抗微生物蛋白的制作方法
本申请要求2016年1月19日提交的美国临时申请no.62/280,597的权益，该申请全文以引用方式并入本文。
本发明涉及农业生物技术领域。更具体地，本发明涉及用于生产具有改善的微生物病原体或害虫耐受性的植物的核苷酸和多肽分子、dna构建体以及方法，以及具有改善的杀虫和/或杀真菌活性的转基因植物。本发明还涉及杀虫和/或杀真菌组合物。
序列表的并入
包含在为592kb(在ms-
背景技术：
防治影响植物的真菌病原体和其它致病微生物是农业和园艺行业所面临的主要困难之一。虽然已成功采用化学试剂，但是一系列环境和监管问题与继续使用化学方法防治植物害虫有关。此外，随着化学农药使用的增加，病原体和害虫种群对这些化学物质的耐受性增加。因此，需要进一步研究以发现提供植物中对病原体如昆虫、线虫、微生物、真菌、细菌和病毒的抗性的替代机制。
技术实现要素：
在一个方面，本发明提供了一种重组dna构建体，其包含编码多结构域防御素多肽的核酸序列，所述多结构域防御素多肽包含通过接头区域连接至第二防御素区域的第一防御素区域，所述第一防御素区域和第二防御素区域各自包含γ-硫素结构域，其中所述编码防御素多肽的核酸序列可操作地连接至植物细胞中有功能的启动子。
在另一方面，本发明提供了一种重组dna构建体，其包含编码单结构域防御素多肽的核酸序列。
对于多结构域防御素，在一些实施方案中，第一防御素区域相对于第二防御素区域或接头区域是异源的，而在其它实施方案中，第一防御素区域或第二防御素区域相对于接头区域是异源的。在某些实施方案中，第一防御素区域与第二防御素区域相同。在其它实施方案中，第一防御素区域不同于第二防御素区域。在某些实施方案中，启动子可以是异源启动子。在其它实施方案中，每个防御素结构域包含至少6个半胱氨酸残基。多结构域防御素的长度可以是至少90个氨基酸。每个防御素结构域可以包含：(a)在5个与10个之间的半胱氨酸残基；(b)e值截止为1e-3的pfamγ-硫素结构域(pf00304)；或(c)cys稳定的αβ(csαβ)基序。
在某些实施方案中，多结构域防御素的第一防御素区域或第二防御素区域包含与选自由seqidno：559-662组成的组的氨基酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少97％同一性的多肽，或具有选自由seqidno：559-662组成的组的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，接头区域包含与选自由seqidno：153-202组成的组的氨基酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少97％同一性的多肽，或包含选自由seqidno：153-202组成的组的氨基酸序列的多肽。在其它实施方案中，多结构域防御素多肽包含与选自由seqidno：52-102、329-454和1156组成的组的氨基酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少97％同一性的氨基酸序列，或包含选自由seqidno：52-102、329-454和1156组成的组的氨基酸序列的多肽。在其它实施方案中，多结构域防御素的第一防御素区域或第二防御素区域包含与选自由seqidno：1054-1152和1154组成的组的氨基酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少97％同一性的氨基酸序列，或选自由seqidno：1054-1152和1154组成的组的氨基酸序列。在其它实施方案中，由核酸序列编码的多结构域防御素多肽还包含与选自由seqidno：809-954组成的组的氨基酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少97％同一性的n末端转运信号序列。
在某些实施方案中，防御素多肽包含与选自由seqidno：1054-1152和1154组成的组的氨基酸序列的防御素序列部分具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少97％同一性的氨基酸序列，或选自由seqidno：1054-1152和1154组成的组的氨基酸序列。在其它实施方案中，由核酸序列编码的多结构域防御素多肽还包含与选自由seqidno：809-954组成的组的氨基酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少97％同一性的n末端转运信号序列。
在另一方面，本发明提供了如seqidno：1158所示的合成启动子，以在植物细胞中表达单结构域防御素或多结构域防御素。
在另一方面，本发明提供包含本文提供的重组dna构建体或包含由本文提供的重组dna构建体编码的多结构域防御素多肽的植物、种子、植物组织、植物部分或细胞。所述植物、种子、植物组织、植物部分或细胞可以表现出对以下真菌属中的一种或多种真菌属内的至少一种植物真菌病原体物种的耐受性或活性：镰刀菌属(fusarium)、炭疽菌属(collectotrichum)、狭壳柱孢属(stenocarpella)和/或层锈菌属(phakopsora)。所述植物、种子、植物组织、植物部分或细胞可以表现出对以下真菌物种中的一种或多种真菌物种的耐受性或活性：禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)、轮枝镰刀菌(fusariumverticilloides)、禾谷炭疽菌(collectotrichumgraminicola)、玉米狭壳柱孢(stenocarpellamaydis)和/或豆薯层锈菌(phakopsorapachyrhizi)。
在另一方面，本发明提供了一种微生物，其包含本文提供的重组dna构建体，或包含本文提供的重组dna构建体的dna分子或载体。所述dna分子或载体可以包含与选自由seqidno：1-51、203-328、955-1053和1155组成的组的核苷酸序列具有至少70％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性或至少97％同一性的多核苷酸序列，或具有选自由seqidno：1-51、203-328、955-1053和1155组成的组的核苷酸序列的多核苷酸序列。
本发明进一步提供了一种用于赋予真菌病原体耐受性或抗性给植物、种子、细胞或植物部分的方法，其包括在所述植物、种子、细胞或植物部分中表达由本文公开的重组dna构建体编码的单结构域防御素或多结构域防御素多肽。本发明进一步提供了用于在植物细胞或微生物中表达本发明的重组dna构建体以产生多结构域防御素多肽，例如以使得多结构域防御素多肽相对于单结构域(1d)防御素对照以更高水平在植物细胞中累积的方法。本发明进一步提供了一种用于产生具有对真菌病原体的抗性或耐受性的转基因植物的方法，其包括用本文提供的重组dna分子或载体转化植物细胞或组织，并再生转基因植物。
在另一方面，本发明提供了一种重组dna构建体，其包含编码防御素的核酸序列，所述防御素与选自由seqidno：1054-1152组成的组的氨基酸序列具有至少80％同一性，其中编码防御素多肽的所述核酸序列可操作地连接至在植物细胞中有功能的启动子。在某些实施方案中，防御素多肽具有选自由seqidno：1054-1152组成的组的氨基酸序列。在其它实施方案中，启动子包含如seqidno：1158所示的核苷酸序列。
本发明进一步提供了包含本文所述的重组dna构建体的植物、种子、植物组织、植物部分或细胞。在一些实施方案中，所述植物、种子、植物组织、植物部分或细胞具有对选自由镰刀菌属、炭疽菌属、狭壳柱孢属和层锈菌属组成的组的至少一种植物真菌病原体，例如选自由禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、禾谷炭疽菌、玉米狭壳柱孢和豆薯层锈菌组成的组的至少一种真菌物种的耐受性或活性。
在另一方面，本发明提供了用于产生具有对真菌病原体的耐受性的转基因植物的方法，其包括用本文所述的重组dna分子或载体转化植物细胞或组织，并再生转基因植物。
序列表简述
seqidno：1-51：天然多结构域防御素的核苷酸序列。
seqidno：52-102：天然多结构域防御素的多肽序列。
seqidno：103-152：来自多结构域防御素的接头区域的核苷酸序列。
seqidno：153-202：来自多结构域防御素的接头区域的多肽序列。
seqidno：203-328：若干合成多结构域防御素的核苷酸序列。
seqidno：329-454：若干合成多结构域防御素的多肽序列。
seqidno：455-558：来自多结构域防御素的防御素区域的核苷酸序列。
seqidno：559-662：来自多结构域防御素的防御素区域的多肽序列。
seqidno：663-808：多结构域防御素的转运信号(ts)的核苷酸序列。
seqidno：809-954：多结构域防御素的ts的多肽序列。
seqidno：955-1053：1d防御素的核苷酸序列。
seqidno：1054-1152：1d防御素的多肽序列。
seqidno：1153：medsa.afpm1的核苷酸序列。
seqidno：1154：medsa.afpm1的多肽序列。
seqidno：1155：合成异源二聚防御素的核苷酸序列。
