源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的纯化法及其扩增法的制作方法

本发明涉及源自多能性干细胞的胰腺祖细胞(pancreaticprogenitorcells)的培养方法、由源自多能性干细胞的胰腺祖细胞制备胰岛细胞的方法、以及源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的冻结保存方法。此外，本发明涉及源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养用培养基。

背景技术：

作为糖尿病(特别是胰岛素依赖性糖尿病)的治疗手段，胰脏移植和胰岛移植是有效的，但在脏器提供数量少、需要服用用于抑制免疫排斥的免疫抑制剂的方面等构成了较大问题。因此，为了解决这样的问题，使用源自小鼠和人的细胞广泛地进行着从人工多能性干细胞(ips细胞)、胚胎干(es)细胞等多能性干细胞和从生物体分离出的胰腺祖细胞进行分化诱导胰岛细胞的研究(例如，非专利文献1)。

在得到胰岛细胞的情况下，将多能性干细胞经过中内胚层细胞、胚胎内胚层分化成胰腺祖细胞后，使其分化成像内分泌祖细胞、α细胞、β细胞、δ细胞这样的胰岛细胞。其中，胰岛移植需要大量的胰岛细胞，但进行了分化的胰岛细胞的增殖力低，而另一方面，虽然未分化的多能性干细胞有增殖力，但分化诱导需要较长时间，而且在用于移植的胰岛细胞中混入多能性干细胞，则有在移植后会形成肿瘤的隐患。因此，较为常见尝试源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的增殖的研究报道。

在这些研究中，为了使源自多能性干细胞的胰腺祖细胞增殖而使用了各种饲养细胞进行共培养(例如，非专利文献2和3)。然而，使用这样的饲养细胞以及使用血清这两点会造成使用成分不明的物质，由于批次之间的成分的差异，存在难以稳定制备具有均一性质的胰腺祖细胞的问题。另外，在使用来自不同种动物的饲养细胞和血清时，存在其可能成为来自不同种动物的未知病原体的感染源的风险。

在非专利文献2中，报道了通过将源自es细胞的祖细胞与间充质细胞共培养，使祖细胞不分化地增殖。

在非专利文献3中，虽然报道了通过将源自es细胞的胰腺祖细胞与内皮细胞共培养或在egfl7的存在下进行培养，由此使其不分化地增殖，但增殖能力不充分。

另外，虽然关于通过在生物体外的培养使从生物体分离的胰腺祖细胞增殖的研究也有报道，但在不为源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的情况下得不到充分的增殖。

例如，在专利文献1中，报道了使用特定的细胞培养培养基培养从生物体分离的胰脏的组织碎片。然而，在专利文献1中，没有公开使用了源自多能性干细胞的胰腺祖细胞，而且，培养中使用的细胞群并不是均一的细胞群，而是培养了来自胰脏组织的多种细胞群，关于均一的胰腺祖细胞群的培养并没有公开。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5722835号公报

非专利文献

非专利文献1：arezaniaetal.natbiotechnol.2014nov；32(11):1121-1133

非专利文献2：jbsneddonetal.nature.2012nov；491(7426):765-768

非专利文献3：dikaoetal.stemcellreports.2015feb；4(2):181-189

技术实现要素：

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养方法，其既能抑制源自多能性干细胞的胰腺祖细胞发生分化、又使其高效率地增殖。另外，目的还在于提供由该培养方法获得的源自多能性干细胞的胰腺祖细胞制备胰岛细胞的方法、及源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的冻结保存方法。此外，目的还在于提供既能够抑制源自多能性干细胞的胰腺祖细胞发生分化、又能够使其高效率地增殖的培养用培养基。

解决问题的方法

本发明人等为了实现上述目的而反复深入研究，结果发现：通过在含有上皮生长因子(egf)和r-脊椎蛋白1(r-spondin1)的培养基中、或在以各种组合含有fgf-7及gsk抑制剂(chir99021)的培养基中以细胞凝集状态培养源自多能性干细胞的胰腺祖细胞，能够实现上述目的。

本发明是基于这些发现而进一步反复研究而完成的，提供如下源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养方法、由源自多能性干细胞的胰腺祖细胞制备胰岛细胞的方法、源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的冻结保存方法、源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养用培养基等。此外，在下文中，在“(i-1)～”这样的记载中也包括(i-1-a)、(i-1-b)等，其他也相同。

(i)源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养方法

(i-1)一种源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养方法，其包括(a)在含有(1)属于上皮生长因子(egf)家族的因子和/或属于成纤维细胞生长因子(fgf)家族的因子、以及(2)wnt激动剂的培养基中，三维培养源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的工序。

(i-1-a)如(i-1)所述的方法，其中，上述wnt激动剂为属于wnt家族的因子、属于r-脊椎蛋白家族(r-spondinfamily)的因子、诺里病蛋白(norrin)和/或gsk抑制剂。

(i-1-b)如(i-1)所述的方法，其中，上述wnt激动剂包含选自以下的至少1个因子：wnt-1/int-1、wnt-2/irp、wnt-2b/13、wnt-3/int-4、wnt-3a、wnt-4、wnt-5a、wnt-5b、wnt-6、wnt-7a、wnt-7b、wnt-8a/8d、wnt-8b、wnt-9a/14、wnt-9b/14b/15、wnt-10a、wnt-10b/12、wnt-11、wnt-16、chir99021、sb216763、sb415286、a1070722、bio、bio-丙酮肟、靛玉红-3'-肟、nsc693868、tc-g24、tcs2002、tws119、sirna、锂、肯帕罗酮(kenpaullone)、r-脊椎蛋白1、r-脊椎蛋白2、r-脊椎蛋白3、r-脊椎蛋白4和诺里病蛋白。

(i-2)如(i-1)所述的方法，其中，上述wnt激动剂为属于r-脊椎蛋白家族的蛋白质和/或gsk抑制剂。

(i-2-a)如(i-1)、(i-1-a)、(i-1-b)或(i-2)所述的方法，其中，上述(1)属于egf家族的因子和/或属于fgf家族的因子为与erbb1结合的因子和/或与fgfr2iiib结合的因子。

(i-2-b)如(i-1)、(i-1-a)、(i-1-b)或(i-2)所述的方法，其中，上述(1)属于egf家族的因子和/或属于fgf家族的因子包括选自以下的至少1种因子：egf、转化生长因子α(tgf-α)、双调蛋白、肝素结合性egf样生长因子、神经鞘瘤源生长因子、细胞素、痘病毒生长因子、酸性成纤维细胞生长因子(afgf、fgf-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf、fgf-2)、fgf-3、角质细胞生长因子(kgf、fgf-7)、fgf-10和fgf-22。

(i-3)如(i-1)所述的方法，其中，上述(1)属于egf家族的因子和/或属于fgf家族的因子为egf，上述(2)wnt激动剂为r-脊椎蛋白1。

(i-4)如(i-2)所述的方法，其中，上述属于egf家族的因子为egf，上述属于fgf家族的因子为fgf-7，上述属于r-脊椎蛋白家族的蛋白质为r-脊椎蛋白1，上述gsk抑制剂为chir99021。

(i-5)如(i-1)～(i-4)中任一项所述的方法，其中，上述培养基为无血清培养基。

(i-6)如(i-1)～(i-5)中任一项所述的方法，其中，上述培养是在不存在饲养细胞下的培养。

(i-7)如(i-1)～(i-6)中任一项所述的方法，其中，上述多能性干细胞为ips细胞或es细胞。

(i-8)如(i-1)～(i-7)中任一项所述的方法，其中，上述多能性干细胞来自人。

(i-9)如(i-1)～(i-8)中任一项所述的方法，其中，上述三维培养为胰腺祖细胞的聚集体(aggregates)的悬浮培养(suspensionculture)。

