微小RNA-143衍生物的制作方法

本发明涉及一种新型微小rna-143(以下也称作“mir-143”)衍生物。此外，也涉及一种含有该mir-143衍生物的药物组合物。另外，本发明还涉及同时使用该mir-143衍生物和egfr抑制剂。

背景技术：

微小rna(以下也称作“mirna”)是在基因组上所编码的内源性约20～25个碱基的非编码(non-coding)rna。mirna是从基因组dna上的mirna基因首先转录为约几百至几千个碱基长度的初级转录物(primarymirna、pri-mirna)，然后被加工为具有大约60～110个碱基左右的发夹结构的mirna前体(pre-mirna，precusormirna)。随后，该mirna前体从细胞核向细胞质内移动，经剪接而成为20～25个碱基左右的双链mirna。双链mirna进入到被称为risc的蛋白中，成为单链mirna(前导链，反义链)，更加不稳定的单链(过客链，有义链)则被降解。单链mirna通过与具有部分互补的碱基序列的目的基因的mrna结合，起到抑制目的基因翻译的作用。

已知在人和小鼠等中有1000种以上的mirna，表明它们分别调控多个目的基因的表达，参与细胞的增殖和分化等各种生命现象，与癌症、心血管疾病、神经变性疾病、精神疾病、慢性炎症疾病等的发病和进展有关。其中，很多研究者指出mirna与癌细胞增殖的关系密切，作为核酸药物的研究和开发正在开展中。

mir-143也是表明与癌症有关的mirna中的一种。非专利文献1记载了mir-143抑制结肠癌细胞(dld-1、sw480)增殖(参考图3)。此外，专利文献1、非专利文献2和3记载了mir-143的4处错配序列中至少匹配有义链的1～3处，用苯吡啶衍生物(bp)修饰有义链和反义链的3’末端的修饰物与天然mir-143相比，具有优异的癌细胞增殖抑制作用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：wo2010/032704号

非专利文献

非专利文献1：oncologyreport,16,845-850(2006)

非专利文献2：cancergenetherapy,17,398-408,(2010)

非专利文献3：cancerletters,307,211-220(2011)

技术实现要素：

发明所要解决的问题

本发明的目的在于提供一种可用作核酸药物的新型mir-143衍生物。

解决问题的技术方案

本发明人进行了潜心研究，结果发现：与野生型(由seqidno:1和seqidno:2组成的天然人mir-143)相比有义链(第一链)的3’末端只少1个碱基而反义链(第二链)相同的seq-22，与第一链是由seqidno:3所示的序列而第二链是由seqidno:5所示的序列的本发明的mir-143衍生物(实施例中的seq-01)相比，seq-01表现出比seq-22更强的肿瘤增殖抑制效果(图10)。进一步发现：与在seq-22第二链的3’末端缺失2个碱基并引入3’末端修饰(^dt^dt)的seq-23相比，seq-01也表现出很强的肿瘤增殖抑制效果(图10)。

另外还发现：第一链是由seqidno:3所示的序列且没有3’末端修饰，第二链为seqidno:4(即seq-01第二链的3’末端缺失2个碱基)所示的序列且有3’末端修饰的本发明的mir-143衍生物(实施例中的seq-10～seq-12、seq-19～seq-21、seq-24～seq-144)表现出在seq-01以上的肿瘤增殖抑制效果，与天然mir-143和其他mir-143衍生物(实施例中的seq-02～seq-04、seq-07～seq-09、seq-13～seq-18)相比，表现出优异的细胞增殖抑制效果(图1～3、表13)。本发明的mir-143衍生物作为核酸药物，尤其是用于治疗癌症或抑制癌症恶化的药物非常有效。

另外，本发明人发现：如果同时使用egfr抑制剂西妥昔单抗(cetuximab)和本发明的mir-143衍生物(seq-01或seq-12)，则对于kras突变型的癌症也具有抗肿瘤作用(图4、图5)。如果存在kras突变，则很可能无法期待egfr抑制剂的药理作用，例如，西妥昔单抗制剂erbitax(注册商标)的日本药物说明书中，作为功效和作用记载有“egfr阳性的不能根治性切除的进展期和复发的结肠与直肠癌头颈癌”，但也提示了“应当在考虑有无ras(kras和nras)基因突变的基础上选择适应症患者”。同时使用egfr抑制剂和本发明的mir-143衍生物，可以向至今难以给予egfr抑制剂的患者进行给药，因此本发明的mir-143衍生物非常有用。

即，本发明涉及如下内容：

(i-1)一种微小rna-143衍生物，

其第一链是由以下序列组成的寡核苷酸：由seqidno:3所示的序列，或者在由seqidno:3所示的序列中置换、缺失、插入或添加1个或2个碱基而形成的序列，并且没有3’末端修饰而可以有5’末端修饰；

第二链是由以下序列组成的寡核苷酸：由seqidno:4所示的序列，或者在由seqidno:4所示的序列中置换、缺失或插入1个或2个碱基而形成的序列，并且有3’末端修饰且可以有5’末端修饰；

或者，

第二链是由以下序列组成的寡核苷酸：由seqidno:5所示的序列，或者在由seqidno:5所示的序列中置换或插入1个或2个碱基而形成的序列，并且没有3’末端修饰而可以有5’末端修饰；

其中，

3’末端修饰是可以含有核苷衍生物和/或修饰的核苷间键的1mer～5mer寡核苷酸衍生物或苯吡啶衍生物，

5’末端修饰是磷酸酯部分或由式：＝cq1-p(＝o)(oh)2表示的基团，

式中，q1为氢、卤素、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的炔基，或者取代或非取代的烷氧基。

(i-2)根据(i-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，

第一链是由seqidno:3所示的序列组成的寡核苷酸，

第二链是由seqidno:4或由seqidno:5所示的序列组成的寡核苷酸。

(i-3)根据(i-1)或(i-2)所述的微小rna-143衍生物，其中，寡核苷酸衍生物为1mer或2mer。

(i-4)根据(i-1)～(i-3)中任一项所述的微小rna-143衍生物，其中，所述核苷衍生物是在糖的2’位具有取代基的核苷，或者是在糖的4’位和2’位之间具有交联结构的核苷。

(i-5)根据(i-4)所述的微小rna-143衍生物，其中，所述取代基为f、och3或och2ch2och3。

(i-6)根据(i-4)所述的微小rna-143衍生物，其中，所述交联结构为4’-(ch2)m-o-2’或4’-c(＝o)-nr³-2’，式中，m为1～4的整数，r³为氢原子或烷基。

(i-7)根据(i-1)～(i-6)中任一项所述的微小rna-143衍生物，其中，修饰的核苷间键为硫代磷酸酯键。

(i-8)根据(i-1)所述的微小rna-143衍生物，其选自于由以下物质组成的组：seq-12、seq-19、seq-29、seq-51、seq-52、seq-56、seq-60、seq-73、seq-74、seq-86、seq-89、seq-94、seq-106、seq-122、seq-123、seq-124、seq-127、seq-139、seq-140、seq-141、seq-142、seq-143和seq-144。

(i-9)一种药物组合物，其含有(i-1)～(i-8)中任一项所述的微小rna-143衍生物。

(i-10)一种药物，其由(i-1)～(i-8)中任一项所述的微小rna-143衍生物和egfr抑制剂组合而成。

(i-11)根据(i-10)所述的药物，其为混合剂。

(i-12)根据(i-10)所述的药物，其特征在于，同时使用有(i-1)～(i-8)中任一项所述的微小rna-143衍生物和egfr抑制剂。

(i-13)根据(i-12)所述的药物，其特征在于，同时或依次给予(i-1)～(i-8)中任一项所述的微小rna-143衍生物和egfr抑制剂。

(i-14)根据(i-12)所述的药物，其特征在于，分别给予(i-1)～(i-8)中任一项所述的微小rna-143衍生物和egfr抑制剂。

(i-15)根据(i-10)～(i-14)中任一项所述的药物，其中，egfr抑制剂为西妥昔单抗。

(i-16)根据(i-10)～(i-15)中任一项所述的药物，用于治疗癌症或抑制癌症恶化。

(i-17)一种egfr抑制剂的癌症治疗效果增强剂，含有(i-1)～(i-8)中任一项所述的微小rna-143衍生物。

(i-18)(i-1)～(i-8)中任一项所述的微小rna-143衍生物的癌症治疗效果增强剂，含有egfr抑制剂。

(i-19)一种与egfr抑制剂同时使用的药物组合物，含有(i-1)～(i-8)中任一项所述的微小rna-143衍生物作为有效成分。

(i-20)一种与(i-1)～(i-8)中任一项所述的微小rna-143衍生物同时使用的药物组合物，含有egfr抑制剂作为有效成分。

(i-21)根据(i-19)或(i-20)所述的药物组合物，用于治疗癌症或抑制癌症恶化。

另外，本发明还涉及如下内容：

(ii-1)一种微小rna-143衍生物，

第一链为核苷间键是磷酸二酯键的rna寡核苷酸，

第二链为含有核苷衍生物和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸，

第二链的3’末端结合有由式：dx¹dx²表示的基团或苯吡啶衍生物，

其中，x¹或x²各自独立地为a、g、c或t。

(ii-2)根据(ii-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，

核苷衍生物是在糖的2’位具有取代基的核苷和/或在糖的4’位和2’位之间具有交联结构的核苷。

(ii-3)根据(ii-2)所述的微小rna-143衍生物，其中，所述取代基为f、och3或och2ch2och3。

(ii-4)根据(ii-2)所述的微小rna-143衍生物，其中，所述交联结构为4’-(ch2)m-o-2’或4’-c(＝o)-nr³-2’，式中，m为1～4的整数，r³为氢原子或烷基。

(ii-5)根据(ii-1)～(ii-4)中任一项所述的微小rna-143衍生物，其中，修饰的核苷间键为硫代磷酸酯键。

(ii-6)根据(ii-1)～(ii-5)中任一项所述的微小rna-143衍生物，其中，第二链的5’末端结合有磷酸酯部分。

(ii-7)根据(ii-1)～(ii-6)中任一项所述的微小rna-143衍生物，其中，x¹和x²为t。

(ii-8)根据(ii-1)～(ii-7)中任一项所述的微小rna-143衍生物，其中，

第一链是含有由seqidno:1或由seqidno:3所示的序列，或者含有在由seqidno:1或由seqidno:3所示的序列中置换、插入、缺失和/或添加1个或更多个碱基而形成的序列的30个碱基以下的寡核苷酸，