seqidno：1156：合成异源二聚防御素的多肽序列。
seqidno：1157：密码子优化的pinsy.afp1的核苷酸序列。
seqidno：1158：用于控制转基因表达的合成调控元件的核苷酸序列。
附图说明
图1示出了：(顶部)描绘衍生自天然存在的单结构域防御素coix22和mtdef4的两个单结构域(1d)防御素和四个同源二聚的合成双结构域(2d)防御素的结构域构型的图。l1和l2表示本文所述的不同2d接头区域。还示出了n末端转运信号(ts)序列。(底部)描绘衍生自coix22和amaru.afp10的异源二聚的合成2d防御素的结构域构型的图。l3表示本文所述的2d接头区域。
图2示出了：与相应的1d防御素的那些水平相比，若干种同源二聚的2d防御素的相对rna和蛋白质表达水平。
具体实施方式
由真菌或其它微生物病原体引起的植物病害可严重影响作物植物的产量，导致每年数百万吨的谷粒损失。真菌植物病可以由若干种病原体的组合导致，并且几乎每一种作物植物都可能在一定程度上经历真菌病害压力。有效的真菌防治方法的开发已经由于缺乏具有针对不同真菌病原体的活性的可用试剂和/或可以与现有真菌防治方法有效组合的试剂而受到阻碍。因此，农业植物中由于真菌病害导致的产量损失仍然是一个重要问题。
本发明提供了新颖的抗微生物肽(amp)，其包含防御素或防御素样蛋白，包括多结构域防御素蛋白，能够赋予植物对害虫的抗性或耐受性和/或杀真菌活性。还提供了编码防御素或防御素样蛋白的新颖多核苷酸分子和序列，以及包含这些新颖的防御素编码的多核苷酸序列的重组dna构建体。此外，提供了用于通过在植物中表达本发明的编码防御素或防御素样蛋白的多核苷酸，诸如通过用包含编码防御素或防御素样蛋白的多核苷酸序列的重组dna构建体转化植物或植物细胞，来产生具有增加的害虫防治或杀虫活性的植物的方法，以及通过这些方法产生并且包含本发明的防御素编码dna构建体的转基因植物或植物细胞。还设想了用于将本发明的防御素或防御素样蛋白施用或施加至植物、植物生长介质或与植物相关的土壤，或植物部分或种子的杀虫和植物健康组合物以及方法。
本发明提供了包含多结构域防御素的防御素或防御素样蛋白分子的新颖多核苷酸和多肽序列，以及这些序列和分子用于在植物中产生害虫抗性或耐受性的用途。如本文所用，与抗性较弱、更“敏感”的植物相比，植物对害虫或病原体的“耐受性”或“改善的耐受性”指示植物在产量、生存力和/或其它相关农艺度量方面受害虫或病原体的影响较小。植物对害虫或病原体的“抗性”或“改善的抗性”指示植物比非抗性或抗性较弱的植物更能够降低害虫或病原体的影响。可将本文所述的防御素引入各种植物物种中以赋予抗真菌和/或抗微生物活性，并且由此赋予对一种或多种植物害虫或病原体的抗性或耐受性。本文公开的防御素和防御素样分子可以引入和在植物或植物细胞中表达，以赋予植物或植物细胞抗真菌和/或抗微生物的活性。根据本发明的实施方案，本发明的多核苷酸、构建体和蛋白质可以赋予对一种或多种真菌病原体的抗性或耐受性以及活性，所述真菌病原体包括镰刀菌属、炭疽菌属、狭壳柱孢属和/或层锈菌属物种，诸如禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、禾谷炭疽菌、玉米狭壳柱孢和/或豆薯层锈菌。除了具有抗真菌活性之外，本发明的构建体和蛋白质可以赋予对其它微生物植物病原体和/或植物害虫(诸如卵菌、细菌、昆虫、线虫等)的抗性或耐受性以及活性。
防御素或防御素样蛋白质或多肽(下文统称为防御素)是富含半胱氨酸的阳离子肽，它们中的许多表现出对多种微生物植物病原体和农业害虫的抑制活性。单结构域(1d)防御素是小球状蛋白质或肽分子，通常包含约50个氨基酸(aa)残基，所述氨基酸残基的序列可以高度可变。尽管存在此类可变性，但是防御素肽确实共享γ-硫素核心共有序列(γ-硫素结构域)并且含有约6-8个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基可与蛋白质折叠形成二硫键。1d防御素的三维结构已经被描述为cys稳定的αβ基序(csαβ)，所述基序具有三个反向平行的β折叠和一个α螺旋，所述α螺旋由保守的半胱氨酸残基形成的多个二硫键稳定(通常由八个保守的半胱氨酸残基形成四个二硫键)。参见例如carvalho，ao等人，peptides30：1007-1020(2009)；和thomma，b等人，planta216：193-202(2002)，所述文献的全部内容和公开内容以引用方式并入本文。防御素可进一步包含具有从仅几个氨基酸直至20-30个氨基酸的可变长度的n末端转运信号(ts)序列，和/或具有至多35-30个氨基酸的可变长度的c末端延伸序列(当存在时)。防御素原蛋白上的n末端ts序列可以在将成熟的防御素蛋白靶向和/或输出到非原质体空间或其它亚细胞隔室方面起作用。然而，ts序列通常可以变成共翻译地或在翻译后被切割并从防御素的剩余部分去除，以产生不含ts序列的成熟防御素蛋白或肽。一些防御素还可具有c末端延伸序列，所述c末端延伸序列也可在植物细胞中发挥多种作用和/或变成被从成熟的防御素蛋白或肽切下。
在一个方面，本发明提供了来自植物的若干种多结构域(md)防御素，包括双结构域(2d)防御素和四结构域(4d)防御素，所述防御素包含通过一个或多个接头区域而连接或桥接在一起的两个或更多个防御素区域或结构域，以及n末端ts序列和/或c末端延伸序列。2d或md防御素的每个防御素区域也可以被称为2d或md防御素的“防御素组分”。因此，本发明的多肽序列可以包含这些多结构域防御素蛋白或多肽中的一种。可以根据本发明的实施方案使用的包含2d防御素的多结构域防御素的实例包括在本文被提供为seqidno：52-102的那些。进一步提供了编码这些多结构域防御素中的一种的多核苷酸分子和构建体，诸如被提供为seqidno：1-51的那些。可以根据本发明的实施方案使用这些md防御素编码多核苷酸，以当在植物中表达时赋予杀虫和/或抗真菌活性。本发明的多结构域防御素蛋白还可以任选地包含n末端转运信号(ts)序列，诸如seqidno：809-954中的一个，和/或c末端序列，诸如通过下表2中对seqidno：101和102的注释标识的序列。
在一个方面，本发明提供了来自具有杀虫和/或抗真菌活性的植物的若干种单结构域(1d)防御素，以及编码这些1d防御素的多核苷酸。因此，本发明的实施方案包括多核苷酸和构建体，所述多核苷酸和构建体编码这些1d防御素以在植物中表达，或者至少包含如本文鉴定的这些1d防御素的防御素序列部分。根据本发明的实施方案使用的1d防御素的实例包括在本文中被提供为seqidno：1054-1127和1129-1152的那些中的一种或多种，并且编码这些1d防御素的多核苷酸序列的实例包括在本文中被提供为seqidno：955-1028和1030-1053的那些中的一种或多种。本发明的1d防御素还可包括含有本文鉴定的2d或md防御素的防御素组分的那些，诸如在本文中被提供为seqidno：559-662的那些中的一种或多种，以及编码这些防御素组分的多核苷酸序列，诸如在本文中被提供为seqidno：455-558的那些中的一种或多种。进一步设想本发明的1d防御素可以包含相对于上述鉴定的序列具有放松的序列同一性的多肽和多核苷酸序列。例如，1d防御素可以具有与seqidno：1054-1127或1129-1152中的一者的至少一个防御素序列部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的多肽序列，和/或1d防御素可以由与seqidno：955-1028或1030-1053中的一者的至少一个防御素序列部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一的多核苷酸序列编码。1d防御素可进一步包含含有seqidno：1054-1127或1129-1152中的一者的防御素序列部分的至少25个、至少50个、至少75个或至少100个连续氨基酸的片段，和/或1d防御素可以由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列是包含seqidno：955-1028或1030-1053中的一者的防御素序列部分的至少25个、至少50个、至少75个或至少100个连续核苷酸的片段。在一些实施方案中，片段具有seqidno：1054-1127或1129-1152中的一者的全长防御素序列部分的活性，或由seqidno：955-1028或1030-1053中的一者编码。可以根据本发明的实施方案使用1d防御素编码多核苷酸和构建体，以当在植物中引入和表达时赋予杀虫和/或抗真菌活性。