(i-10)如(i-1)～(i-9)中任一项所述的方法，其还包括(b)将在工序(a)中得到的胰腺祖细胞进一步进行传代培养的工序。

(i-11)如(i-1)～(i-10)中任一项所述的方法，其用于胰腺祖细胞的纯化。

(i-12)如(i-1)～(i-11)中任一项所述的方法，其还包括(c)制备ips细胞的工序，并在工序(a)中使用源自该ips细胞的胰腺祖细胞。

(i-13)如(i-1)～(i-12)中任一项所述的方法，其还包括(d)将多能性干细胞分化诱导成胰腺祖细胞的工序，并在工序a中使用该胰腺祖细胞。

(ii)由源自多能性干细胞的胰腺祖细胞制备胰岛细胞的方法

(ii-1)一种由源自多能性干细胞的胰腺祖细胞制备胰岛细胞的方法，所述方法包括(e)将利用(i-1)～(i-13)中任一项所述的方法培养的胰腺祖细胞分化诱导成胰岛细胞的工序。

(iii)源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的冻结保存方法

(iii-1)一种源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的冻结保存方法，其包括(f)将利用(i-1)～(i-13)中任一项所述的方法培养的胰腺祖细胞冻结的工序。

(iv)源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养用培养基

(iv-1)一种源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养用培养基，其含有(1)属于egf家族的因子和/或属于fgf家族的因子、以及(2)wnt激动剂。

(iv-1-a)如(iv-1)所述的培养基，其中，上述wnt激动剂为属于wnt家族的因子、属于r-脊椎蛋白家族的因子、诺里病蛋白和/或gsk抑制剂。

(iv-1-b)如(iv-1)所述的培养基，其中，上述wnt激动剂包括选自以下中的至少1种因子：wnt-1/int-1、wnt-2/irp、wnt-2b/13、wnt-3/int-4、wnt-3a、wnt-4、wnt-5a、wnt-5b、wnt-6、wnt-7a、wnt-7b、wnt-8a/8d、wnt-8b、wnt-9a/14、wnt-9b/14b/15、wnt-10a、wnt-10b/12、wnt-11、wnt-16、chir99021、sb216763、sb415286、a1070722、bio、bio-丙酮肟、靛玉红-3’-肟、nsc693868、tc-g24、tcs2002、tws119、sirna、锂、肯帕罗酮、r-脊椎蛋白1、r-脊椎蛋白2、r-脊椎蛋白3、r-脊椎蛋白4和诺里病蛋白。

(iv-2)如(vi-1)所述的培养基，其中，上述wnt激动剂为属于r-脊椎蛋白家族的蛋白质和/或gsk抑制剂。

(iv-2-a)如(iv-1)、(iv-1-a)、(iv-1-b)或(iv-2)所述的培养基，其中，上述(1)属于egf家族的因子和/或属于fgf家族的因子为与erbb1结合的因子和/或与fgfr2iiib结合的因子。

(iv-2-b)如(iv-1)、(iv-1-a)、(iv-1-b)或(iv-2)所述的培养基，其中，上述(1)属于egf家族的因子和/或属于fgf家族的因子包含选自egf、转化生长因子α(tgf-α)、双调蛋白、肝素结合性egf样生长因子、神经鞘瘤由来生长因子、细胞素、痘病毒生长因子、酸性成纤维细胞生长因子(afgf、fgf-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf、fgf-2)、fgf-3、角质细胞生长因子(kgf、fgf-7)、fgf-10和fgf-22中的至少1种因子。

(iv-3)如(vi-1)所述的培养基，其中，上述(1)属于egf家族的因子和/或属于fgf家族的因子为egf，上述(2)wnt激动剂为r-脊椎蛋白1。

(iv-4)如(iv-2)所述的培养基，其中，上述属于egf家族的因子为egf，上述属于fgf家族的因子为fgf-7，上述属于r-脊椎蛋白家族的蛋白质为r-脊椎蛋白1，上述gsk抑制剂为chir99021。

(iv-5)如(iv-1)～(iv-4)中任一项所述的培养基，其不含血清。

(iv-6)如(iv-1)～(iv-5)中任一项所述的培养基，其用于在不存在饲养细胞下的培养。

(iv-7)如(iv-1)～(iv-6)中任一项所述的培养基，其中，上述多能性干细胞为ips细胞或es细胞。

(iv-8)如(iv-1)～(iv-7)中任一项所述的培养基，其中，上述多能性干细胞来自人。

(iv-9)如(iv-1)～(iv-8)中任一项所述的培养基，其还含有选自sonichedgehog信号抑制剂、tgf-β受体抑制剂和视黄酸中的至少1种。

(iv-10)如(iv-1)～(iv-9)中任一项所述的培养基，其用于纯化胰腺祖细胞。

(v)在源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养用培养基中的用途

(v-1)上述(iv-1)～(iv-4)和(iv-9)中任一项所述的成分在源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养用培养基中的用途。

(vi)药物

(vi-1)包含由上述(i-1)～(i-13)中任一项所述的方法培养的胰腺祖细胞的药物。

(vii)培养物

(vii-1)一种分离得到的培养物，其包含(1)属于egf家族的因子和/或属于fgf家族的因子、(2)wnt激动剂、以及5质量％以上、10质量％以上、15质量％以上或20质量％以上的胰腺祖细胞。

发明的效果

按照本发明的培养方法，能够在无血清且无饲养细胞的条件下，在抑制作为均一性高的细胞群的源自多能性干细胞的胰腺祖细胞发生分化的同时使其高效率地增殖。由于是在无血清且无饲养细胞的条件下培养，所以可降低培养基的批次间的差异、能够制备品质稳定的胰腺祖细胞。

另外，本发明的培养方法能够在传代培养中利用，因此能够使胰腺祖细胞大量增殖，也能够在传代培养的过程中进行胰腺祖细胞的纯化。

此外，以本发明的培养方法增殖的胰腺祖细胞能够分化诱导成包括产生胰岛素的细胞(β细胞)的胰岛细胞。

以本发明的培养方法增殖的胰腺祖细胞也能够冻结保存，在解冻后也可以与冻结前同样地增殖。

根据本发明的培养方法能够制备大量的胰腺祖细胞，因此具有如下优点：能够在胰腺祖细胞的阶段进行细胞的筛选(例如，未分化细胞或致瘤性细胞的除去)及安全性的评价，能够缩短胰腺祖细胞的制备时间和降低制备成本，能够在短时间内大量供给品质有保证的胰岛细胞等。

对以本发明的培养方法增殖的胰腺祖细胞或以本发明的培养方法增殖的胰腺祖细胞进行分化诱导而获得的胰岛细胞而言，通过直接或者胶囊化后移植到患部而作为用于治疗(1型或2型)糖尿病的细胞药物或设备有效。

附图说明

[图1]是示出向胰腺祖细胞分化诱导后的基于流式细胞仪的分析结果的图。

[图2]是示出向胰腺祖细胞分化诱导后在各因子或其组合的存在下培养6天的细胞的相差显微镜图像的照片。

[图3]是示出向胰腺祖细胞分化诱导后在各因子或其组合的存在下培养时，细胞数的经时变化的图表。纵轴表示将培养开始时设为1时，细胞数的相对值。

[图4]是示出向胰腺祖细胞分化诱导后在各因子或其组合的存在下培养6天的细胞(没有进行传代)的流式细胞仪的分析结果的图。

[图5]是示出向胰腺祖细胞分化诱导后粘附培养时的细胞数的经时变化的图表。纵轴表示以培养开始时为1时的细胞数的相对值。

[图6]是示出各传代中sox9且brdu阳性细胞的比例(％)的图表。

[图7]是示出各传代中的细胞的利用流式细胞仪的分析结果的图。

[图8]是表示各传代中的sox9阳性且pdx1阳性细胞的比例(％)的图表。

[图9]是示出传代5次后的细胞聚集体的相差显微镜图像的照片。

[图10]是示出向胰腺祖细胞分化诱导后每隔6天传代并培养时的细胞数的经时变化的图表。纵轴表示将培养开始时设为1时的细胞数的相对值。

[图11]是示出传代9次后的细胞的免疫染色图像的照片。

[图12]是示出传代9次后的细胞的基于流式细胞仪的分析结果的图。

[图13]是示出进行了向胰岛细胞的分化诱导的细胞的流式细胞仪的分析结果的图。

图14]是示出进行了向胰岛细胞的分化诱导的细胞的葡萄糖耐量试验的结果的图表。纵轴表示c-peptide(肽)的分泌量(pm/256凝集体(aggregates)，0.5ml，0.5h)。

