用于提高靶mRNA的蛋白质表达水平的融合蛋白的制作方法

本发明涉及用于提高靶mrna的蛋白质表达水平的融合蛋白。

背景技术：

近年来建立并使用了通过多种分析显示的结合核酸的蛋白质因子与目的序列结合的技术。使用这种序列特异性结合在一定程度上能够除去靶dna序列或能够调节(激活或失活)靶dna序列下游存在的编码蛋白质的基因的表达。

虽然已知锌指核酸酶(zfn)、tal效应核酸酶(taleffectornuclease，talen)、crispr-cas9等作为使用作用于dna的蛋白质因子的技术，但使用特异性作用于rna的蛋白质因子的技术的开发仍然是有限的。

本发明人已经提出了利用ppr蛋白(具有一个或更多个五肽重复区(pentatricopeptiderepeat，ppr)基序的蛋白质)的特性设计可以特异性结合靶rna序列的蛋白质的方法，所述ppr蛋白是主要存在于植物中的蛋白质(专利文献1)。

[引用列表]

[专利文献]

[专利文献1]

wo2013/058404

[

技术实现要素：
]

[技术问题]

在根据专利文献1的公开内容中，鉴定了当ppr基序表现出rna结合特性时起作用的氨基酸，并且显示了ppr基序的结构与靶碱基之间的关系，从而能够构建具有一个或更多个ppr基序并且可以与具有任何序列和长度的rna结合的蛋白质。然而，尚未发现使用根据专利文献1的技术实际调节靶rna的方法。

[问题的解决方案]

作为对使用ppr蛋白提高靶mrna的蛋白质表达水平的方法的广泛研究的结果，本发明人发现预定功能结构域和ppr蛋白的融合蛋白提高了靶mrna的蛋白质表达水平，并已经完成了本发明。

具体地，本发明的一个实施方案涉及用于提高靶mrna的蛋白质表达水平的融合蛋白，所述融合蛋白包含：

(a)一种或更多种提高mrna的蛋白质表达水平的功能结构域；和

(b)可以以rna碱基选择性或rna碱基序列特异性方式与靶mrna结合的多肽部分，

其中多肽部分(b)是包含一个或更多个ppr基序的多肽部分，每个ppr基序包含长度上由30至38个氨基酸组成并且由式1表示的多肽：

[式1]

(螺旋a)-x-(螺旋b)-l(式1)

其中

螺旋a是长度上由12个氨基酸组成并且可以形成α-螺旋结构的部分，并且由式2表示：

[式2]

a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-a10-a11-a12(式2)

其中a1至a12各自独立地表示氨基酸；

x不存在，或者是长度上由1至9个氨基酸组成的部分；

螺旋b是长度上由11至13个氨基酸组成并且可以形成α-螺旋结构的部分；

l是长度上由2至7个氨基酸组成并且由式3表示的部分：

[式3]

lvli-lvi-lv-liv-liii-lii-li(式3)

其中所述氨基酸从c端起编号为“i”(-1)、“ii”(-2)、……并且liii至lvii可以不存在，并且

三个氨基酸a1、a4和lii的组合或两个氨基酸a4和lii的组合对应于所述靶mrna的碱基或碱基序列。

在根据本发明的一个实施方案中，多肽部分(b)包含2至30个ppr基序，并且多个ppr基序被布置成特异性结合靶mrna的碱基序列。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，多肽部分(b)包含5至25个ppr基序。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，一个或更多个功能结构域(a)各自结合至多肽部分(b)的n端侧和/或c端侧。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，一个或更多个功能结构域(a)选自将核糖体引导至所述mrna的结构域、与所述mrna的翻译的起始或促进相关的结构域、与所述mrna的核输出相关的结构域、与和内质网膜的结合相关的结构域、包含内质网驻留信号(er驻留信号)序列的结构域和包含内质网信号序列的结构域。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，所述将核糖体引导至所述mrna的结构域是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：denr(density-regulatedprotein，密度调节蛋白)、mct-1(malignantt-cellamplifiedsequence1，恶性t细胞扩增序列1)、tpt1(translationally-controlledtumorprotein，翻译控制的肿瘤蛋白)和lerepo4(zincfingerccch-domain，锌指ccch结构域)，

所述与所述mrna的翻译的起始或促进相关的结构域是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：eif4e和eif4g，

所述与所述mrna的核输出相关的结构域是包含slbp(stem-loopbindingprotein，茎-环结合蛋白)的全部或功能性部分的结构域，

所述与和内质网膜的结合相关的结构域是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：sec61b、trap-α(transloconassociatedproteinalpha，易位子相关蛋白α)、sr-α、dial(cytochromeb5reductase3，细胞色素b5还原酶3)和p180，

所述内质网驻留信号(er驻留信号)序列是包含kdel(keel)序列的信号序列，或者

所述内质网信号序列是包含mgwsciilflvatatgahs(seqidno：22)的信号序列。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，每个所述ppr基序中所述三个氨基酸a1、a4和lii的组合是：

如果所述ppr基序的靶碱基是a(腺嘌呤)，则按照(a1，a4，lii)的顺序为(缬氨酸，苏氨酸，天冬酰胺)、(苯丙氨酸，丝氨酸，天冬酰胺)、(苯丙氨酸，苏氨酸，天冬酰胺)、(异亮氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸)或(苏氨酸，苏氨酸，天冬酰胺)；