除了新发现的来自植物的单结构域防御素和多结构域防御素之外，还提供了用于构建、合成和表达合成的多结构域防御素蛋白的方法和组合物，所述合成的多结构域防御素蛋白包含两个或更多个防御素区域或结构域与将所述两个或更多个防御素区域连接或桥接在一起的一个或多个接头区域的异源或非天然存在的组合，并且还提供了编码这些合成多结构域防御素的多核苷酸。例如，合成的多结构域防御素的每个防御素区域可以包含1d防御素的防御素序列部分或2d或md防御素的防御素组分，如本文所鉴定的。因此，这些合成的多结构域防御素蛋白可以被称为嵌合多结构域防御素，所述嵌合多结构域防御素包含在起源上异源的一个或多个防御素区域和/或一个或多个接头区域。除了它们的新颖结构之外，合成的多结构域防御素还可以具有一种或多种新颖的性质或特征，诸如相对于现有的或已知的防御素(例如包含合成的多结构域防御素的防御素组分中的一者的1d防御素)，当在植物细胞中表达时增加的累积和/或新的、改变的或增强的抗真菌和/或杀虫活性。本发明的合成的多结构域防御素可以包含第一防御素结构域或区域、第二防御素结构域或区域和接头区域的异源或非天然存在的组合，其中第一防御素区域和第二防御素区域通过接头区域相互链接或相互连接。例如，本发明的合成2d防御素可以按以下顺序(在n末端至c末端方向上)包含这些区域：(i)第一防御素区域，(ii)接头区域，以及(iii)第二防御素区域。合成的多结构域防御素可以进一步包含通过一个或多个附加的接头区域连接的一个或多个附加防御素区域。此外，3d防御素可具有以下顺序：(i)第一防御素区域，(ii)第一接头区域，(iii)第二防御素区域、(iv)第二接头区域和(v)第三防御素区域，而4d防御素可以另外包含第三接头区域和第四防御素区域，其中第三接头区域在第三防御素区域与第四防御素区之间，等等。
因此，本发明的合成多结构域防御素蛋白或多肽可包含两个或更多个防御素结构域或区域的组合，每个防御素区域包含在本文中被提供为seqidno：559-662的序列中的一者和/或seqidno：1054-1152和/或1154中的一者的防御素序列部分，其中所述两个或更多个防御素区域通过一个或多个接头区域链接或连接在一起，所述接头区域为诸如在本文中被提供为seqidno：153-202的那些中的一个或多个。例如，合成的2d防御素的第一防御素区域可以包含seqidno：559-662中的一者，和/或seqidno：1054-1152和/或1154中的一者的防御素序列部分，第二防御素区域可以包含seqidno：559-662中的一者和/或seqidno：1054-1152和/或1154中的一者的防御素序列部分，所述第二防御素区域可以与第一防御素区域相同或不同，并且连接所述第一防御素区域和第二防御素区域的接头区域可以是seqidno：153-202中的一者。
在本发明的一个实施方案中，“防御素序列部分”应指1d防御素或防御素样蛋白的排除n末端ts序列和c末端延伸序列(如果存在的话)的序列部分，以及编码防御素或防御素样蛋白的防御素序列部分的多核苷酸序列。参见例如下表15，其提供了1d防御素序列的防御素序列部分的注释。然而，根据一些实施方案，合成的2d或md蛋白的n末端附近的防御素区域可保留其天然ts序列，和/或合成的2d或md蛋白质的c末端附近的防御素区域可保留其天然c末端延伸。本发明的合成多结构域防御素还可任选地包含n末端转运信号(ts)序列，诸如seqidno：809-954中的一者，和/或c末端序列，诸如通过下表2中对seqidno：101和102的注释标识的序列。例如，本发明的合成多结构域防御素可以包含在本文中被提供为seqidno：329-454和1156的那些中的一种或多种。
本发明的多核苷酸可以包含编码合成的多结构域防御素的序列。这些多核苷酸可以包含两个或更多个编码防御素结构域或区域的多核苷酸序列的组合，这些编码防御素区域的多核苷酸序列中的每一者可以包含在本文中被提供为seqidno：455-558的多核苷酸序列或在本文中被提供为seqidno：955-1053和/或1153的多核苷酸序列中的一者的防御素序列部分，所述多核苷酸序列通过编码接头区域的多核苷酸序列链接或连接在一起，所述编码接头区域的多核苷酸序列为诸如在本文中被提供为seqidno：103-152的那些中的一种或多种。例如，编码合成的2d防御素的第一防御素区域的序列可包含seqidno：455-558中的一者或在本文中被提供为seqidno：955-1053和/或1153的多核苷酸序列中的一者的防御素序列部分，编码合成的2d防御素的第二防御素区域的序列可包含seqidno：455-558中的一者或在本文中被提供为seqidno：955-1053和/或1153的多核苷酸序列中的一者的防御素序列部分，所述序列可以与编码第一防御素区域的序列相同或不同，并且编码合成的2d防御素的连接第一和第二防御素区域的接头区域的序列可以是seqidno：103-152中的一者。本发明的多核苷酸还可任选地包含编码n末端靶向信号(ts)序列的序列，诸如seqidno：663-808中的一者，和/或c末端序列，诸如通过本文表1中对seqidno：50和51的注释标识的序列中的一者。例如，编码本发明的合成多结构域防御素的多核苷酸可以包含在本文中被提供为seqidno：203-328和1155的那些中的一种或多种。
本发明的多结构域防御素蛋白还可以包含本文提供的天然和合成防御素序列的变体和同源物。根据一些实施方案，多结构域防御素变体可以包含相对于天然或合成的防御素或多结构域防御素序列、或其它工程化的防御素样序列的一种或多种突变、缺失、插入等。本发明的多结构域防御素蛋白或多肽可以包含两个或更多个防御素结构域或区域的组合，其中那些防御素区域中的一者或多者具有相对于seqidno：559-662中的一者或多者，和/或seqidno：1054-1152和/或1154中的一者或多者的防御素序列部分放松的序列同一性。多结构域防御素的每个防御素区域可以与seqidno：559-662中的一者和/或seqidno：1054-1152和/或1154中的一者的防御素序列部分至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一。多结构域防御素的防御素区域可以进一步包含含有seqidno：1054-1152和/或1154中的一者的至少25个、至少50个、至少75个或至少100个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，片段具有seqidno：1054-1154中的一者的全长防御素区域的活性。多结构域防御素蛋白的一个或多个接头结构域或区域中的每一者也可以具有相对于seqidno：153-202的放松的序列同一性。多结构域防御素的每个接头区域可以与seqidno：153-202中的一者至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一。实际上，本发明的多结构域防御素蛋白可包含与seqidno：52-102、329-454或1156中的任一者至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一的多肽序列。多结构域防御素蛋白可进一步包含包含seqidno：52-102、329-454或1156中的任一者的至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个或至少200个连续氨基酸的片段。在一些实施方案中，片段具有seqidno：52-102、329-454或1156的活性。然而，多结构域的接头区域也可以是在序列和长度方面高度可变的，与seqidno：153-202具有很少或几乎没有序列同一性或相似性。接头区域还可以包含串联布置的两个或更多个接头序列，其中接头序列中的每一个可以包含seqidno：153-202中的一者，相对于seqidno：153-202具有放松的序列同一性的多肽序列，或其它序列。
多结构域防御素的n末端靶向信号(ts)和/或c末端序列(如果存在的话)还可以各自相对于本文提供的序列具有放松的序列同一性。n末端靶向信号(ts)序列可以与seqidno：809-954中的一者至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一。c末端序列可以与通过表2中对seqidno：101和102的注释标识的c末端序列中的一者至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一。然而，根据一些实施方案，多结构域防御素的n末端和/或c末端序列可以替代地为相对于本文提供的序列不相似或具有较低的序列同一性。
本发明的多核苷酸可以包含编码多结构域防御素蛋白的序列，所述序列相对于本文提供的序列具有宽松的序列同一性。编码这些多结构域防御素的多核苷酸可包含编码防御素结构域或区域的两个或更多个序列的组合，其中编码这些防御素区域的多核苷酸序列中的一者或多者具有相对于seqidno：455-558中的一者或多者和/或seqidno：955-1053和/或1153中的一者或多者的防御素序列部分放松的序列同一性。因此，编码多结构域防御素的每个防御素区域的多核苷酸序列可以与seqidno：455-558中的一者和/或seqidno：955-1053和/或1153中的一者的防御素序列部分至至少70％同一、至少75％同一、至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一。多结构域防御素的防御素区域可以进一步包含含有seqidno：455-558中的任一者和/或seqidno：955-1053和/或1153中的一者的防御素序列部分的至少50个、至少75个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个或至少200个连续核苷酸的片段。在一些实施方案中，片段编码具有由seqidno：455-558和/或seqidno：955-1053和/或1153中的一者的防御素序列部分编码的蛋白质的活性的蛋白质。编码多结构域防御素蛋白的一个或多个接头结构域或区域的多核苷酸序列还可以具有相对于seqidno：103-152放松的序列同一性。因此，编码多结构域防御素的接头区域的多核苷酸序列可以与seqidno：103-152中的一者至少70％同一、至少75％同一、至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一。实际上，编码本发明的多结构域防御素蛋白的多核苷酸可以包含与seqidno：1-51、203-328或1155中的任一者至少70％同一、至少75％同一、至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一的多核苷酸序列。然而，编码多结构域的一个或多个接头区域的多核苷酸序列也可以是在序列和长度方面高度可变的，与seqidno：103-152具有很少或几乎没有序列同一性或相似性。如上所述，接头区域还可以包含串联布置的两个或更多个接头序列，其中接头序列中的每一个可以包含seqidno：103-152中的一者，相对于seqidno：103-152具有放松的序列同一性的多肽序列，或其它序列。