[图15]是示出进行了向胰岛细胞的分化诱导的细胞的免疫染色图像的照片。

[图16]是示出使用各种冻结保存液将胰腺祖细胞冻结并在-196℃保存后，解冻时的细胞生存率(％)的图表。

[图17]是示出将冻结保存的细胞的解冻后的细胞、以及没有进行冻结保存的细胞在胰腺祖细胞增殖用培养基中培养时的细胞数的经时变化的图表。纵轴表示将培养开始时设为1时的细胞数的相对值。

[图18]是示出添加4种因子(egf+rspd1+fgf-7+chir99021)培养时的来自rpchips771-2株的胰腺祖细胞的细胞数的经时变化的图表。纵轴表示以培养开始时为1时的细胞数的相对值。

[图19]是示出将各源自人ips细胞株的胰腺祖细胞添加4种因子(egf+rspd1+fgf-7+chir99021)培养时的流式细胞仪的分析结果的图。

[图20]是示出将各源自人ips细胞株的胰腺祖细胞添加2～4种因子培养时的细胞数变化的图表。纵轴表示将培养开始时设为1时的细胞数的相对值。

[图21]是示出将各源自人ips细胞株的胰腺祖细胞添加2～4种因子培养时的ki67和pdx1阳性细胞的比例(％)的图表。

本说明书包括作为本申请优选权的基础的日本特愿2016-091116(2016年4月28日提出申请)的说明书中记载的内容。

具体实施方式

以下将对本发明进行详细说明。

此外，本说明书中“包含、含有(comprise)”既包括“本质上由……构成(essentiallyconsistof)”的意思，也包括“由……构成(consistof)”的意思。

在本说明书中，“培养”是指将细胞在体外环境中维持或/和使其增殖。“进行培养”是指在组织外或体外、例如在细胞培养皿或烧瓶中使细胞维持或/和使其增殖。

(多能性干细胞)

多能性干细胞是指具有能够分化成三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)中的任一种的能力(多能性：pluripotency)、且能够自我复制的干细胞。作为多能性干细胞，没有特别限定，例如可以列举：胚胎干(es)细胞、源自通过核移植得到的克隆胚胎的胚性干(ntes)细胞、多能性生殖干细胞(“mgs细胞”)、胚胎生殖细胞(“eg细胞”)、人工多能性干(ips)细胞等。另外，作为多能性干细胞来源的生物，没有特别限定，可以列举例如人、猴、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、牛、猪、狗、马、猫、山羊、绵羊等哺乳动物。其中优选人来源的多能性干细胞。多能性干细胞可以使用市售或由指定机关赠予的细胞、或根据已知的方法制备的细胞。作为多能性干细胞，可以优选使用es细胞和ips细胞。

es细胞可以利用已知的方法制备。es细胞除了以从母体取出的受精卵为材料制作的细胞以外，例如也可以是以由体外受精得到的受精卵为材料制作的细胞。

ips细胞能够通过已知的方法、例如向任意体细胞导入初始化因子来制备。其中，作为初始化因子，能够列举例如，oct3/4、sox2、sox1、sox3、sox15、sox17、klf4、klf2、c-myc、n-myc、l-myc、nanog、lin28、fbx15、eras、ecat15-2、tcl1、beta-catenin、lin28b、sall1、sall4、esrrb、nr5a2、tbx3、glis1等基因或基因产物，这些初始化因子可以单独或组合2种以上使用。其中，作为初始化因子的组合，能够使用例如wo2007/069666、wo2008/118820、wo2009/007852、wo2009/032194、wo2009/058413、wo2009/057831、wo2009/075119、wo2009/079007、wo2009/091659、wo2009/101084、wo2009/101407、wo2009/102983、wo2009/114949、wo2009/117439、wo2009/126250、wo2009/126251、wo2009/126655、wo2009/157593、wo2010/009015、wo2010/033906、wo2010/033920、wo2010/042800、wo2010/050626、wo2010/056831、wo2010/068955、wo2010/098419、wo2010/102267、wo2010/111409、wo2010/111422、wo2010/115050、wo2010/124290、wo2010/147395、wo2010/147612、huangfudetal.,nat.biotechnol.,26:795-797(2008)、shiyetal.,cellstemcell,2:525-528(2008)、eminlisetal.,stemcells.26:2467-2474(2008)、huangfudetal.,nat.biotechnol.26:1269-1275(2008)、shiyetal.,cellstemcell,3:568-574(2008)、zhaoyetal.,cellstemcell,3:475-479(2008)、marsona,cellstemcell,3:132-135(2008)、fengbetal.,nat.cellbiol.11:197-203(2009)、judsonrletal.,nat.biotechnol.,27:459-461(2009)、lyssiotiscaetal.,procnatlacadsciusa.106:8912-8917(2009)、kimjbetal.,nature.461:649-643(2009)、ichidajketal.,cellstemcell.5:491-503(2009)、hengjcetal.,cellstemcell.6:167-174(2010)、hanjetal.,nature.463:1096-1100(2010)、malipetal.,stemcells.28:713-720(2010)、maekawametal.,nature.474:225-229(2011)等中记载的组合。

作为上述体细胞，没有特别限制，包括胎儿(仔)的体细胞、新生儿(仔)的体细胞、以及已成熟的健康和疾患性的体细胞，另外，还包括初代培养细胞、传代细胞和株化细胞。作为体细胞，可以列举例如(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(成体干细胞)、(2)组织祖细胞、(3)血液细胞(末梢血细胞、脐带血细胞等)、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞、脂肪细胞等分化后的细胞等。

(胰腺祖细胞)

本发明中的胰腺祖细胞(pancreaticprogenitor)是指之后会向胰岛细胞分化的细胞。胰腺祖细胞能够例如以为pdx1(pancreasduodenalhomeoboxgene1，胰十二指肠同源框基因1)阳性(和sox9阳性)为指标。

另外，对本发明的胰腺祖细胞而言，还可以追加nkx6.1、ngn3(nerurogenin3)等为阴性作为进一步的指标，但nkx6.1和/或ngn3也可以为阳性。

此外，hnf6、hlxb9、pax4和/或nkx2-2等标记物也能够作为胰腺祖细胞的指标使用。

作为一例，pdx1、hnf6、hlxb9等标记物为阳性的细胞、或者nkx6.1、ngn3、pax4、nkx2-2等标记物为阳性的细胞也包括在本发明的胰腺祖细胞中。

本发明的胰腺祖细胞优选为pdx1阳性，更优选为pdx1阳性和sox9阳性。

本发明的胰腺祖细胞特别优选为pdx1阳性、sox9阳性、以及nkx6.1阴性和/或ngn3阴性。

作为其他方式，本发明的胰腺祖细胞特别优选为pdx1阳性、sox9阳性、以及nkx6.1阳性和/或ngn3阳性。

(胰岛细胞)

本发明中的胰岛(朗格汉斯氏岛)细胞包括分泌胰高血糖素的α细胞、分泌胰岛素的β细胞和分泌生长抑素的δ细胞中的至少1种，优选至少包括β细胞。胰岛细胞包含α细胞、β细胞和δ细胞，例如能够分别通过使用针对胰高血糖素、胰岛素或c肽及生长抑素的抗体的免疫染色来确认。β细胞也能够用使用针对c肽的抗体的免疫染色进行检测。β细胞还可以利用双硫腙染色检测。胰岛细胞还可以包含分泌胰多肽的f细胞及胰岛祖细胞。

(胰腺祖细胞的培养方法(a工序))

本发明的源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的培养方法的特征在于，包括将源自多能性干细胞的胰腺祖细胞在以下培养基中进行三维培养的工序，所述培养基含有(1)属于上皮生长因子(egf)家族的因子和/或属于成纤维细胞生长因子(fgf)家族的因子(以下有时称为成分(1))、以及(2)wnt激动剂(以下有时称为成分(2))。

