本发明涉及应用于疫苗接种和基因疗法的药物领域和基因递送领域。更具体地，本发明涉及用于用重组载体(例如质粒载体、病毒载体和重组病毒)表达两种转基因的有效和平衡的双向启动子。
背景技术：
：：重组载体广泛用于各种分子生物学应用中以表达异源蛋白质，包括例如它们应用于基因疗法和疫苗接种中。对于这些基因疗法和疫苗接种应用，载体(包括病毒载体)被用作待引入宿主细胞的感兴趣的一种或多种基因的载体。例如，病毒载体可用于表达编码所希望的抗原以引发免疫应答的基因或其部分。最早的病毒载体典型地仅包括一个转基因，并且针对早世代载体发表了许多策略。例如，已发表的策略报告了各种不同腺病毒(rad)载体的用途，并且显示了转基因表达盒可以被置于rad的不同区域(例如在e1区域、e3区域中、或在e4和右itr之间)。然而，对于用作疫苗，通常需要多于一种抗原或来自若干不同菌株的相同抗原来实现保护和广泛覆盖。因此，在某些情况下，希望的是由一种载体表达至少两种抗原。已经描述了在一种病毒载体中编码两种抗原的不同方法。在最早的用rad的两种抗原方法中，将一种抗原表达盒置于e1区域中，并将第二种抗原表达盒放置在e3区域中(例如(vogels等人，2007))。在用rad的不同的两种抗原方法中，将一种抗原表达盒放置于e1中并将第二种抗原表达盒放置在e4和右itr之间(例如(holman等人，2007；pham等人，2009；schepp-berglind等人，2007))。用rad的另外的两种抗原方法是使用两种抗原表达盒(这两种抗原表达盒是使用两种不同的启动子序列以头对尾的方式被放置于e1区域中)，以试图通过重组来防止遗传不稳定性(例如(belousova等人，2006；c.d.harro等人，2009))。两种抗原方法的另一个实例是使用正链rna病毒(例如衍生自脑心肌炎病毒(emcv))的内部核糖体进入位点(ires)，以产生被翻译成两种蛋白质的单个转录物(例如(amendola，venneri，biffi，vigna，&naldini，2005；na&fan，2010))。其他实例包括利用宿主细胞剪接机制或使用衍生自正链rna病毒(例如口蹄疫2a序列)或来自其他病毒的等效物的“切割”肽，来产生被切割成两种蛋白质的多蛋白。根据已发表的报告，所有这些策略都可以同样有用和成功。可替代地，使用双向启动子是用病毒载体表达两种抗原的另一种方法。例如，已经描述了用于慢病毒载体(heilbronn&weger，2010)和腺病毒载体(na&fan，2010；post&vanmeir，2001；robbins&ghivizzani，1998；walther&stein，2000)的不同双向启动子。通常，已知使用两种不同类型的双向启动子，具有双向特性的天然存在的序列和合成设计的双向启动子。具有双向特性的天然存在的序列可以在病毒、植物或哺乳动物基因组中发现(andrianaki，siapati，hirata，russell，&vassilopoulos，2010；barski，siller-lopez，bohren，gabbay，&aguilar-cordova，2004)。例如，据报道人类基因组中的许多启动子具有一些双向特性。具有双向特性的人启动子的特征在于gabp位点的过表达(collins，kobayashi，nguyen，trinklein，&myers，2007)。与天然存在的序列相反，可以将合成的双向启动子设计成利用不同单向启动子的理想特性。例如，amendola等人通过将衍生自人巨细胞病毒的最小启动子(mincmv)与人磷酸甘油酸激酶启动子(pgk)或人泛素c启动子(ubic)组合，产生用于慢病毒载体的两种不同的合成的双向启动子(amendola等人，2005))。为了构建双向启动子，单向启动子以相反的方向(头对头)配置，同时仅利用一种增强子。根据amendola等人，当在该构型中将强最小启动子与完整的哺乳动物启动子组合时，结果是从两侧的协调表达。新产生的多价载体的重要特征包括，例如，扩增(upscaling)期间的遗传稳定性、大规模载体的生产力、两种抗原的有效的表达、两种抗原的平衡的表达、以及从插入的表达盒表达的抗原的尺寸限制。与之前披露的方法相比，最近描述的产生特别好的结果的策略使用了双向小鼠巨细胞病毒(mcmv)启动子来表达两种转基因(wo2016/166088)。其中，第一转基因在一个方向上与双向mcmv启动子可操作地连接，并且第二转基因在另一个方向上与双向mcmv启动子可操作地连接。具有双向mcmv启动子的rad被确定为遗传稳定的，提供与仅具有单个转基因的rad相当的遗传稳定性。此外，基于有关t细胞和b细胞应答的经表达的抗原的免疫原性的elispot和elisa分析，确定两种转基因都被充分表达以产生对两种抗原的免疫原性应答。因此，mcmv双向启动子被描述为优于若干种其他之前描述的策略。然而，确定可以进一步改进在mcmv启动子的两侧之间的表达水平的平衡。与位于启动子的左侧(5′末端)的抗原相比，位于双向mcmv启动子的右侧(3′末端)的抗原的表达高大约10倍。与较低表达的抗原相比，两种编码抗原的表达的不平衡导致针对高表达抗原的更强的免疫应答。这种差异表达对于某些应用可能是有用的，但是对于其他应用，还希望具有一种将mcmv启动子的若干优点与更平衡的表达相结合的策略，即一种比双向mcmv启动子和已在文献中描述的其他双向启动子有效且更平衡的双向启动子。因此，仍然需要鉴定如下双向启动子，这些双向启动子与mcmv双向启动子相比是有效的、相对较短的、没有或有有限长度的相同序列的内部延伸，并且在从两侧的表达方面具有改进的平衡，并且需要提供如下重组病毒，这些重组病毒是遗传稳定的并且具有两种转基因的有效和平衡的表达。技术实现要素：本发明提供了包含双向hcmv-rhcmv启动子和载体的重组核酸分子，这些载体包括例如包含双向hcmv-rhcmv启动子的质粒载体、病毒载体、和病毒。本发明的重组载体包含两种转基因，其中hcmv-rhcmv双向启动子点的hcmv和rhcmv部分的转录方向(5′至3′)彼此远离(头对头构型)，其中在表达由双向启动子的hcmv部分控制的情况下，第一转基因在左侧的一个方向上可操作地连接，并且在表达由双向启动子的rhcmv部分控制的情况下，第二转基因在右侧的相反方向上可操作地连接。hcmv增强子置于指向hcmv启动子部分的两个不同启动子之间的中间。由于增强子可以是不依赖于方向的，因此增强子提供了与双向启动子的hcmv和rhcmv部分可操作地连接的两种转基因的协调表达。参见，例如，图1d显示了代表性hcmv-rhcmv启动子的不同结构单元的同一性和方向。优选地，根据本发明的hcmv-rhcmv启动子包含与seqidno：4至少80％、优选地至少85％、更优选地至少90％、仍更优选地至少95％、并且至多100％的同一性的核苷酸序列。在某些实施例中，重组病毒和重组病毒载体是重组腺病毒(rad)和rad载体。用本发明的双向hcmv-rhcmv启动子产生的rad在遗传上是稳定的，其中通过pcr分析直到第13代(p13)没有检测到缺失带(deletionband)，从而提供与仅具有单个转基因的病毒相当的遗传稳定性。此外，该双向hcmv-rhcmv启动子是相对短的双向启动子，仅具有943个核苷酸，并且它提供了两种转基因的有效和非常平衡的表达。因此，本发明的双向hcmv-rhcmv启动子适用于用重组(病毒)载体的基因疗法和疫苗应用，以及特别是其中非常平衡和有效的表达是重要的和/或其中双向hcmv-rhcmv启动子的小尺寸是有用的。本文所附独立权利要求和从属权利要求分别限定了一般和优选的实施例，为了简洁起见，将其通过引用并入本文。从下面结合附图的详细描述中，本发明的不同方面的其他优选的实施例、特征和优点将变得明显。在一个实施例中，本发明提供了在左侧包含hcmv启动子并且在右侧包含rhcmv启动子的双向hcmv-rhcmv启动子，其中该双向hcmv-rhcmv启动子在左侧的一个方向上可操作地连接至第一转基因，并且该双向hcmv-rhcmv启动子在右侧的另一个方向上可操作地连接至第二转基因。在另一个实施例中，本发明还提供了生产包含第一和第二转基因的重组病毒的方法，该方法包括：制备如下构建体，该构建体包含在一个方向上可操作地连接至第一转基因并且在相反方向上可操作地连接至第二转基因的双向hcmv-rhcmv启动子，并将所述构建体并入重组病毒的基因组中。在某些实施例中，该重组病毒是重组腺病毒。在某些实施例中，重组腺病毒在e1区域具有缺失，并且在某些实施例中，在该e1区域中包含双向hcmv-rhcmv启动子以及第一和第二转基因。可替代地，也可以使用重组腺病毒的其他区域。例如，该双向启动子表达盒也可以置于基因组的右末端，在重组腺病毒的e4区域和右itr之间。在某些实施例中，该第一和第二转基因是不同的，并且它们中的至少一种编码抗原。在某些实施例中，两种转基因编码不同的抗原。在某些实施例中，该腺病毒是人腺病毒血清型26或人腺病毒血清型35。在另一个实施例中，本发明还提供了用于在细胞中表达至少两种转基因的方法，该方法包括向细胞提供根据本发明的重组载体。在另一个实施例中，本发明还提供了用于诱导针对至少两种抗原的免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予根据本发明的重组载体。在另一个实施例中，本发明还提供了包含根据本发明的重组腺病毒的基因组的重组dna分子。在另一个实施例中，本发明还提供了包含根据本发明的重组载体(例如重组腺病毒)和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在某些实施例中，该药物组合物是疫苗。附图说明图1：测试的双向启动子构建体的示意图，包括不同双向启动子序列的结构单元的同一性和方向的注释。p：启动子，enh：增强子，i：内含子。图2：通过hek293细胞中的瞬时转染评估的用不同双向启动子构建体的荧光素酶和egfp的表达。通过facs，将荧光素酶表达测量为相对光单位(rlu)，并且将egfp表达测量为平均荧光强度(mfi)。显示了筛选不同启动子构建体的三个不同实验的结果。显示了不同双向启动子的从左侧的荧光素酶表达和从右侧的egfp表达的结果的条形图。阳性对照：在单向hcmv启动子控制下的荧光素酶或egfp；未转染的细胞被用作阴性对照。图3：(a)在pshuttle26中双向启动子hcmv-rhcmv的双向表达盒的组织，包括用于在双向启动子构建体两侧插入转基因的限制性位点的同一性和位置。p：启动子，enh：增强子，tg：转基因，pa：衍生自sv40(右侧)或牛生长激素(bgh)(左侧)的聚腺苷酸化信号。质粒载体pshuttle26中的表示。在padapt35中使用相同的双向表达盒组织。(b)hcmv-rhcmv双向启动子的示意图，包括结构单元的核苷酸位置。箭头表示转录的方向。图4：萤光素酶和egfp转基因在ad26rad载体(a)和ad35rad载体(b)的双向启动子构建体的左侧或右侧的表达，其中在a549细胞中以1000vp/细胞感染。通过facs，将荧光素酶表达测量为相对光单位(rlu)，并且将egfp表达测量为平均荧光强度(mfi)。将不同hcmv-rhcmv双向启动子构建体的结果与在单向hcmv启动子控制下的荧光素酶或egfp的100vp/细胞和1000vp/细胞的阳性对照、以及空白载体感染的细胞进行比较。对于ad26rad载体，另外将hcmv-rhcmv与双向mcmv启动子进行比较。图5：通过连续繁殖然后在ad26载体基因组上进行pcr来进行遗传稳定性测试，该ad26载体基因组在e1区域中携带双向hcmv-rhcmv启动子并在双向hcmv-rhcmv启动子的右侧或左侧编码egfp和荧光素酶。从上到下的小图中显示的是per.c6细胞在p5、p10、和p13的连续繁殖后每个载体5个噬斑的pcr产物。每个小图中的泳道1-5显示了双向hcmv-rhcmv启动子，其中左侧荧光素酶，右侧egfp。每个小图中的泳道6-10显示了双向hcmv-rhcmv启动子，其中左侧egfp，右侧荧光素酶。泳道11显示了kb标志。泳道12显示了ad26.luc.hcmv-rhcmv.egfp的质粒阳性对照。泳道13显示了rad26.egfp.hcmv-rhcmv.luc的质粒阳性对照。