用于制备多跨膜蛋白的方法和平台与流程

本申请要求于2016年5月4日提交的美国临时申请号62/331,628的权益，该申请通过引用并入本文。

序列表

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背景技术：

g蛋白偶联受体(gpcr)是多跨膜蛋白的成员，而gpcr超家族包含约800个人gpcr成员。gpcr由gpcr各自配体的激活启动了细胞内多个信号传导过程的级联，这些信号传导过程例如调节细胞生长、代谢和其他必需的细胞功能。这些gpcr及其随后信号级联的失调和异常表达与许多不同类型的疾病病理学相关。

技术实现要素：

在某些实施方案中，本文公开了包含经修饰的多跨膜多肽的方法、平台、抗体、疫苗、构建体和试剂盒。在一些情况下，所述经修饰的多跨膜多肽是离子通道多肽。在一些情况下，所述经修饰的多跨膜多肽是gpcr。在一些情况下，本文描述了包含经修饰的离子通道多肽的方法、平台、抗体、疫苗、构建体和试剂盒。在另外的情况下，本文描述了包含经修饰的gpcr的方法、平台、抗体、疫苗、构建体和试剂盒。

在某些实施方案中，本文公开了针对经修饰的多跨膜多肽筛选治疗剂的方法，该方法包括(a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；(b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的所述文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至所述多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至所述多核苷酸的n末端；(c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达所述第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；(d)生成生产载体，该生产载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(e)在第二多个宿主细胞中表达所述生产载体，其中所述宿主细胞是生产宿主细胞；(f)将由步骤e)的所述生产载体生成的多跨膜多肽产物与治疗剂一起温育；以及(g)检测所述多跨膜多肽产物与所述治疗剂之间的结合。在一些实施方案中，所述治疗剂是小分子或多肽。在一些实施方案中，所述小分子是药物或小分子片段。在一些实施方案中，所述多肽是抗体或其结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价fab’、二价fab2、单链可变片段(scfv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)或骆驼抗体或其结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段通过噬菌体展示或酵母展示方法产生。在一些实施方案中，步骤f)中的温育进一步包括在与所述治疗剂一起温育之前将所述多跨膜多肽产物固定化在纳米颗粒上。在一些实施方案中，所述纳米颗粒包括顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒或无机纳米管。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因选择防止所述多跨膜多肽的过早截短，并且/或者促进所述多跨膜多肽的稳定且正确的折叠。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因促进所述多跨膜多肽的稳定且正确的折叠。在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白、黏附素、移位酶或受体。在一些实施方案中下，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些实施方案中，所述经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。在一些实施方案中，所述修饰包括插入、缺失或突变。在一些实施方案中，所述突变包括无义突变或错义突变。在一些实施方案中，所述修饰包括n末端截短、c末端截短或其组合。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是哺乳动物gpcr。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是人gpcr。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因是相同的。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因是不同的。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因包括抗生素抗性基因、营养缺陷型基因或转录激活物或阻遏物。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因不编码报告蛋白。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因包括抗生素抗性基因、营养缺陷型基因或转录激活物或阻遏物。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因不编码报告蛋白。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因编码第一选择多肽。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因编码第二选择多肽。在一些实施方案中，当所述第一选择多肽适当地展示在所述经修饰的多跨膜多肽的c末端部分上且任选地所述第二选择多肽适当地展示在所述经修饰的多跨膜多肽的n末端部分上时，通过与所述第一选择多肽的相互作用和任选地与所述第二选择多肽的相互作用，使所述至少一种选择剂对所述第一多个宿主细胞无毒。在一些实施方案中，所述至少一种选择剂包括第一选择剂和第二选择剂。在一些实施方案中，所述第一选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，所述第二选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，所述抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、红霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，所述毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。在一些实施方案中，所述第一选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，所述第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，步骤d)的所述生产载体不包含第一选择标记基因或第二选择标记基因。在一些实施方案中，所述第一组表达载体和所述生产载体进一步独立地包含编码标签的多核苷酸。在一些实施方案中，将所述标签连接至所述经修饰的多跨膜多肽的n末端、所述经修饰的多跨膜多肽的c末端或其组合。在一些实施方案中，所述标签包括mbp、trxa、flag标签、avi标签或histag。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(a)生成第二组生产载体，其中每个生产载体包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码来自上述方法的步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(b)在第三多个宿主细胞中表达所述第二组生产载体，其中所述宿主细胞是生产宿主细胞；以及(c)通过分析方法来分析步骤b)的一组多跨膜多肽产物，以确定来自所述组的、具有增强或改善的物理化学性质的多跨膜多肽产物，以用于针对上述方法的步骤f)的所述治疗剂进行筛选，其中所述增强或改善的物理化学性质是相对于对照多跨膜多肽的。在一些实施方案中，所述增强或改善的物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性或途径激活选择性。在一些实施方案中，所述对照包括野生型多跨膜多肽或具有不同修饰的经修饰的多跨膜多肽。在一些实施方案中，通过流式细胞术方法或通过酶联免疫吸附测定(elisa)来检测步骤g)中的所述结合。在一些实施方案中，所述流式细胞术方法包括磁激活细胞分选(macs)或荧光激活细胞分选(facs)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞或昆虫宿主细胞。在一些实施方案中，所述第一多个宿主细胞包括原核宿主细胞。在一些实施方案中，所述原核宿主细胞是大肠杆菌(e.coli)细胞。在一些实施方案中，所述第二多个宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞或昆虫宿主细胞。