本发明的培养方法中使用的胰腺祖细胞是源自多能性干细胞、即是从多能性干细胞分化诱导得到的。

本发明的培养方法中使用的培养基以在动物细胞的培养中使用的培养基为基础培养基，至少包含(1)属于egf家族的因子和/或属于fgf家族的因子、以及(2)wnt激动剂。作为基础培养基，只要是可在动物细胞培养中使用的培养基即可，没有特别限定，可以列举例如：imdm培养基、medium199培养基、eagle'sminimumessentialmedium(emem，eagle氏最低必需培养基)培养基、αmem培养基、doulbecco'smodifiedeagle'smedium(dmem，dulbecco改良的eagle'smedium)培养基、ham'sf12培养基、rpmi1640培养基、fischer's培养基、mcdb131培养基、这些的混合培养基等。这样，通过组合成分(1)和成分(2)使用，能够使胰腺祖细胞高效率地增殖。

作为属于egf家族的因子，只要是与egf受体结合，能够使其活性提高的物质，就没有特别限制，优选为与作为egf受体的erbb1结合的因子，例如可以列举egf、转化生长因子α(tgf-α)、双调蛋白、肝素结合性egf样生长因子、神经鞘瘤源生长因子、细胞素、痘病毒生长因子等，更优选为egf。

上皮生长因子(egf)是促进各种表皮和成纤维细胞的增殖的由53个氨基酸构成的多肽，具有3个分子内二硫键。另外，与上皮生长因子受体结合。上皮生长因子有时也被称为上皮增殖因子、上皮细胞增殖因子、表皮增殖因子和表皮生长因子。本发明中的上皮生长因子只要具有本来的活性即可，也广泛包括天然存在的上皮生长因子的变体。上皮生长因子能够使用市售的产品或按照已知方法制备的产品。

作为属于fgf家族的因子，在人和小鼠中存在22种fgf。fgf有时也被称为成纤维细胞生长因子及肝素结合性增殖因子。作为属于fgf家族的因子，可以列举例如酸性成纤维细胞生长因子(afgf、fgf-1)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf、fgf-2)、fgf-3、角质细胞生长因子(kgf、fgf-7)、fgf-10、fgf-22等，优选为与作为fgf受体的fgfr2iiib结合的因子，更优选为fgf-3、fgf-7、fgf-10及fgf-22。

wnt激动剂是活化wnt信号转导，在细胞中活化tcf/lef介导性的转录的物质，其包括与frizzled受体结合而活化的物质、细胞内β-连环蛋白分解的抑制剂、tcf/lef的活化物质等。具体而言，可以列举属于wnt家族的因子(例如，属于wnt家族的蛋白质、显示与wnt家族同样的作用的低分子化合物)、属于r-脊椎蛋白家族的因子(例如，属于r-脊椎蛋白家族的蛋白质(r-脊椎蛋白1～4等)、显示与r-脊椎蛋白家族同样的作用的低分子化合物)、诺里病蛋白(norrin)、gsk抑制剂等、优选为属于r-脊椎蛋白家族的因子和/或gsk抑制剂、更优选为属于r-脊椎蛋白家族的蛋白质和/或gsk抑制剂。

作为属于wnt家族的蛋白质，没有特别限制，可以列举例如wnt-1/int-1、wnt-2/irp、wnt-2b/13、wnt-3/int-4、wnt-3a、wnt-4、wnt-5a、wnt-5b、wnt-6、wnt-7a、wnt-7b、wnt-8a/8d、wnt-8b、wnt-9a/14、wnt-9b/14b/15、wnt-10a、wnt-10b/12、wnt-11、wnt-16等，特别是wnt-3a。

gsk抑制剂只要是抑制gsk-3β(glycogensynthasekinase(糖原合成酶激酶)3β)的因子即可，没有特别限制，例如可以列举：chir99021、sb216763、sb415286、a1070722、bio、bio-丙酮肟、靛玉红-3'-肟、nsc693868、tc-g24、tcs2002、tws119、sirna、锂、肯帕罗酮等，优选为chir99021。

作为属于r-脊椎蛋白家族的蛋白质，优选为r-脊椎蛋白1。r-脊椎蛋白1属于作为wnt调节因子的rspo(rspo1-4)家族，是调节wnt/β-连环蛋白信号转导的分泌蛋白。本发明中的r-脊椎蛋白1只要具有本来的活性即可，也广泛包括天然存在的r-脊椎蛋白1的变体。r-脊椎蛋白1能够使用市售的产品或按照已知方法制备的产品。

在培养基中包含以下中的至少2种：属于egf家族的因子、属于fgf家族的因子、属于r-脊椎蛋白家族的因子(例如，蛋白质、显示与r-脊椎蛋白家族同样作用的低分子化合物)、以及gsk抑制剂。在培养基中可以包含以下中的3种以上，也可以包含4种以上：属于egf家族的因子、属于fgf家族的因子、属于r-脊椎蛋白家族的因子(例如，蛋白质、显示与r-脊椎蛋白家族同样作用的低分子化合物)、以及gsk抑制剂。

培养基中的成分(1)的各浓度，只要是胰腺祖细胞能够增殖即可，没有特别限定，例如优选为1～1000ng/ml、更优选为20～100ng/ml。另外，培养基中的成分(2)的各浓度，只要是胰腺祖细胞能够增殖即可，没有特别限定，例如优选10～2000ng/ml或0.1～50μm、更优选200～1000ng/ml或1～10μm。在培养基中包含chir99021作为gsk抑制剂的情况下，chir99021的浓度优选为1～20μm，更优选为3～10μm。

培养基中的上皮生长因子的浓度只要是胰腺祖细胞能够增殖即可，没有特别限定，例如优选1～1000ng/ml、更优选20～100ng/ml。另外，培养基中的r-脊椎蛋白-1的浓度只要是胰腺祖细胞能够增殖即可，没有特别限定，例如优选10～2000ng/ml、更优选200～1000ng/ml。

本发明中使用的培养基优选还包含选自以下中的至少1种：sonichedgehog信号抑制剂、tgf-β受体抑制剂和视黄酸。

作为sonichedgehog信号抑制剂，只要是能够抑制sonichedgehog信号的因子就没有特别限定，具体可以列举sant-1、蒜藜芦碱(jervine)、环巴胺(cyclopamine)-kaad等。

作为tgf-β受体抑制剂，只要是能够抑制tgf-β受体的功能的因子，就没有特别限定，具体可以列举ldn193189、d4476、ly2157299、ly364947、sb525334、sb431542、sd208等。另外，也可以代替tgf-β受体抑制剂，而使用dorsomorphin、noggin等bmp信号抑制剂。在反复传代、进行长期培养的情况下，优选在培养基中添加tgf-β受体抑制剂和/或bmp信号抑制剂。

作为视黄酸，特别优选使用全反式视黄酸。

此外，本发明中使用的培养基中可以包含rock(rho-associatedcoiled-coilformingkinase/rho结合激酶)抑制剂。rock抑制剂优选仅在传代后1～2天添加到培养基中。

作为rock抑制剂，只要是能够抑制rock的功能的因子即可，没有特别限定，具体可以列举y-27632、fasudil(或ha1077)、h-1152、wf-536、y-30141等。

本发明中使用的培养基可以含有血清，也可以无血清，其中优选为无血清培养基。

本发明中使用的培养基还可以含有血清替代物(例如，白蛋白、转铁蛋白、knockout血清替代品(ksr)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油、its-添加剂等)。作为血清替代物，可以使用1种或2种以上。

此外，本发明中使用的培养基还可以含有以下中的1种以上的物质：b27-添加剂、n2-添加剂、脂质、葡萄糖、氨基酸(非必须氨基酸等)、l-谷氨酰胺、glutamax(thermofisherscientific)、维生素、生长因子、细胞因子、抗生物质、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。

