抗-CD19抗体制剂的制作方法
本公开内容涉及抗-cd19抗体的稳定的冻干药物制剂，并提供该制剂的制造方法和使用方法。
背景技术：
b细胞是在体液免疫应答中发挥重大作用的淋巴细胞。它们在大多数哺乳动物的骨髓中产生，并代表循环淋巴库的5-15％。b细胞的主要功能是针对各种抗原制造抗体，并且是适应性免疫系统必不可少的组分。
由于其在调节免疫系统中的关键作用，b细胞调节异常与许多种疾病相关，例如淋巴瘤和白血病。这些包括非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)和急性成淋巴细胞性白血病(all)。
人cd19分子是在人b细胞表面上表达的结构上独特的细胞表面受体，人b细胞包括但不限于，前-b细胞、早期发育的b细胞(即，幼b细胞)、通过终末分化成浆细胞的成熟b细胞、以及恶性b细胞。cd19由大多数前-b急性成淋巴细胞性白血病(all)、非霍奇金氏淋巴瘤、b细胞慢性淋巴细胞性白血病(cll)、原淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、常见的急性淋巴细胞性白血病和一些零急性(null-acute)成淋巴细胞性白血病表达(nadler等人,j.immunol.,131:244-250(1983)；loken等人,blood,70:1316-1324(1987)；uckun等人,blood,71:13-29(1988)；anderson等人,1984.blood,63:1424-1433(1984)；scheuermann,leuk.lymphoma,18:385-397(1995))。cd19在浆细胞上的表达进一步表明，其可以在分化的b细胞肿瘤上表达，例如，多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、waldenstrom's肿瘤(grossbard等人,br.j.haematol,102:509-15(1998)；treon等人,semin.oncol,30:248-52(2003))。
因此，cd19抗原是治疗非霍奇金氏淋巴瘤(包括本文所述的各个亚型)、慢性淋巴细胞性白血病和/或急性成淋巴细胞性白血病的免疫疗法靶点。
mor208(之前称作xmab5574)是与cd19结合的fc改造的人源化单克隆抗体。由于xmab改造的突变，相对于未经修饰的抗体，mor208fc与fcγr的结合增加，显著提高了体外抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(adcc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)和对于肿瘤的直接的细胞毒性作用(细胞凋亡)。mor208未显示介导补体依赖性细胞毒作用。
mor208已在cll、all和nhl临床试验中加以研究，或者目前正在研究中。具体地，完成了题为
相比于传统的有机或无机药物小分子，治疗性抗体和抗体片段是很大、更加复杂的分子，因为抗体除了复杂的三维结构以外，还具有多种官能团，因此，这些蛋白质的制剂面临特殊的挑战。为使蛋白质保持生物学活性，制剂必须保留至少蛋白质氨基酸核心序列的构象完整性，同时保护蛋白质的多种官能团免于降解。抗体制剂可能储存期(shelflife)短，并且配制的抗体在储存过程中会由于化学和物理上的不稳定性而丧失生物学活性。蛋白质降解的三种最常见途径是蛋白质聚集、脱酰胺作用(deamidation)和氧化作用(cleland等人，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems10(4)：307-377(1993))。具体地，聚集可潜在地导致在患者的免疫应答增加，造成安全性隐患，必须加以最小化或预防。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供抗-cd19抗体制剂，具体地，在于具有适当储存期的抗-cd19抗体制剂。
适当的治疗性抗体制剂能够是水性药物组合物或者能够重构以提供施用于患者的溶液的冻干物(lyophilisate)。
本文提供包括抗体的冻干药物制剂。一方面，该制剂包括抗-cd19抗体、缓冲剂、蔗糖和表面活性剂，其中制剂的ph为约6.0，其中所述抗-cd19抗体包括序列
一方面，本文提供稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗-cd19抗体、缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中该制剂还包括：
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖，或
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇，和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖。
在一些实施方式中，所述抗-cd19抗体包括：包括序列syvmh(seqidno：1)的hcdr1区、包括序列npyndg(seqidno：2)的hcdr2区、包括序列gtyyygtrvfdy(seqidno：3)的hcdr3区、包括序列rsskslqnvngntyly(seqidno：4)的lcdr1区、包括序列rmsnlns(seqidno：5)的lcdr2区、和包括序列mqhleypit(seqidno：6)的lcdr3区。
在一些实施方式中，所述抗-cd19抗体包括：序列syvmh(seqidno：1)的hcdr1区、序列npyndg(seqidno：2)的hcdr2区、序列gtyyygtrvfdy(seqidno：3)的hcdr3区、序列rsskslqnvngntyly(seqidno：4)的lcdr1区、序列rmsnlns(seqidno：5)的lcdr2区、和序列mqhleypit(seqidno：6)的lcdr3区。
在一些实施方式中，所述抗-cd19抗体包括：序列
在一些实施方式中，所述抗-cd19抗体包括：序列
在一些实施方式中，制剂中的抗-cd19抗体的浓度为约20mg/ml至约80mg/ml。在一些实施方式中，制剂中的抗-cd19抗体的浓度为约40mg/ml。
在一些实施方式中，制剂中的所述缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂。
在一些实施方式中，制剂中的所述海藻糖为约200mm。在一些实施方式中，制剂中的所述海藻糖为200mm。
在一些实施方式中，制剂中的所述甘露醇为约219mm，并且制剂中的蔗糖为约29mm。在一些实施方式中，制剂中的所述甘露醇为219mm，并且制剂中的蔗糖为29mm。
在一些实施方式中，制剂的ph为约6.0。在一些实施方式中，制剂的ph为6.0。
在一些实施方式中，制剂中的所述聚山梨醇酯是聚山梨醇酯20。在一些实施方式中，制剂中的所述聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20)为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)。在一些实施方式中，制剂中的所述聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20)为约0.02％(w/v)。在一些实施方式中，制剂中的所述聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20)为0.02％(w/v)。
另一方面，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐、浓度为约200mm的海藻糖、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0。
另一方面，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的柠檬酸盐、浓度为200mm的海藻糖、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为6.0。