第二链是含有由seqidno:2或由seqidno:4所示的序列，或者含有在由seqidno:2或由seqidno:4所示的序列中置换、插入、缺失和/或添加1个或更多个碱基而形成的序列的30个碱基以下的寡核苷酸。

(ii-9)根据(ii-8)所述的微小rna-143衍生物，其中，

第一链是由seqidno:3所示的序列组成的寡核苷酸，

第二链是由seqidno:4所示的序列组成的寡核苷酸。

(ii-10)一种药物组合物，其含有(ii-1)～(ii-9)中任一项所述的微小rna-143衍生物。

(ii-11)一种微小rna-143衍生物，

第一链是由seqidno:3所示的序列组成的寡核苷酸，

第二链是由seqidno:5所示的序列组成的寡核苷酸。

(ii-12)一种药物组合物，其含有(ii-11)所述的微小rna-143衍生物。

(ii-13)一种药物，其由(ii-1)～(ii-9)、(ii-11)中任一项所述的微小rna-143衍生物和egfr抑制剂组合而成。

(ii-14)根据(ii-13)所述的药物，其为混合剂。

(ii-15)根据(ii-13)所述的药物，其特征在于，同时使用有(ii-1)～(ii-9)、(ii-11)中任一项所述的微小rna-143衍生物和egfr抑制剂。

(ii-16)根据(ii-15)所述的药物，其特征在于，同时或依次给予(ii-1)～(ii-9)、(ii-11)中任一项所述的微小rna-143衍生物和egfr抑制剂。

(ii-17)根据(ii-15)所述的药物，其特征在于，分别给予(ii-1)～(ii-9)、(ii-11)中任一项所述的微小rna-143衍生物和egfr抑制剂。

(ii-18)根据(ii-13)～(ii-17)中任一项所述的药物，其中，egfr抑制剂为西妥昔单抗。

(ii-19)根据(ii-13)～(ii-18)中任一项所述的药物，用于治疗癌症或抑制癌症恶化。

(ii-20)一种egfr抑制剂的癌症治疗效果增强剂，含有(ii-1)～(ii-9)、(ii-11)中任一项所述的微小rna-143衍生物。

(ii-21)(ii-1)～(ii-9)、(ii-11)中任一项所述的微小rna-143衍生物的癌症治疗效果增强剂，含有egfr抑制剂。

(ii-22)一种与egfr抑制剂同时使用的药物组合物，含有(ii-1)～(ii-9)、(ii-11)中任一项所述的微小rna-143衍生物作为有效成分。

(ii-23)一种与(ii-1)～(ii-9)、(ii-11)中任一项所述的微小rna-143衍生物同时使用的药物组合物，含有egfr抑制剂作为有效成分。

(ii-24)根据(ii-22)或(ii-23)所述的药物组合物，用于治疗癌症或抑制癌症恶化。

发明效果

本发明的mir-143衍生物表现出优异的细胞增殖抑制作用，作为用于治疗癌症或抑制癌症恶化的药物非常有效。此外，本发明的mir-143衍生物和egfr抑制剂的组合尤其作为用于治疗难以给予egfr抑制剂的kras突变型的癌症或抑制该癌症恶化的药物非常有效。

附图说明

图1表示使用dld-1细胞的mir-143衍生物的肿瘤增殖抑制效果。

图2表示使用dld-1细胞的mir-143衍生物的肿瘤增殖抑制效果。

图3表示使用dld-1细胞的mir-143衍生物的肿瘤增殖抑制效果。

图4表示抗egfr抗体(erbitax(注册商标))对dld-1细胞的肿瘤增殖抑制效果。

图5表示经mir-143衍生物处理后的抗egfr抗体(erbitax(注册商标))的肿瘤增殖抑制效果。

图6表示mir143调控蛋白和ras通路下游蛋白的表达分析。

图7表示经mir-143衍生物处理后的kras基因的表达分析。

图8是对kras基因的两种sirna的设计位置的相关说明。kras中存在两种异构体(krasa和krasb)，krasb的表达量多(上)。sir-krasa将krasa异构体的外显子4a作为靶标，sir-kras将两个异构体中共同的3’非翻译区域作为靶标。

图9的上部分表示经以kras为靶标的sirna处理后的kras蛋白的表达分析，下部分表示经sirna处理后的erbitax(注册商标)的肿瘤增殖抑制效果。

图10表示使用dld-1细胞的mir-143衍生物的肿瘤增殖抑制效果。

图11表示体内(invivo)的mir-143衍生物的肿瘤增殖抑制效果。

具体实施方式

除非特别说明，本说明书中使用的术语均按照本领域常用的含义使用。

本发明中，可以使用本领域公知的基因操作方法。例如可举出分子克隆实验指南(第3版)(molecularcloning,alaboratorymanual,thirdedition)冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)(2001)、最新分子生物学实验操作指南(currentprotocolsinmolecularbiology)约翰威立国际出版公司(johnwiley&sons)(2003)中记载的方法等。

下面对本说明书中使用的各术语进行说明。予以说明，本说明书中，无论是单独使用各术语，还是与其他术语一起使用，如无特别说明，均具有相同的含义。

mir-143为公知的微小rna。作为天然人mir-143，例如可举出：由seqidno:1(5’-ggugcagugcugcaucucuggu-3’)(mimat0004599、hsa-mir-143-5p)或seqidno:2(5’-ugagaugaagcacuguagcuc-3’)(mimat0000435、hsa-mir-143-3p)所示的序列组成的单链rna、由seqidno:1所示的序列和由seqidno:2所示的序列组成的双链rna等。

核苷意为核酸碱基和糖通过n-糖苷键结合而形成的化合物。

寡核苷酸意为多个相同或不同的核苷通过核苷间键结合而形成的核苷。

本说明书中，“dna核苷”或“rna核苷”是天然dna核苷或天然rna核苷，意为构成寡核苷酸一个单位的核苷酸的一部分。“天然dna核苷”为以下含义：

[化1]

(式中，bx1(核酸碱基)是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶)。

“天然rna核苷”为以下含义：

[化2]

(式中，bx2(核酸碱基)是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶)。

“rna寡核苷酸”是指多个rna核苷通过核苷间键结合而形成的寡核苷酸。

本说明书中，“核苷衍生物”意为在上述dna核苷或上述rna核苷的核酸碱基和/或糖位点进行人工修饰而形成的核苷。如果是本领域公知的核苷修饰，则可任意使用。

关于本领域公知的核苷酸的修饰和修饰方法，例如也已在以下专利文献中被公开：

wo98/39352、wo99/014226、wo2000/056748、wo2005/021570、wo2003/068795、wo2011/052436、wo2004/016749、wo2005/083124、wo2007/143315、wo2009/071680、wo2014/112463、wo2014/126229等。

作为核酸碱基的修饰，例如可举出：5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶等。

另外，“核苷衍生物”中也包括由下式所示的缺失核酸碱基的衍生物(脱碱基(abasic))。

[化3]

(式中，x是氢或oh)。

作为糖位点的修饰，例如可举出糖的2’位的取代。具体地是2’-f、2’-och3(2’-ome)、2’-och2ch2och3(2’-moe)等。

另外，例如可举出以下的糖的4’位和2’位之间的交联结构：

4’-(cr¹r²)m-o-2’、4’-(cr¹r²)m-s-2’、4’-(cr¹r²)m-o-c(＝o)-2’、4’-(cr¹r²)m-nr³-o-(cr¹r²)m1-2’、4’-(cr¹r²)m1-c(＝o)-nr³-2’、4’-(cr¹r²)m2-c(＝o)-nr³-y⁴-2’、4’-(cr¹r²)m1-so2-nr³-2’、4’-(cr¹r²)m-nr³-2’或

[化4]

其中，

y⁴是o、s、nh或ch2，

r¹各自独立地为氢原子、卤素、氰基、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基，或者取代或非取代的炔基，

r²各自独立地为氢原子、卤素、氰基、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基，或者取代或非取代的炔基，

r³为氢原子、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的炔基、取代或非取代的芳香族碳环基、取代或非取代的非芳香族碳环基、取代或非取代的芳香族杂环基、取代或非取代的非芳香族杂环基、取代或非取代的芳香族碳环烷基、取代或非取代的非芳香族碳环烷基、取代或非取代的芳香族杂环烷基，或者取代或非取代的非芳香族杂环烷基，

y¹为cr⁴或n，

y²为cr⁵或n，

y³为cr⁶或n，

r⁴、r⁵和r⁶各自独立地为氢原子、卤素、氰基、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的炔基、取代或非取代的氨基、取代或非取代的烷氧基、取代或非取代的烷基羰基氨基、取代或非取代的烯基羰基氨基、取代或非取代的炔基羰基氨基、取代或非取代的烷基氨基甲酰基、取代或非取代的烯基氨基甲酰基，或者取代或非取代的炔基氨基甲酰基，

m为1～4的整数，

m1为0～3的整数，

m2为0或1。

r¹和r²优选为氢原子。

r³优选为氢原子、烷基、烯基、炔基、芳香族碳环基、非芳香族碳环基、芳香族杂环基、非芳香族杂环基、芳香族碳环烷基、非芳香族碳环烷基、芳香族杂环烷基或非芳香族杂环烷基，可以具有1个以上选自于α组的任意取代基。

α组为羟基、烷基、烷氧基、巯基、烷硫基、氨基、烷基氨基或卤素。

作为所述交联结构，优选为4’-(cr¹r²)m-o-2’或4’-(cr¹r²)m1-c(＝o)-nr³-2’(amna，桥接核酸)，

其中，

r¹各自独立地为氢原子、卤素、氰基、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基，或者取代或非取代的炔基，

r²各自独立地为氢原子、卤素、氰基、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基，或者取代或非取代的炔基，

r³为氢原子、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基，或者取代或非取代的炔基，

m为1～4的整数，

m1为0～2的整数。

作为所述交联结构，特别优选为4’-(ch2)m-o-2’(m为1～4的整数)或4’-c(＝o)-nr³-2’(r³为氢原子或烷基)。

4’-(ch2)m-o-2’(m为1～4的整数)中，特别优选4’-ch2-o-2’(lna，锁核酸)。具体实例及其制备方法记载于wo98/39352、wo2003/068795、wo2005/021570等中。