如果所述ppr基序的靶碱基是g(鸟嘌呤)，则按照(a1，a4，lii)的顺序为(谷氨酸，甘氨酸，天冬氨酸)、(缬氨酸，苏氨酸，天冬氨酸)、(赖氨酸，苏氨酸，天冬氨酸)或(亮氨酸，苏氨酸，天冬氨酸)；

如果所述ppr基序的靶碱基是u(尿嘧啶)，则按照(a1，a4，lii)的顺序为(缬氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸)、(异亮氨酸，天冬酰胺，天冬酰胺)、(异亮氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸)、(异亮氨酸，甲硫氨酸，天冬氨酸)、(苯丙氨酸，脯氨酸，天冬氨酸)或(酪氨酸，脯氨酸，天冬氨酸)；或者

如果所述ppr基序的靶碱基是c(胞嘧啶)，则按照(a1，a4，lii)的顺序为(缬氨酸，天冬酰胺，天冬酰胺)、(异亮氨酸，天冬酰胺，天冬酰胺)、(缬氨酸，天冬酰胺，丝氨酸)或(异亮氨酸，甲硫氨酸，天冬氨酸)。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，每个所述ppr基序中所述两个氨基酸a4和lii的组合是：

如果所述ppr基序的靶碱基是a(腺嘌呤)，则按照(a4，lii)的顺序为(苏氨酸，天冬酰胺)、(丝氨酸，天冬酰胺)或(甘氨酸，天冬酰胺)；

如果所述ppr基序的靶碱基是g(鸟嘌呤)，则按照(a4，lii)的顺序为(苏氨酸，天冬氨酸)或(甘氨酸，天冬氨酸)；

如果所述ppr基序的靶碱基是u(尿嘧啶)，则按照(a4，lii)的顺序为(天冬酰胺，天冬氨酸)、(脯氨酸，天冬氨酸)、(甲硫氨酸，天冬氨酸)或(缬氨酸，苏氨酸)；或者

如果所述ppr基序的靶碱基是c(胞嘧啶)，则按照(a4，lii)的顺序为(天冬酰胺，天冬酰胺)、(天冬酰胺，丝氨酸)或(亮氨酸，天冬氨酸)。

根据本发明的另一个实施方案涉及编码根据本发明的融合蛋白的核酸。

根据本发明的另一个实施方案涉及包含根据本发明的核酸的载体(优选表达载体)。

根据本发明的另一个实施方案涉及提高细胞内靶mrna的蛋白质表达水平的方法，所述方法包括：

提供根据本发明的融合蛋白或根据本发明的载体的步骤；以及

将所述融合蛋白或载体引入细胞中的步骤。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，细胞是真核细胞。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，细胞是动物细胞。

此外，在根据本发明的一个实施方案中，动物细胞是人细胞。

具有上述本发明的一个或更多个特征的任意组合的发明也包括在本发明的范围内。

[附图简述]

[图1]图1示出了实施例中使用的效应质粒和报告质粒的示意图，以及实验概要的示意图。图1a示出了实施例中使用的效应质粒和报告质粒的示意图。从效应质粒中表达了ppr基序和eif4g的融合蛋白。在实施例中，使用靶序列被很好地研究的crr4蛋白。从报告质粒中，海肾萤光素酶(renillaluciferase，rluc)和萤火虫萤光素酶(fireflyluciferase，fluc)以双顺反子mrna的形式转录。将ppr结合序列(此处为crr4结合序列)插入到fluc5’端的位点中。图1b示出了实施例的实验概要的示意图。无论ppr结合序列存在与否，rluc以相似的水平翻译。因此，rluc的活性值可以视为该报告系统中转染的对照。只有当ppr-eif4g结合ppr结合序列并且翻译因子可以被eif4g的作用吸引时，才开始fluc的翻译。相反，如果不存在ppr结合序列，则fluc的翻译保持在低水平，因此ppr-eif4g不能结合ppr结合序列。

[图2]图2示出了使用hek293t细胞的报告测定的实验程序。

[图3]图3示出了实施例1的实验结果。序列特异性翻译的激活取决于crr4-eif4g和ppr结合序列。该实验使用效应质粒和报告载体进行，该效应质粒中插入了crr4-flag(无翻译激活因子，白色)或crr4-eif4g(有翻译激活因子，灰色)，该报告载体具有或不具有插入的ppr结合序列。从结果可以证实，在ppr-eif4g和ppr结合序列二者的存在下，特异性翻译活性提高了2.75倍。该值代表平均值和标准偏差(n＝3)。

[图4]图4示出了实施例2中的实验的概要。

[图5]图5示出了实施例2中的实验结果以及结构域的功能。

[图6]图6示出了实施例2中的实验结果以及结构域的功能。

[实施方案描述]

[ppr基序和ppr蛋白]