另一方面，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐、浓度为约219mm的甘露醇、浓度为约29mm的蔗糖、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯并且，ph值为约6.0。
另一方面，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的柠檬酸盐、浓度为219mm的甘露醇、浓度为29mm的蔗糖、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph值为6.0。
在一些实施方式中，制剂中的所述抗-cd19抗体不经过在先的冻干，即，是液体。在一些实施方式中，制剂中的所述抗-cd19抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，制剂中的所述抗-cd19抗体是全长抗体。在一些实施方式中，制剂中的所述抗-cd19抗体是igg抗体。在一些实施方式中，制剂中的所述抗-cd19抗体是人源化或人抗体。在一些实施方式中，制剂中的所述抗-cd19抗体是包括抗原结合区的抗体片段。在一些实施方式中，抗体片段是fab或f(ab’)2片段。
附图说明
图1：提供了mor208的氨基酸序列。
图2：在40℃下3个月之后mor208的显微镜下才看得到的颗粒(subvisibleparticle)(svp)计数。对制剂3和制剂9进行比较，甘露醇/蔗糖制剂随时间产生更多的颗粒，尤其是在2μm至1000μm范围内。
具体实施方式
术语“抗体”是指单克隆抗体，包括任意同种型，例如，igg、igm、iga、igd和ige。igg抗体包括通过二硫键连接的两个相同的重链和两个相同的轻链。每个重链和轻链均含有恒定区和可变区。每个可变区含有三个称作“互补决定区”(“cdr”)或“高变区”的片段，其主要负责与抗原表位结合。它们从n-端依次编号，称作cdr1、cdr2和cdr3。可变区在cdr外部的更高度保守的部分称作“框架区”。“抗体片段”是指fv、scfv、dsfv、fab、fab’、f(ab’)2片段或其它片段，其含有至少一个可变重链或可变轻链，每一个都含有cdr和框架区。
“vh”是指抗体或抗体片段的免疫球蛋白重链的可变区。“vl”是指抗体或抗体片段的免疫球蛋白轻链的可变区。
术语“cd19”是指称作cd19的蛋白质，其具有以下同义词：b4、b-淋巴细胞抗原cd19、b-淋巴细胞表面抗原b4、cvid3、分化抗原cd19、mgc12802和t-细胞表面抗原leu-12。
人cd19具有以下氨基酸序列：
“mor208”是抗-cd19抗体。可变结构域的氨基酸序列在图1中提供。mor208的重链和轻链fc区的氨基酸序列在图1中提供。“mor208”和“xmab5574”作为同义词使用，描述图1所示的抗体。mor208抗体描述于美国专利申请系列号第12/377,251号中，将其全文并入以供参考。
其它的cd19特异性抗体描述于以下文献中：美国专利第7,109,304号(immunomedics)，将其全文并入以供参考；美国申请系列号第11/917,750号(medarex)，将其全文并入以供参考；美国申请系列号第11/852,106号(medimmune)，将其全文并入以供参考；美国申请系列号第11/648,505号(merckpatentgmbh)，将其全文并入以供参考；美国专利第7,968,687号(seattlegenetics)，将其全文并入以供参考；和美国申请系列号第12/710,442号(glenmarkpharmaceuticals)，将其全文并入以供参考。
此外，其它cd19特异性抗体描述于以下文献中：wo2005012493(us7109304)、wo2010053716(us12/266,999)(immunomedics)；wo2007002223(us8097703)(medarex)；wo2008022152(12/377,251)和wo2008150494(xencor)、wo2008031056(us11/852,106)(medimmune)；wo2007076950(us11/648,505)(merckpatentgmbh)；wo2009/052431(us12/253,895)(seattlegenetics)；和wo2010095031(12/710,442)(glenmarkpharmaceuticals)、wo2012010562和wo2012010561(internationaldrugdevelopment)、wo2011147834(rocheglycart)、和wo2012/156455(sanofi)，将其均全文并入以供参考。
术语“药物制剂”是指用于施用于受试者的制剂。这些受试者可以是人。
“稳定”制剂是指能够在储存之后施用于患者的制剂。在多个方面，制剂在储存时基本上保持其物理和化学特性及其生物学活性。用于测量蛋白质稳定性的多种分析技术是本领域可提供的，例如，在以下文献中综述：peptideandproteindrugdelivery,247-301,vincentlee编著,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,pubs.(1991)；和jones,a.adv.drugdeliveryrev.10:29-90(1993)。
稳定性能够以多种不同方式进行定性和/或定量评价，其包括评价聚集物形成(例如使用尺寸排阻色谱、通过测量浊度和/或通过目测检查)；通过使用离子交换色谱(iec)、尺寸排阻色谱(hp-sec)、sds-page分析评价电荷异质性，以比较减小的和完整的抗体；评价抗体的生物学活性或抗原结合功能；等。不稳定性可涉及以下的任意一种或多种：聚集、脱酰胺作用(例如，asn脱酰胺作用)、氧化作用(例如，met氧化作用)、异构化作用(例如，asp异构化作用)、clipping(剪辑)/水解/断裂(例如，铰链区断裂)、琥珀酰亚胺形成、半胱氨酸不成对、n-末端延伸、c-末端加工、糖基化差异等。
如本文所用，单克隆抗体的“生物学活性”是指抗体与抗原结合的能力。其能够进一步包括抗体与抗原结合，并导致能够在体外或体内测量的可测量生物学应答。
如本文所用，“缓冲剂”是指通过其酸碱共轭组分的作用抵抗ph变化的缓冲溶液。本发明的缓冲剂优选ph范围在约4.5至约7.0，优选约5.6至约7.0。在一实施方式中，缓冲剂的ph为约6.0，或者ph为6.0。例如，柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂均为将ph控制在该范围内的缓冲剂的实例。
如本文所用，“表面活性剂”是指具有表面活性的试剂。优选地，表面活性剂是非离子型表面活性剂。在本文中，表面活性剂的实例包括聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)；泊洛沙姆(poloxamer)(例如，泊洛沙姆188)；triton；十二烷基硫酸钠(sds)；月桂醇硫酸钠(sodiumlaurelsulfate)；辛基糖苷钠；月桂基-、豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-磺基甜菜碱；月桂基-、豆蔻基-、亚油基-或硬脂基-肌氨酸；亚油基-、豆蔻基-或鲸蜡基-甜菜碱；月桂酰胺基丙基-、椰油酰胺基丙基-、亚油酰胺基丙基-、豆蔻酰氨基丙基-、棕榈酰胺基丙基-(palmidopropyl-)或异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱(例如，月桂酰氨基丙基)；豆蔻酰氨基丙基-、棕榈酰胺基丙基-或异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺；甲基椰油酰基-牛磺酸钠或甲基油酰基-牛磺酸二钠；和monaquattm系列(monaindustries,inc.,paterson,n.j.)；聚乙二醇、聚丙二醇、以及乙二醇和丙二醇的共聚物(例如，pluronics、pf68等)；等。在一实施方式中，本文中表面活性剂是聚山梨醇酯20。