如果存在的话，则编码多结构域防御素的n末端靶向信号(ts)序列和/或c末端序列的多核苷酸序列也可以具有相对于本文提供的序列放松的序列同一性。编码多结构域防御素的n末端靶向信号(ts)序列的多核苷酸序列可以与seqidno：663-808中的一者至少70％同一、至少75％同一、至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一。编码多结构域防御素的c末端序列的多核苷酸序列可以与表1中对seqidno：50和51标识的c末端序列中的一者至少70％同一、至少75％同一、至少80％同一、至少85％同一、至少90％同一、至少95％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一。然而，根据一些实施方案，多结构域防御素的n末端和/或c末端序列可以替代地为相对于本文提供的序列不相似或具有较低的序列同一性。
出于本发明的目的，两个多核苷酸或多肽序列的同一性百分比可以通过以下方式来确定：首先最佳地比对所述两个序列，然后确定在比较窗口上所述两个序列之间相同的核苷酸碱基或氨基酸残基的百分比，所述比较窗口可以超过所述两个序列中的一者的全长。最佳比对被定义为对比中的任何空位具有抗性或耐受性的两个序列的最佳拟合或匹配。在本领域中已知有许多计算机化程序和算法用于实现两个或更多个序列的最佳比对(gap、bestfit、fasta、blast、smith-waterman)。当最佳比对时，通过以下方式来确定主题序列与参考序列的同一性百分比：取所述两个序列之间匹配或同一的碱基或氨基酸的数目，除以参考序列的长度，然后将商乘以100％。
本发明的多结构域防御素还可具有特征性的结构特征，所述特征可能与所述多结构域防御素的杀虫和抗真菌活性有关。这些特征可以允许鉴定可以用于设计新颖的多结构域防御素的附加防御素。例如，本发明的多结构域防御素蛋白可以定义为包含以下特征：(a)pfamγ-硫素结构域(pf00304)，如通过使用为1e-3的e值截止搜索pfam蛋白家族数据库确定的(finn等人，nucleicacidsresearch，2014，数据库版本42：d222-d230)；(b)包含多于8个半胱氨酸残基的多肽；以及(c)包含两个或更多个由多肽接头序列分开的γ-硫素结构域(gxcxnc)的多肽，其中n为3-22个氨基酸长度，并且x是任何氨基酸。这些推定的md防御素可以进一步具有至少90个氨基酸或更长的蛋白质长度，并且在其编码序列中不存在任何提前终止密码子。此外，多结构域防御素的每个防御素区域可以定义为具有至少6个半胱氨酸残基或至少8个半胱氨酸残基，并且当如上所述折叠时具有预测的cys稳定化的αβ基序(csαβ)结构。然而，根据一些实施方案，一个或多个防御素区域可以各自具有较少的半胱氨酸，诸如在一个或多个防御素区域中4或5个半胱氨酸。因此，多结构域防御素可以具有至少8个半胱氨酸残基，或至少10个半胱氨酸残基，至少12个半胱氨酸残基，或至少14个半胱氨酸残基，和/或两个或更多个预测的csαβ结构基序。多结构域防御素还可以在功能上定义为具有对一种或多种植物真菌病原体的一定杀虫或抗真菌活性。
如上所述，本发明提供合成的2d或其它md防御素，所述防御素包含至少通过接头区域与第二防御素区域连接的第一防御素区域。多结构域防御素蛋白的防御素区域可以是同源的(即，防御素区域相同)或异源的(即防御素区域不同)。本发明的2d或md防御素可以包含防御素区域的天然组合(即，包含在天然多结构域防御素中存在的防御素区域的相同组合)或防御素区域的异源组合(即，包含在天然多结构域防御素中不一起存在和/或来源于不同防御素的防御素区域)。一个或多个防御素区域可以是相对于md防御素的一个或多个接头区域异源的。实际上，本公开的多结构域防御素可以包含可以相对于彼此同源或异源，但是相对于接头区域异源的防御素区域的天然组合。不受任何理论束缚，具有相对于至少一个防御素区域异源的接头区域的合成多结构域防御素当在植物或植物细胞中表达时可能倾向于累积至更高水平和/或赋予新的或改变的抗真菌或抗微生物活性。
如上文进一步所述，本公开的实施方案提供包含seqidno：455-558中的一者或多者和/或955-1053中的一者或多者的防御素序列部分的核酸和多核苷酸(诸如seqidno：1-51、203-328或1155)，以及由这些多核苷酸序列编码的防御素多肽或蛋白质。防御素多肽或蛋白质可以包含seqidno：559-662中的一者或多者和/或1054-1152中的一者或多者的防御素序列部分，诸如seqidno：52-102、329-454或1156。还提供了本文所述的核酸或多核苷酸序列中的任一者的互补序列。本发明的多核苷酸分子可以编码包含两个或更多个防御素结构域或区域的多结构域防御素多肽，诸如2d、3d、4d或其它md防御素蛋白。多结构域防御素的每个防御素区域通过一个或多个接头区域与所有其它防御素区域分开，其中至少一个接头区域存在于相邻或邻近的防御素区域之间。在具体实施方案中，多结构域防御素蛋白可以包含两个或更多个防御素结构域，每个防御素结构域包含4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个半胱氨酸残基。在如上所述的某些实施方案中，本文提供的多核苷酸分子可以定义为包含一个或多个核苷酸序列，每个核苷酸序列具有与seqidno：1-51、103-152、203-328、455-558、663-808、1155的全长序列和/或955-1053和/或1153的防御素序列部分至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。类似地，本文提供的多肽分子可以定义为包含一个或多个蛋白质序列，每个蛋白质序列具有与seqidno：52-102、153-202、329-454、559-662、809-954、1156的全长序列和/或1054-1152和/或1154的防御素序列部分至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
当在植物中表达时，本公开的多核苷酸序列可赋予植物增加的杀虫或杀真菌活性和/或增加的害虫或真菌防治。实际上，编码本公开的多结构域防御素的多核苷酸构建体可用于产生对一种或多种真菌病原体具有更大抗性或耐受性的转基因植物。此类杀虫或杀真菌活性可有效对抗镰刀菌属、炭疽菌属、狭壳柱孢属和/或层锈菌属物种中的一种或多种，诸如禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌、禾谷炭疽菌、玉米狭壳柱孢和/或豆薯层锈菌中的一种或多种。此类杀虫活性可以进一步有效对抗一种或多种其它微生物植物病原体和/或植物害虫，诸如卵菌、细菌、昆虫、线虫等。
本发明还提供了包含本文所述的多核苷酸序列的重组dna构建体，以及用所述重组dna构建体转化的植物、植物细胞和种子。在一个实施方案中，此类dna构建体可用于在植物中表达编码1d、2d或其它md防御素的核苷酸序列，以便保护植物免受植物害虫如一种或多种真菌的侵害。在另一个实施方案中，此类构建体可用于产生对植物真菌病原体具有增加的或增强的抗性或耐受性的转基因或重组植物。因此，本发明的实施方案还包括转化载体，所述转化载体包含本发明的防御素编码dna构建体或此类防御素编码dna构建体的一部分。根据一些实施方案，防御素编码dna构建体和载体可用于在微生物如细菌或酵母中产生1d、2d或md防御素转录物和/或蛋白质。
本发明的重组dna构建体、分子或载体可以包含多核苷酸表达盒，所述多核苷酸表达盒包含编码1d防御素或多结构域防御素蛋白的编码序列，其中所述编码序列可操作地连接至在植物细胞中有功能的启动子。或者，编码防御素的多核苷酸序列可以可操作地连接至适于在微生物中表达防御素蛋白的启动子。本领域已知的任何合适的启动子可用于在植物中表达本发明的防御素编码序列，所述启动子为诸如组成型、组织特异性、组织增强的或组织优选的、发育的、可诱导的、病害可诱导的启动子等。此外，可操作地连接至防御素编码序列的植物启动子可以相对于待用防御素编码dna构建体转化的植物物种是天然的、同源的或异源的，或者启动子可以是嵌合的或合成的。合成的核苷酸序列可以是不知道在自然界中是否存在或不是天然存在的核苷酸序列。通常，当与任何其它天然存在的核苷酸序列相比时，此类合成的核苷酸序列将包含至少一个核苷酸差异。应当认识到，本发明的基因调控元件包含合成的核苷酸序列。优选地，合成的核苷酸序列与天然序列共享很少的或没有延伸同源性。延伸同源性在此上下文中通常是指延伸超过连续序列的约25个核苷酸的100％序列同一性。本发明的合成基因调控元件包含合成的核苷酸序列。