4’-c(＝o)-nr³-2’(r³为氢原子或烷基)中，特别优选4’-c(＝o)-nch3-2’。具体实例及其制备方法记载于wo2011/052436中。

另外，作为在糖位点有修饰的“核苷衍生物”，也包括由下式所示的糖开环的基团。

[化5]

(式中，bx3为可被修饰的核酸碱基)。

另外，也包括2’,5’-rna(biochemistry1998,37,7478-7486)。

“卤素”包括氟原子、氯原子、溴原子和碘原子。特别优选氟原子和氯原子。

“烷基”包括碳原子数1～15、优选碳原子数1～10、更优选碳原子数1～6、进一步优选碳原子数1～4的直链或支链烃基。例如可举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、正庚基、异庚基、正辛基、异辛基、正壬基、正癸基等。

作为“烷基”的优选方式，可举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基。作为更优选的方式，可举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基。

“烯基”包括在任意位置上具有1个以上双键的碳原子数2～15、优选碳原子数2～10、更优选碳原子数2～6、进一步优选碳原子数2～4的直链或支链烃基。例如可举出：乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、异戊二烯、丁二烯基、戊烯基、异戊烯基、戊二烯基、己烯基、异己烯基、己二烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一烯基、十二烯基、十三烯基、十四烯基、十五烯基等。

作为“烯基”的优选方式，可举出：乙烯基、烯丙基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基。

“炔基”包括在任意位置上具有1个以上三键的碳原子数2～10、优选碳原子数2～8、更优选碳原子数2～6、进一步优选碳原子数2～4的直链或支链烃基。例如包括：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等。它们还可以在任意位置上具有双键。

作为“炔基”的优选方式，可举出：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基。

“烷基氨基”包括单烷基氨基和双烷基氨基。如果是2个，则2个烷基可以相同也可以不同。

“烷基羰基氨基”、“烯基羰基氨基”或“炔基羰基氨基”分别意为烷基羰基、烯基羰基或炔基羰基与氨基氮原子结合的1个或2个氢原子进行置换而形成的基团。如果是2个，则2个烷基羰基、烯基羰基或炔基羰基可以相同也可以不同。

“烷基氨基甲酰基”、“烯基氨基甲酰基”或“炔基氨基甲酰基”分别意为烷基、烯基或炔基与氨基甲酰基氮原子结合的1个或2个氢原子进行置换而形成的基团。如果是2个，则2个烷基、烯基或炔基可以相同也可以不同。

作为“取代或非取代的烷基”、“取代或非取代的烯基”、“取代或非取代的炔基”、“取代或非取代的烷氧基”、“取代或非取代的烷基羰基氨基”、“取代或非取代的烯基羰基氨基”、“取代或非取代的炔基羰基氨基”、“取代或非取代的烷基氨基甲酰基”、“取代或非取代的烯基氨基甲酰基”或“取代或非取代的炔基氨基甲酰基”的取代基，可举出以下取代基。任意位置的碳原子可以与1个以上选自于以下取代基的基团结合。

取代基：卤素、羟基、羧基、氨基、亚氨基、羟基氨基、羟基亚氨基、甲酰基、甲酰氧基、氨基甲酰基、氨磺酰基、硫烷基、亚磺基、磺基、硫代甲酰基、硫代羧基、二硫代羧基、硫代氨基甲酰基、氰基、硝基、亚硝基、叠氮基、肼基、脲基、脒基、胍基、三烷基甲硅烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、卤代烷氧基、烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、单烷基氨基、双烷基氨基、烷基磺酰基、烯基磺酰基、炔基磺酰基、单烷基羰基氨基、双烷基羰基氨基、单烷基磺酰氨基、双烷基磺酰氨基、烷基亚氨基、烯基亚氨基、炔基亚氨基、烷基羰基亚氨基、烯基羰基亚氨基、炔基羰基亚氨基、烷氧基亚氨基、烯基氧亚氨基、炔基氧亚氨基、烷基羰氧基、烯基羰氧基、炔基羰氧基、烷氧基羰基、烯氧基羰基、炔氧基羰基、烷基硫烷基、烯基硫基、炔基硫烷基、烷基亚磺酰基、烯基亚磺酰基、炔基亚磺酰基、单烷基氨基甲酰基、双烷基氨基甲酰基、单烷基氨磺酰基、双烷基氨磺酰基、芳香族碳环基、非芳香族碳环基、芳香族杂环基、非芳香族杂环基、芳香族碳环氧基、非芳香族碳环氧基、芳香族杂环氧基、非芳香族杂环氧基、芳香族碳环羰基、芳香族碳环羰基、非芳香族碳环羰基、芳香族杂环羰基、非芳香族杂环羰基、芳香族碳环氧羰基、非芳香族碳环氧羰基、芳香族杂环氧羰基、非芳香族杂环氧羰基、芳香族碳环烷氧基、非芳香族碳环烷氧基、芳香族杂环烷氧基，非芳香族杂环烷氧基、芳香族碳环烷氧基羰基、非芳香族碳环烷氧基羰基、芳香族杂环烷氧基羰基、非芳香族杂环烷氧基羰基、芳香族碳环烷基氨基、非芳香族碳环烷基氨基、芳香族杂环烷基氨基、非芳香族杂环烷基氨基、芳香族碳环硫烷基、非芳香族碳环硫烷基、芳香族杂环硫烷基、非芳香族杂环硫烷基、非芳香族碳环磺酰基、芳香族碳环磺酰基、芳香族杂环磺酰基，以及非芳香族杂环磺酰基。予以说明，可以有1个以上选自于上述α组的任意取代基。

“芳香族碳环基”意为单环或双环以上的环状芳香族烃基。例如可举出：苯基、萘基、蒽基、菲基等。

作为“芳香族碳环基”的优选方式，可举出苯基。

“非芳香族碳环基”意为单环或双环以上的环状饱和烃基或环状非芳香族不饱和烃基。双环以上的非芳香族碳环基也包括单环或双环以上的非芳香族碳环基与上述“芳香族碳环基”上的环缩合而形成的基团。

另外，“非芳香族碳环基”也包括如下交联的基团或形成螺环的基团：

[化6]

作为单环的非芳香族碳环基，优选碳原子数3～16，更优选碳原子数3～12，进一步优选碳原子数4～8。例如可举出：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基等。

作为双环以上的非芳香族碳环基，例如可举出：茚满基、茚基、苊基、四氢萘基、芴基等。

“芳香族杂环基”意为在环内有1个以上杂原子的单环或双环以上的芳香族环基，所述杂原子相同或不同地任意选自于o、s、n。

双环以上的芳香族杂环基也包括单环或双环以上的芳香族杂环基与上述“芳香族碳环基”和/或“非芳香族碳环基”上的环缩合而形成的基团。

作为单环芳香族杂环基，优选五元至八元，更优选五元或六元。例如可举出：吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三唑基、三嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、异噻唑基、噻唑基、噻二唑基等。

作为双环芳香族杂环基，例如可举出：吲哚基、异吲哚基、吲唑基、吲嗪基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、萘啶基、喹喔啉基、嘌呤基、哌啶基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并噁唑基、苯并噁二唑基、苯并异噻唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并三唑基、咪唑并吡啶基、三唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吡嗪并哒嗪基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基等。

作为三环以上的芳香族杂环基，例如可举出：咔唑基、吖啶基、呫吨基、吩噻嗪基、吩噻基、吩嗪基、二苯并呋喃基等。

“非芳香族杂环基”意为在环内有1个以上杂原子的单环或双环以上的环状非芳香族环基，所述杂原子相同或不同地任意选自于o、s、n。

双环以上的非芳香族杂环基也包括单环或双环以上的非芳香族杂环基与上述“芳香族碳环基”、“非芳香族碳环基”和/或“芳香族杂环基”上的各个环缩合而形成的基团。

另外，“非芳香族杂环基”也包括如下交联的基团或形成螺环的基团：

[化7]

作为单环非芳香族杂环基，优选三元至八元，更优选五元或六元。例如可举出：二噁烷基、硫杂丙基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、氧硫杂环戊烷基、氮杂环丁烷基、硫烷基、噻唑烷基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吗啉代基、硫代吗啉基、硫代吗啉代基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、二氢噻唑基、四氢噻唑基、四氢异噻唑基、二氢噁嗪基、六氢氮杂基、四氢二氮杂基、四氢哒嗪基、六氢嘧啶基、二氧戊环基、二噁嗪基、氮丙啶基、二氧杂环戊烯基、氧杂环庚烷基、硫杂环戊烷基、thiinyl、噻嗪基等。

作为双环以上的非芳香族杂环基，例如可举出：吲哚基、异吲哚啉基、色满基、异色满基等。

作为“取代或非取代的芳香族碳环基”、“取代或非取代的非芳香族碳环基”、“取代或非取代的芳香族杂环基”和“取代或非取代的非芳香族杂环基”的“芳香族碳环”、“非芳香族碳环”、“芳香族杂环”和“非芳香族杂环”的环上的取代基，可举出以下取代基。环上任意位置的原子可以与1个以上选自于以下取代基的基团结合。