泳道14显示了没有转基因的表达盒的pcr产物大小的质粒对照。泳道15显示了阴性水pcr对照。标记：p5、p10、p13：病毒传代数。除了预期的pcr产物之外的另外的带是非特异性pcr产物。注释：过度曝光的图片上证实不存在缺失带。具体实施方式本文描述了比较新的双向启动子构建体的效力和平衡的实验结果。结果显示基于在hek293细胞中用padapt质粒载体的瞬时转染和用rad26和rad35(包含双向hcmv-rhcmv启动子，其中第一转基因在一个方向上可操作地连接至该双向hcmv-rhcmv启动子，并且第二转基因在另一个方向上可操作地连接至该双向hcmv-rhcmv启动子)的病毒感染，双向hcmv-rhcmv启动子提供了两种转基因的有效和非常平衡的表达。该双向hcmv-rhcmv启动子也是一个相对较短的双向启动子，仅具有943个核苷酸。此外，用双向hcmv-rhcmv启动子的rad在遗传上是稳定的，其中通过pcr分析直到第13代(p13)没有检测到缺失带(deletionband)，从而提供与仅具有单个转基因的病毒相当的遗传稳定性。因此，用双向hcmv-rhcmv启动子的本发明的rad适用于基因疗法和疫苗应用，其中非常平衡和有效的表达是优先重点，和/或其中双向hcmv-rhcmv启动子的小尺寸是有用的，例如与其他更长的双向启动子相比，在载体或病毒基因组的有限尺寸内为转基因留下更多的空间。因此，本发明涉及如下重组核酸分子，该重组核酸分子包含在一个方向上可操作地连接至第一转基因并且在相反方向上可操作地连接至第二转基因的双向hcmv-rhcmv启动子，其中hcmv-rhcmv双向启动子点的hcmv和rhcmv部分的转录方向(5′至3′)彼此远离，并且其中从左侧的表达受双向启动子的hcmv部分控制，且从右侧的表达受双向启动子的rhcmv部分控制。在某些实施例中，本发明涉及使用包含双向hcmv-rhcmv启动子的载体、病毒载体、和病毒用于在细胞中表达两种转基因。在某些实施例中，本发明涉及用于使宿主细胞产生异源蛋白质的质粒载体。例如，包含双向hcmv-rhcmv启动子的质粒载体可用于表达异聚多亚基蛋白质复合物的两种不同组分。此类质粒载体可以是dna序列，该dna序列含有例如，(1)双向hcmv-rhcmv启动子，(2)向mrna提供针对每个转基因的核糖体结合位点的序列，(3)每个转基因的编码区、即编码所希望的多肽的核苷酸的序列，(4)用于启动翻译的每个转基因的kozak共有序列，(5)每个转基因的终止序列(当读取每个转基因的完整编码时允许翻译终止)，和(6)允许整个载体一旦进入细胞内就被复制的复制原点(如果载体不直接插入基因组中)。然后，仍然诱导宿主细胞并入载体(例如通过转染或电穿孔)，并仍然以这样的方式生长宿主细胞，以作为宿主细胞功能的一部分来表达两种转基因。在某些实施例中，本发明涉及包含双向hcmv-rhcmv启动子的rad和rad载体、以及制备和使用rad和rad载体的方法，其中这些rad和rad载体包含双向hcmv-rhcmv启动子和两种转基因，其中第一转基因在一个方向上可操作地连接至该双向hcmv-rhcmv启动子，并且第二转基因在另一方向上可操作地连接至该双向hcmv-rhcmv启动子。本发明的rad可以大量或分批生产。rad的“批次”是在单个生产容器中在一次生产运行中生产的组合物，或者可以指存在于单个容器(例如生物反应器、袋、烧瓶、瓶、多剂量小瓶、单剂量小瓶、注射器等)中的组合物中的多个rad颗粒。根据本发明的一批rad或包含根据本发明的rad的组合物优选包含至少107个rad颗粒，并且在某些实施例中包含至少108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018或更多个rad颗粒，多达1020个rad颗粒(例如在单个生产运行中在大规模生物反应器中生产的)。除了rad之外，批次或组合物另外可以包含或不包含相关组分。如本文所使用的，用于重组腺病毒的术语“重组”意指已被人工修饰的腺病毒，而不是野生型腺病毒，例如重组腺病毒包含一种或多种异源基因或者其部分，以及双向hcmv-rhcmv启动子。如本领域惯例，本文中的序列以5′至3′方向提供。“腺病毒衣壳蛋白”是指在腺病毒的衣壳上的蛋白质，该腺病毒衣壳蛋白参与确定特定的腺病毒的血清型和/或趋向性。腺病毒衣壳蛋白典型地包括纤维、五邻体和/或六邻体蛋白。根据本发明的(或“基于”)某种血清型的rad典型地包含特定血清型的纤维、五邻体和/或六邻体蛋白，并且优选包含该特定血清型的纤维、五邻体和六邻体蛋白。这些蛋白质典型地由rad的基因组编码。某种血清型的rad可以任选地包含和/或编码来自其他腺病毒血清型的其他蛋白质。通过至少依次从野生型衍生，rad“基于”如本文所使用的腺病毒。这可以通过使用野生型基因组或其部分作为起始材料的分子克隆来实现。也可以使用野生型腺病毒基因组的已知序列来通过dna合成重新产生(部分)基因组，这可以通过在dna合成和/或分子克隆领域具有业务的服务公司(例如基因艺术公司(geneart)、基斯奎思公司(genscripts)、英杰公司(invitrogen)、欧陆公司(eurofins))使用常规程序执行。因此，作为非限制性实例，包含ad35的六邻体、五邻体和纤维的rad被认为是基于ad35等的rad。本发明的腺病毒载体被称为rad载体。rad载体的制备在本领域中是熟知的。在某些实施例中，根据本发明的rad载体在病毒复制必需的腺病毒基因组的e1区域(例如，e1a区域和/或e1b区域)的至少一个必需基因功能上是有缺陷的。在某些实施例中，根据本发明的腺病毒载体在非必须e3区域的至少部分中是有缺陷的。在某些实施例中，该载体在e1区域的至少一个必需基因功能中以及在非必须e3区域的至少部分中是有缺陷的。腺病毒载体可以是“多重缺陷的”，意味着腺病毒载体在腺病毒基因组的两个或更多个区域的每一个中的一个或多个必需基因功能上是有缺陷的。例如，上述e1缺陷型，或e1-、e3-缺陷型腺病毒载体可以进一步在e4区域的至少一种必需基因和/或e2区域(例如，e2a区域和/或e2b区域)的至少一种必需基因上是有缺陷的。腺病毒载体、其构建方法和其繁殖方法是本领域熟知的，并且被描述于以下文献中：例如，美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、6,020,191、6,113,913和8,932,607，以及virology[病毒学](thomasshenk，“adenoviridaeandtheirreplication[腺病毒及其复制]”m.s.horowitz，″adenoviruses[腺病毒]″，分别为第67和68章)，b.n.fields等人(编辑)，第3版，雷文出版社有限公司(ravenpress，ltd.)，纽约(1996)，以及本文提及的其他参考文献。典型地，腺病毒载体的构建涉及本领域熟知的标准分子生物技术的使用，如描述在以下的那些：例如sambrook等人，molecularcloning，alaboratorymanual[分子克隆，实验室手册]，第2版，冷泉港实验出版社，冷泉港实验室，纽约(1989)，watson等人，recombinantdna[重组dna]，第2版，scientificamericanbooks[科学美国人书](1992)，和ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology[分子生物学现代方法]，威利国际科学出版社(wileyintersciencepublishers)，纽约(1995)，和本文提及的其他参考资料。根据本发明的腺病毒属于腺病毒科，并且优选地是属于哺乳动物腺病毒(mastadenovirus)属的一种。它可以是人腺病毒，但还可以是感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3，badv3)、犬腺病毒(例如cadv2)、猪腺病毒(例如padv3或padv5)、或猿猴腺病毒(其包括猴腺病毒和猿腺病毒，例如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，腺病毒是人腺病毒(hadv或adhu；在本发明中，如果提及腺病毒但是没有指示物种的情况下，即指人腺病毒，例如简短符号“ad5”表示与hadv5(人腺病毒血清型5)相同)或猿猴腺病毒(例如黑猩猩或大猩猩腺病毒(chad、adch或sadv))。已使用人腺病毒进行大多数高级研究，并且根据本发明的某些方面，人腺病毒是优选的。在某些优选的实施例中，根据本发明的重组腺病毒基于人腺病毒。在优选的实施例中，该重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。根据本发明的特别优选的实施例，腺病毒是人腺病毒血清型26和35中的一种。这些血清型的优点是在人群中的低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价。rad26载体的制备描述于以下文献中：例如wo2007/104792以及(abbink等人，2007)。ad26的示例性基因组序列发现于基因库登录号ef153474中和wo2007/104792的seqidno：1中。rad35载体的制备描述于以下文献中：例如u.s.7,270,811、wo00/70071、以及(vogels等人，2003)。ad35的示例性基因组序列发现于基因库登录号ac_000019中和wo00/70071的图6中。猿猴腺病毒在人群中通常也具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价，并且已经报道了使用黑猩猩腺病毒载体的大量作品(例如u.s.6,083,716；和wo2005/071093；wo2010/086189；和wo2010085984；(bangari&mittal，2006；cohen等人，2002；farina等人，2001；kobinger等人，2006；lasaro&ertl，2009；tatsis等人，2007)。因此，在其他优选的实施例中，根据本发明的重组腺病毒基于猿猴腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些实施例中，重组腺病毒基于猿猴腺病毒类型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或sa7p。猕猴腺病毒载体也被描述为有用的候选载体(例如(abbink等人，2015)；wo2014/078688)。因此，在其他优选的实施例中，本发明的重组腺病毒基于猕猴腺病毒，例如基于非限制性实例rhad51、rhad52或rhad53(或sad4287、sad4310a或sad4312；参见例如(abbink等人，2015)和wo2014/078688)中的一个。除腺病毒外，本领域技术人员将认识到其他病毒也适于用作使用本发明双向启动子的病毒载体。例如，腺相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒(hsv)、痘病毒和慢病毒也可以被工程化以包括本发明的双向启动子。参见，例如(heilbronn&weger，2010；robbins&ghivizzani，1998；walther&stein，2000)中讨论的关于不同载体的综述。上面提到的大多数人和非人腺病毒的序列是已知的，并且对于其他的腺病毒序列，可以使用常规程序获得。根据本发明的重组腺病毒可以是具有复制能力的或复制缺陷的。在某些实施例中，该腺病毒是复制缺陷的，例如，因为它在基因组的e1区域中含有缺失。与野生型腺病毒相比，“e1区域中的缺失”是指在该区域中的缺失，并且指在e1a、e1b55k或e1b21k编码区域中至少之一中的缺失，优选e1a、e1b55k和e1b21k编码区域的缺失。正如本领域技术人员已知的，在缺失来自腺病毒基因组的必需区域的情况下，由这些区域编码的功能必须由菌株反式提供，优选的是由生产细胞提供，即，当e1、e2和/或e4区域的部分或全部从腺病毒中缺失时，这些必须存在于生产细胞中，例如整合到其基因组中，或以所谓的辅助腺病毒或辅助质粒形式。