在某些实施方案中，本文公开了针对经修饰的多跨膜多肽筛选抗体或其结合片段的方法，该方法包括：(a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；(b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的所述文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至所述多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至所述多核苷酸的n末端；(c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达所述第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；(d)生成生产载体，该生产载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(e)在第二多个宿主细胞中表达所述生产载体，其中所述宿主细胞是生产宿主细胞；(f)将由步骤e)的所述生产载体生成的多跨膜多肽产物与所述抗体或其结合片段一起温育；以及(g)检测所述多跨膜多肽产物与所述抗体或其结合片段之间的结合。在一些实施方案中，步骤f)中的温育进一步包括在与所述治疗剂一起温育之前将所述多跨膜多肽产物固定化在纳米颗粒上。在一些实施方案中，所述纳米颗粒包括顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒或无机纳米管。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因选择防止所述多跨膜多肽的过早截短，并且/或者促进所述多跨膜多肽的稳定且正确的折叠。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因促进所述多跨膜多肽的稳定且正确的折叠。在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白、黏附素、移位酶或受体。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段通过噬菌体展示或酵母展示方法产生。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价fab’、二价fab2、单链可变片段(scfv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)或骆驼抗体或其结合片段。在一些实施方案中下，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些实施方案中，所述经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。在一些实施方案中，所述修饰包括插入、缺失或突变。在一些实施方案中，所述突变包括无义突变或错义突变。在一些实施方案中，所述修饰包括n末端截短、c末端截短或其组合。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是哺乳动物gpcr。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是人gpcr。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因是相同的。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因和所述第二选择标记基因是不同的。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因包括抗生素抗性基因、营养缺陷型基因或转录激活物或阻遏物。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因不编码报告蛋白。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因包括抗生素抗性基因、营养缺陷型基因或转录激活物或阻遏物。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因不编码报告蛋白。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因。在一些实施方案中，所述第一选择标记基因编码第一选择多肽。在一些实施方案中，所述第二选择标记基因编码第二选择多肽。在一些实施方案中，当所述第一选择多肽适当地展示在所述经修饰的多跨膜多肽的c末端部分上且任选地所述第二选择多肽适当地展示在所述经修饰的多跨膜多肽的n末端部分上时，通过与所述第一选择多肽的相互作用和任选地与所述第二选择多肽的相互作用，使所述至少一种选择剂对所述第一多个宿主细胞无毒。在一些实施方案中，所述至少一种选择剂包括第一选择剂和第二选择剂。在一些实施方案中，所述第一选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，所述第二选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，所述抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、红霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，所述毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。在一些实施方案中，所述第一选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，所述第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，步骤d)的所述表达载体不包含第一选择标记基因或第二选择标记基因。在一些实施方案中，所述第一组表达载体和所述表达载体进一步独立地包含编码标签的多核苷酸。在一些实施方案中，将所述标签连接至所述经修饰的多跨膜多肽的n末端、所述经修饰的多跨膜多肽的c末端或其组合。在一些实施方案中，所述标签包括mbp、trxa、flag标签、avi标签或histag。在一些实施方案中，所述方法进一步包括：(a)生成第二组生产载体，其中每个生产载体包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码来自上述方法的步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(b)在第三多个宿主细胞中表达所述第二组生产载体，其中所述宿主细胞是生产宿主细胞；(c)通过分析方法来分析步骤b)的一组多跨膜多肽产物，以确定来自所述组的、具有增强或改善的物理化学性质的多跨膜多肽产物，以用于针对上述方法的步骤f)的所述治疗剂进行筛选，其中所述增强或改善的物理化学性质是相对于对照多跨膜多肽的。在一些实施方案中，所述增强或改善的物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性或途径激活选择性。在一些实施方案中，所述对照包括野生型多跨膜多肽或具有不同修饰的经修饰的多跨膜多肽。在一些实施方案中，通过流式细胞术方法或通过酶联免疫吸附测定(elisa)来检测步骤g)中的所述结合。在一些实施方案中，所述流式细胞术方法包括磁激活细胞分选(macs)或荧光激活细胞分选(facs)。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞或昆虫宿主细胞。在一些实施方案中，所述第一多个宿主细胞包括原核宿主细胞。在一些实施方案中，所述原核宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，所述第二多个宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞或昆虫宿主细胞。

在某些实施方案中，本文公开了分离并纯化的抗体或其结合片段，其包含重链cdr1、cdr2和cdr3序列以及轻链cdr1、cdr2和cdr3序列，其中所述重链和轻链cdr与经修饰的多跨膜多肽相互作用，并且其中所述抗体或其结合片段通过以下过程产生：(a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；(b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的所述文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至所述多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至所述多核苷酸的n末端；(c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达所述第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；(d)生成生产载体，该生产载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(e)在第二多个宿主细胞中表达所述生产载体，其中所述宿主细胞是生产宿主细胞；(f)将由步骤e)的所述生产载体生成的多跨膜多肽产物与一组抗体或其结合片段一起温育；以及(g)选择与所述多跨膜多肽产物特异性结合的抗体或其结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段通过噬菌体展示或酵母展示方法产生。在一些实施方案中，所述抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价fab’、二价fab2、单链可变片段(scfv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)或骆驼抗体或其结合片段。在一些实施方案中下，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些实施方案中，所述经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。

在某些实施方案中，本文公开了包含上述分离并纯化的抗体或其结合片段的疫苗。在一些实施方案中，所述疫苗进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。

在某些实施方案中，本文公开了包含经修饰的多跨膜多肽或编码所述经修饰的多跨膜多肽的多核苷酸的疫苗，其中所述经修饰的多跨膜多肽通过以下过程产生：(a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；(b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的所述文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至所述多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至所述多核苷酸的n末端；(c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达所述第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；(d)生成第二组生产载体，其中每个生产载体包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(e)在第二多个宿主细胞中表达所述第二组生产载体，其中所述宿主细胞是生产宿主细胞；以及(f)用分析方法来分析由步骤e)的所述第二组表达载体生成的一组多跨膜多肽产物，以确定具有增强或改善的物理化学性质的稳定折叠的多跨膜多肽，以用于生成疫苗，其中所述增强或改善的物理化学性质是相对于对照多跨膜多肽的。在一些实施方案中，所述增强或改善的物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性或途径激活选择性。在一些实施方案中，所述对照包括野生型多跨膜多肽或具有不同修饰的经修饰的多跨膜多肽。在一些实施方案中下，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些实施方案中，所述经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些实施方案中，所述疫苗进一步包含佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)。

在某些实施方案中，本文公开了式(i)的经修饰的多跨膜多肽：

sp2x-l2m-msmpy-l1n-sp1z

式i

其中：

msmp为包含至少一个修饰的多跨膜多肽；

sp1为连接至msmp的c末端的第一选择多肽，其中sp1对第一选择剂具有抗性；

sp2为连接至msmp的n末端的第二选择多肽，其中sp2对第二选择剂具有抗性；

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；

x独立地为0-3；

y独立地为1-5；

z独立地为1-3；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白、黏附素、移位酶或受体。在一些实施方案中下，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些实施方案中，所述经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。在一些实施方案中，所述至少一个修饰通过随机诱变方法生成。在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括插入、缺失或突变。在一些实施方案中，所述突变包括无义突变或错义突变。在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括n末端截短、c末端截短或其组合。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是哺乳动物gpcr。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是人gpcr。在一些实施方案中，当在宿主细胞中表达时，sp1位于所述宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些实施方案中，当在宿主细胞中表达时，sp2位于所述宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些实施方案中，当在宿主细胞中表达时，sp1位于所述宿主细胞的细胞内部分中。在一些实施方案中，当在宿主细胞中表达时，sp2位于所述宿主细胞的细胞外部分中。在一些实施方案中，当在宿主细胞中表达时，sp1位于所述宿主细胞的细胞内部分中，而当在宿主细胞中表达时，sp2位于所述宿主细胞的细胞外部分中。在一些实施方案中，所述第一选择多肽由抗生素抗性基因、营养缺陷型基因或转录激活物或阻遏物编码。在一些实施方案中，所述第一选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，所述第一选择多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。在一些实施方案中，所述第二选择多肽由抗生素抗性基因、营养缺陷型基因或转录激活物或阻遏物编码。在一些实施方案中，所述第二选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，所述第二选择多肽多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。在一些实施方案中，sp1z为sp12-3，并且每个sp1与另一个不同。在一些实施方案中，sp2x为sp22-3，并且每个sp2与另一个不同。在一些实施方案中，所述第一选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，所述第二选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，所述抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，所述毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。在一些实施方案中，所述第一选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，所述第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽进一步包含标签。在一些实施方案中，将所述标签连接至所述经修饰的多跨膜多肽的n末端、所述经修饰的多跨膜多肽的c末端或其组合。在一些实施方案中，所述标签包括mbp、trxa、flag标签、avi标签或histag。