取代基：卤素、羟基、羧基、氨基、亚氨基、羟基氨基、羟基亚氨基、甲酰基、甲酰氧基、氨基甲酰基、氨磺酰基、硫烷基、亚磺基、磺基、硫代甲酰基、硫代羧基、二硫代羧基、硫代氨基甲酰基、氰基、硝基、亚硝基、叠氮基、肼基、脲基、脒基、胍基、三烷基甲硅烷基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、卤代烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、烷基羰基、烯基羰基、炔基羰基、单烷基氨基、双烷基氨基、烷基磺酰基、烯基磺酰基、炔基磺酰基、单烷基羰基氨基、双烷基羰基氨基、单烷基磺酰氨基、双烷基磺酰氨基、烷基亚氨基、烯基亚氨基、炔基亚氨基、烷基羰基亚氨基、烯基羰基亚氨基、炔基羰基亚氨基、烷氧基亚氨基、烯基氧亚氨基、炔基氧亚氨基、烷基羰氧基、烯基羰氧基、炔基羰氧基、烷氧基羰基、烯氧基羰基、炔氧基羰基、烷基硫烷基、烯基硫基、炔基硫烷基、烷基亚磺酰基、烯基亚磺酰基、炔基亚磺酰基、单烷基氨基甲酰基、双烷基氨基甲酰基、单烷基氨磺酰基、双烷基氨磺酰基、芳香族碳环基、非芳香族碳环基、芳香族杂环基、非芳香族杂环基、芳香族碳环氧基、非芳香族碳环氧基、芳香族杂环氧基、非芳香族杂环氧基、芳香族碳环羰基、芳香族碳环羰基、非芳香族碳环羰基、芳香族杂环羰基、非芳香族杂环羰基、芳香族碳环氧羰基、非芳香族碳环氧羰基、芳香族杂环氧羰基、非芳香族杂环氧羰基、芳香族碳环烷基、非芳香族碳环烷基、芳香族杂环烷基、非芳香族杂环烷基、芳香族碳环烷氧基、非芳香族碳环烷氧基、芳香族杂环烷氧基，非芳香族杂环烷氧基、芳香族碳环烷氧基羰基、非芳香族碳环烷氧基羰基、芳香族杂环烷氧基羰基、非芳香族杂环烷氧基羰基、芳香族碳环烷氧基烷基、非芳香族碳环烷氧基烷基、芳香族杂环烷氧基烷基、非芳香族杂环烷氧基烷基、芳香族碳环烷基氨基、非芳香族碳环烷基氨基、芳香族杂环烷基氨基、非芳香族杂环烷基氨基、芳香族碳环硫烷基、非芳香族碳环硫烷基、芳香族杂环硫烷基、非芳香族杂环硫烷基、非芳香族碳环磺酰基、芳香族碳环磺酰基、芳香族杂环磺酰基，以及非芳香族杂环磺酰基。予以说明，可以有1个以上选自于上述α组的任意取代基。

另外，“取代或非取代的非芳香族碳环基”和“取代或非取代的非芳香族杂环基”可以被“氧代基”取代。此时，其意为如下的碳原子上的2个氢原子被取代而形成的基团。

[化8]

本说明书中，“修饰的核苷间键”意为天然寡核苷酸中核苷间的化学键(糖和糖之间的化学键)磷酸二酯(d-oligo)键被人工修饰而形成的化学键或没有磷原子的化学键。作为核苷间键，只要是本领域公知的化学键，就可任意使用。作为经过人工修饰的化学键，可举出：硫代磷酸酯(s-oligo)键、甲基膦酸酯(m-oligo)键、硼烷磷酸酯键等。此外，也可以使用如wo2013/022966、wo2011/005761、wo2014/012081、wo2015/125845等中记载的化学键。作为没有磷原子的化学键，可举出：衍生自以下基团的二价取代基，所述基团为烷基、非芳香族碳环基、卤代烷基、被卤素取代的非芳香族碳环基等。例如衍生自以下基团的二价取代基，所述基团为硅氧烷、硫化物、亚砜、砜、乙酰基、甲酸乙酰酯、乙酰硫代甲酸酯、乙酰甲基甲酸酯、乙酰硫代甲酸酯、烯基、氨基磺酸、亚甲基亚氨基、亚甲基肼基、磺酸盐、磺酰胺、酰胺等。寡核苷酸中可以含有全部相同的化学键，也可以含有不同的化学键。

“由式：dx¹dx²表示的基团(其中，x¹或x²各自独立地为a、g、c或t”意为2个dna核苷通过核苷间键结合而形成的基团。具体意为以下基团：

[化9]

(式中，x¹和x²各自独立地为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；y¹和y²各自独立地为o或s)。

本说明书中，“苯吡啶衍生物”意为以下基团：

[化10]

(式中，x³和x⁴各自独立地意为n或ch，z为下述化合物：

[化11]

y³和y’各自独立地为o或s)。

具体实例及其制备方法记载于专利文献1、wo2011/071078等中。

下面对本发明进行详细说明。

本发明包括下述“mir-143衍生物(i)”。

(i)一种微小rna-143衍生物，

其第一链是由以下序列组成的寡核苷酸：由seqidno:3所示的序列，或者在由seqidno:3所示的序列中置换、缺失、插入或添加1个或2个碱基而形成的序列，并且没有3’末端修饰而可以有5’末端修饰；

第二链是由以下序列组成的寡核苷酸：由seqidno:4所示的序列，或者在由seqidno:4所示的序列中置换、缺失或插入1个或2个碱基而形成的序列，并且有3’末端修饰且可以有5’末端修饰；

或者，

第二链是由以下序列组成的寡核苷酸：由seqidno:5所示的序列，或者在由seqidno:5所示的序列中置换或插入1个或2个碱基而形成的序列，并且没有3’末端修饰而可以有5’末端修饰；

其中，

3’末端修饰是可以含有核苷衍生物和/或修饰的核苷间键的1mer～5mer寡核苷酸衍生物或苯吡啶衍生物，

5’末端修饰是磷酸酯部分或由式：＝cq1-p(＝o)(oh)2表示的基团。(式中，q1为氢、卤素、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的炔基，或者取代或非取代的烷氧基)。

另外，本发明包括下述“mir-143衍生物(a)”。

(a)一种微小rna-143衍生物，

第一链为核苷间键是磷酸二酯键的rna寡核苷酸，

第二链为含有核苷衍生物和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸，

第二链的3’末端结合有由式：dx¹dx²表示的基团或苯吡啶衍生物(其中，x¹或x²各自独立地为a、g、c或t)。

mir-143衍生物(a)的寡核苷酸的碱基序列不限于天然“mir-143”，只要能维持细胞增殖抑制作用，则可以在天然“mir-143”的碱基序列(第一链的寡核苷酸是由seqidno:1所示的序列，第二链的寡核苷酸是由seqidno:2所示的序列)各自独立地置换、插入、缺失和/或添加1个或更多个碱基。

mir-143衍生物(a)的第一链和第二链的寡核苷酸优选如下。

第一链是是含有以下序列的30个碱基以下的寡核苷酸，所述序列是含有由seqidno:1或由seqidno:3所示的序列，或者含有在由seqidno:1或由seqidno:3所示的序列中置换、插入、缺失和/或添加1个或更多个碱基而形成的序列，

第二链是含有以下序列的30个碱基以下的寡核苷酸，所述序列是含有由seqidno:2或由seqidno:4所示的序列，或者含有在由seqidno:2或由seqidno:4所示的序列中置换、插入、缺失和/或添加1个或更多个碱基而形成的序列。

“1个或更多个碱基”意为1～5个、1～3个碱基，或1个或2个碱基。

即使在第一链和/或第二链的寡核苷酸产生“置换、缺失、插入或添加”、“置换或插入”、“置换、插入、缺失和/或添加”的突变的情况下，mir-143衍生物(i)或mir-143衍生物(a)也具有作为mir-143的活性即“细胞增殖抑制作用”。“细胞增殖抑制作用”可以用本领域公知的方法测定和确认。例如，可以通过下述实施例2记载的方法进行测定。当mir-143衍生物(i)的2个碱基或mir-143衍生物(a)的多个碱基发生突变时，各突变(置换、缺失、插入或添加)的种类可以相同也可以不同。

mir-143衍生物(i)或mir-143衍生物(a)的第一链或第二链的寡核苷酸长度可以相同也可以不同。mir-143衍生物(a)的第一链或第二链的寡核苷酸各自独立地为30个碱基以下。例如为15～30个碱基、20～25个碱基、21个碱基、22个碱基、23个碱基、24个碱基或25个碱基。

作为mir-143衍生物(i)或mir-143衍生物(a)的第一链和第二链的寡核苷酸，特别优选为：第一链是由seqidno:3所示的序列组成的寡核苷酸；第二链是由seqidno:4所示的序列组成的寡核苷酸。

mir-143衍生物(i)的第一链和/或第二链的寡核苷酸可以含有核苷衍生物和/或修饰的核苷间键。

mir-143衍生物(a)第二链的寡核苷酸含有1个以上的核苷衍生物和/或修饰的核苷间键。

mir-143衍生物(i)的第一链和/或第二链，或者，mir-143衍生物(a)第二链的寡核苷酸所含有的核苷衍生物的种类、数量、位置没有限制。寡核苷酸中，所含的核苷衍生物的种类可以全部相同也可以不同。如果是在糖的2’位有取代基的核苷，则优选种类为在糖的2’位有f、och3(ome)或och2ch2och3(moe)的核苷，特别优选为在糖的2’位有f或och3(ome)的核苷。如果是糖的4’位和2’位之间的交联结构，则特别优选为4’-ch2-o-2’。此外，作为优选种类，也可举出由下式所示的基团：

[化12]

(式中，x为氢或oh，bx3为可被修饰的核酸碱基)。

当使用“脱碱基”(abasic)作为核苷酸衍生物时，由于不存在核酸碱基，因此在碱基序列上该位置的碱基缺失。

mir-143衍生物(i)的第一链和/或第二链，或者，mir-143衍生物(a)第二链的寡核苷酸所含有的修饰的核苷间键的种类、数量、位置没有限制。寡核苷酸中，所含的修饰的核苷间键的种类可以全部相同也可以不同。优选种类为硫代磷酸酯键。关于优选的数量和位置，在寡核苷酸的3’末端和/或5’末端位点各自独立地为1至数个，优选1～3个，更优选2个。特别优选在寡核苷酸的5’末端位点为2个。

在mir-143衍生物(i)或mir-143衍生物(a)中，第一链的寡核苷酸和第二链的寡核苷酸形成双链，但只要能在严格条件下进行杂交，则也包括在杂交位点上存在1个或更多个错配的寡核苷酸。

例如，可举出第一链(有义链)的寡核苷酸的杂交位点与第二链(反义链)的寡核苷酸的互补序列至少具有70％以上、优选80％以上、更优选90％以上、最优选95％以上同源性的寡核苷酸。其中，同源性例如可以使用通过altschul等(thejournalofmolecularbiology,215,403-410(1990))开发的算法的检索程序blast，以评分表示相似性。