这些腺病毒还可以具有在e3区域中的缺失，该缺失对于复制是非必要的，并且因此不必补充此种缺失。可以使用的生产细胞(有时在本领域中以及在本文中也被称为“包装细胞”或“补充细胞”)可以是任何生产细胞，其中可以繁殖所希望的腺病毒。例如，在生产细胞中完成重组腺病毒载体的繁殖，该生产细胞补充了腺病毒中的缺陷。此类生产细胞优选地在其基因组中至少具有腺病毒e1序列，并且从而能够补充在e1区域中具有缺失的重组腺病毒。可以使用任何e1补充生产细胞，例如由e1永生化的人网膜细胞，例如911或per.c6细胞(参见例如u.s.5,994,128)、e1转化的羊水细胞(参见例如ep1230354)、e1转化的a549细胞(参见例如wo98/39411，u.s.5,891,690)、gh329：hela细胞(gao，engdahl，&wilson，2000)、293细胞等。在某些实施例中，这些生产细胞是，例如，hek293细胞、或per.c6细胞、或911细胞、或it293sf细胞等。对于不是衍生自亚型c或e腺病毒的e1缺陷型腺病毒，优选地是将非亚型c或e腺病毒的e4-orf6编码序列与亚型c的腺病毒(例如ad5)的e4-orf6进行交换。这允许在表达ad5的e1基因的熟知的补充细胞系中此类腺病毒的繁殖，例如像293细胞或per.c6细胞(参见例如(havenga等人，2006)；wo03/104467，通过引用以其全文并入本文)。在替代性实施例中，不需要将异源(例如ad5的)e4orf6区域置于腺病毒载体中，但是需要e1缺陷型非亚型c或e载体在表达e1和相容的e4orf6二者的细胞系(例如，表达来自ad5的e1和e4orf6二者的293-orf6细胞系)中繁殖(参见例如(brough，lizonova，hsu，kulesa，&kovesdi，1996)，该文献描述了293-orf6细胞的产生；(abrahamsen等人，1997；nan等人，2003)每个描述了使用这种细胞系产生e1缺失的非亚型c腺病毒载体)。可替代地，可以使用从待繁殖的血清型表达e1的补充细胞(参见例如wo00/70071，wo02/40665)。对于在e1区域具有缺失的亚型b腺病毒(如ad35)，优选地是将e1b55k可读框的3′末端保留在腺病毒中，例如pix可读框直接上游的166bp或包含所述166bp的片段，例如pix起始密码子直接上游的243bp的片段(在5′末端由ad35基因组中的bsu36i限制性位点标记)，因为pix基因的启动子部分驻留在该区域，这增加了腺病毒的稳定性(参见例如(havenga等人，2006)；wo2004/001032，通过引用并入本文)。本发明的载体或(腺)病毒中的“异源核酸”(本文中也被称为“转基因”)不是天然存在于该载体或(腺)病毒中的核酸。例如，通过标准分子生物学技术将其引入载体或(腺)病毒中。在某些实施例中，它可以编码感兴趣的蛋白质或其部分。例如，可以将它克隆至腺病毒载体的缺失的e1或e3区域。在本发明的优选的实施例中，将具有在双向hcmv-rhcmv启动子控制下的两种转基因的表达盒置于腺病毒基因组的e1区域中。通常，转基因可操作地连接至表达控制序列。这可以例如通过将编码一种或多种转基因的核酸置于启动子的控制下来完成。许多启动子可用于表达一种或多种转基因，并且是本领域技术人员已知的。已知核酸的同源延伸可以导致不稳定性。例如，在一个腺病毒载体中使用两个相同(hcmv)启动子，虽然先前已报道是可能的，但是在更广泛的测试中似乎可以导致腺病毒的基因不稳定性(wo2016/166088)。因此，诸位发明人试图在设计双向启动子时，尽量减少使用具有广泛序列同一性的延伸的启动子结构单元，以防止腺病毒载体中由同源重组造成的缺失。重要的是，在本文中，显示具有通过本发明的hcmv-rhcmv双向启动子调节的转基因的腺病毒载体在遗传上是稳定的。如本文所使用的，术语“启动子”或“启动子区域”或“启动子元件”可互换地使用，并且是指控制与其有效地连接的核酸序列的转录的核酸序列片段，典型地但不限于dna。启动子区域包括足以用于rna聚合酶识别、结合和转录启动的特异性序列。此外，启动子区域可以任选地包括调节rna聚合酶的这种识别、结合和转录启动活性的序列。这些序列可以是顺式作用的或可能对反式作用因子有应答。此外，启动子可以是组成型或调控型的，这取决于调控的性质。技术人员将意识到启动子是由核酸序列延伸构建的，并且通常在核酸序列的那些延伸中包含元件或功能单位，例如转录起始位点、rna聚合酶的结合位点、一般转录因子结合位点(例如tata盒)、特定转录因子结合位点等。还可以存在另外的调控序列，例如增强子，并且有时在启动子序列末端存在内含子。此类功能单元在下文中被称为“结构单元”，并且它们可以在核酸的延伸中组合以构建功能启动子序列。结构单元可以彼此直接相邻，但也可以通过在启动子功能中不起直接作用的核酸的延伸分开。本领域技术人员知道如何测试核酸的延伸中的核苷酸是否与启动子功能相关，以及如何通过标准分子生物学方法将结构单元和/或核苷酸去除或添加到给定的启动子序列中，以例如使其长度最小化的同时保留启动子活性或优化活性。如本文所使用的，术语“增强子”或“增强子结构单元”是指可以被蛋白质(激活蛋白)结合以刺激或增强一种基因或若干种基因的转录的调控dna序列，例如50-1500bp。这些激活蛋白(又称转录因子)与介体复合物相互作用并募集聚合酶ii和一般转录因子，然后开始转录基因。增强子通常是顺式作用的，但可以位于基因或它们调控的基因的起始位点的上游或下游。此外，增强子可以是向前或向后方向，并且不需要位于转录起始位点附近以影响转录，因为已发现一些增强子位于起始位点上游或下游的数十万个碱基对。内含子中也可以发现增强子。术语“双向启动子”是指如下连续基因调控序列，这些连续基因调控序列可以含有除启动子元件之外的增强子元件和内含子元件，并且由如本文所述的结构单元限定。这些双向启动子以双向方式指导基因表达，控制置于双向启动子序列两侧的转基因的表达。例如，本发明的双向启动子以双向方式指导两种不同转基因的转录，并且包括增强子结构单元，该增强子结构单元侧翼为一侧是第一启动子结构单元并且另一侧是第二启动子结构单元，使得转基因位于各自启动子结构单元的下游。注意，侧翼和相邻不一定意味着是直接连续的，因为在结构单元之间可能存在一些另外的核苷酸，但优选地不添加太多另外的序列使得双向启动子维持紧密的大小。还应注意，术语“上游”和“下游”是关于本领域常用的转录方向。例如，按照惯例，术语上游和下游涉及发生rna转录的5′至3′方向。上游朝向rna分子的5′末端，并且下游朝向3′末端。当考虑双链dna时，上游朝向所讨论的基因的编码链的5′末端，并且下游朝向3′末端。由于dna的反平行性质，这意味着模板链的3′末端是基因的上游，并且5′末端是下游。参见，例如，图1d显示了优选的双向hcmv-rhcmv启动子，该双向hcmv-rhcmv启动子包含人巨细胞病毒主要立即早期增强子(hcmv增强子)作为增强子结构单元，该增强子结构单元的侧翼为一侧是作为第一启动子结构单元的人巨细胞病毒主要立即早期启动子(hcmv)以及另一侧是作为第二启动子结构单元的猕猴cmv启动子(rhcmv)。本发明的双向hcmv-rhcmv启动子可操作地连接至两种转基因，使得第一转基因可操作地连接至hcmv启动子结构单元，并且第二转基因可操作地连接至rhcmv启动子结构单元，使得第一和第二转基因各自位于各自的启动子的下游，并且使得第一和第二转基因在从hcmv增强子向外的方向上转录。本发明优选的双向启动子是包含seqidno：4的双向hcmv-rhcmv启动子，其具有如图3b中所指示的不同元件的序列位置，但是本领域技术人员将认识到不同结构单元的序列和间插序列的长度或同一性可以在一定程度上变化，使得可以获得基本类似的结果。例如，可以测试不同的增强子的取代和/或可以调整增强子序列，使得可以获得基本类似的表达。相似地，可以在一个或两个启动子结构单元相邻且是其下游处添加内含子，并且预期双向hcmv-rhcmv启动子仍然是有活性的。可能，这甚至可以导致增强的表达，但是在任何情况下，这都可能以转基因的空间为代价，因为一个或多个内含子将在载体或病毒中占据空间。本文指示的增强子是优选的，其具有合适的尺寸、在腺病毒载体环境中产生平衡的表达并且是稳定的构建体。本发明的双向启动子的结构单元本身可以是单独已知的，但是从未组合，甚至不建议在本发明的群集(constellation)中组合，这导致有效的、非常平衡的并且相对较短的双向启动子。如本文所示，尽管具有一个相对较短的序列(只有943个核苷酸)，出乎意料地发现hcmv增强子与hcmv和rhcmv启动子的这种新颖的双向组合能够指导两种可操作地连接的转基因的有效和平衡的转录，同时在腺病毒载体的复杂环境中保持具有相关转基因的双向启动子的稳定构型。本文提供的数据显示，基于已知的类似结构单元产生此类双向启动子是不可预测的，因为若干其他类似设计的双向启动子缺乏强启动子活性、和/或导致不平衡的表达，由此可操作地连接至双向启动子的一部分的转基因的表达与可操作地连接至这种双向启动子的另一部分的转基因的表达相比显著更强(例如至少5x差异)。先验不可预测的是任何能够满足从两侧的类似表达水平的需求的启动子(例如，从两侧的表达之间差异小于2x)和腺病毒载体情况下的稳定性是否是可以实现的。本发明出乎意料地提供了满足这些需求并且具有小尺寸的双向启动子，该双向启动子在携带转基因的载体的尺寸限制的情况下是非常有利的(即可以适应更大的转基因和/或载体可以保持更稳定)。还可以将另外的调控序列添加到包含本发明的双向启动子的构建体中。术语“调控序列”与“调控元件”在本文中可互换地使用，并且是指核酸片段，典型地但不限于dna，该核酸片段调控与其有效地连接的核酸序列的转录，并且因此作为转录调节子。调控序列通常包含作为转录结合结构域的核酸序列，该转录结合结构域被转录蛋白和/或转录因子、增强子或阻遏物等的核酸结合结构域识别。例如，调控序列可以包括一个或多个四环素操纵子操纵基因序列(teto)，使得在四环素操纵子阻遏蛋白(tetr)存在下表达被抑制。在不存在四环素的情况下，该tetr蛋白能够结合至teto位点并且阻遏可操作地连接至teto位点的基因的转录。然而，在四环素的存在下，tetr蛋白质中构象变化阻止其结合至操纵基因序列，允许发生可操作连接的基因的转录。在某些实施例中，本发明的rad可以任选地包括与双向hcmv-rhcmv启动子有效地连接的teto，使得在表达tetr蛋白的生产细胞系中产生的载体中一种或多种转基因的表达被抑制。随后，如果将载体引入受试者或不表达tetr蛋白的细胞中，那么将不能抑制表达(参见例如，wo07/073513)。在某些其他实施例中，本发明的载体可以任选地包括cumate基因开关系统，其中表达的调控是通过将阻遏物(cymr)结合至操纵基因位点(cuo)、置于启动子下游进行介导的(参见例如(mullick等人，2006))。如本文所使用的，术语“阻遏物”是指具有抑制、干扰、延迟和/或阻遏重组表达载体的异源蛋白产物的产生的能力的实体(例如，蛋白质或其他分子)。例如，通过干扰表达载体中(例如在表达盒中)处于适当位置的结合位点。阻遏物的实例包括tetr、cymr、乳糖阻遏物、trp阻遏物、半乳糖阻遏物、λ阻遏物、以及其他本领域中已知的适当的阻遏物。此外，本发明的重组载体、病毒或腺病毒包含双向hcmv-rhcmv启动子，其中hcmv-rhcmv双向启动子点的hcmv和rhcmv部分的转录方向(5′至3′)彼此远离，并且其中hcmv-rhcmv双向启动子在一个方向上可操作地连接至第一转基因，且在相反方向上可操作地连接至第二转基因。因此，双向启动子将驱动第一转基因朝向载体或(腺)病毒基因组第一末端和驱动第二转基因朝向载体或(腺)病毒基因组的另一末端的表达。技术人员将意识到突变可以在提供的序列中进行并且可以通过常规方法针对启动子活性进行测试。典型地，与所指示的启动子序列具有至少90％同一性的序列(不包括增强子序列)将仍具有功能活性，并且因此将被认为是双向hcmv-rhcmv启动子。因此，本发明的双向hcmv-rhcmv启动子优选地与所指示的启动子序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性(在增强子序列之外)。