在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽进一步包括式(ia)的经修饰的多跨膜多肽：

sp2-l2m-msmp-l1n-sp1

式ia

其中：

msmp为包含至少一个修饰的多跨膜多肽；

sp1为连接至msmp的c末端的第一选择多肽，其中sp1对第一选择剂具有抗性；

sp2为连接至msmp的n末端的第二选择多肽，其中sp2对第二选择剂具有抗性；

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽进一步包括式(ii)的经修饰的受体多肽。

sp2x-l2m-rpy-l1n-sp1z

式ii

其中：

rp为选自离子通道多肽或gpcr的受体多肽，其中rp包含至少一个修饰；

sp1为连接至rp的c末端的第一选择多肽，其中sp1对第一选择剂具有抗性；

sp2为连接至rp的n末端的第二选择多肽，其中sp2对第二选择剂具有抗性；

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；

x独立地为0-3；

y独立地为1-5；

z独立地为1-3；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述离子通道多肽是电压门控离子通道多肽或瞬时受体电位通道多肽。在一些实施方案中，所述离子通道多肽包括trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，gpcr包括ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。

在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽进一步包括式(iii)的经修饰的受体多肽。

sp2x-l2m-gpcry-l1n-sp1z

式iii

其中：

gpcr为包含至少一个修饰的gpcr；

sp1为连接至gpcr的c末端的第一选择多肽，其中当在宿主细胞中表达时，sp1位于所述宿主细胞的细胞内部分中并且对第一选择剂具有抗性。

sp2为连接至gpcr的n末端的第二选择多肽，其中当在宿主细胞中表达时，sp2位于所述宿主细胞的细胞外部分中并且对第二选择剂具有抗性。

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；

x独立地为0-3；

y独立地为1-5；

z独立地为1-3；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，gpcr是哺乳动物gpcr。在一些实施方案中，gpcr是人gpcr。在一些实施方案中，gpcr包括ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。

在一些实施方案中，所述经修饰的多跨膜多肽进一步包括式(iv)的经修饰的受体多肽。

sp2x-l2m-icpy-l1n-sp1z

式iv

其中：

icp为包含至少一个修饰的离子通道多肽；

sp1为连接至icp的c末端的第一选择多肽，其中sp1对第一选择剂具有抗性；

sp2为连接至icp的n末端的第二选择多肽，其中sp2对第二选择剂具有抗性；

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；

x独立地为0-3；

y独立地为1-5；

z独立地为1-3；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述离子通道多肽包括trpv3、kca3.1或trpc6。

在某些实施方案中，本文公开了编码上述经修饰的多跨膜多肽的载体。

在某些实施方案中，本文公开了细胞培养组合物，其包含表达上述经修饰的多跨膜多肽的宿主细胞；和细胞培养基。

附图说明

本公开内容的各个方面在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解；在这些附图中：

图1图示了本文所述的平台的概念示意图，该平台用于生成具有改善或增强的物理化学性质的经修饰的多跨膜多肽。

图2示出了野生型膜受体及其增强的经修饰的多跨膜多肽(本文也称为“启用的膜蛋白”或“emp”)的western印迹。使用抗flaghrp缀合的抗体进行flag标记的经修饰的融合多跨膜多肽的染色。蛋白质分子量标准以kda表示分子量。

图3图示了在一轮诱变后在蛋白质-去污剂复合物中纯化的膜受体上使用荧光尺寸排阻色谱法(fsec)测定的热解折叠曲线。野生型受体以闭合圆圈示出，而稳定化突变体以三角形示出。

图4图示了纯化的野生型(黑色迹线)膜受体和五种突变多跨膜多肽的归一化fsec峰。对应于分析的多跨膜多肽的单体和二聚体(估计的分析样品的寡聚状态)的峰用黑色箭头表示。

图5a图示了样品纯化步骤的示意图表示。

图5b示出了在imac纯化步骤后使用gpcr样品(野生型(wt)和emp004和005)的hplc谱的样品同质性。

图5c比较了如图5b所示的相同样品即wt和emp004和005的产率。

图5d图示了在高盐缓冲液条件下使用cpm测定获得的gpcr样品(wt和emp001、002和003)的归一化熔解曲线。

图6a和图6b示出了使用spr的结合数据。两个传感图均图示了emp005样品的结合性质。

图6c示出了使用小分子化合物测定emp005质量和结合动力学的动力学数据。

图7图示了荧光标记的多克隆滴度的facs数据，所述多克隆滴度获自用gpr55emp-012dna免疫的c57bl6小鼠和针对用wt受体转染的hela细胞的纯化蛋白质。如箭头所示，右图示出了：阴性对照(a)、dna免疫后3周(b)、dna第一次加强(c)、dna第二次加强(d)、纯化蛋白质加强(e)。在in-cell-art(nantes,france)使用进行免疫工作。显示的数据来自两种代表性动物。使用用不相关的gpcr(左图)或wt-gpr55(右图)转染的hela细胞，对来自用gpr55emp-012免疫的动物的血清进行facs分析。

图8图示了纯化的趋化因子受体emp004，其用于以elisa形式测试对wt趋化因子受体具有特异性的抗体的结合。测试了两种类型的emp受体捕获：在冻融事件之前(▲)和在冻融事件之后(●)，并且它们显示相同的信号。使用his标签捕获emp004纯化的受体。

图9示出了gpcr-gpr55wt的一级氨基酸序列(seqidno:1)。

图10示出了gpcr-gpr55-emp-012的一级氨基酸序列(seqidno:2)。加下划线的残基表示相对于野生型gpr55序列的突变位置。

具体实施方式

多跨膜蛋白是细胞膜的必要组分，因为它们提供细胞的细胞外环境与细胞内环境之间的联系。在一些情况下，多跨膜蛋白构成约30％的蛋白质组并且对许多细胞和生理过程是至关重要的。在一些情况下，多跨膜蛋白也与许多病理状况(例如，内分泌疾病或癌症)有关。此外，例如，市场上约60％的现有药物与多跨膜蛋白相互作用或调节多跨膜蛋白。