“fc区”是指抗体恒定区，其在人中可以是igg1、2、3、4亚类或其它。人fc区的序列可获自imgt,humanighc-regions,http://www.imgt.org/imgtrepertoire/proteins/protein/human/igh/ighc/hu_ighcallgenes.html(2011年5月16日检索)。
“施用”或“给药”包括但不限于，通过可注射形式例如静脉内、肌内、真皮内或皮下路径或黏膜路径，例如，作为鼻喷雾或气溶胶用于吸入或作为可消化溶液、胶囊或片剂递送。
化合物或组合的“治疗有效量”是指足以至少部分阻止指定疾病或病症及其并发症的临床表现的量。对于特定治疗目的来说有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及受试者的体重和一般状况。应当理解到，通过构建数值矩阵并测试矩阵中的不同点，使用常规试验可以实现适当剂量的确定，其均在经过训练的医师或临床科学家的普通技能范围以内。
在本文中，“cdr”通过chothia等人或kabat等人定义。参见chothiac,leskam.(1987)canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmunoglobulins.jmolbiol.,196(4):901-17，将其全文并入以供参考。参见kabate.a,wut.t.,perryh.m.,gottesmank.s.和foellerc.(1991).sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.第5版,nihpublicationno.91-3242,美国卫生与公众服务部(usdept.ofhealthandhumanservices),washington,dc，将其全文并入以供参考。
“交叉竞争”是指在标准竞争结合检验中抗体或其它结合剂干扰其它抗体或结合剂与cd19结合的能力。抗体或其它结合剂能够干扰另一抗体或结合分子与cd19结合的能力或程度，因而无论其是否可以根据本发明称作交叉竞争，均可以使用标准竞争结合检验确定。一种合适的检验涉及到使用biacore技术(例如，通过使用biacore3000仪器(biacore,uppsala,sweden))，其可以使用表面等离子体共振技术测量相互作用的程度。另一测量交叉竞争的检验使用基于elisa的方法。国际专利申请第wo2003/48731号中描述了一种基于其交叉竞争将抗体“表位合并(binning)”的高通量方法。
术语“表位”包括任何能够与抗体特异性结合或者以其它方式与分子相互作用的蛋白质决定簇(determinant)。表位决定簇通常由以下组成：分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链，并能够具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。表位可以是“线性的”或“构象的”。术语“线性表位”是指蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间所有相互作用的点沿着蛋白质一级氨基酸序列线性出现(连续)的表位。术语“构象表位”是指不连续的氨基酸在三维构象中来到一起的表位。在构象表位中，相互作用的点跨越蛋白质上彼此隔开的氨基酸残基出现。
“结合相同表位”是指抗体或其它结合剂与cd19结合、并且与示例的抗体具有相同表位的能力。示例抗体和其它抗体结合cd19的表位可以使用表位定位技术确定。本领域公知的表位定位技术包括：epitopemappingprotocolsinmethodsinmolecularbiology,vol.66(glenne.morris,ed.,1996)humanapress,totowa,newjersey。例如，线性表位可以通过以下方法确定：例如，在固体载体上同时合成大量的肽，这些肽与蛋白子分子的部分对应，并且在肽仍与载体连接的同时使肽与抗体反应。这些技术是本领域已知的，并且描述于以下文献中：例如，美国专利第4,708,871号；geysen等人,(1984)proc.natl.acad.sci.usa8:3998-4002；geysen等人,(1985)proc.natl.acad.sci.usa82:78-182；geysen等人,(1986)mol.immunol.23:709-715。类似地，构象表位通过确定氨基酸的空间构象很容易地确定，例如，通过氢/氘交换、x-射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，epitopemappingprotocols,同上。蛋白质的抗原区也可以使用标准抗原性和亲水性图来鉴定，例如，使用例如获自oxfordmoleculargroup的omiga1.0版软件程序计算。该计算机程序使用hopp/woods方法(hopp等人,(1981)proc.natl.acad.sciusa78:3824-3828)用于确定抗原性图谱，并且使用kyte-doolittle技术(kyte等人,(1982)j.moi.biol.157:105-132)用于亲水性图。
实施方式
在另一实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗cd-19抗体、缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中该制剂还包括：
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖
或者
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖。
在另一实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗-cd19抗体、柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中该制剂还包括：
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖
或者
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖。
在一些实施方式中，制剂中所述缓冲剂的浓度为10-75mm。在一些实施方式中，制剂中所述缓冲剂的浓度为20-50mm。在一些实施方式中，制剂中所述缓冲剂的浓度为20-40mm。在一些实施方式中，制剂中所述缓冲剂的浓度为20-30mm。在一些实施方式中，制剂中所述缓冲剂的浓度为约25mm。在一些实施方式中，制剂中所述缓冲剂的浓度为25mm。在一些实施方式中，制剂中所述缓冲剂是柠檬酸盐或磷酸盐缓冲剂。
在一些实施方式中，制剂中所述柠檬酸盐缓冲剂的浓度为10-75mm。在一些实施方式中，制剂中所述柠檬酸盐缓冲剂的浓度为20-50mm。在一些实施方式中，制剂中所述柠檬酸盐缓冲剂的浓度为20-30mm。在一些实施方式中，制剂中所述柠檬酸盐缓冲剂的浓度为约25mm。在一些实施方式中，制剂中所述柠檬酸盐缓冲剂的浓度为25mm。
在一些实施方式中，制剂中所述磷酸盐缓冲剂的浓度为10-75mm。在一些实施方式中，制剂中所述磷酸盐缓冲剂的浓度为20-50mm。在一些实施方式中，制剂中所述磷酸盐缓冲剂的浓度为20-30mm。在一些实施方式中，制剂中所述磷酸盐缓冲剂的浓度为约25mm。在一些实施方式中，制剂中所述磷酸盐缓冲剂的浓度为25mm。
在另一实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为20-50mm的柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中该制剂还包括：