除非另有说明，否则本发明中使用的术语“ppr基序”表示由30至38个氨基酸构成并且具有等于或小于预定值的e值的氨基酸序列(理想地为e-03)的多肽，在网上用蛋白质结构域搜索程序分析氨基酸序列时，在pfam以pf01535和在prosite以ps51375获得e值。形成本发明中定义的ppr基序的氨基酸的位置编号基本上如pf01535所定义，而其对应于通过从ps51375中的氨基酸位置减去2获得的编号(例如，本发明中的位置1对应于ps51375中的位置3)。注意，术语第“ii”(-2)个氨基酸是指从形成一个ppr基序的氨基酸的尾端(c端侧)起第二个氨基酸，或靠近n端距离下一个ppr基序的第一个氨基酸两个氨基酸的氨基酸(即，-2个氨基酸)。如果未明确鉴定下一个ppr基序，则距离下一螺旋结构第一个氨基酸两个氨基酸的正向氨基酸被限定为“ii”。关于pfam参见http：//pfam.sanger.ac.uk/；关于prosite参见http：//www.expasy.org/prosite/。

尽管ppr基序的保守氨基酸序列在氨基酸水平上具有低保守特性，但是在二级结构上两个α-螺旋很好地保守。尽管典型的ppr基序由35个氨基酸构成，但其长度可在30至38个氨基酸变化。

更具体地，本发明中使用的术语ppr基序由长度为30至38个氨基酸并且由式1表示的多肽构成：

[式4]

(螺旋a)-x-(螺旋b)-l(式1)

其中

螺旋a是长度上由12个氨基酸组成并且可以形成α-螺旋结构的部分，并且由式2表示：

[式5]

a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8-a9-a10-a11-a12(式2)

其中a1至a12各自独立地表示氨基酸；

x不存在，或者是长度上由1至9个氨基酸组成的部分；

螺旋b是长度上由11至13个氨基酸组成并且可以形成α-螺旋结构的部分；并且

l是长度上由2至7个氨基酸组成并且由式3表示的部分：

[式6]

lvli-lvi-lv-liv-liii-lii-li(式3)

其中所述氨基酸从c端起编号为“i”(-1)、“ii”(-2)、……并且liii至lvii可以不存在。

除非另有说明，否则本发明中使用的术语“ppr蛋白”表示包含一个或更多个上述ppr基序，优选两个或更多个上述ppr基序的ppr蛋白。除非另有说明，否则本文使用的术语“蛋白质”通常表示由多肽(通过肽键结合的几个氨基酸的链)组成的物质，还包括由相对低分子量的多肽组成的物质。本发明中使用的术语“氨基酸”可以表示通常的氨基酸分子，或者在某些情况下可以表示形成肽链的氨基酸残基。本领域技术人员从上下文清楚地理解该术语表示的情况。

除非另有说明，否则本发明中关于ppr基序与rna碱基的结合特性的“选择性”表示ppr基序与rna碱基之一的结合活性高于其与其它碱基的结合活性。本领域技术人员可以针对该选择性计划实验并对其进行验证，并且还可以通过计算确定。

除非另有说明，否则本发明中使用的术语“rna碱基”表示形成rna的核糖核苷酸的碱基，特别是腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)或尿嘧啶(u)。注意到尽管ppr蛋白可以对rna中的碱基具有选择性，但它不与核酸单体结合。

ppr蛋白存在于许多植物中，并且在拟南芥(arabidopsisthaliana)中可以发现500种蛋白质，约5000种基序。具有多种氨基酸序列的ppr基序和ppr蛋白也存在于许多陆地植物中，例如稻属(oryza)、杨属(populus)和卷柏(selaginellatamariscina)。在本发明中，可以使用自然界中存在的ppr基序和ppr蛋白，或者可以使用例如基于wo2013/058404中公开的方法设计的ppr基序和ppr蛋白。具体地，可以基于wo2013/058404中公开的以下信息设计所需的ppr基序和ppr蛋白。

(i)关于选择性结合所必需的氨基酸位置的信息

三个氨基酸，即ppr基序的第1个、第4个和第“ii”(-1)个氨基酸的组合(a1，a4，lii)，或者两个氨基酸，即第4个和第“ii”(-1)个氨基酸的组合(a4，lii)对于选择性结合rna碱基是必需的，并且可以通过这些组合确定用于结合的靶rna碱基。

本发明可以使用wo2013/058404中公开的关于三个氨基酸a1、a4和lii的组合和/或两个氨基酸a4和lii的组合的发现。

(ii)关于三个氨基酸a1、a4和lii的组合与rna碱基的对应关系的信息

(3-1)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照缬氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与u的结合最强，并且与c的结合第二强，随后是与a或g的结合。

(3-2)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照缬氨酸、苏氨酸和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与a的结合最强，并且与g的结合第二强，随后是与c的结合而不与u结合。

(3-3)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照缬氨酸、天冬酰胺和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与c的结合最强，并且与a或u的结合第二强，不与g结合。

(3-4)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与g的结合强，不与a、u或c结合。

(3-5)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照异亮氨酸、天冬酰胺和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与c的结合最强，并且与u的结合第二强，随后是与a的结合，而不与g结合。

(3-6)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照缬氨酸、苏氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与g的结合最强，并且与u的结合第二强，不与a或c结合。

(3-7)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照赖氨酸、苏氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与g的结合最强，并且与a的结合第二强，不与u或c结合。

(3-8)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照苯丙氨酸、丝氨酸和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与a的结合最强，并且与c的结合第二强，随后是与g和u的结合。

(3-9)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照缬氨酸、天冬酰胺和丝氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与c的结合最强，并且与u的结合第二强，不与a或g结合。