在一些情况下，使用多跨膜蛋白的实验存在困难，因为多跨膜蛋白的脂质相互作用表面是高度疏水的并且需要使用模拟膜双层环境的去污剂或两亲分子。此外，多跨膜蛋白具有高构象柔性、低稳定性和/或低表达水平。此外，例如在实验期间，多跨膜蛋白的处理通常导致多跨膜蛋白的解折叠、失活和/或降解。

在一些实施方案中，本文描述了用于生成多跨膜蛋白(或经修饰的多跨膜多肽)的方法和平台，该多跨膜蛋白(或经修饰的多跨膜多肽)具有改善的性质(例如，物理化学性质)以用于在实验期间进行处理。在一些情况下，该方法和平台包括通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；和可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；以及在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择。

在一些实施方案中，本文还描述了筛选治疗剂(例如，多肽，如抗体或小分子)的方法。在一些实施方案中，针对本文所述的经修饰的多跨膜多肽筛选治疗剂的方法包括a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；d)生成生产载体，该生产载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；e)在第二多个宿主细胞中表达生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；f)将由步骤e)的生产载体生成的多跨膜多肽产物与治疗剂一起温育；以及g)检测该多跨膜多肽产物与治疗剂之间的结合。

在其他实施方案中，本文描述了由经修饰的多跨膜多肽生成的疫苗(例如，基于抗体的疫苗、基于核酸的疫苗或基于多肽的疫苗)。在一些情况下，疫苗是基于抗体的疫苗。在其他情况下，疫苗是基于多肽的疫苗或基于核酸的疫苗，其中经修饰的多跨膜多肽通过以下过程产生：a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；c)在存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；d)生成第二组生产载体，其中每个生产载体包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；e)在第二多个宿主细胞中表达第二组生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；以及f)用分析方法来分析由步骤e)的第二组生产载体生成的一组多跨膜多肽产物，以确定来自该组的、具有增强或改善的物理化学性质的多跨膜多肽产物，以用于生成疫苗，其中该增强或改善的物理化学性质是相对于对照多跨膜多肽的。

在另外的实施方案中，本文描述了针对本文所述的经修饰的多跨膜多肽选择的抗体组合物。在一些情况下，本文所述的分离并纯化的抗体或其结合片段包含重链cdr1、cdr2和cdr3序列以及轻链cdr1、cdr2和cdr3序列，其中该重链和轻链cdr与经修饰的多跨膜多肽相互作用，并且其中该抗体或其结合片段通过以下过程产生：a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至于多核苷酸的n末端；c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；d)生成生产载体，该生产载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；e)在第二多个宿主细胞中表达生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；f)将由步骤e)的生产载体生成的多跨膜多肽产物与一组抗体或其结合片段一起温育；以及g)选择与多跨膜多肽产物特异性结合的抗体或其结合片段。

在进一步的实施方案中，本文还描述了经修饰的多跨膜多肽构建体(例如，式i-iv的经修饰的多跨膜多肽)和包含经修饰的多跨膜多肽构建体、纯化的经修饰的多跨膜多肽、本文所述的抗体或本文所述的疫苗的试剂盒。

多跨膜多肽

在一些实施方案中，本文公开了用于生成经修饰的多跨膜多肽的平台。在一些情况下，本文还公开了生成经修饰的多跨膜多肽的方法。在一些实施方案中，多跨膜多肽包含全长膜蛋白或其片段。在一些情况下，多跨膜多肽片段是生物活性多肽片段。在一些情况下，该生物活性多肽片段是功能活性多肽片段、结构稳定的(例如，热稳定或ph稳定的)多肽片段或其组合。在一些情况下，多跨膜多肽包括整合膜蛋白、外周膜蛋白或多肽毒素。在一些情况下，整合膜蛋白进一步分类为整合多面(polytopic)蛋白(或跨膜蛋白)或整合单面(monotopic)蛋白。在一些情况下，整合多面蛋白是跨越膜至少一次并且落入两个三级结构类别—螺旋束蛋白或β桶蛋白—的膜蛋白。在一些情况下，整合单面蛋白是仅附着于膜的一侧并且不跨越脂双层的膜蛋白。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白、黏附素、移位酶或受体。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白。在一些情况下，质膜蛋白包括锚定在质膜或细胞最外层中的膜蛋白。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括核膜蛋白。在一些情况下，核膜蛋白包括与核膜的膜缔合或锚定在核膜的膜中的膜蛋白。在一些情况下，核膜蛋白进一步包括内核膜蛋白，例如，核纤层蛋白b受体(lbr)、纤层相关多肽1(lap1)、纤层相关多肽-2(lap2)、伊默菌素和man1(含有lem结构域的蛋白质3或lemd3)。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括外周膜蛋白。在一些情况下，外周膜蛋白包括仅暂时黏附于生物膜的膜蛋白。例如，与整合膜蛋白相互作用或穿透脂双层外周区域的膜蛋白有时被称为外周膜蛋白。另外，离子通道或跨膜受体的调节亚单位有时被称为外周膜蛋白。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括细胞内膜蛋白(例如，线粒体膜蛋白)。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括转运蛋白。在一些情况下，转运蛋白包括跨膜泵、护航蛋白、酸转运蛋白、阳离子转运蛋白或阴离子转运蛋白。在一些情况下，转运蛋白进一步被称为载体蛋白。载体蛋白是跨生物膜运送离子、小分子或大分子(例如，蛋白质)的蛋白质。在一些情况下，载体蛋白为囊泡转运蛋白。囊泡转运蛋白是促进囊泡跨生物膜转运的跨膜蛋白。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括通道蛋白。在一些情况下，通道蛋白包括形成水性孔的蛋白质，该水性孔延伸穿过允许诸如离子或小分子的溶质跨越转运的脂双层。在一些情况下，通道蛋白包括离子通道蛋白。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括黏附素。在一些情况下，黏附素包括黏附于感兴趣的细胞或表面的微生物细胞表面蛋白。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括移位酶。在一些情况下，移位酶包括有助于在一些情况下跨生物膜转运另一分子的蛋白质。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括受体。在一些情况下，将受体进一步细分为四类：1型受体或离子型受体；2型受体或g蛋白偶联受体；3型受体或激酶连接且相关的受体；以及4型受体或核受体。在一些情况下，受体是1型受体或离子型受体(例如，包含离子通道蛋白的亚组)。在一些情况下，受体是2型受体或g蛋白偶联受体。在一些情况下，受体是3型受体或激酶连接且相关的受体。在一些情况下，受体是4型受体或核受体。

g蛋白偶联受体

g蛋白偶联受体(gpcr)，也称为七跨膜结构域受体、7tm受体、七螺旋受体、蛇形受体或g蛋白连接受体(gplr)，构成在转运蛋白-视蛋白-g-蛋白偶联受体(tog)超家族下的gpcr受体家族。gpcr架构包括细胞外n末端部分，由三组外环(el-1至el-3)和细胞环(il-1至il-3)连续连接的七跨膜(tm)核心，和细胞内c末端尾部。在一些情况下，当c末端尾部在半胱氨酸残基处进一步棕榈酰化时，形成第四个细胞质环。在配体结合(例如，与离子、蛋白质、脂质、激素、神经递质、胺、核苷酸、气味分子或光子相互作用)后，gpcr经历构象变化，该构象变化随后激活g蛋白(或鸟嘌呤核苷酸结合蛋白)，例如，诱导g蛋白的α亚单位从其β和γ亚单位解离，从而启动下游信号传导激活的级联。在一些情况下，通过g蛋白的α亚单位类型，例如，gq/11α、g12/13α、gi/oα(g抑制的、g其他的)和gsα(g刺激的)来调节细胞内信号传导蛋白和/或靶功能蛋白。有时，在包括领鞭毛虫和酵母在内的真核生物中观察到gpcr。