优选地，双向hcmv-rhcmv启动子包含与seqidno：4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的序列。在某些优选的实施例中，双向hcmv-rhcmv启动子含有如图1d显示的结构单元，其中双向hcmv-rhcmv启动子包含hcmv增强子作为增强子结构单元，该增强子结构单元的侧翼为一侧是作为第一启动子结构单元的hcmv启动子和另一侧是作为第二启动子结构单元的猕猴cmv(rhcmv)启动子。在某个其他优选的实施例中，双向hcmv-rhcmv启动子与seqidno：4具有100％同一性，其具有如图3中所指示的不同元件的序列位置，但是本领域技术人员将认识到不同结构单元的序列和间插序列的长度可以在一定程度上变化，并且增强子的同一性也可以变化，使得可以获得基本类似的结果。术语“可操作地连接(operablylinked)”或“有效地连接(operativelylinked)”在本文中可互换地使用，并且是指核酸序列与核苷酸的调控序列(例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点以及其他信号序列)的功能关系并且表明两个或更多个dna片段结合在一起，使得它们为了预期的目的而一致起作用。例如，核酸序列(典型地为dna)与调控序列或启动子区域的有效连接是指dna与调控序列或启动子之间的物理和功能关系，使得通过特异性识别、结合和转录该dna的rna聚合酶从调控序列或启动子启动这种dna的转录。为了优化表达和/或体外转录，可能需要修饰其所表达的细胞类型中核酸或dna表达的调控序列。对这种修饰的期望或需要可以根据经验确定。在表达由双向hcmv-rhcmv启动子的任一部分控制的情况下，转基因被有力地表达。如本文所使用的，“被有效表达”或“有效的表达”意指从双向hcmv-rhcmv启动子的任一部分的表达(如例如通过不同蛋白质检测技术(例如蛋白质印迹法、facs分析、或使用发光或荧光的其他测定)所测量的)是在单向hcmv启动子(具有seqidno：9)的控制下从表达单个转基因的单价载体的至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％的表达。值得注意的是，与其他通常使用的单向启动子(例如pgk、ubic或rsvltr启动子)相比，单向hcmv启动子更强(powell，rivera-soto，&gray，2015)。因此，不如hcmv启动子强的双向启动子(即导致表达水平是此类单向hcmv启动子的至少10％)仍然可以被认为是有效的。hcmv启动子衍生自人巨细胞病毒的主要立即早期(mie)区域，并且经常用于疫苗和基因疗法载体中的有效单向基因表达。例如，hcmv启动子序列可以衍生自hcmvad169菌株mie基因座(x03922)，并且包括nf1结合位点、增强子区域、tata盒和第一外显子的一部分。已知其他hcmv启动子序列可以更短(例如仅含有增强子和启动子区域并且缺乏nf1结合位点)或更长(例如包括另外的细胞因子结合位点和第一内含子序列)。发现这些长度不同的hcmv启动子都是有效的普遍活性的启动子。对于如本文所述的表达水平的比较，hcmv启动子序列是seqidno：9。例如，从rad中本发明的双向hcmv-rhcmv启动子的任一部分的表达水平优选地为从rad(其中转基因在seqidno：9的单向hcmv启动子的控制下)的表达水平的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％。在某些实施例中，从双向hcmv-rhcmv启动子的任一部分的表达水平是从rad(其中转基因在seqidno：9的单向hcmv启动子的控制下)的表达水平的约10％-60％，例如20％-50％，例如约30％。此外，从rad在hcmv启动子的控制下表达单个抗原可知，该表达足以产生显著的t细胞和b细胞免疫应答。相似地，预期由本发明的双向hcmv-rhcmv启动子表达的两种转基因的表达对两种转基因产生显著的t细胞和b细胞免疫应答。例如，如果两种转基因在被给予至受试者时编码抗原以引发免疫应答，则预期这两种转基因的有效的表达将产生针对两种抗原的可测量的免疫应答。表达从双向hcmv-rhcmv启动子的两侧也非常平衡。如本文所使用的，“平衡的表达”、“表达的平衡”、“表达平衡”、或“平衡的”，当指的是表达时意指从双向启动子的一侧的表达(如例如通过不同蛋白质检测技术(例如蛋白质印迹法、facs分析、或使用发光或荧光的其他测定所测量的))与从双向启动子的另一侧的表达相当。例如，从本发明的双向hcmv-rhcmv启动子的一侧的表达水平优选地为从双向启动子的另一侧的表达水平的至少50％、60％、70％、80％、90％、或95％。在某些实施例中，从双向hcmv-rhcmv启动子的一侧的表达水平是从双向启动子的另一侧的表达水平的约70％-130％，例如80％-120％，例如90％-110％，例如约100％。在另一个实例中，从双向hcmv-rhcmv启动子两侧的表达比率在1/1、1.1/1、1.2/1、1.3/1、1.4/1、1.5/1、1.6/1、1.7/1、1.8/1、1.9/1、和2/1的范围内。此外，从rad在hcmv启动子的控制下表达单个抗原可知，该表达足以产生显著的t细胞和b细胞免疫应答。因此，由本发明的双向hcmv-rhcmv启动子表达的两种抗原的平衡的表达对两种抗原可以产生相当的t细胞和b细胞免疫应答，尽管这可能还取决于抗原随着时间的表达和抗原自身产生某些类型的免疫应答的固有能力。因此，与mcmv双向启动子相比，本发明的双向hcmv-rhcmv启动子在表达的平衡方面得到改进。为了比较，与位于双向mcmv启动子的左侧(5′末端)的抗原相比，位于双向mcmv启动子的右侧(3′末端)的抗原表达高达约10倍(其描述于wo2016/166088)，这已经被认为是相对很平衡的了，但是显然比本发明的双向启动子的平衡差得多。如果它是dna载体如质粒载体或病毒载体如腺病毒载体，载体的一个重要方面是这些载体适应所希望的转基因序列的能力。这种能力可能受到载体的尺寸限制的约束，如果超过某种尺寸限制，这种能力可能例如变得不稳定或甚至不可能产生。因此，除了此类启动子应该具有的功能能力，启动子(尤其是能控制多于一种转基因的表达的双向启动子)占据的空间是在设计新的载体时的重要考虑因素。即时双向启动子具有其相对较短的优点，这意味着在载体的一定尺寸限制下，为转基因剩余空间更多，例如，与较大尺寸的其他双向启动子相比，如果转基因是免疫原则允许包含更多表位，或允许更大的蛋白质的表达。术语“编码序列”、“序列编码”或“编码”在本文中可互换地使用，并且是指核酸序列，所述核酸序列当被可操作地连接至适当的调控序列上时，将在体外或体内被转录(dna)和翻译(mrna)成多肽。聚腺苷酸化信号，例如牛生长激素polya信号(u.s.5,122,458)可以存在于这些转基因后面。优选地，每个转基因具有polya信号，并且优选地，第一转基因的polya信号不同于第二转基因的polya信号。在一个实施例中，第一polya信号是sv40polya信号，并且第二polya信号是牛生长激素polya信号。包含内含子的序列也可以置于本发明的双向启动子的一个或两个末端。例如，已知内含子可以增加(特别是体内)蛋白质表达。如本文所使用的，内含子具有本领域已知的正常功能和结构，并且是核酸中的多核苷酸序列，该核酸不编码蛋白质合成的信息，并且在翻译信使rna之前通过称为剪接的方法被除去。内含子包含剪接供体位点(内含子的5′末端，通常是gu序列)和剪接受体位点(内含子的3′末端，通常是ga序列)。根据本发明可以有效地使用各种不同的内含子，尽管优选地使用相对较短的内含子和被修饰为更短内含子的内含子，以便在病毒载体中不占用太多的空间，使得为重组腺病毒中的转基因保留更多的空间。优选地，在双向启动子的一侧使用第一内含子并且在双向启动子的另一侧使用第二不同的内含子，即每种转基因之前有不同的内含子序列。在某些实施例中，内含子可以是嵌合体内含子。技术人员意识到许多不同的内含子是可获得的并且可以使用的。然而，本发明启动子的优点是它不需要用于适当表达的此类内含子，并且因此在优选的实施例中，双向启动子的启动子结构单元和两侧各自的转基因之间没有内含子。在某些实施例中，本发明的双向启动子可以例如用于驱动两种抗原的表达，目的是在疫苗应用中产生对这些抗原的免疫应答。然而，技术人员将立即清楚的是，平衡的转基因表达水平也可以与免疫应答不是其主要目标的转基因(例如，用于基因疗法目的的两种不同的转基因、表达异源蛋白质复合物、或两种抗体链的成比例的表达)相关。因此，可以用期望从单个重组载体(例如腺病毒载体)表达的转基因的任何组合来实践本发明。因此，该转基因的同一性不适合本发明，其适用于例如包含任何转基因的载体或腺病毒。合适的转基因是本领域技术人员熟知的，并且例如可以包括转基因可读框，例如编码具有疗效的多肽的可读框(例如用于基因疗法目的)，或当rad载体用于疫苗接种目的时希望对其产生免疫应答的多肽。特别优选的异源核酸是编码期望对其产生免疫应答的抗原决定簇的感兴趣的基因。典型地，这种抗原决定簇也被称为抗原。当对受试者给予重组腺病毒时，将针对一种或多种抗原产生免疫应答。任何所希望的抗原都可以由腺病毒载体编码。在根据本发明的典型实施例中，抗原是来自可能引起疾病或病症的生物体的肽、多肽或蛋白质。因此，在另外的优选的实施例中，所述感兴趣的异源核酸编码免疫原性(或抗原性)决定簇。更优选地，所述免疫原性决定簇是来自细菌、病毒、酵母或寄生虫的抗原。这些生物体引起的疾病通常被称为“传染病”(并且因此不限于会“感染”的生物体，而且还包括进入宿主并引起疾病的那些)。所谓的“自体抗原”，例如肿瘤抗原也构成了现有技术的一部分，并且可以由根据本发明的重组腺病毒中的异源核酸编码。可作为抗原决定簇(或抗原)的非限制性实例是引起疟疾的生物体(例如恶性疟原虫)、引起结核病的生物体(例如结核分枝杆菌)、酵母或病毒。在其他优选的实施例中，可以根据本发明的组合物使用来自如下病毒的抗原：例如黄病毒(例如西尼罗河病毒、丙型肝炎病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒)、埃博拉病毒、人免疫缺陷病毒(hiv)和马尔堡病毒。在一个实施例中，所述抗原是来自恶性疟原虫(p.falciparum)的cs蛋白或其免疫原性部分(例如编码cs的腺病毒载体，参见例如havenga等人，2006；ophorst等人，2006)；wo2004/055187，以上所有均通过引用以其全文并入本文)。在另一个实施例中，抗原决定簇是一种抗原的蛋白质，或来自结核分枝杆菌(m.tuberculosis)的若干种抗原的融合蛋白，例如ag85a、ag85b和/或tb10.4蛋白或其一种或多种免疫原性部分(参见这种结核病疫苗病毒的构建和生产，例如wo2006/053871，其通过引用并入本文)。在又另一个实施例中，所述抗原决定簇是病毒糖蛋白或其免疫原性部分，例如来自线状病毒(例如埃博拉病毒或马尔堡病毒)的gp(例如geisbert等人，2011；sullivan等人，2006；sullivan等人，2003)。在又另外的实施例中，所述免疫原性决定簇来自hiv蛋白，例如gag、pol、env、nef或其变体(关于基于hiv疫苗的腺病毒的实例，参见例如wo2009/026183、wo2010/096561、wo2006/120034、wo02/22080、wo01/02607)。在其他实施例中，所述抗原决定簇是来自流感病毒的ha、na、m或np蛋白或这些中的任何的免疫原性部分(例如hu等人，2011；zhou等人，2010)；由(vemula&mittal，2010)综述)。在其他实施例中，抗原决定簇是来自麻疹病毒的ha蛋白或其免疫原性部分(例如wo2004/037294)。在其他实施例中，抗原决定簇是狂犬病病毒糖蛋白(例如(zhou，cun，li，xiang，&ertl，2006))。在另外的实施例中，抗原来自呼吸道合胞病毒(rsv)，例如rsvf蛋白(参见例如wo2013/139911和wo2013/139916)、或rsvg蛋白、或两者、或其他rsv蛋白。在其他实施例中，抗原来自另一种病毒，例如人乳头瘤病毒或其他病毒等。重组腺病毒可以编码来自相同生物体的两种不同的抗原。重组腺病毒还可以编码来自不同生物体的抗原的组合，例如，来自第一生物体的第一抗原和来自第二生物体的第二抗原。也可以将抗原和例如佐剂编码到相同的腺病毒中，例如，抗原和toll样受体(tlr)激动剂，例如tlr3激动剂，例如dsrna或其模拟物等(例如wo2007/100908)。在某些实施例中，重组载体(例如重组腺病毒)编码各自在双向hcmv-rhcmv启动子的控制下的两种不同的抗原。在其他实施例中，载体或重组(腺)病毒编码各自在双向hcmv-rhcmv启动子的控制下的抗原和免疫调节子。在某些实施例中，除了在双向hcmv-rhcmv启动子控制下的第一和第二转基因外，另外的异源序列或转基因可存在于载体或重组(腺)病毒中。本发明还提供了一种用于产生遗传稳定的重组腺病毒的方法，该重组腺病毒包含当腺病毒感染靶细胞时各自被有效地表达的第一和第二转基因，该方法包括：制备包含双向hcmv-rhcmv启动子的构建体，该双向hcmv-rhcmv启动子在一个方向上可操作地连接至第一转基因并且在相反方向上可操作地连接至第二转基因，和将所述构建体并入重组腺病毒的基因组中。这种构建体的制备包括使用如本领域技术人员已知的并且在重组腺病毒