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖
或者
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖。
在另一实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中该制剂还包括：
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖
或者
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖。
在另一实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中该制剂还包括：
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖
或者
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖。
在另一实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的磷酸盐缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中该制剂还包括：
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖
或者
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖。
在另一实施方式中，所述抗-cd19抗体是全长抗体。在另一实施方式中，所述抗-cd19抗体是igg1、igg2、igg3或igg4抗体。
在另一实施方式中，所述抗-cd19抗体是人源化或人抗体。在另一实施方式中，所述抗-cd19抗体是包括抗原结合区的抗体片段。在另一实施方式中，所述抗体片段是fab或f(ab')2片段。
在另一实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂在2-8℃下稳定至少6个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或者至少36个月。
在另一实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂在约40℃下稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多周。在某些实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂在约40℃下稳定至少约1、2、3、4、5或更多个月。在某些实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂在约25℃下稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月。在某些实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂在约5℃下稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或更多个月。在某些实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂在约5+/-3℃下稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或更多个月。在某些实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂在约-20℃下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或更多个月。在某些实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂在5℃或-20℃下稳定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或更多个月。
在另一实施方式中，制剂中的抗-cd19抗体在储存之后保持其生物学活性的至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％。在一些实施方式中，通过抗体与cd19结合测量生物学活性。在一些实施方式中，通过在facscd19结合检验中的抗体与cd19结合测量生物学活性。在一些实施方式中，通过所述抗-cd19抗体的adcc活性测量生物学活性。在一些实施方式中，稳定的冻干药物制剂是无菌的。
在另一实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂适合于施用于受试者。在另一实施方式中，所述稳定的冻干药物制剂适合于静脉内(iv)给药或皮下给药。
另一方面，本文提供一种制品，其包括容纳本文公开的稳定的冻干药物制剂的容器。在一实施方式中，所述容器是玻璃瓶或金属合金容器。在另一实施方式中，金属合金是316l不锈钢或哈斯特洛依合金。
另一方面，本文提供一种治疗受试者的疾病或病症的方法，其包括将有效量的本文所公开的制剂施用于受试者，其中疾病或病症是癌症。另一方面，本文提供一种本文公开的稳定的冻干药物制剂用于治疗受试者的疾病或病症的用途，其包括将有效量的所述制剂施用于受试者，其中疾病或病症是癌症。另一方面，本文提供一种本文公开的稳定的冻干药物制剂用于制造治疗受试者的疾病或病症的药物的用途，其包括将有效量的所述制剂施用于受试者，其中疾病或病症是癌症。在一实施方式中，疾病或病症是非霍奇金氏淋巴瘤(包括本文所述的各个亚型)、慢性淋巴细胞性白血病和/或急性成淋巴细胞性白血病。在实施方式中，非霍奇金氏淋巴瘤选自滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、黏膜相关型淋巴组织、边缘区、弥漫性大b细胞、伯基特(burkitt′s)和套细胞。
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括：
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖
或者
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖，
其中所述抗-cd19抗体包括序列syvmh(seqidno：1)的hcdr1区、序列npyndg(seqidno：2)的hcdr2区、序列gtyyygtrvfdy(seqidno：3)的hcdr3区、序列rsskslqnvngntyly(seqidno：4)的lcdr1区、序列rmsnlns(seqidno：5)的lcdr2区和序列mqhleypit(seqidno：6)的lcdr3区。
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖
或者
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖，
其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约20mg/ml至约125mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.005％(w/v)至约0.06％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括
a)浓度为约180mm至约240mm的海藻糖
或者
b)浓度为约180mm至约240mm的甘露醇和浓度为约10mm至约50mm的蔗糖，
其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括：
a)浓度为约200mm的海藻糖
或者
b)浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，