(3-10)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照苯丙氨酸、苏氨酸和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与a的结合强，不与g、u或c结合。

(3-11)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照异亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与u的结合最强，并且与a的结合第二强，不与g或c结合。

(3-12)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照苏氨酸、苏氨酸和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与a的结合强，不与g、u或c结合。

(3-13)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照异亮氨酸、甲硫氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与u的结合最强，并且与c的结合第二强，不与a或g结合。

(3-14)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照苯丙氨酸、脯氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与u的结合最强，并且与c的结合第二强，不与a或g结合。

(3-15)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照酪氨酸、脯氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与u的结合强，不与a、g或c结合。

(3-16)如果三个氨基酸a1、a4和lii的组合按照亮氨酸、苏氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与g的结合强，不与a、u或c结合。

(ii)关于两个氨基酸a4和lii的组合与rna碱基的对应关系的信息(2-1)如果a4和lii按照天冬酰胺和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与u的结合最强，并且与c的结合第二强，随后是与a和g的结合。

(2-2)如果a4和lii按照天冬酰胺和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与c的结合最强，与u的结合第二强，随后是与a和g的结合。

(2-3)如果a4和lii按照苏氨酸和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有选择性rna碱基结合能力，其中与a的结合强，与g、u和c的结合弱。

(2-4)如果a4和lii按照苏氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有选择性rna碱基结合能力，其中与g结合强，与a、u和c的结合弱。

(2-5)如果a4和lii按照丝氨酸和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与a的结合最强，与g、u和c的结合第二强。

(2-6)如果a4和lii按照甘氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与g的结合最强，并且与u的结合第二强，随后是与a的结合，不与c结合。

(2-7)如果a4和lii按照天冬酰胺和丝氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与c的结合最强，并且与u的结合第二强，随后是与a和g的结合。

(2-8)如果a4和lii按照脯氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与u的结合最强，并且与g、c和c的结合是第二强，不与a结合。

(2-9)如果a4和lii按照甘氨酸和天冬酰胺的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与a的结合最强，并且与g的结合第二强，不与c或u结合。

(2-10)如果a4和lii按照甲硫氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有选择性rna碱基结合能力，其中与u的结合强，与a、g和c的结合弱。

(2-11)如果a4和lii按照亮氨酸和天冬氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与c的结合最强，并且与u的结合第二强，不与a或g结合。

(2-12)如果a4和lii按照缬氨酸和苏氨酸的顺序，则ppr基序具有如下选择性rna碱基结合能力：与u的结合最强，并且与a的结合第二强，不与g或c结合。

[ppr基序和ppr蛋白的用途]

鉴定和设计：

一个ppr基序可以识别rna的特定碱基。根据本发明，可以通过在ppr基序的特定位置中布置适当的氨基酸来选择或设计对a、u、g或c具有选择性的ppr基序。此外，含有适当系列的这种ppr基序的蛋白质可以识别其对应的特定序列。此外，根据上述发现，可以设计可选择性结合所需rna碱基的ppr基序和具有多个可以序列特异性结合所需rna的ppr基序的蛋白质。在设计中，天然存在的ppr基序的序列信息可以参考除了布置在ppr基序的重要位置中的氨基酸之外的部分。或者，可以通过使用天然存在的ppr基序作为整体并且用其他氨基酸替换仅重要位置中的氨基酸来设计ppr基序。ppr基序的重复数可以根据靶序列适当确定；例如，重复数可以是2或更多，或2至30。

如此设计的ppr基序或ppr蛋白可以通过本领域技术人员公知的方法制备。例如，编码设计的ppr基序或ppr蛋白的氨基酸序列的核酸序列可以从氨基酸序列中确定，并且可以被克隆以制备产生所需ppr基序或ppr蛋白的转化体(例如表达载体)。

融合蛋白的制备和用途：

本发明涉及上述ppr基序或ppr蛋白(即，可以rna碱基选择性地或rna碱基序列特异性地结合靶mrna的多肽)与一个或更多个提高mrna的蛋白质表达水平的功能结构域的融合蛋白。

可用于本发明的“提高mrna的蛋白质表达水平的功能结构域”可以是例如直接或间接促进mrna翻译的已知蛋白质的功能结构域的全部或功能性部分。更具体地，可用于本发明的功能结构域可以是例如将核糖体引导至mrna的结构域、与mrna的翻译的起始或促进相关的结构域、与mrna的核输出相关的结构域、与和内质网膜的结合相关的结构域、包含内质网驻留信号(er驻留信号)序列的结构域或包含内质网信号序列的结构域。

更具体地，将所述核糖体引导至所述mrna的结构域可以是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：denr(密度调节蛋白)、mct-1(恶性t细胞扩增序列1)、tpt1(翻译控制的肿瘤蛋白)和lerep04(锌指ccch结构域)。所述与所述mrna的翻译的起始或促进相关的结构域可以是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：eif4e和eif4g。所述与所述mrna的核输出相关的结构域可以是包含slbp(茎-环结合蛋白)的全部或功能性部分的结构域。所述与和内质网膜的结合相关的结构域可以是包含选自以下的多肽的全部或功能性部分的结构域：sec61b、trap-α(易位子相关蛋白α)、sr-α、dial(细胞色素b5还原酶3)和p180。所述内质网驻留信号(er驻留信号)序列可以是包含kdel(keel)序列的信号序列。所述内质网信号序列可以是包含mgwsciilflvatatgahs(seqidno：22)的信号序列。