技术领域：
：中常规进行的熟知的标准分子克隆方法(参见例如(holterman等人，2004；lemckert等人，2006；vogels等人，2003)；sambrook，fritsch和maniatis，molecularcloning：alaboratorymanual[分子克隆：实验室手册]，第二版，1989；currentprotocolsinmolecularbiology[现行分子生物学方案]，ausubelfm等人编辑，1987；theseriesmethodsinenzymology(academicpress，inc.)[酶学方法系列(学术出版社有限公司)]；pcr2：apracticalapproach[pcr2：实践方法]，macphersonmj，hamsbd，taylorgr编辑，1995)，并且在本文中举例说明。双向hcmv-rhcmv启动子具有如上所述的特征，并且可以通过常规方法获得。为方便起见，技术人员可以通过克隆到更小的片段中来操纵腺病毒基因组，例如基因组左边部分的第一部分直到e1区域，以便于操纵和引入质粒形式的转基因以及与第一部分重组时可以产生完整的腺病毒基因组的基因组的其余部分的第二、较大的部分(参见例如wo99/55132)。不同于通过用于表达现有技术中提供的两种转基因的各种替代性方法制备的腺病毒，本发明的rad具有表达两种转基因并保持遗传稳定性的优点，同时还提供由双向启动子驱动的两种转基因的平衡的表达。因此，双向hcmv-rhcmv启动子解决了表达两种转基因的腺病毒的遗传不稳定性问题，以及两种转基因的不平衡的表达的问题，并且与某些其他具有较大尺寸的双向启动子相比，由于该启动子相对较小的尺寸，允许显著更多的空间用于转基因序列(例如，它比mcmv双向启动子短约1kb，因此在理论上，给定的具有尺寸容量限制的载体能适应总体比相同载体长约1kb的转基因，其中转基因将由mcmv启动子驱动)。为了测试遗传稳定性，rad被拯救并在合适的细胞系(例如辅助细胞系)中繁殖。在某些传代数下分离病毒dna，并且可以通过以下中的一个或多个分析rad基因组的完整性：pcr分析转基因区域存在或缺失带不存在、限制性消化rad基因组以确定限制性片段上差异的存在或不存在、和/或对rad基因组或rad基因组的pcr产物进行测序以确定rad序列中突变的存在或不存在。关于本发明的rad，“遗传稳定”是指核苷酸序列不从用于产生rad的质粒转化到后来rad的生产阶段，使得表达两种转基因的rad具有与具有单个转基因(例如，hcmv启动子后面)的相当的rad相同的遗传稳定性，其合适于大规模批量生产。例如，与rad或起始材料的更早期传代数相比，使用侧翼于表达盒的引物的pcr分析不显示缺失片段(带)和/或测序e1、e3和e4区域的pcr产物确认了核苷酸序列不改变。优选地用双向启动子对含有表达盒的区域进行测序证实了核苷酸序列在含有表达盒的区域中没有改变。与其他测试方法(例如测试单次产生的病毒批次的消化)相比，本研究彻底评估了遗传稳定性。通过以下方式增加测定的灵敏度：分离若干病毒种群(噬斑)并进行扩展传代(extendedpassaging)。扩展传代，结合使用侧翼于表达盒的引物的pcr分析，可以检测使用其他方法可能会被忽略的rad群体中的一小部分缺失突变体。此外，进行测序分析以排除点突变(例如在转基因的可读框中引入终止密码子)的发生。更具体地，由于病毒突变总是呈现为概率事件，所以一个噬斑可能是稳定的，而另一个噬斑可能呈现为缺失带。因此，为了正确评估遗传稳定性，需要测试若干种病毒种群(噬斑)。在发生突变的情况下，载体比亲本载体能够更有效地复制，这可能导致突变体形式的产生，这通常仅在本研究中所描述的扩展传代后才能观察到。优选地，本发明的rad的遗传稳定性在所使用的测试系统中可以持续至少多达10代，并且甚至更优选地至少直至13代，使得在大规模生产活动中该病毒足够稳定。最近发现，具有在双向mcmv启动子的控制下的两个转基因的重组腺病毒是遗传稳定的，参见例如wo2016/166088(其也描述了多种其他的已在本领域中有所描述的用于从一种载体表达两种抗原的解决方案，这些解决方案未能导致稳定的rad或有效的表达，使得在本文中mcmv启动子被描述为这个间题的最优选的解决方案)。本申请证明了具有在本发明的双向hcmv-rhcmv启动子的控制下的两种转基因的重组腺病毒也是遗传稳定的、并且还具有与它们在双向mcmv启动子的控制下相比更平衡的表达。根据本发明的方法产生的重组腺病毒可以根据以上针对重组腺病毒所述的实施例进行制备。本发明还提供了用于在细胞中表达至少两种转基因的方法，该方法包括向细胞提供根据本发明的载体或重组病毒(例如重组腺病毒)。向细胞提供重组腺病毒可以通过向受试者给予腺病毒，或通过体外或离体引入(例如感染)腺病毒至细胞中来进行。在某些实施例中，本发明提供了用于(例如，通过向受试者给予重组腺病毒)在细胞中表达至少两种转基因的重组腺病毒载体。本发明还提供了用于诱导针对至少两种抗原的免疫应答的方法，该方法包括向受试者给予根据本发明的载体(例如重组(腺)病毒)。本发明还提供了根据本发明的、用于诱导针对至少两种抗原的免疫应答的载体或重组(腺)病毒。本发明还提供了包含本发明的双向hcmv-rhcmv启动子或本发明的重组腺病毒的基因组的重组dna分子。本领域技术人员将意识到，这也可以是至少两种不同的重组dna分子的组合，这两种dna分子可以一起形成本发明的单个重组dna分子。此类分子可用于操纵基因组并产生新颖的重组腺病毒。基因组编码腺病毒复制和在容许细胞中包装所需的蛋白质。针对用于本公开中的数值的术语“约”是指±10％的值。培养生产细胞以增加细胞和病毒数量和/或病毒滴度。进行细胞培养以使其能够代谢、和/或生长和/或分裂和/或产生根据本发明的感兴趣的病毒。这可以通过例如本领域技术人员熟知的方法来实现，并且包括但不限于(例如在合适的培养基中)为细胞提供营养物。合适的培养基是本领域技术人员熟知的，并且通常可以从大量的商业来源获得，或者根据标准方案定制。可以使用分批、分批补料、连续系统等在培养皿、滚瓶或生物反应器中进行培养。培养细胞的合适条件是已知的(参见例如tissueculture[组织培养]，文学出版社(academicpress)，kruse和paterson编辑(1973)，以及r.i.freshney，cultureofanimalcells：amanualofbasictechnique[动物细胞培养：基本技术手册]，第四版(威利利斯公司(wiley-lissinc.)，2000，isbn0-471-34889-9))。典型地，腺病毒将在培养基中暴露于合适的生产细胞，允许摄取病毒。典型地，最佳搅拌速度为约50rpm至300rpm之间，通常为约100rpm-200rpm，例如约150rpm，典型的do为20％-60％，例如40％，最佳ph在6.7和7.7之间，最佳温度在30℃和39℃之间，例如34℃-37℃，并且最佳moi在5和1000之间，例如约50-300。典型地，腺病毒自发感染生产细胞，并促使生产细胞与rad颗粒接触，足以感染这些细胞。通常，向培养基中添加腺病毒种子原料以引发感染，并且随后腺病毒在生产细胞中繁殖。这对于本领域技术人员来说都是常规的。在感染腺病毒后，病毒在细胞内复制，并且从而被扩增，该过程在本文中被称为腺病毒的繁殖。腺病毒感染最终会导致被感染细胞的溶解。因此，腺病毒的溶解特性允许两种不同的病毒生产模式。第一模式是在细胞溶解(使用外部因素来溶解细胞)之前收获病毒。第二模式是在细胞被产生的病毒(几乎)完全溶解后收获病毒上清液(参见例如u.s.6,485,958，其描述了通过外部因素在不溶解宿主细胞情况下收获腺病毒)。优选地使用外部因素来以保持活性的方式溶解细胞以收获腺病毒。可用于活性细胞裂解的方法是本领域技术人员已知的，并且已描述于例如wo98/22588(第28-35页)中。在这方面有用的方法是例如冻融、固体剪切、高渗和/或低渗溶解、液体剪切、超声处理、高压挤出、洗涤剂溶解、上述组合等。在本发明的一个实施例中，使用至少一种洗涤剂溶解细胞。使用洗涤剂用于溶解的优点在于它是一种简单的方法，并且易于扩展。可以使用的洗涤剂及其使用方式是本领域技术人员通常已知的。例如在wo98/22588(第29-33页)中讨论了若干实例。洗涤剂可以包括阴离子、阳离子、两性离子和非离子洗涤剂。洗涤剂的浓度可以变化，例如在约0.1％-5％(w/w)的范围内。在一个实施例中，所用的洗涤剂是tritonx-100。核酸酶可用于去除污染物(即主要来自生产细胞，核酸)。适用于本发明的示例性核酸酶包括或本领域中通常使用的任何其他脱氧核糖核酸酶和/或核糖核酸酶。在优选的实施例中，核酸酶是其通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键来快速水解核酸，从而降低细胞溶解产物的粘度。可以从德国默克集团(merckkgaa)(代码w214950)商购获得。使用了核酸酶的浓度优选在1-100单位/ml的范围内。可替代地，或除了核酸酶处理之外，还可以使用选择性沉淀剂(例如多巴胺溴化物)在腺病毒纯化期间选择性沉淀宿主细胞dna，使其远离腺病毒制剂(参见例如u.s.7,326,555；(goerke，to，lee，sagar，&konz，2005)；wo2011/045378；wo2011/045381)。用于从生产细胞的培养物中收获腺病毒的方法已经广泛描述于wo2005/080556中。在某些实施例中，进一步纯化收获的腺病毒。腺病毒的纯化可以在若干个步骤中进行，这些步骤包括澄清、超滤、渗滤或用如通过引用并入本文的例如wo05/080556中所述的色谱分离。澄清可以通过过滤步骤进行，从细胞溶解产物中除去细胞碎片和其他杂质。使用超滤来浓缩病毒溶液。使用超滤器的渗滤或缓冲液交换是用于除去和交换盐、糖等的一种方式。本领域技术人员知道如何找到针对每个纯化步骤的最佳条件。还有wo98/22588(通过引用以其全文并入本文)描述了用于生产和纯化腺病毒载体的方法。这些方法包括让宿主细胞生长、用腺病毒感染宿主细胞、收获和溶解宿主细胞、浓缩粗溶解产物、更换粗溶解产物的缓冲液、用核酸酶处理溶解产物、以及使用色谱法进一步纯化病毒。优选地，纯化采用至少一个例如wo98/22588(第61-70页)中所讨论的层析步骤。已经描述了用于进一步纯化腺病毒的许多方法，其中色谱步骤包括在这些方法中。本领域技术人员将了解这些方法，并且可以改变采用色谱步骤的确切方式以优化这些方法。例如可以通过阴离子交换层析步骤纯化腺病毒，参见例如wo2005/080556。已经描述了许多其他腺病毒纯化的方法，并且在技术人员的可及范围内。生产和纯化腺病毒的另外的方法披露在例如wo00/32754、wo04/020971、wo2006/108707、和u.s.5,837,520和6,261,823中，所有这些都通过引用并入本文。