用于表达防御素蛋白的多核苷酸编码序列也可以可操作地连接至一个或多个附加调控元件，诸如一个或多个增强子、前导序列、转录起始位点(tss)、接头、一个或多个5′和3′端非翻译区、一个或多个内含子、多腺苷酸化信号、终止区或序列等，所述调控元件适用于调控或允许多结构域防御素在植物细胞中的表达，或是调控或允许多结构域防御素在植物细胞中的表达所必需的。一个或多个此类附加的调控元件可以是任选的和/或用于增强或优化防御素转基因或编码序列的表达。术语“可操作地连接”是指两个序列之间的功能性连接。启动子或增强子通过影响、引起、驱动、促进转基因或编码序列的转录和表达等而可操作地连接至转基因或编码序列。
根据本发明的实施方案，关于dna分子、构建体、载体等的术语“重组”是指dna分子或序列在自然界中不存在和/或存在于其在自然界中不存在的环境中，包括包含在没有人为干预的情况下不会天然地、连续或紧靠在一起存在的dna序列的组合的dna分子、构建体等，和/或包含至少两个彼此异源的dna序列的dna分子、构建体等。重组dna分子、构建体等可以包含与天然存在于一个或多个此类dna序列附近的一个或多个其它多核苷酸序列分开的一个或多个dna序列，和/或与不彼此天然相邻的一个或多个其它多核苷酸序列邻近(或邻接)的dna序列。重组dna分子、构建体等也可以指已经在细胞外进行基因工程化和构建的dna分子或序列。例如，重组dna分子可包括任何合适的质粒、载体等，并且可以包括线性或环状dna分子。除了植物选择性标记基因等之外，可能此类质粒、载体等还可以含有各种维持元件，包括原核复制起点和选择性标记，以及表达防御素的转基因或盒。术语“重组”还可以进一步指由这些重组dna分子、构建体等表达或编码的蛋白质，如果所述蛋白质包含非天然序列的话。
如本文所用，关于dna分子、构建体、载体等的术语“分离的”可以指dna分子或序列在自然界中不存在和/或存在于其在自然界中不存在的环境中。术语“分离的”还可以指已经经历从更复杂的溶液或来源中分离或浓缩或富集的至少一个步骤的核酸分子。然而，术语“分离的”绝非意图将所述核酸分子限于特定的位置或状态，并且本发明将适用范围扩及引入细胞基因组时或存在于核酸分子已经导入细胞基因组的细胞的后代中时的核酸分子。
根据本发明的另一个广泛方面，提供了用包含防御素转基因或编码序列的重组dna分子或构建体转化植物细胞、组织或外植体以产生含防御素的转基因植物的方法。用重组dna分子在植物细胞中转化染色体的许多方法是本领域已知的，所述方法可以根据本发明的方法用来产生转基因植物细胞和植物。可以根据本发明的方法来使用本领域中已知的用于转化植物细胞的任何合适的方法或技术。用于转化植物的有效方法包括细菌介导的转化，诸如农杆菌(agrobacterium)介导的或根瘤菌(rhizhobium)介导的转化，以及微粒轰击介导的转化。用于植物转化的其它方法也是本领域已知的，包括但不限于基因编辑、定点整合、peg介导的转化、原生质体转化、电穿孔、显微注射、用二氧化硅/碳纤维搅拌、病毒介导的或脂质体介导的转化等。本领域中已知有多种方法用于使用转化载体、经由细菌介导的转化或微粒轰击来转化外植体，然后培养这些外植体以再生或发育转基因植物，等等。进一步提供了用于在植物细胞中可操作的启动子控制下，在一种或多种植物细胞或组织中表达本发明的多结构域防御素转基因的方法。此类方法可用于赋予植物抗真菌和杀虫特性并对抗真菌感染。
靶植物材料或外植体的转化可以在营养培养基上的组织培养物中实施，所述营养培养基为例如允许细胞在体外生长的营养物的混合物。受体细胞靶标或外植体可包括但不限于分生组织、茎尖、原生质体、下胚轴、愈伤组织、未成熟或成熟的胚芽、幼株、芽、节面、叶、配子细胞(诸如小孢子、花粉、配子和卵细胞等)，或其任何合适的部分。设想可以再生或生长/发育可育植株的任何可转化细胞或组织可以用作转化的靶标。如本领域已知的，经转化的外植体、细胞或组织可以经受附加的培养步骤，诸如愈伤组织诱导、选择、再生等。可以根据本领域已知的方法将含有重组dna插入的经转化细胞、组织或外植体在培养基、穴盘(plug)或土壤中生长、发育或再生成转基因植物。转基因植物可以进一步与自身自交或与其它植物杂交以产生转基因种子和后代。还可以通过将包含重组dna序列或转化事件的第一植株与缺乏所述插入的第二植株杂交来制备转基因植物。例如，可以将重组dna序列引入易于转化的第一株系中，然后可以将所述第一株系与第二株系杂交以将重组dna序列渐渗至第二株系中。这些杂交的后代可以进一步多次回交以变成更理想的株系，诸如经由6至8个世代或6至8次回交，以产生具有与原始亲本系基本相同的基因型、但用于导入重组dna序列的后代植株。
本发明的重组dna分子或构建体可以包括在dna转化载体中，以用于转化靶植物细胞、组织或外植体。除了表达防御素的转基因或表达盒之外，本发明的此类转化载体通常还可以包含对于有效转化必需或有益的序列或元件。对于农杆菌介导的转化，转化载体可以包含经工程化的转移dna(或t-dna)区段或区域，所述区段或区域具有两个边界序列，即左边界(lb)和右边界(rb)，所述边界序列侧接有至少表达防御素的转基因或者盒，以使得t-dna插入植物基因组将产生防御素转基因或盒的转化事件。换句话说，防御素转基因将位于t-dna的左边界与右边界之间，可能还有附加的转基因或表达盒位于t-dna的左边界与右边界之间，诸如农艺学上受关注的植物选择性标记转基因和/或其它基因，所述农艺学上受关注的植物选择性标记转基因和/或其它基因可以赋予植物农艺学上受关注的特征或表型。除了蛋白质编码序列外，农艺学上受关注的基因还可包含编码rna抑制元件的多核苷酸序列。根据替代实施方案，编码防御素的转基因或盒以及植物选择性标记转基因(或其它农艺学上受关注的基因)可以存在于相同或不同重组dna分子上的单独t-dna区段中，诸如以进行共转化。转化载体或构建体可以进一步包含原核维持元件，对于农杆菌介导的转化，所述原核维持元件可以位于t-dna区域外的载体骨架中。
由于存在选择剂如抗生素或除草剂，所以本发明的转化载体或构建体中的植物选择性标记转基因可用于帮助选择转化的细胞或组织，其中所述植物选择性标记转基因提供对选择剂的耐受性或抗性。因此，选择剂可偏向或有利于表达植物选择性标记基因的转化细胞的存活、发育、生长、增殖等，诸如以增加r0植株中转化细胞或组织的比例。常用的植物选择性标记基因包括例如赋予对抗生素(诸如卡那霉素和巴龙霉素(nptii)、潮霉素b(aphiv)、链霉素或壮观霉素(aada)和庆大霉素(aac3和aacc4))的耐受性或抗性的那些，或者赋予对除草剂如草铵膦(bar或pat)，麦草畏(dmo)和草甘膦(aroa或epsps)的耐受性或抗性的那些。还可以使用提供视觉筛选转化体的能力的植物可筛选标记基因，诸如荧光素酶或绿色荧光蛋白(gfp)，或者表达β葡糖醛酸酶的基因或各种生色底物是已知的uida基因(gus)。
本文另外提供了用本发明的重组dna构建体或载体转化的转基因植物、植物部分，繁殖体和植物细胞，所述重组dna构建体或载体具有编码多结构域防御素的多核苷酸序列。此类转基因植物、植物部分或植物细胞可以包含本发明的编码防御素的重组dna构建体或序列到所述植物的至少一个植物细胞的基因组中的转化事件或插入。包含编码防御素的dna构建体或序列的转基因植物可以通过任何合适的转化方法产生，所述转基因植物可以接着根据期望或需要进行选择、培养、再生、发育等以产生转基因r0植株，所述植株可以随后自交或与其它植株杂交以产生r1种子和后续子代，并通过附加的交配选种，等等。类似地，本发明的实施方案还包括包含一个或多个转基因细胞的植物细胞、组织、外植体等，所述转基因细胞具有包含编码防御素的转基因、构建体或序列的重组dna或多核苷酸序列的转化事件或基因组插入。相对于不具有编码防御素的转基因的野生型或对照植株，包含编码防御素的转基因的转基因植株可以具有增加的对一种或多种植物害虫或真菌的抗性或耐受性和/或增加的抗真菌性质或活性。
出于本发明的目的，“植株”可以包括在再生或发育的任何阶段的外植体、胚芽、幼苗、小植株或全株。如本文所用，“转基因植株”是指这样的植株，所述植株的基因组已经通过整合或插入重组dna分子、构建体或序列而改变。转基因植株包括从一个或多个最初转化的植株细胞发育或再生的r0植株，以及在随后的世代或交配中来自r0转基因植株的后代转基因植株。如本文所用，“植物部分”可以指植物的任何器官或完整组织，诸如分生组织、发芽器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花或花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药、花粉和胚珠)、种子(例如，胚芽、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟的子房)、繁殖体或其它植物组织(例如，插条、维管组织、基本组织等)、愈伤组织、原生质体或它们的任何部分。本发明的植物部分可以是有活力的、无活力的、可再生的和/或不可再生的。“繁殖体”可以包括能够生长成全株的任何植物部分。如本文所用，“转基因植物细胞”仅指用稳定整合的重组dna分子或序列转化的任何植物细胞。转基因植物细胞可以包括最初转化的植物细胞、再生或发育的r0植株的转基因植物细胞，或来自转化的r0植株的任何后代植株或子代的转基因植物细胞，包括植物种子或胚胎的细胞，或培养的植株或愈伤组织细胞等。