在一些实施方案中，基于序列同源性和功能相似性将gpcr进一步分为6类。在一些情况下，该6类为a类(或第1类；视紫红质样)gpcr、b类(或第2类；分泌素受体家族)gpcr、c类(或第3类；代谢型谷氨酸/信息素)gpcr、d类(或第4类；真菌交配信息素受体)gpcr、e类(或第5类；环amp受体)gpcr和f类(或第6类；卷曲/平滑)gpcr。

a类gpcr(或第1类)是包含约800个成员的最大的gpcr组。在一些情况下，视紫红质样gpcr包含激素、神经递质和光受体。在另外的情况下，将视紫红质样gpcr进一步分类为19个亚组—亚家族a1-a19。示例性的a类(视紫红质样)gpcr包括但不限于，胺能：乙酰胆碱(毒蕈碱乙酰胆碱受体m1、m2、m3、m4和m5)、肾上腺素能(α-1a、α-1b、α-1d、α-2a、α-2b、α-2c-1、β-1、β-2、β-3)、多巴胺(d(1a)、d(1b)、d(2)、d(3)、d(4))、组胺(h1、h2、h3、h4)、血清素(5-ht-1a、5-ht-1b、5-ht-1d、5-ht-1e、5-ht-1f、5-ht-2a、5-ht-2b、5-ht-2c、5-ht-4、5-ht-5a、5-ht-6、5-ht-7)、大麻素(cb1、cb2)、糖蛋白激素(卵泡刺激激素受体(fsh-r)、gpr24黑色素浓缩激素受体、促黄体素-绒毛膜促性腺激素激素受体(lsh-r)、gpcr0459黑色素浓缩激素受体2(mch2)、促甲状腺激素受体(tsh-r))、脂质(类花生酸(白三烯(ltb(白三烯b4受体(又称p2y嘌呤受体7，p2y7)、白三烯b4受体(又称fishboyg蛋白偶联受体)和ltc(半胱氨酰白三烯受体cyslt2)、半胱氨酰白三烯受体(cyslt1))、前列腺素类(crth2(gpr44)、前列环素受体(前列腺素类ip受体)、前列腺素d2受体(前列腺素类dp受体)、前列腺素e2受体ep1亚型(前列腺素类ep1受体)、前列腺素e2受体ep2亚型(前列腺素类ep2受体)、前列腺素e2受体ep3亚型(前列腺素类ep3受体)、前列腺素e2受体ep4亚型(前列腺素ep4受体)、前列腺素f2-α受体(前列腺素类fp受体)、血栓素a2受体(txa2-r)(前列腺素类tp受体))、溶血鞘脂(edg-4、edg-1、edg6、edg-7、edg-2、edg-3、edg5、edg-8)、鞘氨醇磷酸胆碱(ogr1)、溶血磷脂酰胆碱(g2a)、褪黑激素(h9、mel-1a-r、mel-1b-r)、核苷酸(p2y12血小板adp受体)、腺苷(a1、a2a、a2b、a3)、核苷糖(kiaa0001、udp-葡萄糖)、p2u(p2u1、p2y2、p2y1、p2y11、p2y6)、嗅觉(or1a2、or1a1、嗅觉受体17-90、or17-24、6m1-16*01/02/03、6m1-18*01/02、6m1-4p*02/05、嗅觉受体89、ac006271、af143328、al096770-01、al096770-02、al096770-03、al096770-04、al121944、al135841、bc62940_2、bc85395_1、bc85395_3、f20569_1、f20722_1、f20722_2、fat11、gpr1、grir-1、or17-4、hgmp07i、hgmp07j、hi7、hor5'β、hor5'β、hor3'β1、hpfh1or、hs6m1-1、hs6m1-3、hs6m1-6、hsa1、hsa10、hsa3、hsa5、hsa8、or16-35、h_dj0855d21.1、h_dj0988g15.2、jcg2、olf1、olf3、olf4、olfr42b、olfr42b、olrcc15、or1-25、or1-26、or10a1、or17-201、or17-209、or17-210、or17-219、or17-228、or17-30、or17-40、or2c1、or2d2、or5-40、or5d3、or5f1、or6a1、or7-138、r30385_1、tpcr100、tpcr110、tpcr120、tpcr16、tpcr24、tpcr25、tpcr26、tpcr27、tpcr85、tpcr92、z98744、dj25j6.1、dj88j8.1、前列腺特异性嗅觉受体)、假定的味觉受体htr2、视蛋白(蓝色敏感视蛋白、脑视蛋白，绿色敏感视蛋白、黑视素、rpe-视黄醛g蛋白偶联受体、红色敏感视蛋白、视紫红质、视色素样受体、周视蛋白)、肽(血管紧张素(at1、at2)、爱帕琳肽(apelin)(apj)、铃蟾肽(brs-3、grp-r(grp-偏爱的铃蟾肽受体)、神经介素-b受体、nmb-r(神经介素-b-偏爱的铃蟾肽受体))、缓激肽(bk-1受体、bk-2受体)、趋化因子(cc(ccr1、ccr10、ccr11、ccr2、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、cx3cr1、xcr1、cxcr3、cxcr4、cxcr5、fmet-leu-phe受体(fmlp受体)、fmlp相关受体i(fmlp-r-i)、fmlp相关受体ii(fmlp-r-ii)、白细胞介素(cxcr1、cxcr2)、过敏毒素(c3a-r、c5a-r))、胆囊收缩素(cck-a受体、cck-b受体)、内皮素(et-b、et-a)、甘丙肽(gal1-r、gal2-r、gal3-r)、黑皮质素(mc1-r(msh-r)、mc2-r(acth-r)、mc3-r、mc5-r))、胃动素(gpr38(胃动素受体))、神经肽(npff(npff2、rf酰胺相关肽受体)、神经肽y(npy1-r、npy2-r、npy4-r、npy5-r、npy6-r)、神经降压素(ntr1、ntr2)、阿片样物质(dor-1、kor-1、mor-1、痛敏肽受体、kor-3)、食欲素(食欲素受体1型、ox1r(下丘脑分泌素受体1型)、ox2r(下丘脑分泌素受体2型))、其他肽(kiss受体(gpr54))、蛋白酶激活(par-2、par-3、par-4、凝血酶受体)、生长抑素(ss5r、ss1r、ss2r、ss3r、ss4r)、速激肽(nk-3受体、nk-4受体、nmu1r(又称fm3)、nmu2r、nk-2受体、nk-1受体)、尾加压素(尾加压素ii受体、gpr14)、血管加压素(ot-r、血管加压素v1a受体、血管加压素v1b受体、血管加压素v2受体)、血小板激活物(白细胞血小板激活物受体、血小板激活物受体(paf-r))、释放激素(gnrh-r、ghs-r、催乳素释放肽受体(gpr10)、促甲状腺激素释放激素受体(trh-r)、ii型gnrh-r蛋白))。