作为本发明中使用的培养基，由于能够降低培养基的批次间的差异、能够制备品质稳定的胰腺祖细胞，故优选使用不含血清等成分不明的物质的、已知组成的(chemically-defined，化学成分确定的)培养基。

本发明中使用的培养基的ph通常为7.0～7.8，优选为7.2～7.6。培养基在使用前为了防止污染，优选利用过滤、紫外线照射、加热灭菌、辐射线照射等方法灭菌。

本发明中使用的培养基能够以溶液形态、干燥形态或浓缩形态(例如，2x～1000x)配制。在为浓缩形态的情况下，能够适当稀释至适当的浓度使用。用于稀释干燥形态或浓缩形态的培养基的液体，可以从水、缓冲水溶液、生理盐水溶液等中适当选择。

本发明的胰腺祖细胞的培养以三维培养进行。其中，三维培养并不是进行单层培养的二维培养，而是以在纵向上具有厚度的状态进行的培养方法。通过进行这样的三维培养，能够使胰腺祖细胞高效地增殖。作为三维培养的方法，只要能够使胰腺祖细胞增殖即可，可以没有特别限制地广泛使用已知的方法。其中，优选基于胰腺祖细胞的细胞聚集体的悬浮培养。

以下说明形成这样的胰腺祖细胞的细胞聚集体的培养方法。

首先，将胰腺祖细胞解离成分散细胞(单一细胞或数个细胞的块)。向分散细胞的解离能够利用胰蛋白酶、胶原酶等酶、及edta等螯合剂的处理、吹打等机械操作等进行。将被解离成分散细胞的胰腺祖细胞悬浮在培养基中，优选以成为10～10000个/孔、更优选为300～3000个/孔的细胞浓度的方式接种于培养器。然后，在该状态下静置一定期间，例如12～36小时，由此能够形成聚集体。聚集体的大小(直径)通常为50～500μm左右，优选为100～200μm左右，一个聚集体中的细胞数通常为100～5000个左右，优选为500～2000个左右。

在形成胰腺祖细胞的细胞聚集体的培养方法中，例如可以使用具有0.001～10μl/孔、0.001～1μl/孔、0.005～0.5μl/孔、0.01～0.5μl/孔、0.01～0.1μl/孔等的容积的培养孔的培养器。另外，优选具有细胞容易沉在底部而形成聚集体的形状、例如，底部向底面鼓出的半球状的培养孔、具有圆柱状且底部呈半球状的形状的培养孔等的培养器。对培养器的培养孔的直径而言,,例如能够列举200～800μm、400～800μm等。另外，这样的培养孔的深度例如为400～1000μm、400～800μm等。通过使用具有多个如上所述的形状的孔的多孔的培养器，能够得到大量胰腺祖细胞。

用于形成胰腺祖细胞的细胞聚集体的培养器为了进行非粘附培养，可以是培养器表面进行了细胞的非粘附处理的培养器(例如进行了细胞非粘附处理的塑料制(例如，聚苯乙烯制)的培养器)，但优选由能够将细胞以非粘附状态培养的原材料形成。作为这样的原材料，希望是具有三维结构且无细胞毒性的亲水性原材料，进一步，为了容易观察培养状态，更优选为透明的原材料。另外，还优选由用于细胞的非粘附处理的亲水性高分子构成的水凝胶。

作为用于制作水凝胶的材料，例如能够列举能够形成水凝胶的各种合成高分子材料：聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯、聚-2-羟乙基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸等合成高分子的(物理的或化学的)交联体和通过辐射线照射的交联体、以及构成上述高分子的单体的共聚物的交联体等。另外，还能够使用作为天然高分子的琼脂糖、海藻酸、葡聚糖、纤维素等多糖及其衍生物、此外还能够使用明胶、白蛋白等蛋白质及其衍生物的交联体等。作为用于制作水凝胶的材料，其中优选琼脂糖凝胶。

作为为了能够将细胞以非粘附状态培养而实施处理中使用的材料，可以列举上述水凝胶的制作中使用的原材料，包含2-甲基丙烯酰基氧乙基磷酸胆碱(mpc)作为主要成分的高分子材料等。

本发明的培养方法的培养条件与通常的细胞培养为同样的条件即可，培养温度优选为35～39℃、更优选为37℃。另外，o2浓度通常约为5～20％，co2浓度通常约为1～10％，优选约为5％。这样的培养能够使用已知的co2培养箱进行。

对培养时间没有特别限制，例如优选3～10天、更优选5～7天。另外，培养中优选每1～3天更换培养基。

本发明的培养方法优选在饲养细胞的非存在下实施。本发明的培养方法能够在饲养细胞的非存在下进行培养，因此不会混入成分不明的物质，能够使具有均一性质的胰腺祖细胞稳定增殖。

本发明的培养方法能够使与分化成胰岛细胞、肝脏细胞、神经细胞、胰腺外分泌细胞等其他功能细胞的细胞比，增殖力更高的胰腺祖细胞有效地增殖，因此适合用于纯化胰腺祖细胞。

(传代培养(b工序))

在本发明的培养方法的优选实施方式中，还包括将工序a中得到的胰腺祖细胞进行传代培养的工序。

传代培养能够通过将利用上述方法培养的胰腺祖细胞的凝集块回收，将其解离成分散细胞后，接种于新的培养基进行培养来进行。这里的向分散细胞的解离、细胞的接种、培养基、培养方法等与上述相同。

传代次数例如为1～10次、1～5次、2～3次，优选为3次以上。此外，在本说明书中，将最初的培养作为第0次传代。

在本发明的培养方法中，即使进行传代培养，也维持胰腺祖细胞的增殖力，因此能够制备大量胰腺祖细胞。此外，随着传代次数增加，胰腺祖细胞的纯化也提高。

(ips细胞的制备工序(c工序))

本发明的培养方法还可以包括制备ips细胞的工序。

作为制备ips细胞的方法，可以列举在上述“多能性干细胞”的项中记载的方法。能够将这里制备的ips细胞分化诱导成胰腺祖细胞，并将该胰腺祖细胞在a工序的培养中使用。

此外，在本发明中，在使用除了ips细胞以外的多能性干细胞的情况下，该工序中可以代替ips细胞而制备其他多能性干细胞。

(向胰腺祖细胞的分化诱导工序(d工序))

本发明的培养方法还可以包括将多能性干细胞分化诱导成胰腺祖细胞的工序。

能够将这里分化诱导的胰腺祖细胞在a工序的培养中使用。

在使多能性干细胞分化成胰腺祖细胞的工序中，可以以模仿生物体内的胰腺发育的过程的方式将培养液的组成经时地改变。另外，该分化诱导工序可以通过上述基于细胞聚集体的悬浮培养或粘附培养进行。

作为这样的方法，能够使用例如以下文献所记载的方法、及对其进行适当修正的方法。如果是参考文献2所记载的方法，则可以通过实施到stage4为止的阶段而分化诱导至胰腺祖细胞。

参考文献1：rezaniaa,bruinje,riedelmj,mojibianm,asadia,xuj,gauvinr,narayank,karanuf,o'neiljj,aoz,warnockgl,kieffertj.maturationofhumanembryonicstemcell-derivedpancreaticprogenitorsintofunctionalisletscapableoftreatingpre-existingdiabetesinmice.diabetes2012；61:2016-2029.

参考文献2：rezaniaa,bruinje,arorap,rubina,batushanskyi,asadia,o'dwyers,quiskampn,mojibianm,albrechtt,yangyh,johnsonjd,kieffertj.reversalofdiabeteswithinsulin-producingcellsderivedinvitrofromhumanpluripotentstemcells.natbiotechnol2014；32:1121-1133.

参考文献3：hrvatins,o'donnellcw,dengf,millmanjr,pagliucafw,diioriop,rezaniaa,gifforddk,meltonda.differentiatedhumanstemcellsresemblefetal,notadult,βcells.procnatlacadsciusa.2014；111:3038-3043

参考文献4：pagliucafw,millmanjr,gurtlerm,segelm,vandervorta,ryujh,petersonqp,greinerd,meltonda.generationoffunctionalhumanpancreaticβcellsinvitro.cell.2014；159:428-439.