其中所述抗-cd19抗体包括序列syvmh(seqidno：1)的hcdr1区、序列npyndg(seqidno：2)的hcdr2区、序列gtyyygtrvfdy(seqidno：3)的hcdr3区、序列rsskslqnvngntyly(seqidno：4)的lcdr1区、序列rmsnlns(seqidno：5)的lcdr2区和序列mqhleypit(seqidno：6)的lcdr3区。
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括
a)浓度为约200mm的海藻糖
或者
b)浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，
其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括
a)浓度为约200mm的海藻糖
或者
b)浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，
其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括：
a)浓度为约200mm的海藻糖
或者
b)浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，
其中所述抗-cd19抗体包括与序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括：
a)浓度为约200mm的海藻糖
或者
b)浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，
其中所述抗-cd19抗体包括与序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约200mm的海藻糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列syvmh(seqidno：1)的hcdr1区、序列npyndg(seqidno：2)的hcdr2区、序列gtyyygtrvfdy(seqidno：3)的hcdr3区、序列rsskslqnvngntyly(seqidno：4)的lcdr1区、序列rmsnlns(seqidno：5)的lcdr2区和序列mqhleypit(seqidno：6)的lcdr3区。
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列syvmh(seqidno：1)的hcdr1区、序列npyndg(seqidno：2)的hcdr2区、序列gtyyygtrvfdy(seqidno：3)的hcdr3区、序列rsskslqnvngntyly(seqidno：4)的lcdr1区、序列rmsnlns(seqidno：5)的lcdr2区和序列mqhleypit(seqidno：6)的lcdr3区。
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约200mm的海藻糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约200mm的海藻糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为20-40mm的磷酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约200mm的海藻糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为20-40mm的磷酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的磷酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约200mm的海藻糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为约40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为约25mm的磷酸盐缓冲剂、浓度为约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为约6.0，其中制剂还包括浓度为约219mm的甘露醇和浓度为约29mm的蔗糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为6.0，其中制剂还包括浓度为200mm的海藻糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列syvmh(seqidno：1)的hcdr1区、序列npyndg(seqidno：2)的hcdr2区、序列gtyyygtrvfdy(seqidno：3)的hcdr3区、序列rsskslqnvngntyly(seqidno：4)的lcdr1区、序列rmsnlns(seqidno：5)的lcdr2区和序列mqhleypit(seqidno：6)的lcdr3区。
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为6.0，其中制剂还包括浓度为219mm的甘露醇和浓度为29mm的蔗糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列syvmh(seqidno：1)的hcdr1区、序列npyndg(seqidno：2)的hcdr2区、序列gtyyygtrvfdy(seqidno：3)的hcdr3区、序列rsskslqnvngntyly(seqidno：4)的lcdr1区、序列rmsnlns(seqidno：5)的lcdr2区和序列mqhleypit(seqidno：6)的lcdr3区。
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为6.0，其中制剂还包括浓度为200mm的海藻糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为6.0，其中制剂还包括浓度为219mm的甘露醇和浓度为29mm的蔗糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为6.0，其中制剂还包括浓度为200mm的海藻糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的磷酸盐缓冲剂、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为6.0，其中制剂还包括浓度为200mm的海藻糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的柠檬酸盐缓冲剂、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为6.0，其中制剂还包括浓度为219mm的甘露醇和浓度为29mm的蔗糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
在一些实施方式中，本文提供一种稳定的冻干药物制剂，该制剂包括浓度为40mg/ml的抗-cd19抗体、浓度为25mm的磷酸盐缓冲剂、浓度为0.02％(w/v)的聚山梨醇酯，并且ph为6.0，其中制剂还包括浓度为219mm的甘露醇和浓度为29mm的蔗糖，其中所述抗-cd19抗体包括序列
工作例
工作例1：mor208的生物物理学表征
出于表征、预制剂筛选和高浓度可行性的目的，分析mor208的生物物理学特性。
为了评价mor208的结构稳定性，使用dsf(差示扫描荧光测定法)进行热熔实验并获得cd光谱。将mor208样品稀释至浓度为1.1mg/ml。加入疏水性染料sypro-橙，检测蛋白质的解折叠(unfolding)，产生各自的熔融曲线。样品表现出相对较低的47℃的熔融温度，其通过荧光的梯度增加(stepincrease)表示。