在一些情况下，将一种或多种a类gpcr进一步分类为孤儿gpcr。在一些情况下，孤儿gpcr是指其中尚未鉴定其内源配体的gpcr。在这类情况下，当鉴定出配体时，随后将孤儿状态重新指定为采用的gpcr。示例性的a类孤儿gpcr包括但不限于5-羟色胺受体同源物、跨膜受体heoad54、趋化因子受体、趋化因子受体样1、g蛋白偶联受体dez、趋化因子受体样2、il-8相关受体dry12gpr30cepr、背根受体1drr1、背根受体2drr2、背根受体3drr3、背根受体4drr4、背根受体5drr5、背根受体6drr6、达菲(duffy)抗原、ebv诱导的g蛋白偶联受体2(ebi2)、edg同源物、edg同源物(gpr45)、edg同源物、gpr35、gpr37、gpr75、g蛋白偶联受体(raig1)、bonzo(strl33)、d38449、etbr-lp-2、gpr1、gpr12、gpr15、gpr17、gpr18、gpr19、gpr20、gpr22、gpr3(acca“孤儿”受体)、gpr31、gpr32、gpr34、gpr39、gpr4(gpr19)、gpr40、gpr41、gpr43、gpr55、gpr6、gpr7、gpr73、gpr8、hg38、hm74、lgr4、rdc1同系物、gpr48、gpr61、gpr62、gpr77、gpr84、gpr86、gpr87、gpr72、gprc5b、h7tba62、g蛋白偶联受体r97222、salpr、y13583、y36302、gpr58、gpr57、re2、gpr21、gpr52、sreb1、sreb2、sreb3、lgr7、mas原癌基因、mas相关g蛋白偶联受体mrg、神经降压素受体ntr2受体同源物、gpr25、h963、p2y10、p2y5、p2y9、fmlp相关受体同源物、信息素受体同源物、n-甲酰肽受体同源物、gpr92、raig1同系物、fksg46、fksg47、v1rl1、cram-a、fksg80、七跨膜结构域蛋白p40同源物tasp睾丸特异性阿霉素敏感蛋白、纹状体特异性g蛋白偶联受体、t细胞死亡相关蛋白和胸主动脉g蛋白偶联受体。

b类gpcr(或第2类)包含gpcr的分泌素家族。在一些情况下，分泌素受体受来自胰高血糖素激素家族的肽激素调节。在一些情况下，示例性的b类gpcr包括但不限于分泌素(bai-1、bai-2、bai-3)、降钙素基因相关肽1型受体、降钙素受体(ct-r)、gip-r、胰高血糖素受体(gl-r)、胰高血糖素样肽1受体(glp-1受体)、胰高血糖素样肽-2受体(glp2r)、生长激素释放激素受体(ghrh受体)、白细胞抗原cd97、眼白化病1型蛋白、pth2受体、pthr受体、pacap-r-1、fmi1(megf2)、sct-r、crh(crf1、crf2)、vip(vip-r-1、vip-r-2)。

在一些情况下，b类孤儿gpcr包括例如钙粘蛋白egflag七通g型受体(celsr1)、细胞表面糖蛋白emr1、b类g蛋白偶联受体y91625、含有粘蛋白样受体emr3的egf样模块、flamingo1(fmi1)、emr2、flj14454、kiaa1828、al033377(he6同系物)、etl、gpr56、he6、kiaa0758、蛛毒素受体-1、蛛毒素受体-2、蛛毒素受体-3、vlgr1。

c类gpcr(或第3类)包含gpcr的代谢型谷氨酸信息素家族。在一些情况下，示例性的c类gpcr包括但不限于代谢型钙敏感受体(casr)、代谢型谷氨酸受体1、代谢型谷氨酸受体2、代谢型谷氨酸受体3、代谢型谷氨酸受体4、代谢型谷氨酸受体5、代谢型谷氨酸受体6、代谢型谷氨酸受体7、代谢型谷氨酸受体8、感觉转导g蛋白偶联受体-b3、味觉受体gpcr-b4和gaba-b(gaba-b1a受体、gaba-b2受体)。

d类gpcr(或第4类)包括真菌交配信息素受体。示例性的交配因子受体包括ste2和ste3。

e类gpcr(或第5类)包括环amp受体。

f类gpcr(或第6类)包括卷曲/平滑gpcr家族。示例性的f类gpcr包括但不限于卷曲1跨膜受体、卷曲10跨膜受体、卷曲2跨膜受体、卷曲3跨膜受体、卷曲4跨膜受体、卷曲5跨膜受体、卷曲6跨膜受体、卷曲7跨膜受体、卷曲9跨膜受体、卷曲样受体平滑同系物(smo)和卷曲7同源物。

在一些实施方案中，本文所述的gpcr进一步包括味觉gpcr。示例性的味觉gpcr包括但不限于t2r1、t2r10、t2r13、t2r14、t2r16、t2r3、t2r4、t2r5、t2r7、t2r8和t2r9。

在一些实施方案中，受体为gpcr。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是gpcr。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是a类、b类、c类、d类、e类或f类gpcr。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是味觉gpcr。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。

离子通道多肽

离子通道蛋白是一种成孔膜蛋白，其调节离子穿过细胞膜的流动、调节细胞体积并建立静息膜电位。在一些情况下，离子通道蛋白包括电压门控离子通道或配体门控离子通道。在一些情况下，离子通道蛋白包括钙激活钾通道、catsper和双孔通道、环核苷酸调节通道、内向整流钾通道、兰尼碱受体、瞬时受体电位通道、双孔钾通道、电压门控钙通道、电压门控钾通道、电压门控质子通道、电压门控钠通道、5-ht3受体、酸敏感(质子门控)离子通道(asic)、上皮钠通道(enac)、gabaa受体、甘氨酸受体、离子型谷氨酸受体、ip3受体、烟碱乙酰胆碱受体、p2x受体或zac。