在根据本发明的融合蛋白中，功能结构域可以与ppr蛋白的n端侧融合，可以与ppr蛋白的c端侧融合，或者可以与其n端侧和c端侧二者融合。此外，根据本发明的融合蛋白可以包含数个功能结构域(例如，2至5个功能结构域)。此外，在根据本发明的融合蛋白中，功能结构域和ppr蛋白可以通过例如接头间接融合。

本发明还涉及编码上述融合蛋白的核酸，以及包含该核酸的载体(例如表达载体)。本文的表达载体是指，例如，按照从上游起的顺序包含具有启动子序列的dna、编码所需蛋白质的dna和具有终止子序列的dna的载体。表达载体可以不按此顺序具有这些dna，只要其表现出所需的功能即可。本领域技术人员通常可以使用的多种表达载体可用于本发明。

因为根据本发明的融合蛋白使用真核生物的rna翻译机制，其可以在真核生物(例如动物、植物、微生物(例如酵母)和原生生物)的细胞中起作用。根据本发明的融合蛋白尤其可以在动物细胞(体外或体内)内起作用。可以引入根据本发明的融合蛋白或表达根据本发明的融合蛋白的载体的动物细胞的实例可以包括来源于人、猴、猪、牛、马、狗、猫、小鼠和大鼠的细胞。可以引入根据本发明的融合蛋白或表达根据本发明的融合蛋白的载体的培养细胞的实例可以包括但不限于中国仓鼠卵巢(cho)细胞、cos-1细胞、cos-7细胞、vero(atccccl-81)细胞、bhk细胞、狗肾来源mdck细胞、仓鼠av-12-664细胞、hela细胞、wi38细胞、293细胞、293t细胞和per.c6细胞。

本文使用的术语(不包括那些特别定义的术语)用于说明具体实施方案，而并不旨在限制本发明。

除非上下文明确要求不同的理解，否则本文使用的术语“包括/包含”旨在表示存在所描述的条目(例如成员、步骤、组件或数字)，并且不旨在排除存在其他条目(例如成员、步骤、组件或数字)。

除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域技术人员广泛理解的含义相同的含义。除非另有明确定义，否则本文使用的术语应被解释为具有与本文及其相关技术领域的含义一致的含义，并且不应被理解为理想化或过度正式的含义。

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，本发明可以用多个方面实施，并且不应该被解释为限制于下面描述的实施例。

[实施例]

实施例1：通过ppr基序与eif4g的融合蛋白提高靶mrna的蛋白质表达水平

材料

(设备)

-用于分子生物学实验(例如用于构建质粒)的基本设施

-倒置显微镜(dmils40，leicamicrosystems，wetzlar，germany)

-co2培养箱(km-cc17rh2，panasonichealthcare，tokyo，japan)

-洁净工作台(mhe-s1300a2，panasonichealthcare，tokyo，japan)

-抽吸器(sp-30，airliquidemedicalsystems，bovezzobs，italy)

-离心机(水平转子)(lc-200，tomyseiko，tokyo，japan)

-超低温冷冻器(-80℃)(mdf-c8v，panasonichealthcare，tokyo，japan)

-读板器(ensightkaleido，perkinelmer，waltham，ma，usa)(细胞培养)

-hek293t细胞系(见注释1)

-dulbecco改良的eagle培养基(dmem，富含葡萄糖)(见注释2)

-100×青霉素-链霉素溶液

-胎牛血清(fbs)(见注释3)

-edta-nacl溶液：10mmedta和0.85％(w/v)nacl，ph调节至7.2至7.4，高压灭菌，室温下储存

-100×20mm细胞培养培养皿(greinerbioone，frickenhausen，germany)

-10ml一次性灭菌移液器

-15ml和50ml塑料离心管

-1.8ml冷冻管(nunc；thermofisherscientific，waltham，ma，usa)

-冷冻容器(nalgene；thermofisherscientific，waltham，ma，usa)

-bambanker(lymphotec，tokyo，japan)

(转染)

-效应质粒：使用pcdna3.1(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)作为基本载体。将ppr和eif4g的融合基因插入到表达盒中(100ng/μl)(参见注释4)。

-报告质粒：使用pcdna3.1(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)作为基本载体。将萤光素酶基因插入表达盒中，并将ppr结合序列插入其5’-utr中(100ng/μl)。

-包被有聚-l-赖氨酸的96孔板(agctechnoglass，shizuoka，japan)

-1×磷酸盐缓冲盐水，pbs(-)：1.47mmkh2po4，8.1mmna2hpo4，137mmnacl和2.7mmkcl。将ph调节至7.4，高压灭菌，在室温下储存

-血细胞计数器(用于对细胞数进行计数)(改进的neubauer型细胞计数器板，watson，hyogo，japan)

-转染试剂(hilymax，dojindomoleculartechnologies，kumamoto，japan)

(萤光素酶测定)

-dual-glo萤光素酶测定系统(promega，madison，wi，usa.)