例如，优选在初期的阶段加入激活素a及wnt3a，还优选在其后加入视黄酸、hedgehog信号抑制剂(例如，sant-1及环巴胺-kaad)、成纤维细胞生长因子等。

另外，在分化的过程中，为了模仿生物体内的胰腺发育的过程，得到胰腺祖细胞，也可以在适当的时期加入维持未分化性而促进增殖的物质、抑制增殖而促进分化的物质、在生物体内的胰脏中表达的蛋白质等。作为这样的物质，可以列举gsk-3β(glycogensynthasekinase3β，糖原合成酶激酶3β)抑制剂(例如，chir99021)、alk抑制剂(例如，sb431542)、notch信号抑制剂(例如，dapt)、tgfβ抑制剂(例如，ldn193189)、ampk及bmp信号抑制剂(例如，dorsomorphin)、pkc活性化剂(例如，pdbu)、胰岛素样生长因子-1、上皮生长因子、肝细胞生长因子、胰高血糖素样肽-1、市售的添加剂等。

(向胰岛细胞的分化诱导工序(e工序))

本发明的从源自多能性干细胞的胰腺祖细胞进行的胰岛细胞的制备方法的特征在于，包括将利用上述方法培养的胰腺祖细胞分化诱导成胰岛细胞的工序。

在使胰腺祖细胞分化成胰岛细胞的工序中，可以以模仿生物体内的胰腺发育的过程的方式将培养液的组成经时地改变。另外，该分化诱导工序可以通过上述基于细胞聚集体的悬浮培养进行。

作为这样的方法，能够使用例如上述参考文献1-4中记载的方法、以及将其适宜修正得到的方法。如果是参考文献2中记载的方法，则可以通过实施从stage5到stage7的阶段而分化诱导至胰岛细胞。

(胰腺祖细胞的冻结工序(f工序))

本发明的源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的冻结保存方法的特征在于包括将利用上述方法培养的胰腺祖细胞冻结的工序。

作为胰腺祖细胞，可以使用由上述培养方法培养的细胞、以及进一步传代培养得到的细胞中的任一种。另外，优选将冻结保存的胰腺祖细胞解离成分散细胞。解离成分散细胞的方法与上述相同。

作为冻结保存液，没有特别限定，能够列举市售的冻结保存液(例如，cellbanker(注册商标)2(日本全药工业株式会社)、stemcellbanker(注册商标)(日本全药工业株式会社)、stemsure(注册商标)freezingmedium(和光纯药工业株式会社)等)、添加了5～20容量％左右的二甲基亚砜的培养液(例如，在上述的培养方法中使用的培养基)等。

冻结保存可以通常在-70～-196℃左右、优选在-100℃以下进行冻结。在进行长期保存的情况下，可以在液氮细胞保存容器的液氮中或液氮上部的气相中进行保存。

冻结保存的细胞的解冻能够通过通常在20～40℃左右、优选35～38℃左右的水浴中快速加温来进行。

用本发明的培养方法增殖的胰腺祖细胞，即使在冻结保存后也维持着与冻结保存前相同程度的增殖力。因此，期待该技术也适用于胰腺祖细胞的细胞库。

实施例

以下，为了更加详细地说明本发明而列举了实施例。但本发明并不受这些实施例等任何限定。

此外，在以下的实施例中，在没有特别记载ips细胞株的名称的情况下，为使用了253g1株得到的实验结果。

[琼脂糖微孔的准备]

使用microtissues公司的3dpetridish，参考制造商的使用说明书(http://www.funakoshi.co.jp/contents/5556)而制作了琼脂糖微孔。使用孔直径400μm、256孔/凝胶板的模具。具体而言，按照以下步骤制作了琼脂糖微孔。

首先，在模具中注入加温的琼脂糖溶液(lonza公司制琼脂糖、2.5％琼脂糖/生理盐水)。然后，在室温冷却，在琼脂糖凝胶化后将琼脂糖微孔从模板取下。将琼脂糖微孔转移至细胞培养用的聚苯乙烯制的12孔板，从周围添加培养基(dmem/f12)，使琼脂糖微孔板浸渍在培养基中。在培养箱(37℃、5％co2)中放置一晚以上，使琼脂糖微孔板与周围的培养基平衡化。由此，得到具有256个具有直径400μm的圆柱部和半球状的底部的孔的琼脂糖微孔。在超净台内以无菌的状态进行以上操作。

[形成聚集体以及向胰腺祖细胞的分化诱导]

将ips细胞(253g1，从rikencellbank获得)使用包覆有geltrex(thermofisherscientific)的培养容器以e8培养基(thermofisherscientific)培养3～4天。在70～80％汇合的状态下使用tryple(thermofisherscientific)处理，将细胞以单一细胞的状态回收。将细胞悬浮于包含10μm的y-27632(rock抑制剂：和光纯药工业株式会社)的e8培养基中，并在上述制备的设置在聚苯乙烯制12孔板一个孔的256孔的琼脂糖微孔板上，以平均2500细胞/孔的方式接种。

静置10分钟使细胞沉到微孔的底后，在琼脂糖微孔板的周围添加培养基(e8培养基+rock抑制剂)，逐个将板浸渍在培养基中。在37℃、5％co2的条件下培养24小时(5％co2、37℃)而使细胞凝集后，培养规定的时间，由此进行分化诱导。具体而言，如下所述，每天吸出培养基，加入新的培养基，由此进行更换，另外在规定的天数改变培养基组成。培养基的组成和在各个培养基中的培养天数按照arezaniaetal.reversalofdiabeteswithinsulinproducingcellsderivedinvitrofromhumanpluripotentstemcells.natbiotechnol.2014nov；32(11):1121-33.的记载。

第1阶段(3天)

mcdb131(thermofisherscientific)+1.5g/lnahco3(nakaraitesque株式会社)+0.5％无脂肪bsa(和光纯药工业株式会社)+2mmglutamax(thermofisherscientific)+10mmd-葡萄糖(nakaraitesque株式会社)+3μmchir99021(tocrisbioscience)+100ng/ml激动素a(r&dsystems)(chir99021仅在初日的培养基中添加)

第2阶段(2天)

mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％无脂肪bsa+2mmglutamax+10mmd-葡萄糖+50ng/ml成纤维细胞生长因子7(fgf-7,peprotech)+0.25mm抗坏血酸(sigma-aldrich)

第3阶段(2天)

mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％不含脂肪酸的牛血清白蛋白(无脂肪bsa)+1/200its添加剂(thermofisherscientific)+2mmglutamax+20mmd-葡萄糖+50ng/mlfgf-7+0.25μmsant-1(和光纯药工业株式会社)+0.1μmldn193189(和光纯药工业株式会社)+1μm视黄酸(sigma-aldrich)+0.2μmtbp(pkc激活剂；catalogno.565740；emdchemicalsinc.)+0.25mm抗坏血酸

第4阶段(2天)

mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％无脂肪bsa+1/200its添加剂+2mmglutamax+20mmd-葡萄糖+50ng/mlfgf-7+0.25μmsant-1+0.2μmldn193189+0.1μm视黄酸+0.1μmtbp+0.25mm抗坏血酸tbp:(2s,5s)-(e,e)-8-(5-(4-(trifluoromethyl)phenyl)-2,4-pentadienoylamino)benzolactam(((2s,5s)-(e,e)-8-(5-(4-(三氟甲基)苯基)-2,4-戊二烯酰氨基)苯并内酰胺)

将由上述从第1阶段到第4阶段的培养得到的细胞的通过流式细胞仪的分析结果示于图1。在图1中，sox9为胰腺祖细胞标记物，brdu为细胞增殖标记物(用于标注对具有增殖能力的细胞的核的核酸类似体)、pdx1为胰腺祖细胞及胰岛细胞标记物。将brdu添加到培养液中，培养24小时后，进行染色和流式细胞仪分析。作为一次抗体，使用了山羊抗pdx1抗体(r&dsystems)、兔抗sox9抗体(merckmillipore)、小鼠抗brdu抗体(dako)，作为二次抗体，使用了fitc标记抗小鼠igg抗体(thermofisherscientific)、pe标记抗山羊igg抗体(thermofisherscientific)、fitc标记抗兔igg抗体(bdbiosciences)、pe标记抗小鼠igg抗体(bdbiosciences)。测定使用guava(注册商标)easycyte(merckmillipore)。