在一些实施方案中，受体为离子通道多肽。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是离子通道多肽。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包括选自钙激活钾通道、catsper和双孔通道、环核苷酸调节通道、内向整流钾通道、兰尼碱受体、瞬时受体电位通道、双孔钾通道、电压门控钙通道、电压门控钾通道、电压门控质子通道、电压门控钠通道、5-ht3受体、酸敏感(质子门控)离子通道(asic)、上皮钠通道(enac)、gabaa受体、甘氨酸受体、离子型谷氨酸受体、ip3受体、烟碱乙酰胆碱受体、p2x受体或zac的离子通道多肽。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包括经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。

用于生成经修饰的跨膜多肽的平台

在某些实施方案中，本文公开了用于生成具有改善或增强的物理化学性质的经修饰的多跨膜多肽的方法和平台。在一些情况下，本文所述的方法或平台包括通过诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽，将编码经修饰的多跨膜多肽的多核苷酸插入包含c末端选择标记和可选的n末端选择标记的表达载体中，以及在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在宿主细胞中表达该载体，以鉴定稳定折叠的经修饰的多跨膜多肽。

在一些情况下，本文所述的用于生成具有改善或增强的物理化学性质的经修饰的多跨膜多肽的方法和平台如图1所示。在一些情况下，方法或平台包括通过诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽(101)。在一些情况下，该诱变方法为随机诱变。示例性的随机诱变包括易错pcr、滚环易错pcr、增变菌株、暂时增变菌株、插入诱变、甲磺酸乙酯、亚硝酸或dna改组。在一些情况下，该诱变方法为易错pcr方法。在一些情况下，该诱变方法为dna改组方法。在其他情况下，该诱变方法为非随机诱变方法。在文库生成后，随后将文库中每个经修饰的多跨膜多肽编码在表达载体中以经历选择过程(102)。在一些情况下，该表达载体进一步包含位于经修饰的多跨膜多肽的c末端的第一选择标记。这样的选择标记有时选择防止多跨膜多肽的过早截短，并且/或者促进多跨膜多肽的稳定且正确的折叠。在一些情况下，该表达载体任选地包含位于经修饰的多跨膜多肽的n末端的第二选择标记。在一些情况下，第二选择标记的存在促进多跨膜多肽的稳定且正确的折叠。在一些情况下，由宿主细胞机器进一步标记并去除错误折叠的多肽以进行降解。在一些情况下，第一选择标记编码第一选择多肽，并且第二选择标记编码第二选择多肽。在一些情况下，在存在或不存在至少一种选择剂的情况下(例如，在存在抗生素或在不存在营养缺陷剂的情况下)，该表达载体在宿主细胞中表达。在一些情况下，当第一选择多肽适当地展示在经修饰的多跨膜多肽的c末端部分上且第二选择多肽适当地展示在经修饰的多跨膜多肽的n末端部分上时，通过与第一选择多肽的相互作用和与第二选择多肽的相互作用，使至少一种选择剂对宿主细胞无毒。在一些情况下，所述至少一种选择剂包括抗生素(例如，氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素或四环素)或毒性代谢物(例如5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑)。在一些情况下，所述至少一种选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在选择过程(102)的一些情况下，鉴定经历额外轮次的随机诱变(101)(例如，2、3、4、5轮或更多轮的随机诱变)和选择过程(102)的经修饰的多跨膜多肽，从而鉴定能够传递感兴趣的物理化学性质的最小突变组。在选择过程(102)的其他情况下，鉴定经修饰的多跨膜多肽的表达和表征(103)。在一些情况下，评价一种或多种物理化学性质，例如，表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性或途径激活选择性中的一种或多种。在一些情况下，增强的物理化学性质如增加的稳定性(例如，热稳定性或ph稳定性)和改善的蛋白质形成晶体的倾向进一步与改善的免疫原性和抗原性相关。在一些情况下，一种或多种分析技术用于表征过程(103)，并且包括x射线晶体学、电子晶体学、冷冻电子显微术、核磁共振光谱(nmr)、热变性技术和/或化学变性技术。在一些情况下，从表达和表征步骤(103)中，鉴定出候选的经修饰的多跨膜多肽以用于大规模蛋白质生产(104)，随后进行候选的经修饰的多跨膜多肽的结晶(105)、小分子筛选(106)、抗体和/或肽筛选(107)，以及/或者疫苗生产(108)。在一些情况下，候选的经修饰的多跨膜多肽在昆虫宿主细胞或哺乳动物宿主细胞中产生。在一些情况下，噬菌体展示或酵母展示用于抗体筛选，并在筛选过程期间将候选的经修饰的多跨膜多肽固定化在纳米颗粒上。在一些情况下，从抗体筛选(107)鉴定的抗体被进一步配制用于疫苗。在一些情况下，从肽筛选(107)鉴定的候选的经修饰的多跨膜多肽的肽被进一步配制用于疫苗。在其他情况下，由蛋白质生产步骤(104)产生的候选的经修饰的多跨膜多肽被进一步配制用于疫苗(例如，基于核酸的疫苗、基于抗原呈递细胞(apc)的疫苗或基于病毒的疫苗)。

经修饰的多跨膜多肽

在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包含一个或多个修饰。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包含约1至约100个修饰。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包含约1至约90、约5至约80、约10至约70、约15至约60、约20至约50、约30至约40、约1至约80、约1至约60、约1至约50、约1至约40、约1至约30、约1至约15、约1至约10、约10至约80、约10至约60、约10至约50、约10至约40、约20至约80、约20至约60、约20至约40、约30至约80、约30至约60或约30至约50个修饰。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。

在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体。在一些情况下，选自质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体的经修饰的多跨膜多肽包含约1至约100个修饰。在一些情况下，选自质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体的经修饰的多跨膜多肽包含约1至约90、约5至约80、约10至约70、约15至约60、约20至约50、约30至约40、约1至约80、约1至约60、约1至约50、约1至约40、约1至约30、约1至约15、约1至约10、约10至约80、约10至约60、约10至约50、约10至约40、约20至约80、约20至约60、约20至约40、约30至约80、约30至约60或约30至约50个修饰。在一些情况下，选自质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体的经修饰的多跨膜多肽包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽是离子通道蛋白。在一些情况下，离子通道蛋白包含约1至约100个修饰。在一些情况下，离子通道蛋白包含约1至约90、约5至约80、约10至约70、约15至约60、约20至约50、约30至约40、约1至约80、约1至约60、约1至约50、约1至约40、约1至约30、约1至约15、约1至约10、约10至约80、约10至约60、约10至约50、约10至约40、约20至约80、约20至约60、约20至约40、约30至约80、约30至约60或约30至约50个修饰。