可以分析转化的植株中编码防御素的序列或转基因的存在和/或所述序列或转基因在植物或植物细胞或组织中的表达水平和/或分布。本领域技术人员知道可用于分析转化的植株的许多方法。例如，用于植株分析的方法包括但不限于dna印迹或rna印迹、基于pcr的方法、生物化学分析、表型筛选方法、以及免疫印迹测定法。可转录的dna分子或转基因的表达可以例如使用如制造商所描述的
包含编码防御素的多核苷酸序列或构建体的本发明的“转基因”植物可以是任何农业作物物种。所述物种可以是单子叶植物或双子叶植物。特别有用的植物可包括但不限于小麦、胡萝卜、高粱米、大麦、大豆、马铃薯、玉米、芸苔、油菜、番茄、苜蓿、花生、甘蔗和棉花。所述植物可以是r0转基因植株(即，源自原始转化组织的植株)。所述转基因植物也可以是源自原始r0转基因植株的任何世代的后代植株，诸如通过任何已知的交配、渐渗、转化或繁殖植物的方法获得的。
本发明还提供了用于产生具有增加的害虫抗性或耐受性和/或杀虫活性的转基因植物的方法，所述方法包括将编码如本文所述的防御素蛋白的重组dna构建体导入或转化至植物中。此类方法可以进一步包括：使所述植株生长以产生另一世代；以及从所述另一世代中选择包含重组dna构建体的至少一个植株，其中所述植株相对于不包含重组dna构建体的对照植株具有增加的害虫抗性或耐受性和/或抗真菌活性。还提供了一种用于产生具有增加的害虫抗性或耐受性和/或杀虫活性的植物的方法，所述方法包括使本发明的转基因植株与其自身自交或与第二植株杂交以产生至少第一后代植株，其中所述后代植株包含增加的害虫抗性或耐受性。来自包含所述重组dna构建体并且具有增加的杀虫活性和/或害虫抗性或耐受性的植株的种子可以从任何数量的来源获得。
根据本发明的另一方面，提供了杀虫组合物，所述杀虫组合物包含具有杀虫或抗真菌活性的本发明的防御素多肽或蛋白质。此类杀虫组合物可以进一步包含可有效对抗一种或多种昆虫、线虫、微生物、真菌、线虫或病毒的其它化合物或活性杀虫分子。包含一种或多种本发明的重组防御素的这些杀虫组合物可以被配制成固体或液体和/或作为局部应用、叶面应用、土壤应用或颗粒应用或处理施用以预防或抑制真菌感染和/或其它植物虫害。其它类型的植物害虫的实例包括昆虫，线虫，杂草，微生物如细菌、真菌和病毒，等等。用于配制本发明的杀虫组合物的方法可以类似于本领域中已知的用于其它杀虫配方的方法。本发明的杀虫组合物的成分或组分可以包括一种或多种载体、稀释剂、表面活性剂，或本领域已知的其它配方成分。
实施例
实施例1.具有两个或多个防御素区域的防御素的鉴定
植物防御素是包含n末端信号肽和防御素区域的小型多肽，所述防御素区域包含约50个氨基酸并且通常具有6至8个半胱氨酸。本发明提供了新的多结构域防御素，其包含通过短接头区域连接的两个防御素区域(2d防御素)或多个防御素区域(md防御素)。这些2d或md防御素中的许多被进一步发现包含n末端转运信号(ts)序列或区域，所述序列或区域通常可以变成从蛋白质的其余部分切下以产生成熟的防御素蛋白质。还发现所述2d或md防御素中的一些包含c末端延伸序列。
为了鉴定新颖的多结构域防御素，挖掘和分析来自19种不同植物物种的基因组和转录组序列以鉴定具有防御素的一种或多种结构或功能特征特性的较长多肽序列。满足以下标准的多肽被鉴定为多结构域防御素并经进一步分析：(a)包含pfamγ-硫素结构域(pf00304)的多肽，如通过使用为1e-3的e值截止搜索pfam蛋白家族数据库确定的(finn等人，nucleicacidsresearch，2014，数据库版本42：d222-d230)；(b)包含至少100个氨基酸的多肽；(c)包含至少8个半胱氨酸残基的多肽；以及(d)包含两个或更多个由短多肽接头序列分开的延伸γ-硫素结构域(gxcxnc)的多肽，其中n为3-22个氨基酸长度，并且x是任何氨基酸。这些推定的多结构域防御素通过在它们的编码序列中不存在提前终止密码子而被进一步鉴定。
通过挖掘以下19种植物基因组的基因组，鉴定了共51种主要包含2d防御素的多结构域防御素蛋白(参见下文)：琴叶拟南芥(arabidopsislyrata)、阿拉伯芥(arabidopsisthaliana)、芸苔(brassicarapa)、甘蓝型油菜(brassicanapus)、番木瓜(caricapapaya)、克莱门柚(citrusclementina)、甜橙(citrussinensis)、厚皮甜瓜(cucumismelo)、黄瓜(cucumissativus)、大豆(glycinemax)、地肤(kochiascoparia)、苹果(malusdomestica)、蒺藜状苜蓿(medicagotruncatula)、马齿苋(portulacaoleracea)、桃(prunuspersica)、野芥菜(raphanusraphanistrum)、布兰达蔷薇(rosablanda)、白车轴草(trifoliumrepens)和玉蜀黍(zeamays)。在许多植物物种中检测到这些多结构域防御素的mrna转录物及它们的发现支持以下结论：这些多结构域防御素在植物中表达。
实施例2.对多结构域防御素的注释
使用手动调用、多序列比对和n末端切割位点(signalp)预测的组合进一步分析通过上述标准鉴定的全长多结构域蛋白质序列，以鉴定和定位n末端ts或信号肽序列、防御素区域、插入的接头区域，以及c末端延伸。接头区域被鉴定为位于n末端侧上的防御素区域的最后半胱氨酸残基与c末端侧上的防御素区域中的第一个半胱氨酸残基上游的一个或两个氨基酸之间。所鉴定的2d或md防御素的接头区域的c末端位置的确定是基于在接头区域的c末端侧上的下游防御素区域的预测切割位点的预期位置，但是与在n末端ts序列与相邻的防御素区域之间的切割位点不同，此位点可能通常不会被切割。
从19种植物基因组中鉴定的51个多结构域防御素序列显示于表1和表2中。seqidno：1-51代表新鉴定的2d或md防御素的核苷酸编码序列，而seqidno：52-102代表这些鉴定的2d或md防御素的相应多肽序列。对于所鉴定的2d和md防御素中的每一者，在表1和表2中分别针对dna和蛋白质序列显示了防御素区域(d1、d2等)、接头区域(l1、l2等)、n末端转运信号(ts)序列和c末端(ct)延伸序列(如果存在的话；如果不存在的话则“不适用”)中的每一者的序列边界(起始和终止位置)。表1中还提供了全长编码序列(cds)。这些2d或md防御素的防御素组分对应于表1和表2中注释的各个防御素区域。为了说明，“araly_afp26”在核苷酸水平上的防御素组分对应于seqidno：1的核苷酸位置82-207(d1)和229-372(d2)，而“araly_afp26”在蛋白质水平上的防御素组分对应于seqidno：52的氨基酸位置28-69(d1)和77-124(d2)。
实施例3.从多结构域防御素中鉴定接头区域
在检查所发现的多结构域植物防御素后，在所述防御素区域之间鉴定到了接头区域。从2d和md防御素鉴定的独特接头区域显示于表3中。seqidno：103-152代表编码这些鉴定的防御素接头区域的核苷酸序列，而seqidno：153-202代表这些防御素接头区域的相应多肽序列。如在表3中可以看出，从这些md防御素中鉴定出了50个独特的接头区域dna和蛋白质序列，因为4d防御素(zm_afp100)的接头区域中的两个接头区域是相同的(seqidno：152和202)。这些鉴定的md防御素中的每一者的n末端ts序列和c末端延伸序列(当存在时)通过上面的表1和表2中的序列位置注释而进一步显示。观察到ts序列(如果存在的话)的长度从几个氨基酸变化至超过30个氨基酸，并且c末端延伸序列通常不存在于所鉴定的2d防御素中，但存在于可变长度为约35-50个氨基酸的2d防御素(zm_afp101)和4d防御素(zm_afp100)中。发现大多数接头富含脯氨酸，而其它接头富含甘氨酸或带电氨基酸。所述接头中的许多接头的长度为约10-20个氨基酸，但是接头的一个小子集具有仅有少量氨基酸的非常短的接头或20-65个氨基酸的较长接头序列长度。
表3.2d和md防御素接头区域。
实施例4.合成多结构域防御素的设计
在此实施例中，合成的同源二聚2d防御素被设计和构建为包含同源单结构域(1d)防御素的两个拷贝，例如mtdef4(核苷酸seqidno：1029；多肽seqidno：1128)或coix22(核苷酸seqidno：990；多肽seqidno：1089)，所述两个拷贝通过来源于本文所述的天然2d或md防御素的各种接头区域连接。在玉米原生质体中评定合成多结构域防御素，所述合成多结构域防御素包含coix22防御素区域并且具有由17个不同的接头区域(在表4中标识)链接或连接的核酸序列seqidno：203-219(分别编码蛋白质序列seqidno：329-345)中的一者。也在玉米和大豆原生质体中评定合成多结构域防御素，所述合成多结构域防御素包含mtdef4防御素区域并且具有使用如在表4中标识的相同接头区域的核酸序列seqidno：220-236(分别编码蛋白质序列seqidno：346-362)。关于与这17个接头区域相对应的序列标识符，进一步参见表3和表5。