“严格条件”意为以下的杂交条件：某碱基序列与特定序列形成杂交体(所谓的特异性杂交体)，没有同等功能的碱基序列与该特定序列不会形成杂交体(所谓的非特异性杂交体)。本领域技术人员可以通过改变杂交反应和洗涤时的温度、杂交反应液和洗涤液的盐浓度等容易地选择这种条件。具体地，作为本发明的严格条件的一例，可举出但不限于以下的条件：42℃下，在6×ssc(0.9mnacl，0.09m柠檬酸三钠)或6×sspe(3mnacl，0.2mnah2po4，20mmedta-2na，ph7.4)中杂交，再在42℃下用0.5×ssc洗涤。作为杂交方法，可以使用本领域中的公知惯用方法，例如southern印迹杂交法等。具体可以按照以下书中记载的方法进行：分子克隆实验指南(第2版)(molecularcloning:alaboratorymanual,secondedition)(1989)冷泉港实验室出版社(coldspringharborlaboratorypress)、最新分子生物学实验操作指南(currentprotocolsinmolecularbiology)(1994)约翰威立国际出版公司(wiley-interscience)、dna克隆1：核心技术与实验方法，第2版(dnacloning1:coretechniques、apracticalapproach,secondedition)(1995)，牛津大学出版社(oxforduniversitypress)等。

“1个或更多个错配”意为1～10个、优选1～8个、更优选1～5个错配。

天然人mir-143的双链寡核苷酸(seqidno:1和seqidno:2)有4处错配。如专利文献1所述，该错配序列中，匹配有义链的至少1～3处，也可以提高活性。作为mir-143衍生物(i)的错配数，特别优选为3～5个，该3-5个包括天然人mir-143的错配在内。

当mir-143衍生物(i)第二链的寡核苷酸是由以下序列组成的寡核苷酸时，具有3’末端修饰，所述序列是由seqidno:4所示的序列，或者在由seqidno:4所示的序列中置换、缺失或插入1个或2个碱基而形成的序列。其中，“3’末端修饰”是可以含有核苷衍生物和/或修饰的核苷间键的1mer～5mer寡核苷酸衍生物或苯吡啶衍生物。

“寡核苷酸衍生物”的长度为1mer～5mer，优选为1mer～3mer，特别优选为1mer或2mer。

“寡核苷酸衍生物”所含有的核苷衍生物的种类、数量、位置没有限制。寡核苷酸衍生物中，所含的核苷衍生物的种类可以全部相同也可以不同。如果是在糖的2’位有取代基的核苷，则为在糖的2’位有f、och3(ome)或och2ch2och3(moe)的核苷，特别优选为在糖的2’位有f或och3(ome)的核苷。如果是糖的4’位和2’位之间的交联结构，则特别优选为4’-ch2-o-2’。此外，作为优选种类，也可举出由下式所示的基团：

[化13]

(式中，bx3为可被修饰的核酸碱基)。

当使用“脱碱基”(abasic)作为核苷酸衍生物时，由于不存在核酸碱基，因此在碱基序列上该位置的碱基缺失。

“寡核苷酸衍生物”所含有的核苷间键的种类、数量、位置没有限制。寡核苷酸衍生物中，所含的修饰的核苷间键的种类可以全部相同也可以不同。优选种类为硫代磷酸酯键。特别优选地，寡核苷酸衍生物所含有的全部核苷间键为硫代磷酸酯键。

作为“寡核苷酸衍生物”，特别优选是由式：dx¹dx²表示的基团(其中，x¹或x²分别为可以被修饰的核酸碱基)。

mir-143衍生物(a)在第二链的寡核苷酸3’末端结合有由式：dx¹dx²表示的基团或苯吡啶衍生物(其中，x¹或x²各自独立地为a、g、c或t)。

作为式：dx¹dx²，优选是由下式所示的基团：

[化14]

(式中，x¹和x²各自独立地为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；y¹和y²各自独立地为o或s)。

进一步优选地，x¹和x²为胸腺嘧啶(t)，y¹和y²为s。

当具有3’末端修饰时，寡核苷酸3’末端的羟基与修饰结合。当修饰为寡核苷酸衍生物时，与上述式：dx¹dx²结合的情况相同，5’末端的磷酸位点与寡核苷酸的3’末端结合。

mir-143衍生物(i)的第一链和/或第二链的寡核苷酸可以有5’末端修饰。其中，“5’末端修饰”是磷酸酯部分或由式：＝cq1-p(＝o)(oh)2表示的基团。(式中，q1为氢、卤素、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的炔基，或者取代或非取代的烷氧基)。

另外，mir-143衍生物(a)第二链的寡核苷酸的5’末端可以与磷酸酯部分结合。

当5’末端修饰为磷酸酯部分时，寡核苷酸的5’末端的羟基与磷酸酯部分结合。

当5’末端修饰是由式：＝cq1-p(＝o)(oh)2表示的基团(式中，q1为氢、卤素、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的炔基，或者取代或非取代的烷氧基)时，如下所述地与寡核苷酸结合。q1优选为氢、卤素、烷基或烷氧基，特别优选为氢或卤素。

[化15]

(式中，x’为氢、oh、f、och3或och2ch2och3，q1为氢、卤素、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的炔基，或者取代或非取代的烷氧基)。

“磷酸酯部分”意为包含磷酸酯和修饰的磷酸酯的末端磷酸基。具体是由式：-p(＝o)(oh)2表示的基团或其修饰基团。也就是说，1个以上的o和oh可以被h、o、s、n(r’)(其中，r’为氨基保护基，或取代或非取代的烷基)或烷基取代。磷酸酯部分可以含有取代或非取代的1～3个磷酸基。

“氨基保护基”只要能够在合成核酸时稳定地保护氨基，就没有特别限制。具体是在酸性或中性条件下稳定，可以通过氢解、水解、电解和光解等化学方法裂解的保护基。例如可举出甲酰基、苯甲酰基等。

本发明还包括下述“mir-143衍生物(b)”。

(b)一种微小rna-143衍生物，其中，第一链是由seqidno:3所示的序列组成的寡核苷酸，并且第二链是由seqidno:5所示的序列组成的寡核苷酸。

第一链和第二链均优选为rna寡核苷酸。此外，核苷间键优选为磷酸二酯键。

另外，进行了对天然人mir-143所具有的4个错配进行匹配的考察，结果是作为错配数，特别优选为3～5个，该3-5个包括天然人mir-143的错配在内。

因此，认为优选将以下mir-143衍生物作为本发明的mir-143衍生物。

(iii-1)根据(i-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，第一链是由以下序列组成的寡核苷酸：在由seqidno:3所示的序列中，第5位、第7位、第15位、第22位的核酸碱基中的1个碱基被取代的序列；或者，在由seqidno:3所示的序列中，第5位、第7位、第15位、第22位以外的核酸碱基中的1个碱基被取代的序列。

另外，可知本发明的mir-143衍生物中，当第一链是不包含核苷衍生物和修饰的核苷间键的rna寡核苷酸时，第二链与seq-12完全相同，第一链缺失seqidno:3的5’末端的3个碱基的mir-143衍生物与seq-12相比，肿瘤增殖抑制效果明显下降。也就是说，当有义链是天然序列时，有义链的碱基长度对活性很重要。

因此，认为优选将以下mir-143衍生物作为本发明的mir-143衍生物。

(iv-1)根据(i-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，

第一链是可以包含由以下序列组成的修饰的核苷间键的rna寡核苷酸，所述序列是由seqidno:3所示的序列，或者在由seqidno:3所示的序列中置换1个或2个碱基而形成的序列，

第二链是由seqidno:4所示的序列组成的核苷衍生物和/或含有修饰的核苷间键的寡核苷酸。

另外，当反义链寡核苷酸中所有的核苷由核苷衍生物组成时，本发明的mir-143衍生物的肿瘤增殖抑制效果高。因此，认为优选将以下mir-143衍生物作为本发明的mir-143衍生物。

(v-1)根据(i-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，

第一链是包含由以下序列组成的核苷衍生物和/或修饰的核苷间键的寡核苷酸，所述序列是由seqidno:3所示的序列，或者在由seqidno:3所示的序列中置换1个或2个碱基而形成的序列，

第二链是由seqidno:4所示的序列组成且可以包含修饰的核苷间键的寡核苷酸，所述序列中所有的核苷由核苷衍生物组成。

另外，当寡核苷酸中具有嘧啶碱基的核苷是只由相同种类的核苷衍生物组成，具有嘌呤碱基的核苷为rna核苷时，本发明的mir-143衍生物的肿瘤增殖抑制效果高。因此，认为优选将以下mir-143衍生物作为本发明的mir-143衍生物。

(vi-1)根据(i-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，

第一链是可以包含由以下序列组成的修饰的核苷间键的寡核苷酸，所述序列是由seqidno:3所示的序列，或者在由seqidno:3所示的序列中置换1个或2个碱基而形成的序列，

第二链是由seqidno:4所示的序列组成的可以含有修饰的核苷间键的寡核苷酸。

该寡核苷酸中具有嘧啶碱基的核苷全部为相同种类的核苷衍生物，具有嘌呤碱基的核苷全部为rna核苷。

(vi-2)根据(vi-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，该核苷衍生物是在糖的2’位有取代基的核苷，该取代基为f或och3。

另外，当从包含第二链的3’末端修饰的3’末端位置至第1～8个的修饰的核苷间键为硫代磷酸酯键时，本发明的mir-143衍生物的肿瘤增殖抑制效果高。此外，该第二链含有的在寡核苷酸中每隔一个地配置硫代磷酸酯键作为修饰的核苷间键的修饰，以及该第二链具有的5’末端修饰，都与肿瘤抑制效果有关。因此，认为优选将以下mir-143衍生物作为本发明的mir-143衍生物。

(vii-1)根据(i-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，

第二链是由seqidno:4所示的序列组成且从seqidno:4的3’末端起的第1～6个的修饰的核苷间键中至少1个以上是硫代磷酸酯键的寡核苷酸。

(vii-2)根据(vii-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，从seqidno:4的3’末端起的第1～6个的修饰的核苷间键中至少3个以上是硫代磷酸酯键。