-96孔光度计板(perkinelmer，waltham，ma，usa)。

实验方法

(载体的构建)

报告测定需要效应质粒和报告质粒。这两种质粒均基于pcdna3.1构建。效应质粒包含编码ppr蛋白和人eif4g的部分结构域(seqidno：1)的融合基因(图1a)。使用的ppr蛋白部分是crr4(seqidno：2)。报告质粒包含两个开放阅读框(orf)，具体是海肾萤光素酶(rluc)和萤火虫萤光素酶(fluc)，它们被双顺反子转录(图1a)。rluc基因位于fluc基因的5’端侧，并且作为基因表达的对照使用。ppr结合区插入到fluc的orf的5’-utr中，并且其由用四碱基序列(atcg和gatc)中断的crr4识别序列(5’-uaucuugucuuua-3’)(seqidno：3)的三个重复组成。为了表达融合的效应基因和报告基因二者，使用巨细胞病毒启动子(cmv)和牛生长激素基因来源多腺苷酸化信号。对于对照实验，通过将flag表位标签与ppr融合来构建不具有eif4g的效应质粒。还构建了没有ppr结合区的对照报告质粒。

实施例中从细胞培养到报告测定的程序概述如图2所示。

(冷冻原种的细胞培养)

该步骤无菌地执行。所有工具都用70％乙醇初步杀菌。

1.将9mldmem培养基置于15ml离心管中(已灭菌)。

2.将冷冻管中的1ml冷冻hek293t细胞在37℃的水浴中孵育以快速融化细胞。

3.将细胞置于含有9mldmem的15ml离心管中。

4.将离心管在室温和1100×g下离心2分钟，除去上清液。

5.将细胞在10mldmem(添加fbs以使得最终浓度为10％)中重悬。

6.将悬浮细胞转移到100mm培养皿中。将培养皿置于37℃和5％co2条件下的培养箱中。如果从冷冻原种开始培养，则在24小时后将培养细胞进行传代培养。

为了使细胞保持健康(见注释5)，培养皿表面上的细胞密度保持在10％至80％。传代基本上每三天进行一次(每周两次)，或者根据细胞的生长速率进行。此外，为了保持少的传代次数，每月一次从冷冻原种中新鲜培养细胞。保持少的传代次数并由此使细胞保持健康对有效的dna转染是重要的。

(传代以维持细胞)

1.根据需要提供新的100mm培养皿。将8mldmem和1mlfbs预先置于每个培养皿上。

2.用抽吸器除去含有培养细胞的培养皿上的培养基(见注释6)。

3.将2mledta-nacl溶液温和地添加到培养皿表面上的贴壁细胞上，以免剥离细胞。转动培养皿以使溶液均匀分布在培养皿的整个表面。用抽吸器除去edta-nacl溶液。轻拍培养皿以剥离细胞。

4.将10mldmem添加到培养皿中的细胞，通过轻轻吹吸将细胞悬浮。

5.将1ml悬浮细胞(10％培养细胞)添加到预先提供的培养皿，每个培养皿含有9ml培养基。转动每个培养皿以使细胞分布在其整个表面。

(冷冻储存细胞)

用bambanker试剂和处于对数生长期的细胞密度达50％的培养细胞制备冷冻原液。bambanker的使用提供了高回收率并有助于长期储存。

1.根据传代程序，自传代后第二天的细胞被剥离。添加5ml至10mldmem，并将细胞在50ml离心管中回收。

2.将离心管在室温和1100×g下离心2分钟，除去上清液。

3.每个培养皿添加1mlbambanker以悬浮细胞。

4.将悬浮细胞快速分配到冷冻管中，并用它们的盖子盖住冷冻管。

5.将冷冻管置于专用冷冻容器中，并置于-80℃下持续12小时(见注释7)。

6.将冷冻管转移到标准样品盒中，并在-80℃下或液氮中储存。

(瞬时基因引入(转染))

1.在开始转染之前，根据需要提供自传代后第二天的各自含有细胞的培养皿，并检查细胞是否健康(正常)(见注释8)。作为估计，可以用一个培养皿进行约96次测定。

2.根据传代程序将自传代后第二天的细胞剥离，将悬浮细胞转移到50ml离心管中。

3.将离心管在室温和1100×g下离心2分钟，除去上清液。

4.将细胞簇在10mldmem(添加fbs以使得最终浓度为10％)中完全分散。

5.用血细胞计数器和倒置显微镜对细胞数进行计数。将细胞悬浮在适量的dmem中(添加fbs以使得最终浓度为10％)，使得细胞数为1×10⁵至2×10⁵个细胞/ml。

6.提供96孔板。将每孔200μl悬浮培养细胞(2×10⁴至4×10⁴个细胞/ml)置于每个孔中，并将板在37℃，5％co2条件下置于培养箱中过夜。一个孔用于一次测定。

7.第二天，小心地从每个孔中取出培养基，并用100μl新dmem(添加fbs以使得最终浓度为10％)替换。

8.将400ng效应质粒(4μl，100ng/μl)和100ng报告质粒(1μl，100ng/μl)置于新的96孔pcr板上的单孔(或0.2毫升管)中。

9.对于一次测定，用10μl无血清dmem稀释1μlhilymax。

10.将11μl稀释的溶液置于含有质粒的每个孔中。通过吹吸使溶液与质粒充分混合。

11.将溶液在室温下放置15分钟。将混合物的总量置于含有培养细胞的孔中。将板在37℃，5％co2条件下置于培养箱中24小时。

(萤光素酶测定)