在此实施例中还描述了如在使用coix22、接头mt.afp65(核苷酸seqidno：134；多肽seqidno：184)和amaru.afp10(核苷酸seqidno：963；多肽seqidno：1062)的核苷酸seqidno：1155和多肽seqidno：1156中所述的合成异源二聚防御素的设计。从这些合成的多结构域2d防御素的n末端防御素区域去除终止密码子。防御素n末端转运信号(ts)结构域维持在n末端防御素区域的n末端，但是从c末端防御素区域的n末端去除。这些合成防御素的图示实例示出于图1中(l1、l2和l3是指源自在本文中鉴定的不同2d防御素的接头)。
实施例5.玉米和大豆植物细胞中1d防御素对照2d防御素的蛋白积累
a.玉米原生质体中的蛋白积累
选择合成实施例4中描述的合成同源二聚2d防御素，并以puc57克隆载体递送。使用聚合酶链式反应(pcr)扩增和限制性消化来扩增编码来自puc57载体的合成2d防御素的序列，然后将扩增的序列连接到包含与合成2d防御素的编码序列连接的35s启动子的原生质体表达载体中。用表达天然1dcoix22或包含通过接头区域连接的coix22防御素结构域/区域的合成2d防御素的原生质体表达质粒载体转化从玉米叶肉叶组织分离的原生质体。对于这些合成2d构建体，同源二聚coix22防御素区域是相对于接头区域异源的。在转化后，将原生质体裂解，并使用针对天然1dcoix22产生的兔多克隆抗体对总蛋白质进行标准western免疫印迹。将与辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗兔抗体用作二抗，并用supersignalwestfemto试剂盒(thermofisherscientific，waltham，ma)显现印迹。在western印迹后，对膜进行考马斯染色以确认相等的样品加载。对纯化的全长ci_afp22的稀释液进行western印迹，并将所得条带进行光密度测定成像(imagerlab5.1)并用于创建标准曲线。然后将标准曲线用作比较基准来量化在玉米原生质体中表达的1d和2dci_afp22蛋白。
将同源二聚coix22结构域与各种异源接头序列(参见表4)的组合的蛋白积累与coix221d防御素组分的蛋白积累进行比较。在这些实验中，许多合成的2d防御素蛋白似乎相较于它们的1d防御素对应物积累至更大的水平。虽然所测试的合成2d防御素中的一者，即由mt77l5(核酸seqidno：218；蛋白质seqidno：344)连接的同源二聚coix222d在大豆和玉米原生质体中都被切割，但是在所测试的合成2dcoix22防御素的剩余防御素中未观察到切割产物。因此，提议可以利用接头区域来增强植物中2d和md防御素的积累，以便能够更有效地防治植物病原体和/或害虫。
b.转基因大豆植物中的蛋白积累
建立表达具有不同异源接头的coix22和sixcoix22同源二聚2d防御素的转基因大豆植物，在v2处收集样品并冻干，然后进行rna和蛋白质定量。使用具有针对所关注的蛋白产生的兔igg一抗和抗兔山羊二抗的间接elisa进行蛋白定量。使用两种浓度的标准蛋白质来计算检测到的蛋白，然后将所述检测到的蛋白用所提取的总蛋白归一化。quantigene技术经由核酸杂交平台直接测量rna，其中经由与磁微珠缀合的多个寡核苷酸探针的协同结合来捕获靶rna。具有对靶序列的特异性的多个寡核苷酸探针的协同结合导致特别高的测定特异性。经由支链dna扩增仪的扩增和荧光信号进行对此寡核苷酸复合物的检测，所述荧光信号通过微珠的高通量流式细胞术分选进行数字计数。rna和蛋白质水平的结果示出在图2中。虽然1dcoix22与同源二聚coix222d防御素之间的rna差异不显著，但即使在归一化蛋白质大小的差异后，五种2d蛋白中的三种以比单一结构域更高的水平表达(使用接头bn36l1的2d防御素增加2.25倍，使用接头bn35l1的2d防御素增加2倍，并且使用接头citc12l17的2d防御素增加1.6倍)。这些结果表明，多个结构域可以经由增加在转基因大豆植物中的稳定性来帮助蛋白质积累。
实施例6.评定多结构域防御素活性的方法
在此实施例中，测试合成2d防御素及其1d防御素对应物抑制若干种真菌物种生长的能力。将所述防御素在毕赤酵母细胞中表达，并纯化以用于如下所述的真菌平板测定。
使用毕赤酵母细胞进行防御素生产
针对毕赤酵母设计并含有毕赤酵母信号肽的构建体由biobasic公司合成。为清楚起见，用于这些实验的此种“毕赤酵母信号肽”不同于防御素蛋白的n末端ts序列，并且可以与ts序列共存。毕赤酵母信号肽用于使合成蛋白能够从毕赤酵母细胞分泌，以促进收集和蛋白质纯化。将大约5μg的dna线性化、纯化，并通过电穿孔转化到电感受态pichiapinktm细胞(thermoscientific)中。在恢复后，将细胞接种到毕赤酵母腺嘌呤缺陷(pad)选择平板上，并在29℃下温育3天。将来自每次转化的一个菌落培养3天以获得生长晕。然后收集细胞团块并用含有甲醇的培养基诱导。培养细胞并每天补充甲醇达另外3天。收集细胞团块并使用所述培养基进行纯化。纯化毕赤酵母表达的防御素蛋白的方法取决于所述防御素蛋白的预期等电点(pi)。
使用阳离子交换纯化pi＞7的防御素。将培养基用ph5.0的50mm乙酸钠以8∶1的比率稀释，并使用真空歧管穿过sp琼脂糖树脂(gehealthcare#17-0729-01)。将树脂用ph5.0的50mm乙酸钠洗涤，并用含有1mnacl的ph5.0的50mm乙酸钠以两倍树脂体积洗脱。
使用阴离子交换纯化pi＜7的防御素。将培养基用ph9.0的50mmches以8∶1的比率稀释，并使用真空歧管穿过q琼脂糖树脂(gehealthcare#17-0510-01)。将树脂用ph9.0的50mmches洗涤，并用含有1mnac1的ph9.0的50mmches以两倍树脂体积洗脱。
缓冲液置换和浓度。使用pura-a-lyzermaxi3500透析管(sigma#purx35050)将纯化蛋白在ph8的8mmtrishcl中透析过夜。通过在pura-a-lyzer管中干燥来浓缩所得溶液，直至实现400-450μl的最终体积。
真菌生长条件
真菌首先根据表5中的条件生长3-4周或更短，具体取决于所示的真菌物种。
表6.真菌生长条件。
用于真菌生长抑制的平板功能测定
在1d和2d防御素蛋白的表达和纯化以及培养物中真菌物种的生长之后，以平板测定测试单独的防御素抑制真菌生长的能力。在生长测试测定当天，收集测试培养基中的真菌，过滤，并重悬至如表7所示的适当滴定度。
表7.真菌生长抑制测定的条件。
将20μl的每种根据表7的真菌溶液加入20μl纯化防御素蛋白中，然后在96孔可视平板(perkinelmer)中在ph8.0的20mmtrishcl中进行测试。将平板用石蜡膜密封，并在透明湿度箱中在根据表8的温度和条件下温育达预定时间段，然后对防御素存在下的真菌生长进行成像。
表8.真菌与防御素一起温育的条件和时间。
使真菌生长成像
使用perkinelmeroperetta高内涵成像仪，使用明场设置和10倍物镜对平板进行可视成像。根据所测试的特定真菌物种，根据表9中提供的评级或标准对所存储的图像进行评分。每个可视抑制评分是两次平行测定的平均，每个平行测定使用至多4个视野。
表9.抑制真菌生长的评分。
实施例7.多结构域防御素的真菌抑制活性
a.在平板测定中2d防御素抑制真菌生长
将本发明的18种天然2d防御素在上述体外平板测定中测试，并与它们的1d防御素对应物进行比较，以确定2d防御素是否对表9中列出的真菌病原体具有活性。这19种2d防御素在表10中标识，并且它们的序列在上面的表1和表2中提供(它们的接头序列也在表3中提供；并且相应的蛋白质序列可以根据所列出的核苷酸序列确定)。还将2d防御素的抗真菌活性与它们同源或组成1d防御素进行比较，以确定它们的效力和活性谱是否相对于它们的1d组分增强。将所测试的1d或2d防御素在毕赤酵母中表达并如上所述进行纯化。将每种防御素的真菌抑制评分计算为所进行的平行测定的平均值。
表10.2d防御素的真菌抑制活性。
如表10中所示，这些天然2d防御素中的一些能够抑制在此平板功能测定中所测试的真菌病原体的生长。测量并比较在真菌生长测定中使用的一些防御素制备物的蛋白浓度(ppm)。在此实验中，发现所述不同2d防御素中的至少一种具有针对每种所测试的真菌物种的活性。在蛋白浓度经测量并确定为大于20ppm的情况下，观察到了所述防御素蛋白对一种或多种病原体的抑制活性。
b.表达maldo_afp11的转基因玉米植株具有增强的抗病性
产生表达maldo_afp11(核苷酸seqidno：31和多肽seqidno：82)的转基因玉米植株并在温室中生长。在vt生长阶段，通过伤害茎秆并将禾生炭疽菌接种体的悬浮液注入伤口来感染两个节。在接种后约2-3周评估玉米植株。收获茎秆，去除叶子并将茎秆纵向劈开。将病害严重程度报告为切割表面的坏死百分比，并与未转化植物的坏死百分比进行比较。与对照相比，所测试的9个转基因玉米事件中的5个转基因玉米事件显示为具有显著的病害减少，p值＜0.05。
实施例8.用合成多结构域防御素进行真菌抑制