(vii-3)根据(vii-1)所述的微小rna-143衍生物，其中，从seqidno:4的3’末端起的第1～6个的修饰的核苷间键均为硫代磷酸酯键。

(vii-4)根据(vii-1)～(vii-3)中任一项所述的微小rna-143衍生物，该微小rna-143衍生物为这样的寡核苷酸，该寡核苷酸在位于从seqidno:4的5’末端起的第2～14个的修饰的核苷间键上，连续有1～7个由式：n’^n’*表示的形式。(式中，n’意为核苷，^意为-p(s)oh-，*意为-p(o)oh-)。

(vii-5)根据(vii-4)所述的微小rna-143衍生物，其中，连续有7个由式：n’^n’*表示的形式。

(vii-6)根据(vii-1)～(vii-5)中任一项所述的微小rna-143衍生物，其中，第二链有5’末端修饰。

本发明的mir-143衍生物中的第一链和第二链的寡核苷酸可以通过本领域的常规方法合成，例如可以利用市售的核酸自动合成仪器(例如appliedbiosystems公司生产的仪器、大日本精机株式会社生产的仪器等)容易地合成。合成法有使用亚磷酰胺的固相合成法、使用氢膦酸酯的固相合成法等。例如，已在下述实施例1、专利文献1、tetrahedronletters22,1859-1862(1981)等中有公开。

合成的第一链和第二链例如通过下述实施例1公开的公知方法进行杂交，从而形成双链寡核苷酸。

本发明也包括含有本发明的mir-143衍生物的药物组合物。本发明的药物组合物的给药方法和制剂，只要是本领域公知的mirna的给药方法和制剂，就可以任意使用。mirna的给药方法和制剂，例如也被以下文献所公开：

naturereviewdrugdiscovery,13,622-638(2014)

专利文献1、wo2010/050328、wo2011/064130、wo2011/153542、wo2013/163258、wo2013/192486等。

本发明的药物组合物可以通过各种方法给药，这取决于希望局部治疗还是全身治疗，或者待治疗的区域。给药方法例如可以是局部(包括点眼、阴道内、直肠内、鼻腔内、经皮肤)、口服或非口服。作为非口服给药，可举出：静脉注射或点滴、皮下、腹腔内或肌内注射、通过抽吸或吸入的肺部给药、鞘内给药、脑室内给药等。优选静脉注射或皮下给药。

当局部给予本发明的药物组合物时，可以使用透皮贴剂、软膏、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂、散剂等制剂。

作为口服给药组合物，可举出：散剂、颗粒剂、溶解于水或非水性溶剂的悬浮液或溶液、胶囊、粉末剂、片剂等。

作为非口服、鞘内或脑室内给药组合物，可举出：含有缓冲液、稀释剂和其他适当添加剂的无菌水溶液等。

本发明的药物组合物可以通过在有效剂量的本发明的mir-143衍生物中根据需要混合适合于该剂型的赋形剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、稀释剂等各种药物添加剂来得到。如果是注射剂，则与适当载体一起进行灭菌处理而制剂即可。

作为赋形剂，可举出：乳糖、白糖、葡萄糖、淀粉、碳酸钙或结晶纤维素等。作为粘合剂，可举出：甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等。作为崩解剂，可举出：羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、淀粉、海藻酸钠、琼脂粉或月桂基硫酸钠等。作为润滑剂，可举出：滑石、硬脂酸镁或聚乙二醇等。作为栓剂的基剂，可以使用可可脂、聚乙二醇或甲基纤维素等。此外，在制备成液体剂或乳浊性、悬浮性注射剂时，可以适当添加常用的助溶剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂等。在口服给药时，可以添加矫味剂、芳香剂等。

为了促进mir-143衍生物向靶细胞内的导入，本发明的药物组合物还可以含有核酸转染试剂。作为该核酸转染试剂，可以使用：去端肽胶原；脂质体；纳米微粒；lipofectin、lipofectamine、dogs(transfectam)、dope、dotap、ddab、dhdeab、hdeab、凝聚胺或者聚(乙烯亚胺)(pei)等阳离子脂质等。

本发明的药物组合物的给药取决于待治疗的疾病严重程度和反应程度，疗程持续几天至数月，或者持续至实现治愈或持续至达到疾病缓解。最佳给药方案可以根据生物体内的药剂积累的测定来计算。本领域技术人员可以确定最佳剂量、给药方法和重复频率。最佳剂量根据各个mir-143衍生物的相对效力而变动，一般可以根据体外和体内动物实验中的ic50或ec50来计算。例如，如果给出mir-143衍生物的分子量(根据mir-143衍生物的序列和化学结构来推导)和如ic50的有效剂量(通过实验来推导)，则可以按照常例来计算表示为mg/kg的剂量。

本发明的药物组合物具有细胞增殖抑制效果，因此可以用于预防或治疗与细胞增殖相关的疾病。本发明的药物组合物尤其可以用于治疗癌症或抑制癌症恶化。作为“癌”，只要是人、宠物、家畜等患有的癌，就没有特别限制。既可以是实体癌也可以是浸润癌，例如可举出：乳腺癌、非小细胞肺癌、胃癌、头颈癌、食道癌、结肠癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、宫体癌、前列腺癌、血管肉瘤、宫颈癌、脑肿瘤、生殖细胞瘤(睾丸癌、卵巢癌、性腺外生殖细胞肿瘤)等。

通过同时使用本发明的mir-143衍生物和公知的抗肿瘤剂，也可以得到进一步的细胞增殖抑制效果。

作为公知的抗肿瘤剂，具体可举出：紫杉烷类(例如紫杉醇、多西紫杉醇)等作用于微管的药物、烷化剂(例如异环磷酰胺、环磷酰胺)、抗代谢剂(例如甲氨蝶呤、氟尿嘧啶)、抗肿瘤性抗生素(例如丝裂霉素c、阿霉素)、抗肿瘤性抗体和分子靶向药物(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、利妥昔单抗(rituximab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate))、其他抗肿瘤剂(例如顺铂(cisplatin)、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、伊匹单抗(ipilimumab))等。

当组合使用本发明的mir-143衍生物和公知的抗肿瘤剂时，给药时间没有限制，既可以对给药对象同时给药，也可以不同时间给药。此外，本发明的mir-143衍生物和该公知的抗肿瘤剂可以作为含有各自活性成分的多种试剂给药，也可以作为含有二者的活性成分的单一制剂给药。本发明的mir-143衍生物的给药量只要在能够治疗癌症或抑制癌症恶化的范围内就没有特别限制，可以参考上述“本发明的药物组合物的给药”来确定。公知的抗肿瘤剂的给药量可以根据在临床上单药给予该抗肿瘤剂时所采用的给药量来确定。当与本发明的mir-143衍生物组合使用时，可以使用2种以上的公知的抗肿瘤剂。

如下述实施例3所示，本发明的mir-143衍生物和egfr抑制剂的组合作为用于治疗kras突变型的癌症或抑制该癌症恶化的药物非常有效。

egfr抑制剂可举出：egfr酪氨酸激酶抑制剂，或将egfr靶向的细胞外结构域作为靶标的抑制剂。优选为抗egfr抗体，更优选为单克隆抗体。具体可举出：酪氨酸激酶抑制剂(例如厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼)，或将egfr靶向的细胞外域作为靶标的分子(例如西妥昔单抗、帕尼单抗)等。

也就是说，本发明包括“本发明的mir-143衍生物和egfr抑制剂组合而成的药物”。更具体地，包括上述(i-10)～(i-21)、(ii-13)～(ii-24)。

(i-19)和(ii-22)所述的“含有微小rna-143衍生物作为有效成分并与egfr抑制剂同时使用的药物组合物”中，在同一包装内包含以下套装：含有mir-143衍生物的药物组合物和记载有与egfr抑制剂同时使用的使用方法的药物说明书。

(i-20)和(ii-23)所述的“含有egfr抑制剂作为有效成分的与mir-143衍生物同时使用的药物组合物”中，在同一包装内包含以下套装：含有egfr抑制剂的药物组合物和记载有与mir-143衍生物同时使用的使用方法的药物说明书。

实施例

下面举出本发明实施例和参考例及试验例，对本发明进行更加详细的说明，但本发明并不限于此。

实施例1mir143衍生物的合成

固相合成

使用dna自动合成仪ns-8(genedesigninc.)，以1umol规模通过亚磷酰胺法来合成所有的寡核苷酸。单体使用具有标准保护基的rnaamidite、2’f-rnaamidite、2’ome-rnaamidit(全部购自proligoreagents)，配制成0.1m乙腈溶液。偶联时间设为5分钟，一个单体的缩合使用10当量的amidite体。po氧化使用0.02mol/l碘(四氢呋喃/水/吡啶/碘＝90.54/9.05/0.41/0.43(v/v/v/w))，ps氧化使用0.05mol/l[(二甲基氨基-亚甲基)氨基]-3h-1,2,4-二噻唑啉-3-硫酮(ddtt)的乙腈/吡啶1/4(v/v)溶液。

脱保护i(从树脂上切下，碱基和磷酸的脱保护)

含有rna的寡核苷酸(s-1～3、7、8、as-1～3)的切下使用28％氨水/甲胺/乙醇＝6/1/3(v/v)，在室温下振荡24小时。用50％乙醇水洗涤树脂后，减压下浓缩滤液后，通过冷冻干燥得到白色粉末。

其他的寡核苷酸(s-4、9、10、as-4、7)的切下使用28％氨水/40％甲胺水溶液/乙醇混合液7/1/2(v/v)，在室温下振荡15小时。用50％乙醇水洗涤树脂后，减压下浓缩。

脱保护ii(2’-tbs基的脱保护)

向得到的白色粉末中加入n-甲基吡咯烷酮/三乙胺/3-氟化氢三乙胺＝6/1/2(v/v)，在65℃下搅拌1.5小时。向反应液中加入相同量的乙氧基三甲基硅烷，在室温下剧烈搅拌10分钟，得到沉淀物。以2500×xg(2分钟)离心分离后，小心地除去有机溶剂层。向得到的沉淀物中加入二乙醚并剧烈搅拌后，同样地进行离心分离，除去有机溶剂，得到粗rna体(白色固体)。

纯化

所有的寡核苷酸在反相模式下进行纯化。纯化条件如下。流动相a液：10mmol/lteaa(ph7)；b液：乙腈、b浓度梯度5％-20％(20分钟)；色谱柱：ymchydrospherec18(20×100mm)(ymc)；流速4ml/min。通过反相hplc分析各组分，回收纯度85％以上的组分，减压下浓缩。

