagatgctcgaat600tacacacaaaaaaccaacacacagatgtaatgaaaataaagatattttattgaattctta660cttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggac720catgtgatcgcgcttctcgttggggtctttgctcagggcggactgggtgctcaggtagtg780gttgtcgggcagcagcacggggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggc840gagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgtt900cttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtg960ccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccag1020ggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaa1080gatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgctt1140catgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggt1200gggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttcagggtcagcttgccgta1260ggtggcatcgccctcgccctcgccggacacgctgaacttgtggccgtttacgtcgccgtc1320cagctcgaccaggatgggcaccaccccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatgcg1380gccgctgggagtggacacctgtggagagaaaggcaaagtggatgtcagtaagaccaatag1440gtgcctatcagaaacgcaagagtcttcatgcattaattacgcgttctgtctcgacaagcc1500cagtttctattggtctccttaaacctgtcttgtaaccttgatacttacctgcccagtgcc1560tctccggacaaatgaaagacccccgaggtgggcagtcaatcactcagaggagaccctccc1620aaggaacagcgagaccacgagtcggatgcaactgcaagagggtttattgagaacacgggt1680acccgggcgacgcagtctatcggaggactggcgcgccgagtgaggggttgtgggctcttt1740tattgagctcggggagcagaagcgcgcgaacagaagcgagaagcgaactgattggttagt1800tcaaataaggcacagggtcatttcaggtccttggggcaccctggaaacatctgatggttc1860tctagaaactgctgagggcgggaccgcatctggggaccatctgttcttggccctgagccg1920gggcaggaactgcttaccacagatatcctgtttggcccatattctgctgttccaactgtt1980cttggccctgagccggggcaggaactgcttaccacagatatcctgtttggcccatattct2040gctgtctctctgttcctaaccttgatctgaacttctcaagcttctaaagccatgacatca2100ttttctggaattttccaagctgtttaaaggcacagtcaacttagtgtatgtaaacttctg2160acccactggaattgtgatacagtgaattataagtgaaataatctgtctgtaaacaattgt2220tggaaaaatgacttgtgtcatgcacaaagtagatgtcctaactgacttgccaaaactatt2280gtttgttaacaagaaatttgtggagtagttgaaaaacgagttttaatgactccaacttaa2340gtgtatgtaaacttccgacttcaactgtatagggatccctgcaggagctcgtcgacccat2400gggggcccgccccaactggggtaacctttgagttctctcagttgggggtaatcagcatca2460tgatgtggtaccacatcatgatgctgattataagaatgcggccgccacactctagtggat2520ctcgagttaataattcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaa2580tcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctct2640tcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccgg2700ccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggca2760tcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaac2820agttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccg2880gcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcag2940gtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcg3000gcaggagcaaggtgtagatgacatggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagcc3060agtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtgg3120ccagccacgatagccgcgctgcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcgg3180tcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagc3240agccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggag3300aacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcatgcgaaacgatcctcatcctgtctcttgat3360cagagcttgatcccctgcgccatcagatccttggcggcgagaaagccatccagtttactt3420tgcagggcttcccaaccttaccagagggcgccccagctggcaattccggttcgcttgctg3480tccataaaaccgcccagtctagctatcgccatgtaagcccactgcaagctacctgctttc3540tctttgcgcttgcgttttcccttgtccagatagcccagtagctgacattca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