针对向人给予，本发明可以采用包含载体或重组病毒(例如rad)和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在本上下文中，术语“医药学上可接受的”意指该载剂或赋形剂在所采用的剂量和浓度下不会在它们给予的受试者中引起任何不必要或不良的影响。此类药学上可接受的载体和赋形剂是本领域熟知的(参见remington′spharmaceuticalsciences[雷明顿药物科学]，第18版，a.r.gennaro编辑，马克出版公司(mackpublishingcompany)[1990]；pharmaceuticalformulationdevelopmentofpeptidesandproteins[肽和蛋白质的制药配方开发]，s.frokjaer和l.hovgaard编辑，taylor&francis[2000]；以及handbookofpharmaceuticalexcipients[药用辅料手册]，第3版，a.kibbe编辑，英国医药出版社(pharmaceuticalpress)[2000]。尽管还可以运用冻干制品，但该纯化的rad优选地是作为无菌溶液进行配制和给予。无菌溶液是通过无菌过滤或通过本领域中自身已知的其他方法制备。这些溶液接着冻干或填充到医药剂量容器中。溶液的ph通常在ph3.0到9.5，例如ph5.0到7.5范围内。该rad典型地是在具有合适缓冲液的溶液中，并且该rad的溶液还可以包含盐。任选地，稳定剂(例如白蛋白)可以存在。在某些实施例中，添加洗涤剂。在某些实施例中，rad可以被配制为可注射制剂。这些配制品包含有效量的rad(为无菌液体溶液、液体悬浮液或冻干形式)并任选地包含稳定剂或赋形剂。也可以雾化腺病毒疫苗用于鼻内给予(参见例如wo2009/117134)。例如，腺病毒可以存储于缓冲液中，该缓冲液还可以用于腺病毒世界标准(hoganson等人，2002)：20mmtrisph8，25mmnacl，2.5％甘油。适用于向人给予的另一种有用的配制品缓冲液是20mmtris、2mmmgcl2、25mmnacl、蔗糖10％w/v、聚山梨酯-800.02％w/v。适用于重组腺病毒的另一种配制品缓冲液包含10mm-25mm柠檬酸盐缓冲液ph5.9-6.2，4％-6％(w/w)羟丙基-β-环糊精(hbcd)、70mm-100mmnacl、0.018％-0.035％(w/w)聚山梨酯-80以及任选地包含0.3％-0.45％(w/w)乙醇。显然，可以使用许多其他缓冲液，并且已知适用于储存和药物给予经纯化的(腺)病毒制剂的配制品的若干实例，包括可以在以下文献中发现的：ep0853660、u.s.6,225,289和在wo99/41416、wo99/12568、wo00/29024、wo01/66137、wo03/049763、wo03/078592、wo03/061708。在某些实施例中，包含腺病毒的组合物另外包含一种或多种佐剂。佐剂是本领域已知的，以进一步增加对所用抗原决定簇的免疫应答，并且包含腺病毒和合适佐剂的药物组合物例如在wo2007/110409中公开，其通过引用并入本文。术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换地使用，并且被定义为引起免疫系统刺激的一种或多种物质。在本上下文中，用佐剂来增强对本发明腺病毒载体的免疫应答。合适的佐剂的实例包括铝盐，例如氢氧化铝和/或磷酸铝；油乳液组合物(或水包油组合物)，包括角鲨烯-水乳液，例如mf59(参见例如wo90/14837)；皂苷配制品，例如像qs21和免疫刺激复合物(iscoms)(参见例如u.s.5,057,540和wo90/03184、wo96/11711、wo2004/004762、wo2005/002620)；细菌或微生物衍生物，其实例为单磷酰脂质a(mpl)、3-o-脱酰基mpl(3dmpl)、含cpg基序的寡核苷酸、adp-核糖基化细菌毒素或其突变体(例如大肠杆菌热不稳定肠毒素lt、霍乱毒素ct等)。也可以例如通过使用编码c4结合蛋白(c4bp)的寡聚化结构域与感兴趣的抗原的融合的异源核酸(ogun，dumon-seignovert，marchand，holder，&hill，2008)，或编码toll样受体(tlr)激动剂(例如tlr3激动剂，例如dsrna(参见例如wo2007/100908)等)的异源核酸，使用载体编码的佐剂。根据本发明的这种rad可以例如编码在双向启动子的一侧上的感兴趣的抗原以及在双向启动子的另一侧上的tlr3激动剂。这种rad特别适用于通过粘膜途径给予，例如，口服给予(参见例如wo2007/100908)。在某些实施例中，本发明的组合物包含作为佐剂的铝，例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸铝钾或其组合的形式，浓度为0.05mg-5mg，例如每剂量铝含量为0.075mg-1.0mg。在其他实施例中，这些组合物不包含佐剂。在某些实施例中，根据本发明的药物组合物可以是疫苗。可以将腺病毒组合物给予至受试者，例如人受试者。在一次给予期间向受试者提供的腺病毒的总剂量可以如技术从业人员已知的有所改变，并且通常是在1x107病毒颗粒(vp)和1x1012vp之间，优选地是在1x108vp和1x1011vp之间，例如在3x108vp和5x1010vp之间，例如在109vp和3x1010vp之间。可以使用标准给予途径进行腺病毒组合物的给予。非限制性实施例包括不经肠给予，例如通过注射(例如皮内、肌内等)，或者皮下或经皮，或粘膜给予(例如鼻内、经口等)。在一个实施例中，通过肌内注射给予组合物，例如向手臂的三角肌、或大腿的股外侧肌。本领域的技术人员已知给予组合物(例如疫苗)以诱导对疫苗中的一种或多种抗原的免疫应答的不同可能性。如本文所使用的，受试者优选地是哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠或非人灵长类动物或人。优选地，该受试者为人受试者。还可以提供一种或多种腺病毒疫苗的一次或多次加强给予。如果执行加强疫苗接种，那么典型地，此类加强疫苗接种将在该组合物第一次给予至受试者(在此类情况下这被称为“初次疫苗接种”)后一周与一年之间，优选地在两周与四个月之间的一个时刻给予至相同的受试者。在可替代性加强方案中，还可以向受试者给予不同载体，例如一种或多种不同血清型的腺病毒，或其他载体，例如mva、或dna、或蛋白，作为初次或增强疫苗接种。在括号中的可以包括专利，公开申请，技术文章和学术文章的各种出版物在整个说明书中被引用，并且在说明书结尾处可以发现每个出版物的完整引用。这些引用的出版物中的每一篇通过引用以其全文并入本文。实例无需进一步描述，据信本领域中的一般技术人员可使用先前描述及以下说明性方法和实例制造且利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实例具体指出了本发明的某些实施例、特征、和优点，并且不应被解释为以任何方式限制本披露的其余部分。实例仅仅用以阐明本发明。方法细胞培养：将细胞(fallaux等人，1998)维持在含有补充有10mmmgcl2的10％胎牛血清(fbs)的杜氏改良的伊格尔氏培养基(dmem)中。padapt35和pshuttle26质粒中的腺病毒载体构建将不同双向启动子构建体克隆到padapt35(vogels等人，2007)或pshuttle26质粒中。基于之前描述的padapt26质粒构建pshuttle26(abbink等人，2007)。将含有ad26载体基因组右侧部分的2-kb片段进行合成并亚克隆到padapt26.luc(其cmv启动子中的spei位点通过引入单个bp取代而被首先破坏)中。结果，pshuttle26可用于通过用ad26粘粒的同源重组或通过用ad26全长基因组质粒的同源重组来构建腺病毒载体。由于padapt35和pshuttle26质粒仅携带具有一个启动子和一个sv40衍生的polya信号的标准单向表达盒，因此通过融合pcr添加另一个转基因加bghpolya信号的限制性位点。经由spei和avrii限制性位点的分子克隆，将含有spei、noti-bghpolya-ecori-荧光素酶-kpni、sali、avrii的融合pcr产物以正确的方向插入质粒中。结果，使用侧翼限制性位点avrii和hindiii，双向启动子序列可以替换单向hcmv启动子。使用一侧的hindiii和xbai限制性位点以及另一侧的avrii、sali或kpni将转基因置于双向启动子的两侧(图3a)。avrii、sali、或kpni的选择取决于质粒序列中限制性位点的独特性。将具有不同双向启动子构建体的完整双向表达盒克隆到pshuttle26质粒中，并使用spei或noti和xbai限制性位点转移至padapt35质粒中。kozak序列(5′gccacc3′)直接包含于每个atg起始密码子的前面，并且将两个终止密码子(5′tgataa3′)添加至每个编码序列的末端。如本文所述，重组腺病毒和载体通常被称为rad或rad载体，并且更具体地被称为rad35或rad26和相关的载体。腺病毒产生、感染和繁殖。所有腺病毒均通过同源重组在per.c6细胞中产生并如前所述地被生产(对于rad35：(havenga等人，2006)；对于rad26：(abbink等人，2007))。简言之，根据制造商(美国生命技术公司(lifetechnologies))提供的说明书使用脂质体转染，用编码质粒的rad载体转染per.c6细胞。为了拯救rad35载体，使用padapt35质粒和pwe/ad35.pix-ritr.de3.5orf6粘粒，而对于rad26载体，使用pshuttle26质粒和pwe.ad26.de3.5orf6粘粒。在达到完全的细胞病变效应(cpe)后一天收获细胞，冻融，在3,000rpm下离心5min，并且存储在--20℃下。接下来，将病毒进行噬斑纯化并且在培养于多孔24组织培养板的单孔中的per.c6细胞中进行扩增。在使用t25组织培养瓶培养的per.c6细胞中进一步进行扩增。表达分析为了评估表达和表达平衡的效力，用编码增强的绿色荧光蛋白(egfp蛋白登录号aab02572.1)和萤火虫荧光素酶(荧光素酶蛋白登录号ach53166)的报告基因产生病毒载体。记录针对与hek293细胞(用padapt载体或pshuttle载体瞬时转染)或a549细胞(病毒感染))组合的每种启动子和报告基因的相对egfp平均荧光强度(mfi)和荧光素酶相对光单位(rlu)。在luminoskantmascent微孔板发光计中，在0.1％dtt(1m)存在下，在细胞裂解物中测量荧光素酶活性。通过在pbs/1％fbs(非病毒材料)或cellfix(病毒材料)中胰蛋白酶消化、离心和再悬浮细胞沉淀，在流式细胞仪(facs)中测量egfp荧光。腺病毒载体在per.c6细胞中的遗传稳定性测试。进行疫苗载体的遗传稳定性测试以确保生产过程中的遗传稳定性，其涉及per.c6细胞中的若干次传代。如上所述地实现了重组疫苗载体的产生、噬斑纯化和扩大至t25形式。简言之，通过在e1补充细胞系per.c6中进行质粒转染产生重组病毒并进行噬斑纯化。选择5种噬斑用于从多孔24(mw24)升级至t25烧瓶。随后，以t25形式感染新的per.c6细胞直到病毒传代数13。使用预定感染体积进行病毒的繁殖，该感染体积在感染后2天将产生完全细胞病变效应，回顾性地确定了rad35的比率(病毒颗粒/细胞)为50并且rad26为900。从p13材料中分离病毒dna，并通过pcr分析测试完整转基因表达盒的存在。疫苗载体在per.c6细胞中繁殖直至传代数为13。繁殖是以感染后两天给予完全cpe的方式进行的。在完全cpe后2天收获rad35病毒，而在完全cpe后一天收获rad26病毒。在第2代、第5代、第10代和第13代分离病毒dna，并且通过使用侧翼于转基因表达盒的引物的pcr分析来测试不存在缺失。不存在缺失突变体由以下参数定义：pcr产物的带大小对应于阳性对照(用于病毒拯救的质粒的pcr产物)，在预期的pcr产物之下没有另外的带(除非另外的带显示为非特异性pcr产物，因为它们也存在于阳性对照中)，批准的测定：pcrh2o对照中没有带。