寡核苷酸的序列和纯度分析

得到的寡核苷酸(s-1～10、as-1～7)通过uplc/ms测定的实测分子量与理论分子量一致，则可确认已合成目标序列。xevog2tofsystem(waters)；色谱柱：aquityostc18(2.1×50mm)(waters)；流动相a液：200mm1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇/8mm三乙胺；b液：甲醇；b浓度梯度：10-30％(10min)，温度50℃，流速0.2ml/min。

关于as-9～23、27、28、31～34、37、40、41、43～57，从固相合成到寡核苷酸的序列和纯度分析为止通过与上述相同的方法合成，确认已合成目标序列。

另外，在5’末端含有vp体的oligo(as-42)的合成参考chembiochem2016,17,985～989的记载来进行，确认已通过与上述相同的方法合成目标序列。

关于s-11～26、as-8、24～26、29、30、35、36、38、39，从genedesigninc.购买。通过maldi-tof-ms测定(autoflexspeed、bruker)的实测分子量与理论分子量一致，则可确认已合成目标序列。

双链核酸的制备

seq-01～seq-21的双链核酸如下制备。等摩尔量地混合各寡核苷酸后，加入蒸馏水，得到浓度0.1mmol/l的溶液。然后在85℃下静置10分钟后，自然冷却至室温，从而得到双链核酸。双链核酸的确认通过尺寸排阻色谱法来实施。色谱柱：ymc-pacdiol-120(4.6×300mm)(ymc生产)；流动相：含有10％乙腈的1×pbs溶液；流速0.5ml/min；温度：室温。

seq-22～seq-144的双链核酸如下进行制备：等摩尔量地混合各寡核苷酸后，加入1×pbs溶液，得到浓度0.01mmol/l的溶液，然后在95℃下静置5分钟后，自然冷却至室温，从而得到双链核酸。

作为评价体系的阴性对照组，从genedesigninc.购买针对海肾荧光素酶的sirna(seq-05、seq-06)。

下面示出合成的寡核苷酸的序列。表1和表2表示有义链(第一链)，表3～表6表示反义链(第二链)，表7和表8表示mirna。

[表1]

[表2]

[表3]

[表4]

[表5]

[表6]

[表7]

[表8]

予以说明，seq-01、seq-10～seq-12、seq-19～seq-21、seq-24～seq-144为本发明的mir-143衍生物，seq-02～seq-04、seq-07～seq-09、seq-13～seq-18、seq-22、seq-23为比较例。seq-05、seq-06为阴性对照组(针对海肾荧光素酶的sirna)。

另外，表1～6中，n(大写字母)表示rna，dn表示dna，nf表示2’-frna，nm表示2’-omerna。

^意为-p(s)oh-，*意为-p(o)oh-。

[化16]

另外，nl、una(n)、ab(abasic(脱碱基))为以下所示的基团。

[化17]

as-42的5’末端的“vp-”和寡核苷酸末端的um为以下所示的基团，式：＝ch-p(＝o)(oh)2属于5’末端修饰(vp-)。

[化18]

bup为以下所示的基团。

[化19]

下面示出寡核苷酸的质量分析结果(理论值和实测值)。

[表9]

[表10]

[表11]

[表12]

实施例2mir143衍生物的肿瘤增殖抑制效果

细胞培养

从jcrb细胞库(japanesecollectionresearchbioresourcescellbank)购买人结肠癌细胞株dld-1(krasmutant；g13d)。dld-1细胞在含有10％fbs的dulbecco’smodifiedeagle培养基(08456-65；nacalaitesque)中，在5％co2、37℃的条件下培养。

活细胞数使用celltiter-glo(注册商标)发光法细胞活力检测试剂盒(g7570；promega)进行评价。在预先在96孔白板培养的各孔中，加入与培养基相同量的celltiter-glo(注册商标)试剂，用振荡器搅拌2分钟以使细胞溶解。随后，在室温下将孔板静置10分钟以使发光信号稳定，用光度计(luminometer)(spimamaxl酶标仪,moleculardevices)测定570nm处的发光。将相对于对照细胞的活细胞数(％)作为细胞存活率。

向培养细胞中导入mirna的方法

以8×10³细胞/孔将dld-1细胞接种到96孔白板。向4.6μl的opti-memi培养基(invitrogen)中加入0.4μl的lipofectamine3000，在室温下放置5分钟。用另外试管，向4μl的opti-memi培养基中加入1μl的10μm各mirna。将两个试管的内容物混合，放置5分钟，制备mirna-lipofectamine3000复合物。以10μl/孔向培养细胞液中加入mirna-lipofectamine3000复合物，使浓度变成40nm，对其培养72小时。接着，测定活细胞数。

mir143衍生物的肿瘤增殖抑制效果

将人结肠癌细胞株dld-1与浓度40nm的各mir-143衍生物一起培养72小时后，使用celltiter-glo(注册商标)试剂将残留的活细胞数作为发光信号来检测。予以说明，图1～3、10的nt(未处理)是未导入mirna的对照细胞，seq-05、seq-06是阴性对照。

首先，与野生型(由seqidno:1和seqidno:2组成的天然人mir-143)相比有义链(第一链)的3’末端只少1个碱基而反义链(第二链)相同的seq-22，与本发明的mir-143衍生物seq-01相比，seq-01相比seq-22表现出很强的肿瘤增殖抑制效果(图10)。然后，与引入寡核苷酸衍生物(^dt^dt)来代替本发明的seq-22的反义链的3’末端的uc而形成的seq-23相比，seq-01也表现出很强的肿瘤增殖抑制效果(图10)。

接着，为了提高mir-143的稳定性，将双链中存在的4个错配碱基对中的2个作为匹配碱基对，再在两条链的3’末端引入寡核苷酸衍生物(seq-02、seq-03、seq-04)。结果是未确认到与错配碱基对和野生型相同且没有核苷衍生物的seq-01相比肿瘤增殖抑制效果提高的序列(图1)。

随后，考察将反义链固定在与野生型相同的磷酸二酯键的rna，在有义链的3’末端引入寡核苷酸衍生物，结果均未确认到肿瘤增殖抑制效果(图2seq-07～seq-09、图3seq-13～seq-15)。予以说明，seq-07～seq-09是将在双链中存在的4个错配碱基对中的2个作为匹配碱基对的序列，seq-13～seq-15是具有与野生型相同的4个错配碱基对的序列。

另一方面，考察将有义链固定在与野生型相同的磷酸二酯键的rna，向反义链的3’末端引入核苷衍生物，结果确认到，与seq-01相比，肿瘤增殖抑制效果有提高(图2seq-10～seq-12)。尤其是在用2’-ome体和2’-f体交替修饰反义链的序列内部的seq-12中，能够确认到很强的增殖抑制效果。此外，当向seq-12的反义链的5’末端引入磷酸酯部分作为末端修饰时，确认到抑制效果进一步提高(图2seq-19)。予以说明，seq-10～seq-12和seq-19是具有与野生型相同的4个错配碱基对的序列。

另外，考察向反义链的3’末端引入核苷衍生物并且向两条链的序列内部引入核苷衍生物和/或修饰的核苷间键，结果确认到与seq-1同等以上的肿瘤增殖抑制效果(图3seq-20和seq-21)。但是，当向有义链的3’末端也引入寡核苷酸衍生物时，肿瘤增殖抑制效果降低(图3seq-16～seq-18)。予以说明，seq-16～seq-21是具有与野生型相同的4个错配碱基对的序列。

同样，关于seq-24～seq-143，也确认到seq-1以上的肿瘤增殖抑制效果。特将活性强的mir-143衍生物的结果示于下表。

[表13]

如上述结果所示，在mir-143衍生物的序列中，第一链的3’末端的化学修饰(寡核苷酸衍生物)的容许性低，而通过向第二链的3’末端引入寡核苷酸衍生物或苯吡啶衍生物，可以提高肿瘤增殖抑制效果。此外，通过向序列内部引入核苷衍生物和/或修饰的核苷间键，以及向反义链的5’末端引入磷酸酯部分或由式：＝cq1-p(＝o)(oh)2表示的基团，可以提高肿瘤增殖抑制效果(式中，q1为氢、卤素、取代或非取代的烷基、取代或非取代的烯基、取代或非取代的炔基，或者取代或非取代的烷氧基)。

实施例3抗egfr抗体(erbitax(注册商标))和mir-143衍生物的同时使用对肿瘤增殖抑制效果的增强

细胞培养

从jcrb细胞库(japanesecollectionresearchbioresourcescellbank)购买人结肠癌细胞株dld-1(krasmutant；g13d)。在购买后6个月以内使用细胞，或者使用利用mycoalert支原体检测试剂盒(lt07-118；lonza)管理的细胞。在含有10％fbs的rpmi-1640培养基(189-02025；invitrogen)中，在5％co2、37℃的条件下培养dld-1。

用胰蛋白酶处理，通过台盼蓝色素排除试验法来评价活细胞数。将培养后的细胞溶液与台盼蓝等量混合，利用血细胞计数板计算活细胞数。将相对于对照细胞的活细胞数(％)作为细胞存活率。

基因导入实验

以0.5×10⁵细胞/ml的细胞密度将各细胞接种到6孔板。在进行转染的24小时前接种dld-1细胞，粘着在孔板上。作为对照，从dharmacon购买阴性mirna。作为公知的mir-143衍生物，从ambion购买mirvanatmmirna模拟物(以下将该衍生物记作“ambion”)。各mirna使用lipofectaminernaimax(invitrogen)形成阳离子脂质体，向细胞内导入。在导入后48小时给予erbitax(注册商标)(默克)，在24小时后计算活细胞数并进行蛋白质印迹分析。