根据制造商的使用说明，除了一些修改之外，使用dual-glo萤光素酶测定系统进行双萤光素酶测定。

1.转染24小时后，用40μl1×pbs(-)替换每个孔的培养基。

2.将40μldual-glo萤光素酶试剂置于每个孔中，并通过吹吸与培养基充分混合。

3.将混合物在室温下放置10分钟，并将其总量转移到96孔光度计板中。

4.用板读数器测量与fluc基因表达有关的萤火虫萤光素酶的光发射。

5.使用dual-glostop&glo缓冲液将stop&glo底物稀释100倍。每孔中添加40μl稀释溶液。

6.将板在室温下放置至少10分钟，然后测量与rluc基因表达相关的海肾萤光素酶的光发射。

(数据分析)

1.计算fluc/rluc的值以校正测定之间的转染效率差异或实验误差。

2.在ppr结合区存在和其不存在的情况下，通过用使用根据本发明的质粒(编码crr4和翻译激活结构域eif4g的融合蛋白的质粒)获得的实验值除以使用对照质粒(编码crr4和flag标签的融合蛋白的质粒)获得的实验值确定报告基因表达活性的提高。

实验结果

萤光素酶测定的结果示于图3中。如图3所示，在ppr-eif4g和ppr结合序列二者的存在下特异性地验证了2.75倍的翻译活性。即，证明了ppr蛋白与提高mrna的蛋白质表达水平的功能结构域的融合蛋白提高了靶mrna的蛋白质表达水平。

注释

(注释1)hek293t是表达sv40大t抗原的人胎来源肾细胞系。该细胞系易于培养，并且可以通过多种方法高效转染。hek293t细胞可以从rikenbrc(ja.brc.riken.jp)或atcc(www.atcc.org)获得。

(注释2)将1×青霉素-链霉素溶液添加到dmem以避免被微生物污染。

(注释3)使用前，将fbs在56℃下灭活30分钟，并储存在4℃下。

(注释4)质粒的纯度对转染效率非常重要。应使用转染级试剂盒分离质粒。

(注释5)每日生长率是指示细胞健康的指标。为了避免抑制细胞生长，细胞应始终在足够的营养条件下在足够的空间中培养。

(注释6)当更换培养基时，应温和地处理hek293t细胞，因为细胞很容易从培养的培养皿上剥离。

(注释7)专用冷冻容器是可以调节其冷冻速度(在-80℃下每分钟约-1℃)，并且使细胞能够冷冻储存在不可编程的-80℃冰箱中的盒子。

(注释8)在转染中，细胞以50％至80％的培养密度使用。然而，合适的细胞密度取决于转染试剂。此外，转染试剂(μl)与质粒dna(μg)的比也应根据制造商的使用说明进行优化。本文描述的程序针对使用96孔板、hek293t细胞和hilymax作为转染试剂的条件进行了优化。

实施例2：通过ppr与另一个功能结构域的融合蛋白提高靶mrna的蛋白质表达水平

在使用细胞产生有用物质的情况下，应该精确控制由内源基因和外源基因合成的蛋白质的量。合成蛋白质的最终量由基因的插入位置、mrna转录量、转录后调节(在rna水平上的调节)、翻译后修饰等决定。由于这些原因，本发明人利用ppr蛋白序列特异性地结合靶rna分子这一事实设计了增强mrna翻译的方法(图4)。在真核生物中的mrna的翻译中，mrna经历翻译起始因子(真核起始因子；eif)的作用。结果，核糖体在翻译起始点附近募集，然后开始mrna的翻译。换言之，本发明人认为如果核糖体可以只募集到mrna上，则可以人工增强mrna的翻译。此外，通常在er中进行mrna向蛋白质的翻译。因此，本发明人认为通过有意地使靶mrna定位于er中，可以增强mrna的翻译。

通过实验验证

为了验证上述想法，制备了使用动物培养细胞(hek293t)的报告分析系统(除了使用不同的功能结构域之外，通过与实施例1中相同的方法进行实验)。使用已知与特定rna序列(uaucuugucuuua)(seqidno：3)结合的crr4蛋白(拟南芥ppr蛋白之一)构建该系统。首先，制备crr4与候选蛋白质功能结构域的融合蛋白表达载体(效应质粒)。选择的候选结构域是(a)eif蛋白(eif4e和eif4g)，(b)核糖体结合蛋白(denr、mct-1、tpt1和lerepo4)，(c)促进转录mrna从核运输到胞质的组蛋白的翻译调节因子(slbp)，(d)er锚蛋白(sec61b、trap-α、sr-α、dial和p180)，(e)er驻留信号(kdel)和(f)er信号肽。克隆融合蛋白以便以ha-crr4-xx或xx-crr4-ha(ha：表位标签(seqidno：4)；xx：候选结构域)的形式表达。

报告质粒包括表达盒，其中海肾萤光素酶(rluc)和萤火虫萤光素酶(fluc)在cmv启动子的控制下以双顺反子mrna的形式转录。将三个ppr结合序列(uaucuugucuuua)(seqidno：3)插入fluc的5’端的位点中。

将效应质粒和报告质粒转染到hek293t细胞中，测量rluc和fluc的光发射强度。将rluc的光发射强度视为转染对照，并且将fluc的光发射强度/rluc的光发射强度的值视为翻译活性量。