mor208是与b细胞及其祖代上的cd19结合的人源化单克隆抗体。fc区已经过改造(s239d/i332e)，以提高支持b-细胞消耗的效应子功能。根据目前的工作假设，该fc区的形式导致ch2结构域的柔性，导致adcc效力提高，但可以伴随有fc结构域的熔融温度降低。
而且，使用dsc、rals和itf进行ph筛选研究，以鉴定对于蛋白质来说最稳定的ph范围。该研究覆盖了3.5-8.0的ph范围。在覆盖所需ph范围的混合缓冲剂系统中进行测量。基于得到的结果，鉴定出mor208最稳定的ph范围为ph6.0-7.0。
因此，鉴定出两个缓冲剂系统，其在6.0-7.0的ph范围内提供充分的缓冲能力，并且对于肠胃外使用来说是药学上可接受的：
-柠檬酸盐(ph5.5；6.0)
-组氨酸(ph6.0；6.5；7.0)
而且，进行dsc、rals和itf测量，以测试mor208在25mm柠檬酸盐和25mm组氨酸缓冲剂中的热稳定性。仅ph5.5下的柠檬酸盐表现出显著较低的转变温度，所有其它测试的样品均表现出相当的热稳定性。这一结论也通过rals和itf测试得到证实。
而且，测试了离子强度、糖、多元醇和聚山梨醇酯20对mor208的热稳定性的影响。选择ph6.0的25mm柠檬酸盐缓冲剂作为制备含有nacl或糖或聚山梨醇酯20的样品的基础缓冲系统。测量结果表明，加入nacl增加了mor208基于52℃下的第一转变温度的热稳定性。该观察结果通过itf测量得以证实。rals测试的结果没有鉴定出nacl对mor208的热稳定性有任何影响。
使用浓度200mm的海藻糖、210mm蔗糖和180mm甘露醇/45mm蔗糖混合物，测试糖(海藻糖和蔗糖)和甘露醇对mor208热稳定性的影响。选择这些浓度，以使制剂迁移至等渗范围内。dsc、rals和itf的结果表明，海藻糖和蔗糖对mor208的热稳定性具有相当的影响，而甘露醇/蔗糖的混合物使第一转变温度稍降低了约0.8℃。
使用0.02％、0.04％、0.08％和0.12％的浓度测试聚山梨醇酯20对mor208热稳定性的影响。dsc和rals测量的结果表明，在测试的浓度下，聚山梨醇酯20对mor208的热稳定性没有显著影响。
使用1、5和10mm的浓度测试mgcl2对mor208热稳定性的影响。dsc和rals测量的结果表明，在测试的浓度下，mgcl2对mor208的热稳定性没有显著影响。
工作例2：mor208液体制剂的稳定性研究
基于mor208的生物物理学表征，在稳定性研究中对以下6种不同的液体制剂进行测试：
选择以下制剂用于稳定性研究：
■制剂f1：10mm柠檬酸盐，ph6.0+0.01％ps20+150mmnacl
■制剂f2：25mm柠檬酸盐，ph6.0+0.02％ps20+125mmnacl
■制剂f3：25mm柠檬酸盐，ph6.0+0.02％ps20+200mm海藻糖
■制剂f4：25mm柠檬酸盐，ph6.0+0.02％ps20+210mm蔗糖
■制剂f5：25mm组氨酸，ph6.0+0.02％ps20+140mmnacl
■制剂f6：25mm组氨酸，ph6.0+0.02％ps20+230mm海藻糖
■制剂f7：25mm琥珀酸盐，ph6.0+0.02％ps20+215mm海藻糖
■制剂f8：25mm组氨酸，ph6.5+0.02％ps20+240mm海藻糖
对于所有制剂，蛋白质浓度均为20mg/ml。对于每种制剂，将10ml装入10ml小瓶中，用涂覆橡胶盖紧闭，并在25℃的受控温度下倒置储存12周。在储存之前(t0)、4、8和12周之后进行分析测试。
与其它制剂相比较，制剂1、3、5和7在12周时间产生较少的显微镜下可见的颗粒。通过mfi对颗粒进行测量。制剂5在>10μm和>25μm范围内显示出最低的svp数。
通过hpsec测试制剂的聚集物和单体水平。与其它制剂相比较，制剂2、3、7和8在12周时间表现出较高的聚集物增加。
储存4周之后，制剂4的摩尔渗透压浓度(osmolality)增加，这最有可能说明制剂中含有的蔗糖发生降解。
ph的变化也表明制剂4中的蔗糖发生降解。
进一步的hic测试表明，与其它制剂相比较，制剂6、7和8表现出更强的峰3面积％降低。具体地，12周之后，制剂8表现出从66.1％(初始值)到52.2％的强降低。
mor208的物化表征鉴定出最稳定的ph范围为ph6.0-7.0。
选择柠檬酸盐、组氨酸和琥珀酸盐作为上述ph范围内的药学上可接受的缓冲剂系统。所有缓冲剂系统均在25mm浓度下使用，对于浓度20mg/ml的蛋白质提供了充分的缓冲能力。加入最小浓度125mm的nacl对于mor208的热稳定性具有微弱的积极效果(基于dsc数据)。加入蔗糖、海藻糖、甘露醇/蔗糖和聚山梨醇酯20不改变mor208的热稳定性。
基于分析结果，鉴定出最稳定的制剂为f1、f3和f5。
■制剂f1：10mm柠檬酸盐，ph6.0+0.01％ps20+150mmnacl
■制剂f3：25mm柠檬酸盐，ph6.0+0.02％ps20+200mm海藻糖
■制剂f5：25mm组氨酸，ph6.0+0.02％ps20+140mmnacl
将这3种制剂的样品在25℃下进一步保持多达8个月，并再次进行测试。制剂1和5提供了最高的稳定性，但所有液体制剂在8个月之后均产生药典规格以上的显微镜下可见的颗粒(nmt6000颗粒≥10μm/小瓶，和nmt600颗粒≥25μm/小瓶)。因此，所需的2-8℃下至少24个月的储存期没有由所测试的20mg/ml蛋白质的液体制剂中的一种达到。
这一事实驱使了开始开发冻干剂型的决定。
工作例3：冻干可行性研究
制剂3和新的制剂9参与到浓度为40mg/ml的mor208的冻干可行性研究中。
制剂3：25mm柠檬酸盐
200mm海藻糖二水合物
0.02％聚山梨醇酯20
ph6.0
制剂9：25mm柠檬酸盐
219mm甘露醇
29mm蔗糖
0.02％聚山梨醇酯20
ph6.0
冻干药物产品的外观
两种制剂冻干块(lyocake)的外观均是可接受的。含有海藻糖的制剂完全是无定形的，并表现出较高的收缩程度，其仅为表面的观察结果，通常不与产品质量或稳定性相关。含有甘露醇的制剂是部分结晶的，提供了没有收缩的药剂的高优美性的块状物。
对冻干mor208的质量进行测试，并与冻干之前的产品质量相比较。下表1总结了制剂3和9的结果。
表1：冻干前后的产品质量比较
进行了额外的冻干研究，其仅关注冻干前后的显微镜下可见颗粒(svp)测试。研究结果列于表2中，其清楚地表明，冻干过程没有增加svp计数。
表2：冻干前后mor208-f3的显微镜下可见颗粒计数
基于测试结果，观察到冻干过程没有对产品质量产生负面影响。两种制剂均提供可接受的块状物外观。对于含有40mg/ml蛋白质的制剂来说，重构时间低于60秒。重构通过加入5ml注射用水进行。与含有海藻糖的制剂相比较，甘露醇/蔗糖制剂的水分含量较高，这是由于冻干块的密度较高。冻干之后摩尔渗透压浓度和蛋白质含量(uv扫描)降低，因为产品因重构步骤而稀释。冻干过程中聚集物水平没有增加，重构之后计数出少量的显微镜下可见颗粒。因此，两种制剂均适合于mor208的冻干，冻干可行性研究成功完成。该项研究之后，在40℃下用3个月的时间进行两种制剂的加速稳定性研究。
工作例4：加速稳定性研究
冻干可行性研究成功完成之后，进行40℃下(75％rh)3个月的第一稳定性研究，以对两种制剂进行比较。稳定性测试包括对颜色和可见颗粒的测试。而且，对产品进行hp-sec(聚集物)、hic、iec、结合检验(cd16biacore)、mfi(显微镜下可见颗粒)和sds-page测试。
hp-sec测试显示，储存3个月之后f9的聚集物有较高的增加(表3)。f3的聚集物水平从0.8％增加至1.7％，f9的聚集物水平从0.8％增加至2.6％。
表3：hp-sec聚集物测试
在t0以及4周、8周和12周以后，用mfi方法对显微镜下可见颗粒进行测试。对两种制剂进行比较，明显地，甘露醇/蔗糖制剂随着时间产生更多的颗粒，特别是在2μm至1000μm范围内(图2)。
基于分析结果，与制剂9相比较，在40℃下含有海藻糖的制剂3表现出更高的稳定性。svp(mfi)和聚集物水平(hpsec)方面也观察到稳定性的差异。