抗egfr抗体和mir-143衍生物的同时使用效果

kras为低分子gtp结合蛋白，将来自egfr(表皮生长因子受体)的增殖信号向下游传递。但是，在约40％的结肠癌中确认到kras突变，虽然迄今为止正在开发各种抗egfr抗体、egfr抑制剂，但因kras突变导致效果不够。即使改变浓度，将erbitax(注册商标)作用于具有g13d突变的人结肠癌细胞株dld-1，也无法确认到明显的细胞增殖抑制效果(图4)。因此，对oncogene,2009,28(10),1385-92.、oncotarget,5(14),5416-27.等报告的抑制ras蛋白表达的mir-143和egfr抗体的同时使用疗法进行考察。对于人结肠癌细胞株dld-1，首先与10nm浓度的各mir-143衍生物(ambion、seq-01、seq-12)或阴性mirna(对照)一起培养48小时，然后加入各浓度的erbitax(注册商标)，之后再培养24小时。通过台盼蓝色素排除试验法来计算残留的活细胞数。结果是在未加入mir-143衍生物的情况(仅用erbitax(注册商标)处理，对照)下，未确认到kras有突变的dld-1细胞增殖抑制效果。此外，即使使用公知的mir-143衍生物(ambion)，也未能确认到明显的抑制效果。而通过潜心研究发现的mir-143衍生物(seq-01、seq-12)即使单独使用也表现出增殖抑制效果，当增加同时使用的erbitax(注册商标)的加入量时，确认到其效果随着浓度而增强(图5)。另外，可以看出，通过引入核苷衍生物和修饰的核苷间键提高对核酸分解酶的耐受性的seq-12表现出更强的增殖抑制效果(图5)。

实施例4mir-143衍生物的肿瘤增殖抑制机制分析

蛋白质印迹分析

1)蛋白质提取

向蛋白质裂解缓冲液(10mmtris-hcl、0.1％sds、1％np-40、0.1％脱氧胆酸钠、150mmnacl、1mmedta)中混合1％蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物ii和iii，用于蛋白质提取液。在蛋白质提取液中悬浮回收的细胞，在冰中静置20分钟。随后，以13,000rpm、4℃离心分离20分钟。回收离心分离的上清液，作为蛋白质样品。细胞核和细胞质的蛋白质的分离提取使用cellytic细胞核提取试剂盒(sigma-aldrich)。蛋白定量使用dc蛋白检测试剂盒(biorad)进行。将定量的蛋白质与sds样品缓冲液(62.5mmtris-hcl、2％sds、10％甘油、50mmdtt、0.01％溴酚蓝)混合并调节至50μg/μl，在98℃下煮沸处理5分钟后，在冰上静置5分钟。

2)电泳和转录

电泳使用easyseparator(wako)和supersepace(wako)。电泳后，将凝胶在印迹缓冲液(25mmtris、0.2m甘氨酸、20％甲醇)中浸泡5分钟。pvdf膜(perkinelmerlifesciences)在甲醇中浸泡3分钟，在超纯水中浸泡5分钟。随后，在印迹缓冲液中浸泡5分钟。从阳极侧开始，依次重叠印迹缓冲液浸泡过的滤纸、pvdf膜、凝胶、滤纸，在15v、370ma下转录40分钟。

转录后，用含有0.1％tween20的50mmtris-hcl缓冲液(tbst)洗涤，浸泡在5％脱脂牛奶溶液中，进行1小时的封闭。用tbst洗涤，浸泡在用抗体稀释液(2％bsa、0.01％叠氮化钠、tbst)稀释的一抗中，在4℃下反应过夜。用tbst洗涤后，浸泡在用5％脱脂牛奶溶液稀释的二抗中，在室温下静置1小时。然后再用tbst洗涤，用luminatafortewesternhrp底物(wbluf0500；millipore)使其发光后，使用发光图像分析仪las-4000uvmini(fujifilm)进行检测。对照组使用抗β-肌动蛋白抗体(a5316；sigma-aldrich)。

实时pcr

1)rna提取

使用nucleospinmirna试剂盒(takara)提取细胞和组织中的rna。rna量通过紫外分光光度法来定量。

2)mrna的定量

使用primescriptrt试剂盒(takara)，在37℃15分钟、85℃5秒、4℃下进行rna样品的反转录反应，合成模板cdna。定量反转录pcr(qrt-pcr)反应使用universalsybrselectmastermix(appliedbiosystems)。将gapdh的mrna量作为内部对照。在95℃30秒下进行初始变性后，进行40次循环的95℃5秒的变性反应和60℃60秒的退火延伸反应，在95℃15秒、60℃30秒、95℃15秒的阶段分析熔融曲线。各样品的反应各进行3次，用δδct法计算mrna量。

抗体

从cellsignalingtechnology购买用于蛋白质印迹的抗体parp-1(#9542)、lc3b(#3868)、akt(#9272)、磷酸化akt(ser473；#4060)、erk、磷酸化erk、erk5。从abcam购买针对kras的抗体。

kras靶向sirna的准备

如图8所示，已知kras中存在krasa和krasb这两种异构体。从利用invitrogen公司的设计软件导出的列表中，购买等级高的针对两个基因序列的sirna，用于kras敲低。下面记载了各sirna的反义链序列，有义链成为与反义链100％互补的序列。

(1)sirnaforkras(3’utr区域、nm004985.4)

5’-aaugcaugacaacacuggaugaccg(seqidno:10)

(2)krasa的sirna(krasa特异性外显子4a、orf区域、nm033360.3)

5’-uauugucggaucucccucaccaaug(seqidno:11)

mir-143衍生物的机制分析

对于人结肠癌细胞株dld-1，与10nm浓度的各mir-143衍生物(seq-01、seq-12)一起培养48小时，然后加入各浓度的erbitax(注册商标)，之后再培养24小时。经过蛋白质印迹分析，结果确认到与目的基因erk5相同，使kras的mrna和蛋白表达显著降低(图6、7)。此外，下游的增殖信号pi3k/akt、mapk(erk1/2)信号明显受到控制。另一方面，考察了sirna和抗egfr抗体的同时使用效果。确认到从invitrogen公司购买的两种sirna中，设计成3’utr(非翻译区域)的sir-kras会抑制kras蛋白的表达量(图9上)。当使用该sir-kras事先敲低kras时，未确认到erbitax(注册商标)的明显的同时使用效果，因此只用sirna抑制kras生成，是无法提高抗egfr抗体的肿瘤增殖抑制效果的(图9下)。由上述内容可知，本发明的mir-143衍生物(seq-01、seq-12)能够明显有力地抑制目的基因kras的mrna降解和向蛋白质的翻译，还会使参与kras生成过程的多种基因沉寂，由此使kras的mrna水平显著下降。结果是可以抑制kras的表达亢进，egfr抑制剂(例如erbitax(注册商标))有效发挥作用。

实施例5mir143衍生物在动物模型中的肿瘤增殖抑制评价

以3.0×10⁶细胞/100ul，将具有kras突变的来源于人膀胱癌的细胞株(caki-1)移植到小鼠的背部皮下。将移植日设为第0天。向对照dsrna(由北海道系统科学公司(hss，sapporo)合成)和本发明的mir143衍生物(seq-12)(各0.1nmol)的50ulopti-mem溶液中，混合2ul的阳离子脂质体试剂(lipotrust，hss，sapporo)，开始向移植后第14天的小鼠肿瘤给药。从移植后第14天开始，到移植后第23天为止，每72小时从小鼠的右心房给予这些混合物，随时间变化而测定肿瘤体积。肿瘤体积由下式计算。肿瘤体积＝0.5236×l1×(l2)²，l1表示肿瘤长径，l2表示肿瘤短径。与给予了对照dna双链的小鼠组相比，给予了seq-12的小鼠组表现出约44％的肿瘤增殖抑制效果(图11)。予以说明，本实施例使用的对照dsrna的序列如下。

(第一链)5’-guaggaguagugaaaggcc-3’(seqidno:23)

(第二链)5’-ggccuuucacuacuccuac-3’(seqidno:24)

[工业实用性]

本发明的mir-143衍生物表现出优异的细胞增殖抑制效果。此外，通过与egfr抑制剂同时使用，本发明的mir-143针对kras突变癌表现出优异的细胞增殖抑制效果。因此，本发明的mir-143衍生物作为核酸药物，尤其是用于治疗癌症或抑制癌症恶化的药物非常有效。

序列表

<110>国立大学法人岐阜大学

盐野义制药株式会社

<120>微小rna-143衍生物

<130>17p00009wo

<160>24

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>智人（homosapiens）

<400>1

ggugcagugcugcaucucuggu22

<210>2

<211>21

<212>rna

<213>智人（homosapiens）

<400>2

ugagaugaagcacuguagcuc21

<210>3

<211>24

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>3

ugaggugcagugcugcaucucugg24

<210>4

<211>22

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的引导序列

<400>4

ugagaugaagcacuguagcuca22

<210>5

<211>24

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir-143的引导序列

<400>5

ugagaugaagcacuguagcucagg24

<210>6

<211>22

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>6

ugagcuacagugcugcaucucu22

<210>7

<211>19

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>7

ugaggaguagugaaaggcc19

<210>8

<211>19

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的引导序列

<400>8

ggccuuucacuacuccuca19

<210>9

<211>22

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>9

ugaggugcagugcugcaucucu22

<210>10

<211>25

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>kras的sirna(3'utr)

<400>10

aaugcaugacaacacuggaugaccg25

<210>11

<211>25

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>krasa的sirna(orf)

<400>11

uauugucggaucucccucaccaaug25

<210>12

<211>21

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>12

ggugcagugcugcaucucugg21

<210>13

<211>19

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的引导序列

<400>13

ugagaugaagcacuguagc19

<210>14

<211>24

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>14

ugagcugcagugcugcaucucugg24

<210>15

<211>24

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>15

ugagguacagugcugcaucucugg24

<210>16

<211>24

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>16

ugagcugcagugcugcaucucugg24

<210>17

<211>24

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>17

ugaggugcagugcugcaucucagg24

<210>18

<211>20

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的引导序列

<400>18

ugagaugaagcacuguagcu20

<210>19

<211>24

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>19

cgaggugcagugcugcaucucugg24

<210>20

<211>24

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>20

tgaggugcagugcugcaucucugg24

<210>21

<211>23

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>21

gaggugcagugcugcaucucugg23

<210>22

<211>23

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>mir143衍生物的过客链

<400>22

ugaggugcagugcugcaucucgg23

<210>23

<211>19

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>对照dsrna的第一链

<400>23

guaggaguagugaaaggcc19

<210>24

<211>19

<212>rna

<213>人工序列（artificialsequence）

<220>

<223>对照dsrna的第二链

<400>24

ggccuuucacuacuccuac19