结果

使用以下指数(a)和(b)检查图5和6中所示的结果。

(a)靶标的不存在与存在之间的比较

比较显示了翻译中序列特异性变化的量。

(b)靶标的存在与效应物的不存在(空)(黑色虚线)的比较

比较显示了由添加结构域引起的翻译变化量。

1.eif4e与crr4的c端侧融合。

(a)2.7倍

(b)1.6倍

2.eif4g与crr4的c端侧融合。

(a)4.5倍

(b)3.3倍

3.denr与crr4的n端侧融合。

(a)1.7倍

(b)1.3倍

4.denr与crr4的c端侧融合。

(a)2.4倍

(b)1.7倍

5.mct-1与crr4的n端侧融合。

(a)1.3倍

(b)1.0倍

6.mct-1与crr4的c端侧融合。

(a)2.0倍

(b)1.2倍

7.tpt-1与crr4的n端侧融合。

(a)1.4倍

(b)1.0倍

8.tpt-1与crr4的c端侧融合。

(a)2.4倍

(b)1.9倍

9.lerepo4与crr4的n端侧融合。

(a)3.0倍

(b)1.8倍

10.lerepo4与crr4的c端侧融合。

(a)3.3倍

(b)2.6倍

11.slbp与crr4的c端侧融合。

(a)4.1倍

(b)3.3倍

12.sec61b与crr4的c端侧融合。

(a)1.6倍

(b)1.6倍

13.sec61btm与crr4的c端侧融合。(a)2.4倍

(b)1.9倍

14.trap-α与crr4的c端侧融合。

(a)3.5倍

(b)4.5倍

15.traptm与crr4的c端侧融合。

(a)2.3倍

(b)1.6倍

16.sr-α与crr4的n端侧融合。

(a)1.7倍

(b)1.5倍

17.dialtm与crr4的n端侧融合。

(a)1.8倍

(b)1.2倍

18.p180tm2r与crr4的n端侧融合。

(a)2.1倍

(b)1.5倍

19.p180tmh与crr4的n端侧融合。

(a)2.3倍

(b)2.5倍

20.p180tm2与crr4的n端侧融合。

(a)3.0倍

(b)2.1倍

21.kdel与crr4的c端侧融合。

(a)1.8倍

(b)1.4倍

22.keel与crr4的c端侧融合。

(a)2.3倍

(b)2.1倍

23.信号肽(sp)与crr4的n端侧融合。

(a)1.4倍

(b)2.0倍

如上所示，在指数(a)和靶标(b)二者中的所有功能结构域中发现了翻译的增加。即，清楚地显示根据本发明的融合蛋白可以增强靶mrna的翻译。

实施例中使用的功能结构域的氨基酸序列如下所示：

[表1]

序列表

<110>kyushuuniversity,nationaluniversitycorporation

<120>用于提高靶mrna的蛋白质表达的融合蛋白

<130>edfp1601f

<150>us62/345252

<151>2016-06-03

<150>jp2016-120524

<151>2016-06-17

<160>22

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>993

<212>prt

<213>智人（homosapiens）

<400>1

gluglulyslysargtyraspargglupheleuleuglypheglnphe

151015

ilephealasermetglnlysprogluglyleuprohisileserasp

202530

valvalleuasplysalaasnlysthrproleuargproleuasppro

354045

thrargleuglnglyileasncysglyproaspphethrproserphe

505560

alaasnleuglyargthrthrleuserthrargglyproproarggly

65707580

glyproglyglygluleuproargglyproglnalaglyleuglypro

859095

argargserglnglnglyproarglysgluproarglysileileala

100105110

thrvalleumetthrgluaspilelysleuasnlysalaglulysala

115120125

trplysproserserlysargthralaalaasplysaspargglyglu

130135140

gluaspalaaspglyserlysthrglnaspleupheargargvalarg

145150155160

serileleuasnlysleuthrproglnmetpheglnglnleumetlys

165170175

glnvalthrglnleualaileaspthrglugluargleulysglyval

180185190

ileaspleuilepheglulysalailesergluproasnpheserval

195200205

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210215220

thrglulysprothrvalthrvalasnphearglysleuleuleuasn

225230235240

argcysglnlysglupheglulysasplysaspaspaspgluvalphe

245250255

glulyslysglnlysglumetaspglualaalathralaglugluarg

260265270

glyargleulysglugluleugluglualaargaspilealaargarg

275280285

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290295300

metleuthrglualailemethisaspcysvalvallysleuleulys

305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

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420425430

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435440445

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450455460

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465470475480

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485490495

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500505510

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515520525

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530535540

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545550555560

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565570575

thrlysargserpheserlysgluvalglugluargserarggluarg

580585590

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595600605

argaspargglyargaspalavallysargglualaalaleupropro

610615620

valserproleulysalaalaleusergluglugluleuglulyslys

625630635640

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645650655

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660665670

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675680685

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690695700

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740745750

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770775780

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835840845

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850855860

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865870875880

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885890895

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965970975

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980985990

his

<210>2

<211>561

<212>prt

<213>拟南芥（arabidopsisthaliana）

<400>2

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151015

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202530

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<400>3

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<213>人工序列

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<223>合成肽

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<213>智人

<400>5

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