根据图1，有6成左右的细胞分化成pdx1阳性的胰腺细胞，包含3成左右的增殖中的sox9/brdu阳性的胰腺祖细胞。作为结果，形成了不均匀的细胞团块，推测包含未分化的细胞、胰腺祖细胞(sox9和pdx1阳性且nkx6.1阴性的细胞)、已发展到向内分泌细胞成熟的细胞。

[胰腺祖细胞的扩增]

将上述由从第1阶段到第4阶段的培养得到的细胞的凝集块使用细胞分散用酶液tryple(thermofisherscientific)分散成单一细胞。将细胞悬浮于包含10μm的y-27632(rock抑制剂：和光纯药工业株式会社)的下述的培养基，在设置在12孔板的孔上的256孔的琼脂糖微孔板中以1000细胞/孔进行接种(1000×256＝2.56×10⁵/板)。静置10分钟使细胞沉底后，从琼脂糖微孔板的周围添加下述培养基，逐个将板浸渍在培养基中。然后，在37℃、5％co2的条件下培养6天。培养基更换每隔一天进行。

mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％无脂肪bsa+1/200its添加剂+2mmglutamax+20mmd-葡萄糖+50ng/ml上皮生长因子(egf,和光纯药工业株式会社)+200ng/mlr-脊椎蛋白1(rspd1,r&dsystems)+0.25μmsant-1(和光纯药工业株式会社)+0.2μmldn193189(和光纯药工业株式会社)+0.1μm视黄酸(sigma-aldrich)

将结果示于图2-4。在图3中，在6天后传代一次。在图4中，将brdu添加到培养液中，培养24小时后进行染色和流式细胞仪分析。其中，24小时培养中增殖的细胞被brdu标记。此外，在图4中，sox9为胰腺祖细胞标记物。由图2和图3可知，在将r-脊椎蛋白1和egf共添加的情况下，细胞良好地增殖。另外，由图4可知，共添加r-脊椎蛋白1和egf的情况下，sox9/brdu阳性细胞的比例最多。与培养前相比，sox9和pdx1阳性的胰腺祖细胞增加(26.3％→57.5％)，推进了向胰腺祖细胞的筛选。

在包被有geltrex的6孔板上，使上述由第1阶段到第4阶段的培养得到的细胞以20000或40000细胞/cm²的密度粘附于板基材，用与上述胰腺祖细胞的扩增同样的培养方法进行粘附培养。在37℃、5％co2的条件下培养12天。培养6天后进行传代。培养基更换每隔一天进行。将结果示于图5。根据图5，在进行粘附培养的情况下，大量细胞会分化成外分泌细胞(数据未显示)，在反复传代的中途，细胞的增殖性减退，转而细胞数减少。

[胰腺祖细胞的纯化]

每隔6天，由琼脂糖微孔板回收细胞聚集体，分散成单一细胞后，接种到新的琼脂糖微孔板。细胞的分散方法、培养基组成及培养条件与上述的[胰腺祖细胞的扩增]相同。

图6中示出了测量各传代中的sox9及brdu阳性细胞的比例的结果。此外，在图6中，p表示传代数。根据图6，每次经过传代，sox9/brdu阳性细胞的比例都增加，在传代1次后上升至60％。图7-8示出了测量各传代中的sox9及pdx1阳性细胞的比例的结果。每次经过传代，sox9及pdx1阳性的胰腺祖细胞的比例都增加，传代3次后上升至90％。由这些结果可以认为增殖能力高于成熟细胞的祖细胞的纯度增加了。

[胰腺祖细胞的长期培养]

每隔6天由琼脂糖微孔板回收细胞聚集体，分散成包含sox9及pdx1阳性的胰腺祖细胞的单一细胞后，接种到新的琼脂糖微孔板。细胞的分散方法、培养基组成及培养条件与上述[胰腺祖细胞的扩增]相同。

将结果示于图9-12。图9的左图示出了在琼脂糖微孔上培养时的细胞聚集体的相差显微镜图像，右图表示从琼脂糖微孔板取出后的细胞聚集体的相差显微镜图像。在图11和图12中，brdu为细胞增殖标记物、pdx1为胰腺祖细胞和胰岛细胞标记物、sox9为胰腺祖细胞标记物、c-肽为β细胞标记物、nkx6.1为内分泌细胞标记物。在包含多种细胞的细胞团块中，聚集体的形态存在变形，但根据图9得到了接近球形的细胞聚集体，可以推测聚集体内的细胞为均一的胰腺祖细胞。根据图10，能够细胞增殖能力不减少地进行长时间(48天)扩增，通过每1次传代即6天的培养，细胞数增加至3倍。根据图11和图12，长时间扩增的细胞的胰腺祖细胞标记物sox9及pdx1为阳性。另外，将brdu添加到培养液中培养24小时后进行染色，时，还观察到大量brdu阳性的增殖中的细胞。但是，作为β细胞标记物的c-肽阳性、和内分泌细胞标记物的nkx6.1阳性的发展到成熟的细胞稀少。

[向内分泌细胞的成熟]

与上述[胰腺祖细胞的扩增]同样，将传代扩增培养6次后的胰腺祖细胞接种于琼脂糖孔板。接种密度设为3000细胞/孔。以下述第1阶段～第3阶段所示的步骤进行向内分泌细胞的成熟。具体而言，如下所述，经时地改变培养基组成。每隔1天吸出培养基，更换成新的培养基，另外在规定的天数改变培养基组成。培养基的组成及在各个培养基中的培养天数按照arezaniaetal.reversalofdiabeteswithinsulin-producingcellsderivedinvitrofromhumanpluripotentstemcells.natbiotechnol.2014nov；32(11):1121-33.的记载。

第1阶段(3天)

mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％无脂肪bsa+1/200its添加剂+2mmglutamax+20mmd-葡萄糖+0.25μmsant-1+0.2μmldn193189+0.05μm视黄酸+1μmt3(甲状腺激素,三碘甲状腺氨酸,sigma-aldrich)+10μmalk5iii(激动素受体样激酶受体5抑制剂ii,enzolifesciences,inc.)+10μg/ml肝素(nakaraitesque株式会社)+10μm硫酸锌(sigma-aldrich)

第2阶段(7天)

mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％无脂肪bsa+1/200its添加剂+2mmglutamax+20mmd-葡萄糖+0.2μmldn193189+1μmt3+10μmalk5iii+10μg/ml肝素+10μm硫酸锌+0.1μmgsixx(γ-分泌酶抑制剂xx,merckmillipore)

第3阶段(7-14天)

mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％无脂肪bsa+1/200its添加剂+2mmglutamax+20mmd-葡萄糖+1μmt3+10μmalk5iii+10μg/ml肝素+10μm硫酸锌+1mmn-cys(n-乙酰半胱氨酸,sigma-aldrich)+2μmr428(axl抑制剂,selleckchem)+10μmtrolox(merckmillipore)

以调查分化诱导效率为目的，研究了进行了向胰岛细胞的分化诱导的细胞聚集体中的c-肽阳性的胰腺β细胞。将结果示于图13。在图13中，nkx6.1为内分泌细胞标记物、c-肽为β细胞标记物。根据图13，即使在使用传代扩增培养6次的胰腺祖细胞的情况下，也以与没有扩增的胰腺祖细胞以同程度的比率分化成c-肽/nkx6.1阳性的β细胞。