为了进一步确认遗传稳定性，对表达盒和一些噬斑的侧翼区域的pcr产物进行测序。实例1：双向启动子构建体设计在之前的工作(wo2016/166088)中，有效的双向小鼠cmv(mcmv)启动子被鉴定为用于从腺病毒载体的e1区域中的双向表达盒表达两种抗原的有用启动子。虽然携带mcmv双向启动子的载体表达抗原、是遗传稳定的并诱导针对两种编码抗原的免疫应答，抗原表达和诱导的免疫应答是不平衡的，如下所解释的。置于双向启动子右侧的抗原的表达高于置于双向启动子左侧的抗原的表达，导致针对置于双向启动子右侧的抗原的更高的免疫应答。mcmv双向表达水平的差异为约10倍。然而，为了取代仅表达一种抗原的两种载体的混合物，对于某些应用，希望有平衡的双向启动子，其诱导两种抗原的相当水平的抗原表达。另外，如果双向启动子的尺寸相对较小将是有益的。为了鉴定有效且更平衡的双向启动子，设计了一组新的双向启动子。由于腺病毒载体的总体大小限制，小尺寸(最大尺寸为2kb)的双向启动子的设计是优选的，以保留足够的抗原的空间。此外，不具有广泛序列同一性(＜15个核苷酸)的延伸的结构单元是优选的，以防止腺病毒载体中的同源重组缺失。本发明的双向启动子以双向方式指导基因表达，控制置于双向启动子序列两侧的基因的表达。这些双向启动子是如下连续基因调控序列，这些连续基因调控序列还可以含有除启动子元件之外的增强子元件和内含子元件，并且由如本文所述的结构单元限定。用于设计合成的双向启动子的结构单元衍生自已知的有效的单向启动子、增强子和内含子序列。启动子驱动置于启动子序列下游的一个基因的表达，并且典型地含有tata盒序列和转录起始位点(tss)。增强子序列可以增强从启动子的基因表达。已经描述了内含子序列在体外尤其是体内增加基因表达。设计并测试以下双向启动子构建体组：1.rcmv-hef1αi(图1a，seqidno：1)2.rcmv-hef1αii(图1b，seqidno：2)3.rhcmv-cag1(图1c，seqidno：3)4.hcmv-rhcmv(图1d，seqidno：4)5.rcmv-cag(图1e，seqidno：5)6.rhcmv-cag2(图1f，seqidno：6)7.rcmvbidir1(图1g，seqidno：10)8.rcmvbidir2(图1h，seqidno：8)9.rcmvbidir1.1(图1i，seqidno：7)10.hcmv-cag4(图1j，seqidno：11)还在之前的专利申请(pct/ep2016/057982)中测试了其他双向启动子构建体：1.mcmvbidir.2.hcmv-cag3.mcmv-cag双向启动子设计及其结构单元的示意图显示于图1，并在下面进行了更详细地描述：用于不同设计的启动子和增强子结构单元衍生自巨细胞病毒立即早期(ie)区域(本文典型地称为hcmv启动子和hcmv增强子，并且有时也称为hcmvie)，鸡β肌动蛋白/兔β珠蛋白启动子序列和人伸长因子1α启动子(hef1α启动子)序列。内含子衍生自嵌合体鸡β肌动蛋白/兔β珠蛋白序列，hef1α第一内含子和人载脂蛋白a-1内含子(hapoa1内含子)。人巨细胞病毒主要立即早期启动子在各种哺乳动物细胞系中已知是有效的启动子(powell等人，2015)。hcmv和其他疱疹病毒以如下三个阶段表达基因：立即早期(ie)、早期和晚期。主要的即时主要立即早期启动子在各种哺乳动物细胞系中以高水平激活异源基因。虽然人巨细胞病毒主要立即早期启动子和增强子最常用于转基因表达盒的设计(addison，hitt，kunsken，&graham，1997；c.harro等人，2009)，感染其他物种，例如小鼠(mcmv)(addison等人，1997；chatellard等人，2007；c.harro等人，2009)、大鼠(rcmv)(sandford&burns，1996；voigt，sandford，hayward，&burns，2005)和猕猴(rhcmv)(barry，alcendor，power，kerr，&luciw，1996；chan，chiou，huang，&hayward，1996；chang等人，1993；hansen，strelow，franchi，anders，&wong，2003)的巨细胞病毒的主要立即早期启动子和增强子也是已知的并且可以用于有效的表达盒的设计。具体地，猕猴cmv序列衍生自猕猴疱疹病毒5型的主要立即早期区域。猕猴cmv短启动子部分是通过与hcmv和黑猩猩cmv短启动子的比对来鉴定的。还描述了hef1α启动子是哺乳动物细胞中异源基因表达的有效的启动子序列(kim，uetsuki，kaziro，yamaguchi，&sugano，1990)。由hcmv增强子、鸡β肌动蛋白启动子(a)和杂交鸡β肌动蛋白/兔β珠蛋白内含子(g)序列组成的嵌合体启动子cag被描述为用于表达异源基因的有效的启动子，可以被缩短，并且可以利用用于表达抗原(richardson等人，2009)。richardson等人的研究描述了cag启动子的修饰导致了δ829cag启动子形式，其中杂交内含子显著缩短。这种没有hcmv增强子(δ829ag)的δ829cag启动子形式被用作某些双向启动子的设计的结构单元，在附图中表示为ag部分，但在双向启动子的名称中被称为cag，并且在整个文本中被称为cag或ag。在下文中，描述了用于设计双向启动子序列的结构单元的排列：缩短的ag启动子和hef1α启动子携带内含子作为所述的有效调控序列的关键部分。当ag启动子或hef1α启动子用于双向启动子设计时，我们还在双向启动子设计的相反侧放置了异源内含子序列。基于小鼠cmv启动子的自然双向性，进行了rcmv立即早期启动子的不同的潜在双向启动子设计。之前已经描述了hef1α衍生的内含子和mcmv启动子序列的合成组合产生有效的调控序列。因此，将hef1α序列与rcmv启动子(衍生自巨细胞病毒(像mcmv)的另一种启动子)和增强子的元件组合以设计双向启动子序列rcmv-hef1αi和rcmv-hef1αii(参见，例如，图1a和1b)。由于hef1α内含子被描述为增加表达水平但是是非常长的序列，我们的设计试图如通过cag启动子的实验方法所描述的来显著缩短hef1α内含子序列(richardson等人，2009)。为此，去除部分内含子序列，同时保留所述的剪接供体、剪接受体和假定的分支点位点加所述的细胞因子结合位点。设计了两种不同形式的缩短的内含子，其中启动子/内含子组合hef1αi比启动子/内含子组合hef1αii保留更多位点，并且产生双向启动子rcmv-hef1αi和rcmv-hef1αii。另外的双向启动子设计是基于缩短的ag启动子与衍生自不同物种(包括猕猴cmv(rhcmv)、大鼠cmv(rcmv)和人cmv(hcmv))的巨细胞病毒主要立即早期启动子的增强子和启动子序列的组合。这些双向启动子被称为rhcmv-cag1、rhcmv-cag2、hcmv-cag4和rcmv-cag。rhcmv-cag1和rhcmv-cag2之间的差异在于rhcmv增强子序列的方向。另外的双向启动子设计是基于hcmv增强子、人cmv启动子(hcmv)和猕猴cmv启动子(rhcmv)的组合。所得双向启动子构建体在整个文本中被称为hcmv-rhcmv。由于之前描述过(amendola等人，2005)，以两个启动子为侧翼的一个增强子的排列导致两种感兴趣的基因的协调表达，理论上使用强启动子和增强子结构单元应该产生具有相当效力和平衡的双向启动子。除了合成的双向启动子设计外，衍生自rcmvmie区域的潜在天然双向启动子用作双向启动子序列rcmvbidir1和rcmvbidir2和rcmvbidir1.1的基础。虽然所有三种双向启动子设计都携带假定的最小rcmv启动子和假定的最小rcmvvox2启动子(侧翼于rcmv增强子序列的)，但设计的不同之处在于增强子片段的长度和增强子片段的方向。vox2启动子正在将大鼠细胞cd200(vox2)基因的转录立即驱动到mie区域的右侧(voigt等人，2005)。实例2：筛选不同的启动子构建体，用于报告基因的有效和平衡的表达在第一筛选实验中，使用报告基因荧光素酶和egfp在hek293中用瞬时转染评估来自不同双向启动子构建体的表达，用于定量效力读数。对于padapt35质粒的瞬时转染，双向启动子在左侧具有荧光素酶转基因，在双向启动子的右侧具有egfp转基因。用携带不同双向启动子设计的质粒进行三次独立的转染实验。在实验1(图2a)中，测试了启动子rcmvbidir2、rcmv-hef1αii、rhcmv-hef1αi、rhcmv-cagl和hcmv-rhcmv。虽然rcmvbidir2、rcmv-ef1αii和rhcmv-cag1总是展示双向启动子功能(即使效力低于具有单向控制的hcmv启动子(seqidno：9))，但是rcmv-hef1αi出乎意料地不展示高于阴性对照的启动子效力(针对egfp表达)和非常差的启动子效力(针对荧光素酶表达)。在实验1中，hcmv-rhcmv是最有效的双向启动子。出乎意料地，hcmv-rhcmv是一个有效的双向启动子，虽然有略低于单向hcmv启动子的表达水平，但是有非常平衡的转基因表达。在筛选实验2(图2b)中，测试了启动子hcmv-cag4、rcmvbidir1.1和rcmv-cag。hcmv-cag4启动子在两侧展示了有效的启动子活性，该活性与这个实验中的单向hcmv对照相当或甚至比其更高。rcmvbidir1.1启动子出乎意料地在两侧展示了较低的启动子效力。双向rcmv-cag启动子展示了双向启动子效力，该双向启动子效力与hcmv单向对照的效力相比，从两侧均更低，并且与双向hcmv-rhcmv启动子相比，两侧也更低并且不平衡(这些数据显示于图2a)。在第三筛选实验中，测试了两个新的双向启动子rhcmv-cag2、rcmvbidir1，以及两个已经测试的双向启动子hcmv-rhcmv和hcmv-cag4。虽然rhcmv-cag2显示了双向启动子效力虽然与单向hcm对照相比更弱，但是rcmvbidir1仅诱导位于启动子右侧的egfp的表达，并且荧光素酶的活性在未转染的细胞对照的范围内。在这个实验3中，又测试了双向启动子hcmv-rhcmv和hcmv-cag4，确认它们有希望的效力和平衡。如在这种基于细胞的生物转染实验所预期的，在实验1和实验3之间观察到了一些变化。与单向hcmv启动子对照相比，cmv-rhcmv和hcmv-cag4都显示了比在实验1中更低的在实验3中的效力。虽然hcmv-rhcmv的效力低于hcmv-cag4，但是关于egf和荧光素酶的表达，hcmv-rhcmv更平衡。因此，hcmv-rhcmv是有效的双向启动子，有非常平衡的转基因表达，并且也有相对较短的优点。出乎意料地，并不是结构单元的所有组合都会导致有效和平衡的双向启动子。例如，hcmv-cag4和rhcmv-cag1和rhcmv-cag2就它们的结构单元而言是相似的。这三种不同的设计都利用了所描述的强cmv衍生的增强子和启动子(虽然它们来自不同的物种)和相同的之前所描述的强cag启动子。然而，出乎意料地，hcmv-cag4比rhcmv-cag1和rhcmv-cag2更有效。另外，cag启动子部分被描述为比hcmv启动子强，然而在双向背景中，偶联到hcmv启动子结构单元上的转基因的表达超过了偶联到cag启动子结构单元上的转基因的表达。这清楚地证明了当在其他群集中使用时，从之前已知的结构单元创造新的双向启动子的不可预测性。从一组测试的双向启动子构建体中，hcmv-rhcmv被鉴定为有效双向启动子构建体的最平衡的候选物。从来自所描述的有效启动子和增强子的结构单元的hcmv-rhcmv启动子的设计，无法预期这个启动子是有效的(尽管效力稍微低于其他新颖的hcmv-cag4双向启动子)并且非常平衡的(比在wo2016/166088中所描述的mcmv启动子更平衡，并且比hcmv-cag4双向启动子甚至稍微更平衡)。另外，双向hcmv-rhcmv启动子具有比其他启动子设计短得多(具有小于1kb的长度)的优点。这意味着与其他双向启动子相比，使用这个双向启动子为转基因在具有空间限制的载体(例如rads)中留下更多的空间(即，允许更长的转基因)。由不同的单向启动子结构单元组成的剩余的测试的合成的双向启动子设计主要展示出良好的双向启动子功能，然而它们与hcmv启动子相比通常效力较低且平衡较差。