结论：
冻干可行性研究显示，使用两种制剂和40mg/ml的蛋白质浓度，可以在不影响产品质量的情况下对mor208进行冷冻干燥。稳定性条件为40℃下(75％rh)3个月时间。在该项稳定性研究中，与甘露醇/蔗糖制剂相比较，含有海藻糖的制剂鉴定出具有更高的稳定性。
工作例5：储存期assignment
对于长期稳定性研究，将制剂3中的mor208置于5℃±3℃下实时储存，并在25℃±2℃测试中进行加速储存。
进行的稳定性研究包括稳定性指示和现有技术方法的状态，以在储存过程中在浓度、活性、纯度、药学和微生物学参数方面对药物产品进行监测。
使用以下参数方法，并将其视作是主要的稳定性指示测试：
-通过hp-sec测试纯度：
通过分析相关压力样品，显示hp-sec稳定性指示特性。而且，通过分析性超速离心验证聚集物检测能力。
-通过iec和还原/非还原cge测试均匀性和纯度：
对于片段检测，应用非还原cge；通过iec检测导致电荷变体的化学修饰，例如脱酰胺化作用。
-活性检验：
产品特异性活性检验cd19结合检验(facs)、cd16结合检验(spr)和adcc效力检验表现出对相关压力样品的敏感性。
5℃±3℃下实时储存和25℃±3℃下加速储存的结果分别总结于表4和表5中。
表4：mor208-5℃±3℃下实时储存
表5：mor208-25℃±3℃下加速储存
结果讨论：
含量和活性
用三种不同的活性检验监测mor208的功能活性：cd19结合检验(facs)、cd16结合检验(spr)和基于adcc的效力检验。这三种检验结合起来，涵盖了抗原结合、相关效应子结合以及主要作用模式(adcc)。
两种结合检验没有表现出清楚的或相关的随时间的趋势。基于adcc的效力检验表现出随着时间的一定增加(实时和加速两种条件下)，但是由于该检验也表现出较高的变化性，该趋势尚不认为是显著的。总之，所有含量和活性检验均在规格范围内，在36个月时间里并没有表现出任何产品质量上的重大变化。
纯度
在预定储存温度5±3℃下储存36个月期间，纯度检验(即，hp-sec、iec、还原和非还原cge)无一表现出产品纯度方面的重大变化。在25±2℃下的加速条件下，hp-sec仅在最近测试的点处表现出一处数值变化(一增量的单体值降低/片段值增加)，但长期数据没有反映出这一点，因此视为可忽略不计。iec在长期条件下没有表现出趋势，但在加速条件下有清楚的主峰组减少/碱性峰组增加的趋势。
总之，所有纯度检验均在规格范围内，在36个月时间里并没有表现出产品质量上的重大变化。
药学测试
在预定储存温度5±3℃下储存36个月期间，药学测试无一表现出随着时间的重大变化。总之，所有药学测试均在规格范围内，在36个月时间里并没有表现出产品质量上的重大变化。
序列表
<110>莫佛塞斯公司（morphosysag）
<120>抗-cd19抗体制剂（anti-cd19antibodyformulations）
<130>ms247
<160>11
<170>bissap1.0
<210>1
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>1
sertyrvalmethis
15
<210>2
<211>6
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>2
asnprotyrasnaspgly
15
<210>3
<211>12
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>3
glythrtyrtyrtyrglythrargvalpheasptyr
1510
<210>4
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>4
argserserlysserleuglnasnvalasnglyasnthrtyrleutyr
151015
<210>5
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>5
argmetserasnleuasnser
15
<210>6
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>6
metglnhisleuglutyrproilethr
15
<210>7
<211>556
<212>prt
<213>智人
<220>
<223>cd19
<400>7
metproproproargleuleuphepheleuleupheleuthrpromet
151015
gluvalargproglugluproleuvalvallysvalglugluglyasp
202530
asnalavalleuglncysleulysglythrseraspglyprothrgln
354045
glnleuthrtrpserarggluserproleulyspropheleulysleu
505560
serleuglyleuproglyleuglyilehismetargproleualaile
65707580
trpleupheilepheasnvalserglnglnmetglyglyphetyrleu
859095
cysglnproglyproproserglulysalatrpglnproglytrpthr
100105110
valasnvalgluglyserglygluleupheargtrpasnvalserasp
115120125
leuglyglyleuglycysglyleulysasnargsersergluglypro
130135140
serserproserglylysleumetserprolysleutyrvaltrpala
145150155160
lysaspargprogluiletrpgluglygluproprocysleupropro
165170175
argaspserleuasnglnserleuserglnaspleuthrmetalapro
180185190
glyserthrleutrpleusercysglyvalproproaspservalser
195200205
argglyproleusertrpthrhisvalhisprolysglyprolysser
210215220
leuleuserleugluleulysaspaspargproalaargaspmettrp
225230235240
valmetgluthrglyleuleuleuproargalathralaglnaspala
245250255
glylystyrtyrcyshisargglyasnleuthrmetserphehisleu
260265270
gluilethralaargprovalleutrphistrpleuleuargthrgly
275280285
glytrplysvalseralavalthrleualatyrleuilephecysleu
290295300
cysserleuvalglyileleuhisleuglnargalaleuvalleuarg
305310315320
arglysarglysargmetthraspprothrargargphephelysval
325330335
thrproproproglyserglyproglnasnglntyrglyasnvalleu
340345350
serleuprothrprothrserglyleuglyargalaglnargtrpala
355360365
alaglyleuglyglythralaprosertyrglyasnproserserasp
370375380
valglnalaaspglyalaleuglyserargserproproglyvalgly
385390395400
proglugluglugluglygluglytyrglugluproaspsergluglu
405410415
aspsergluphetyrgluasnaspserasnleuglyglnaspglnleu
420425430