对进行了向胰岛细胞的分化诱导的细胞聚集体进行糖负荷试验。即，将聚集体在包含2.5mm、22.5mm、2.5mm、22.5mm葡萄糖的krebsringer凝胶液中各浸渍30分钟，将分泌到krebsringer凝胶液中的c-肽利用elisa(enzyme-linkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附试验)法定量。将结果表示于图14。由图14可知，从胰腺祖细胞成熟的细胞根据葡萄糖浓度而c-肽的分泌量发生变化。作为结果，表明扩增的胰腺祖细胞能够分化诱导成包含β细胞的胰腺内分泌细胞，具有响应葡萄糖浓度而改变胰岛素分泌量的能力。

图15示出对进行了向胰岛细胞的分化诱导的细胞聚集体进行免疫染色的结果。此外，在图15中，胰高血糖素为α细胞标记物，生长抑素为δ细胞标记物，胰岛素为β细胞标记物。由图15可知，在分化诱导成胰岛细胞的细胞聚集体中还包含胰高血糖素阳性的α细胞、生长抑素阳性的δ细胞。

[胰腺祖细胞的冻结保存]

·冻结

与上述的[胰腺祖细胞的扩增]同样传代5次后，使胰腺祖细胞分散成单一细胞。使用市售的冻结保存液(cellbanker2(日本全药工业株式会社)或stemcellbanker(日本全药工业株式会社))或在用于增殖的培养液中添加了10％二甲基亚砜的溶液中，利用缓慢冻结法将细胞冻结。具体而言，在500μl的冻结保存液中悬浮5×10⁵细胞，注入冻存管中。在冻结处理容器(bicell,nihonfreezerco.,ltd.)中放入样品瓶，在-80℃保存一晚。长期保存时，将冻存管转移到液氮罐中保存。

·解冻方法

将在-80℃保存1天、在液氮的保存罐保存6小时的冻存管用37℃的水浴加温，急速解冻。将解冻了的细胞悬浊液添加到10ml的培养液(mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％无脂肪bsa+1/200its添加剂+2mmglutamax+20mmd-葡萄糖)中。通过离心分离除去上清液后，将细胞悬浮于包含10μm的y-27632的培养基(mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％无脂肪bsa+1/200its添加剂+2mmglutamax+20mmd-葡萄糖+50ng/mlegf+200ng/mlr-脊椎蛋白1+0.25μmsant-1+0.2μmldn193189+0.1μm视黄酸+10μmy-27632)，在其中添加台盼蓝染色液，算出解冻后的细胞生存率。

将结果表示于图16中。此外，在图16中，cb2表示使用cellbanker2作为冻结保存液的结果，scb表示使用stemcellbanker作为冻结保存液的结果，dmso表示使用培养基+10％dmso(自制冻结保存液)作为冻结保存液的结果。根据图16，在使用任一种冻结保存液的情况下，均为70-80％的生存率。

另外，图17示出了将解冻后的细胞与上述的[胰腺祖细胞的扩增]同样，利用三维培养每6天进行传代时的细胞数的变化。图17为利用cellbanker2进行了冻结保存的细胞的结果。由图17所示的结果可知，进行了冻结保存的细胞具有与没有冻结保存的细胞同程度的增殖能力。

[向源自其他ips细胞株的胰腺祖细胞的分化诱导]

作为源自人的ips细胞使用了454e2株(从rikencellbank获得)、rpchips771-2株(株式会社reprocell)、和p11025株(takarabio株式会社)。

454e2株使用包覆有geltrex(thermofisherscientific)的培养容器以e8培养基(thermofisherscientific)培养3～4天。在70～80％汇合的状态下，使用tryple(thermofisherscientific)处理，将细胞以单一细胞的状态回收。将细胞悬浮于包含10μm的y-27632(rock抑制剂：和光纯药工业株式会社)的e8培养基，以1.2～1.5×10⁵cells/cm²接种于包覆有geltrex(thermofisherscientific)的培养容器。454e2株通过粘附培养进行向胰腺祖细胞的分化诱导。第4阶段的培养进行3天，除此以外，利用与上述相同的培养液及培养期间进行分化诱导。

771-2株使用包覆有geltrex(thermofisherscientific)的培养容器，用stemfitak02n培养基(味之素株式会社)培养3～4天。使用tryple(thermofisherscientific)处理，将细胞以单一细胞的状态回收后，将细胞悬浮于包含10μm的y-27632(rock抑制剂：和光纯药工业株式会社)的stemfitak02培养基(味之素株式会社)中，以1.2～1.5×10⁵细胞/cm²接种在包覆有geltrex(thermofisherscientific)的培养容器中。771-2株利用粘附培养进行向胰腺祖细胞的分化诱导。第4阶段的培养进行3天，除此以外，利用与上述相同的培养液及培养期间进行分化诱导。

p11025株用def-csculturesystem(takarabio株式会社)培养3～4天。使用tryple(thermofisherscientific)处理，将细胞以单一细胞的状态回收后，将细胞悬浮于包含10μm的y-27632(rock抑制剂：和光纯药工业株式会社)的def-cs培养基(takarabio株式会社)中，以1.2～1.5×10⁵cells/cm²接种于包覆有def-cscoat(takarabio株式会社)的培养容器中。p11025株利用粘附培养进行向胰腺祖细胞的分化诱导。第4阶段的培养进行3天，除此以外，以与上述相同的培养液及培养期间进行分化诱导。

[源自其他ips细胞株的胰腺祖细胞的扩增]

将上述得到的胰腺祖细胞与253g1株同样地使用细胞分散用酶液tryple(thermofisherscientific)分散成单一细胞。将细胞悬浮于包含10μm的y-27632(rock抑制剂：和光纯药工业株式会社)的下述培养基中，以1000细胞/孔接种于(1000×256＝2.56×10⁵/板)设置在12孔板的孔上的256孔的琼脂糖微孔板中。静置10分钟使细胞沉底后，从琼脂糖微孔板的周围添加下述培养基，逐个将板浸渍在培养基中。然后，在37℃、5％co2的条件下培养4天。培养基更换每隔一天进行。此外，也进行了代替包含4种因子(egf+rspd1+fgf-7+chir99021)的培养基而使用包含3种因子(egf+rspd1+chir99021或egf+rspd1+fgf-7)或2种因子(fgf-7+chir99021)的培养基的培养。

mcdb131+1.5g/lnahco3+0.5％无脂肪bsa+1/200its添加剂+2mmglutamax+20mmd-葡萄糖+50ng/ml上皮生长因子(egf,和光纯药工业株式会社)+200ng/mlr-脊椎蛋白1(rspd1,r&dsystems)+0.25μmsant-1(和光纯药工业株式会社)+0.2μmldn193189(和光纯药工业株式会社)+0.1μm视黄酸(sigma-aldrich)+4.5μmchir99021(tocrisbioscience)+50ng/ml成纤维细胞生长因子7(fgf-7,peprotech)

将结果示于图18-21。图18示出了添加4种因子(egf+rspd1+fgf-7+chir99021)时的源自771-2株的胰腺祖细胞的细胞数变化(培养8天)。源自771-2株的胰腺祖细胞通过添加4种因子，与4天的培养相比，胰腺祖细胞增殖至约2倍。另外，根据图19，在3种细胞株中，添加4种因子时70％左右的细胞为胰腺细胞标记物pdx1和细胞分裂标记物ki67为阳性。图20-21示出了添加2～4种因子时的结果。由该结果可知，添加3种因子(egf+rspd1+chir99021或egf+rspd1+fgf-7)及2种因子(fgf-7+chir99021)时，细胞增殖至2倍左右，且50％以上的比例为pdx1及ki67阳性，能够实现胰腺祖细胞的增殖。

将源自p11025株的胰腺祖细胞利用添加了4种因子(egf+rspd1+fgf-7+chir99021)的增殖培养基传代2次后，进行向内分泌细胞的成熟。成熟培养的方法与源自253g1株的胰腺祖细胞的情况相同。对于经分化诱导的细胞进行了免疫染色，结果在进行了向胰岛细胞的分化诱导的细胞聚集体中还包含胰岛素(insulin)阳性的β细胞、胰高血糖素(glucagon)阳性的α细胞、生长抑素(somatostatin)阳性的δ细胞。

本说明书中引用的全部刊行物、专利和专利申请直接作为参考并入本说明书中。