与小鼠cmv双向启动子相比，rcmv立即早期启动子可以设计为双向启动子，然而其效力较低。结果显示，不可预测结构单元的哪种组合提供双向启动子的良好功能(在两个方向上都有效表达，即在hcmv单向启动子的控制下的表达的至少10％、优选地至少20％、更优选地至少30％)。图3中展示了hcmv-rhcmv的示意图，包括结构单元的同一性和方向的注释。双向hcmv-rhcmv启动子的右侧包括猕猴cmv启动子结构单元(rhcmv)并且双向hcmv-rhcmv启动子的左侧包括hcmv启动子结构单元和hcmv增强子结构单元，该hcmv增强子结构单元以反转方向指向双向启动子的左侧，与hcmv启动子的方向相同。虽然在此使用术语“左”和“右”以便于描述，但技术人员将立即认识到双向hcmv-rhcmv启动子构建体也可以转向反方向、并以相反的方向使用。还应当注意，hcmv-rhcmv启动子具有小于1kb的相对小尺寸，非常合适用作重组腺病毒载体中的双向启动子。实例3：从携带hcmv-rhcmv表达盒的腺病毒载体的转基因表达的效力和平衡为了进一步评估从腺病毒载体e1区域的表达的效力和平衡，我们在e1区域产生了携带hcmv-rhcmv双向表达盒的ad26和ad35载体。产生四种不同的载体(也就是ad26.egfp.hcmv-rhcmv.luc、ad26.luc.hcmv-rhcmv.egfp、ad35.egfp.hcmv-rhcmv.luc和ad35.luc.hcmv-rhcmv.egfp)以在非补充a549细胞的转导后评估报告基因表达的效力和平衡。以100vp/细胞和1000vp/细胞进行转导。由于两种vp/细胞比率的结果类似，只将1000vp/细胞转导的结果显示于图4。为了估计表达100vp/细胞和1000vp/细胞中的十倍差异，显示了在单向hcmv启动子的控制下表达报告基因的阳性对照载体ad.luc和ad.egfp的转导。小图4a显示了hcmv-rhcmv诱导从ad26e1双向表达盒的报告基因的有效的表达，并且表达水平比在1000vp/细胞的ad26.luc和ad26.egfp对照载体的表达水平略低。将ad26.luc.hcmv-rhcmv.egfp与ad26.luc.mcmvbidir.egfp进一步直接比较，并显示egfp的转基因表达与mcmvbidir.相比降低，但是也显示了总体更平衡的转基因表达。图4b显示了从ad35载体中hcmv-rhcmv双向表达盒的转基因表达。有趣的是，ad35载体中的表达谱与ad26载体中的表达谱略有不同。因此，虽然有效的双向启动子可用于衍生自不同血清型的radv，但不同的启动子可能最佳用于一种radv而非另一种radv，这进一步示例了启动子和表达盒的复杂设计是最佳病毒载体所需的。实例4：在e1区域携带hcmv-rhcmv双向表达盒的腺病毒载体的遗传稳定性测试除转基因表达外，adv产生期间的遗传稳定性是表达两种抗原的有用adv的关键参数。因此，如之前申请wo2016/166088中所述测试遗传稳定性。简言之，通过在per.c6细胞中的质粒转染产生载体ad26.luc.hcmv-rhcmv.egfp和ad26.egfp.hcmv-rhcmv.luc，并通过噬斑挑选来分离病毒群体。将每个载体10个噬斑繁殖至病毒传代数(vpn)3。从那时起，选择五个噬斑用于延长传代直至传代数13。通过e1表达盒区域(图5)、和e3和e4区域上的同一性pcr来评估遗传稳定性(未显示e3和e4pcr的数据)。通过vpn13的e1pcr产物的标准sanger测序，证实不存在小的缺失或点突变。ad26.luc.hcmv-rhcmv.egfp和ad26.egfp.hcmv-rhcmv.luc两者的五个噬斑中有五个直至传代数13是遗传稳定的。结论如上所述，通过筛选一组新的双向启动子构建体，确定不可预测哪种双向启动子构建体将给出所希望的启动子特性。事实上，甚至看起来非常类似的双向启动子构建体也不一定给出相同的结果。例如，双向hcmv-rhcmv启动子(在左侧具有人cmv启动子(hcmv)并且在右侧具有短猕猴cmv启动子(rhcmv))显示出来自rad26和rad35载体的e1区域的两种不同转基因的特别平衡的表达。出乎意料地，双向hcmv-rhcmv启动子结合了转基因表达的效力和平衡，并且非常小，其中长度小于1kb。即使在per.c6细胞中连续传代至p13后，具有双向hcmv-rhcmv启动子的rad也被确定为是遗传稳定的。因此，不可预测地，本发明的双向hcmv-rhcmv启动子是用于重组病毒载体的具有出人意料的优选特征的启动子，这些重组病毒载体可用于基因疗法或疫苗，其中特别平衡和有效的表达是所希望的和/或其中双向hcmv-rhcmv启动子的小尺寸是有用的。表1：*描述于wo2016/166088参考文献美国专利文献：us5057540a(10/15/1991).“saponinadjuvant”.kensil，charlottea.；marciani，dantej.us5122458a(6/16/1992).“useofabghgdnapolyadenylationsignalinexpressionofnon-bghpolypeptidesinhighereukaryoticcells”.post，leonarde.；palermo，danielp.；thomsen，darrellr.；rottman，fritzm.；goodwin，edwardc.；woychik，richardp.us5559099a(9/24/1996).“pentonbaseproteinandmethodsofusingsame”.wickham，thomasj.；kovesdi，imre；brough，douglase.；mcvey，duncanl.；brader，josepht.us5837511a(11/17/1998).“non-groupcadenoviralvectors”.falckpedersen，eriks.；crystal，ronaldg.；mastrangeli，andrea；abrahamson，karilus5837520a(11/17/1998).“methodofpurificationofviralvectors”.shabram，paulw.；huyghe，bernardg.；liu，xiaodong；shepard，h.michaelus5846782a(12/8/1998).“targetingadenoviruswithuseofconstrainedpeptidemotifs”.wickham，thomasj.；roelvink，petrusw.；kovesdi，imreus5851806a(12/22/1998).“complementaryadenoviralsystemsandcelllines”.kovesdi，imre；brough，douglase.；mcvey，duncanl.；bruder，josepht.；lizonova，alenaus5891690a(4/6/1999).“adenoviruse1-complementingcelllines”.massie，bernardus5965541a(10/12/1999).“vectorsandmethodsforgenetransfertocells”.wickham，thomasj.；kovesdi，imre；brough，douglase.us5981225a(11/9/1999).“genetransfervector，recombinantadenovirusparticlescontainingthesame，methodforproducingthesameandmethodofuseofthesame”.kochanek，stefan；schiedner，.gudrunus5994106a(11/30/1999).“stocksofrecombinant，replication-deficientadenovirusfreeofreplication-competentadenovirus”.kovesdi，imre；brough，douglase.；mcvey，duncanl.；bruder，josepht.；lizonova，alenaus5994128a(11/30/1999).“packagingsystemsforhumanrecombinantadenovirustobeusedingenetherapy”.fallaux，fritsjacobus；hoeben，robertcornelis；vandereb，alexjan；bout，abraham；valerio，domenicous6020191a(2/1/2000).“adenoviralvectorscapableoffacilitatingincreasedpersistenceoftransgeneexpression”.scaria，abraham；gregory，richardj.；wadsworth，samuelc.us6040174a(3/21/2000).“defectiveadenovirusesandcorrespondingcomplementationlines”.imler，jeanluc；mehtali，majid；pavirani，andreaus6083716a(7/4/2000).“chimpanzeeadenovirusvectors”.wilson，jamesm.；farina，stevenf.；fisher，krishnaj.us6113913a(9/5/2000).“recombinantadenovirus”.brough，douglase.；kovesdi，imreus6225289b1(5/1/2001).“methodsandcompositiohsforpreservingadenoviralvectors”.kovesdi，imre；ransom，stephenc.us6261823b1(7/17/2001).“methodsforpurifyingviruses”.tang，johnchutay；vellekamp，gary；bondoc，jr.，laureanol.us6485958b2(11/26/2002).“methodforproducingrecombinantadenovirus”.blanche，francis；guillaume，jeanmarcus7326555b2(2/5/2008).“methodsofadenovirruspurification”.konz，jr.，johno.；lee，annl.；to，chishungbrian；goerke，aaronrus8932607b2(1/13/2015).“batchesofrecombinantadenoviruswithalteredterminalends”.custers，jeromeh.h.v.；vellinga，jort欧洲专利文献：ep1230354b1(1/7/2004).“permanentamniocytecellline，theproductionthereofanditsuseforproducinggenetransfervectors”.kochanek，stefan；schiedner，gudrunep1601776b1(7/2/2008).“expressionvectorscomprisingthemcmvie2promoter”.chatellard，philippe；imhof，markusep853660b1(1/22/2003).“methodforpreservinginfectiousrecombinantviruses，aqueousviralsuspensionanduseasmedicine”.sene，claude国际专利申请出版物：wo2003049763a1(6/19/2003).“compositionforthepreservationof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