将包含通过接头区域连接或桥接在一起的两个相同防御素区域的合成2d防御素与1d防御素进行比较。如上文实施例5中所示，当在玉米和大豆原生质体体系中表达时，这些较长的2d防御素中的许多相对于它们的1d对应物表现出增加的积累，此可能是由于它们的大小增加。在原生质体中积累至较高水平的合成2d防御素也倾向于在平板测定中具有针对真菌病原体的增强或改变的活性。
coix22(pht000006；核苷酸seqidno：990；多肽seqidno：1089)和mtdef4(pht000025；核苷酸seqidno：1029；多肽seqidno：1128)是显示为对真菌病原体具有活性的1d防御素。将这些coix22和mtdef4结构域与异源防御素接头区域融合以创建新的合成2d防御素，所述新的合成2d防御素类似于上述实施例4和实施例5中表达的那些，但经修饰以在毕赤酵母中表达。测试来自从不同植物物种中鉴定的2d防御素的17种独特防御素接头的产生活性2d防御素的能力。从毕赤酵母表达载体表达每种合成防御素，并将蛋白质纯化和在体外测试上述活性。将1dcoix22和mtdef4防御素用作对照。这些合成2d防御素的真菌抑制活性或评分显示在表11、表12和表13中。表12和表13提供了标准化为1μm或0.5μm蛋白质浓度的这些真菌抑制活性或评分。这些真菌抑制评分的标准化允许在没有它们的可变蛋白积累水平影响的情况下更直接地比较这些2d和1d防御素的内在抗真菌活性。
实施例9.用合成多结构域防御素进行真菌抑制
如实施例8中所证明的，防御素区域可以通过接头区域序列连接以创建具有功能活性的合成或嵌合2d防御素，并测试所述防御素的抗真菌活性。通过用16种异源接头中的一个(17种接头中的一个是所述2d防御素的天然接头)替换天然接头区域来测试来自不同2d防御素的十七种接头区域与五种天然2d防御素区域的组合。基于2种防御素区域中的半胱氨酸，从一组17个2d防御素中选择五种天然2d防御素。两种防御素mt_afp14和bn_afp79代表最常见的8∶8类2d防御素。bn_afp79和mt_afp65代表8∶10类的防御素，而mt_afp60代表7∶9类防御素。参见表1和表2，所述表格提供了这些天然2d蛋白的序列标识符。对于2d防御素，此x∶y命名法是指两个防御素区域中半胱氨酸的相对数量。例如，8∶10类是指在第一防御素区域中具有8个半胱氨酸并且在第二防御素区域中具有10个半胱氨酸的2d防御素。在平板测定中测试总共80个构建体(5种天然2d防御素中的16种异源接头区域)和三个对照的真菌抑制活性。可用于这些构建体中的57个的数据显示在下表14中。还测试了五种天然2d防御素中的每一种(即，没有接头交换)。结果显示在表14中。如上所述将蛋白质在毕赤酵母中表达并进行纯化。
表14.合成的嵌合2d防御素的真菌抑制活性。
此数据表明接头具有将两个防御素区域连接在一起以创建对一种或多种真菌病原体具有活性的合成2d防御素的广泛能力。所测试的十七种接头中的八种(bn35l11、bn47l2、bn74l3、bn75l13、citc12l17、citcl3l14、maldo11l12和mt65l8)显示出在不同的防御素背景下工作的希望。合成的多结构域防御素或2d防御素中的许多在具有针对不同真菌病原体的新的或改变的活性谱潜力的植物原生质体中具有较高水平的蛋白积累。
实施例10.用合成的异源二聚2d防御素减少转基因大豆植物中的病害
建立表达异源二聚2d防御素c1.afp22/接头mt.afp65/amaru.afp10(核苷酸seqidno：1155和多肽seqidno：1156)的转基因大豆植物并在生长室的土壤中生长，并在v2阶段用含有豆薯层锈菌(亚洲大豆锈病的病原体，asr)的病原体悬浮液接种。在接种后12-14天对植物的叶感染百分比进行评分。将所述评分与用空载体转化的植物的评分进行比较。与对照植物相比，表达异源二聚2d防御素的转基因大豆植物显示出显著的病害减少。
表15.表达异源二聚2d防御素的转基因大豆植物。
*平均值是统计学上不同的，p＜0.05
实施例11.能够抑制真菌生长的1d防御素
还鉴定了可以在设计合成2d防御素或其它md防御素时单独使用或作为防御素区域/结构域使用的若干种天然1d防御素。表16提供了天然1d防御素的列表，所述天然1d防御素具有核苷酸和蛋白质序列标识符并且经注释以标识不同序列区域或结构域之间的边界。表16中列出的九十九(99)种防御素是基于它们在上文于实施例6中描述的真菌平板测定中的活性而选择的。在所测试的413种1d防御素蛋白中，表16中列出的99种1d防御素在针对上述表中列出的五种真菌中的至少一种的至少两次重复实验中具有为2或更高的平均真菌生长抑制评分。
如上文所类似描述的，针对所列出的每个1d防御素标识出了限定编码n末端ts序列(ts_开始，ts_结束)、防御素序列部分(def_开始，def_结束)和c末端延伸序列(ct_开始，ct_结束；如果存在的话)的多核苷酸序列的边界的多核苷酸序列位置。基于表16中提供的信息，通过将核苷酸位置除以三(一个氨基酸对应于一个由三个核苷酸组成的密码子)，可以辨别由表15中的多核苷酸序列编码的1d防御素的n末端ts序列、防御素序列部分和c末端延伸序列(如果存在的话)的对应蛋白质序列边界。作为示例性说明，1d防御素蛋白“araly_afp15”具有83个氨基酸的氨基酸长度，其中其ts序列对应于seqidno：1054的氨基酸1-19，其防御素序列部分对应于seqidno：1054的氨基酸20-75，并且其c末端延伸序列对应于seqidno：1054的氨基酸76-83。
实施例12.表达1d防御素的转基因大豆植物具有增强的对豆薯层锈菌的抗病性
建立表达表17中列出的1d防御素的转基因大豆植物并在生长室的土壤中生长，并在v2阶段用含有大豆锈病病原菌豆薯层锈菌的病原体悬浮液接种。在接种后12-14天对植物的叶感染百分比进行评分。在表17中将病害减少报告为相对于阴性对照(用空载体转化的植物)的病害百分比。这些结果表明，表达1d防御素c1.afp44、erate_afp29或erate_afp30的转基因大豆植物具有增强的对豆薯层锈菌的抗性。
表17.对表达1d防御素的转基因大豆植物的病害测试
实施例13.表达pinsy.afp1的转基因大豆植物具有增强的对豆薯层锈菌的抗病性
产生在如seqidno：1158所示的合成启动子的控制下表达密码子优化的pinsy.afp1基因(seqidno：1157)的转基因大豆植物。对表达pinsy.afp1(多肽seqidno：1107)的转基因植物进行田间试验，以利用多个种植日期评定植物对豆薯层锈菌的抗性。使用针对两个种植日期中的每一者的随机完全区组设计来进行所述田间试验。在整个田间试验季节中对功效参数进行评分，并在所述季节结束时测定产量。一旦在野生型地块中观察到asr，就通过以14天间隔对病害流行率评分3次来测量性状功效。病害评级采取为1-9的总体地块感染评级(rst)和地块中的病害感染百分比(dppf)。利用功效数据计算病害进展曲线下的面积(audpc)以确定每个事件的总体抗病性。数据呈现于表18中。
表18.作为病害感染评级(rst)和病害感染减少百分比(dppf)的田间试验功效结果
*病害显著减少，p≤0.1
**病害显著减少，p≤0.05
对照植物的平均病害评级为31.9。转基因pinsy.aflp1大豆事件1、事件2、事件3和事件4的平均作物病害损伤评级分别为26.3、21.0、26.3和22.8。对于测试的所有事件，在0.10处病害减少评级的最小显著性差异(lsd)为7.4。利用疾病进展曲线下的面积(audpc)的非转基因对照的平均病害百分比为319.4。转基因pinsy.afp1大豆事件1、事件2、事件3和事件4的作物病害损伤百分比的平均audpc分别为117.7、95.4、207.8和163.6。对于测试的所有转基因事件，在0.10处的audpc病害减少百分比的最小显著性差异(lsd)为99.7。这些结果表明，表达pinsy.afp1的所有转基因大豆事件已经增强了对豆薯层锈菌的抗病性。
实施例14.表达1d防御素的转基因玉米植物具有增强的抗病性
产生表达1d防御素的转基因玉米植株并在温室中生长。在vt生长阶段，通过伤害茎秆并将禾生炭疽菌接种体的悬浮液注入伤口来感染两个节。在接种后约2-3周评估玉米植株。收获茎秆，去除叶子并将茎秆纵向劈开。将病害严重程度报告为切割表面的坏死百分比，并与未转化植物的坏死百分比进行比较，如表19所示。如表19所示的表达防御素ambtr_afp7、cl_afp22，cl_afp44、erate_afp95、ph_afp2或pinsy_afp1的转基因玉米植物具有增强的对禾生炭疽菌的抗病性。进一步测试表达防御素ph_afp2的转基因玉米植株对其它病原体的抗性，并且所述转基因玉米植株显示出具有增强的对玉米狭壳柱孢、轮枝镰刀菌、禾谷镰刀菌的广谱抗病性。
表19.表达1d防御素的转基因玉米植物具有增强的抗病性
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由于可以在不脱离本发明的范围的情况下对本文所描述和说明的构型和方法进行各种修改，因此在前面的描述中包含或在附图中示出的所有内容应当被解释为说明性而非限制性。本发明的广度和范围不应受上述任何示例性实施方案中的任一者的限制，而应仅根据本文所附的权利要求书及其等同物来限定。本说明书中引用的所有专利和非专利文献均全文以引用方式并入本文。
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