serglnaspglyserglytyrgluasnprogluaspgluproleugly
435440445
progluaspgluaspserpheserasnalaglusertyrgluasnglu
450455460
aspglugluleuthrglnprovalalaargthrmetasppheleuser
465470475480
prohisglyseralatrpaspproserargglualathrserleugly
485490495
serglnsertyrgluaspmetargglyileleutyralaalaprogln
500505510
leuargserileargglyglnproglyproasnhisglugluaspala
515520525
aspsertyrgluasnmetaspasnproaspglyproaspproalatrp
530535540
glyglyglyglyargmetglythrtrpserthrarg
545550555
<210>8
<211>330
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
alaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlys
151015
serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyr
202530
pheprogluprovalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrser
505560
leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthr
65707580
tyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplys
859095
lysvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocys
100105110
proalaprogluleuleuglyglyproaspvalpheleuphepropro
115120125
lysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcys
130135140
valvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasntrp
145150155160
tyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglu
165170175
gluglnpheasnserthrpheargvalvalservalleuthrvalval
180185190
hisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasn
195200205
lysalaleuproalaprogluglulysthrileserlysthrlysgly
210215220
glnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglu
225230235240
metthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyr
245250255
proseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasn
260265270
asntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphephe
275280285
leutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasn
290295300
valphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthr
305310315320
glnlysserleuserleuserproglylys
325330
<210>9
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>13
argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu
151015
glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe
202530
tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln
354045
serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser
505560
thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu
65707580
lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser
859095
provalthrlysserpheasnargglyglucys
100105
<210>10
<211>121
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>10
gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvallysproglygly
151015
serleulysleusercysalaalaserglytyrthrphethrsertyr
202530
valmethistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpile
354045
glytyrileasnprotyrasnaspglythrlystyrasnglulysphe
505560
glnglyargvalthrileserserasplysserileserthralatyr
65707580
metgluleuserserleuargsergluaspthralamettyrtyrcys
859095
alaargglythrtyrtyrtyrglythrargvalpheasptyrtrpgly
100105110
glnglythrleuvalthrvalserser
115120
<210>11
<211>112
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的构建体
<400>11
aspilevalmetthrglnserproalathrleuserleuserprogly
151015
gluargalathrleusercysargserserlysserleuglnasnval
202530
asnglyasnthrtyrleutyrtrppheglnglnlysproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrargmetserasnleuasnserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythrgluphethrleuthrile
65707580
serserleugluprogluaspphealavaltyrtyrcysmetglnhis
859095
leuglutyrproilethrpheglyalaglythrlysleugluilelys
100105110
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！