在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约1个或多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约2个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约3个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约4个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约5个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约6个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约7个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约8个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约9个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约10个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约11个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约12个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约13个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约14个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约15个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约16个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约17个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约18个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约19个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约20个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约25个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约30个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约35个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约40个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约45个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，离子通道蛋白包含约50个或更多个经修饰的氨基酸残基。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽是受体。在一些情况下，受体是gpcr。在一些情况下，gpcr包含约1至约100个修饰。在一些情况下，gpcr包含约1至约90、约5至约80、约10至约70、约15至约60、约20至约50、约30至约40、约1至约80、约1至约60、约1至约50、约1至约40、约1至约30、约1至约15、约1至约10、约10至约80、约10至约60、约10至约50、约10至约40、约20至约80、约20至约60、约20至约40、约30至约80、约30至约60或约30至约50个修饰。

在一些实施方案中，gpcr包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约1个或多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约2个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约3个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约4个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约5个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约6个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约7个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约8个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约9个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约10个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约11个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约12个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约13个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约14个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约15个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约16个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约17个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约18个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约19个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约20个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约25个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约30个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约35个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约40个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约45个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些情况下，gpcr包含约50个或更多个经修饰的氨基酸残基。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体。在一些情况下，选自质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体的经修饰的多跨膜多肽包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽是离子通道蛋白。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约0.5％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约1％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约2％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约3％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约4％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约5％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约6％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约7％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约8％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约9％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约10％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约11％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约12％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约13％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约14％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约15％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约20％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约25％或更多的修饰。在一些实施方案中，离子通道蛋白包含约30％或更多的修饰。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽是受体。在一些情况下，受体是gpcr。在一些实施方案中，gpcr包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约0.5％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约1％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约2％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约3％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约4％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约5％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约6％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约7％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约8％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约9％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约10％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约11％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约12％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约13％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约14％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约15％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约20％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约25％或更多的修饰。在一些实施方案中，gpcr包含约30％或更多的修饰。

在一些实施方案中，一个或多个修饰位于gpcr的n末端部分、gpcr的跨膜核心(tm)、gpcr的c末端部分或其组合。在一些情况下，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个或更多个修饰位于gpcr的n末端部分。在一些情况下，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个或更多个修饰位于gpcr的tm内，例如，位于tm1、tm2、tm3、tm4、tm5、tm6、tm7或其组合内。在另外的情况下，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个或更多个修饰位于gpcr的c末端部分。

在一些实施方案中，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的物理化学性质相关。在一些情况下，物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性和/或途径激活选择性。在一些情况下，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的物理化学性质相关，其中该物理化学性质选自表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性和/或途径激活选择性。在一些情况下，该多跨膜多肽是离子通道蛋白或gpcr。在一些情况下，上文所述的修饰与离子通道蛋白相对于其野生型的增强或改善的物理化学性质相关，其中该物理化学性质选自表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性和/或途径激活选择性。在另外的情况下，上文所述的修饰与gpcr相对于其野生型的增强或改善的物理化学性质相关，其中该物理化学性质选自表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性和/或途径激活选择性。

在一些实施方案中，物理化学性质是改善或增强的表达水平。在一些情况下，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的表达水平相关。在一些情况下，该多跨膜多肽是离子通道蛋白或gpcr。在一些情况下，上文所述的修饰与离子通道蛋白相对于其野生型的增强或改善的表达水平相关。在一些情况下，上文所述的修饰与gpcr相对于其野生型的增强或改善的表达水平相关。

在一些实施方案中，物理化学性质是改善或增强的稳定性。在一些情况下，稳定性进一步包括ph稳定性和热稳定性。在一些情况下，多跨膜多肽的ph稳定性是多肽保持折叠并在限定的ph范围内保持生物学功能(例如，生物学活性)的能力。在一些情况下，限定的ph范围为约1至约11、约3至约9、约4至约9、约5至约9、约6至约9或约7至约9。在一些情况下，限定的ph为至少约1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11或更高。

在一些情况下，多跨膜多肽的热稳定性是多肽保持折叠并在限定的温度内保持生物学功能(例如，生物学活性)的能力。在一些情况下，限定的温度范围为约0℃至约120℃、约10℃至约100℃、约15℃至约80℃、约20℃至约60℃、约25℃至约50℃、约30℃至约40℃、约15℃至约37℃、约20℃至约37℃、约25℃至约37℃、约25℃至约50℃或约37℃至约50℃。在一些情况下，限定的温度范围为至少约1℃、4℃、5℃、8℃、10℃、15℃、16℃、18℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、42℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、100℃或更高。

在一些情况下，多跨膜多肽的热稳定性进一步与该多跨膜多肽的熔点相关。在一些情况下，通过加热多跨膜多肽样品并利用诸如热位移分析(例如，使用染料的荧光位移)、差示扫描量热法、圆二色性、峰移位分析(基于hplc/尺寸排阻色谱法)等技术来测定解折叠、失活、聚集或降解来生成熔点曲线。在一些情况下，热稳定性是指经修饰的多跨膜多肽相对于其野生型升高的熔点(或解链温度)。在一些情况下，升高的温度是升高约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30度或更多度。

在一些情况下，稳定性进一步包括多跨膜多肽在一系列去污剂、表面活性剂和增溶缓冲液中的稳定性，这使得其能够在其正常膜环境之外进行纯化。因此，该多跨膜多肽以从非所需抗原如非靶膜蛋白、膜相关蛋白或其他膜组分如脂蛋白、载脂蛋白、脂质、磷酸肌醇脂质和脂糖中移除的分离形式提供。

在一些情况下，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的稳定性(例如，ph稳定性或热稳定性)相关。在一些情况下，该多跨膜多肽是离子通道蛋白或gpcr。在一些情况下，上文所述的修饰与离子通道蛋白相对于其野生型的增强或改善的稳定性(例如，ph稳定性或热稳定性)相关。在一些情况下，上文所述的修饰与gpcr相对于其野生型的增强或改善的稳定性(例如，ph稳定性或热稳定性)相关。

在一些实施方案中，物理化学性质是改善或增强的构象选择性。在一些情况下，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的构象选择性相关。在一些情况下，该多跨膜多肽是离子通道蛋白或gpcr。在一些情况下，上文所述的修饰与离子通道蛋白相对于其野生型的增强或改善的构象选择性相关。在一些情况下，上文所述的修饰与gpcr相对于其野生型的增强或改善的构象选择性相关。

在一些实施方案中，物理化学性质是改善或增强的同质性。在一些情况下，同质性是指多结构相似性或均一性和/或多跨膜多肽群体内一种或多种物理化学性质的均一性。在一些情况下，多跨膜多肽的降低的蛋白质构象可变性与样品内多跨膜多肽的增加或更高程度的同质性相关。在其他情况下，多跨膜多肽的降解和/或解折叠的增加与样品内多跨膜多肽同质性的降低相关。

在一些情况下，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的同质性相关。在一些情况下，该多跨膜多肽是离子通道蛋白或gpcr。在一些情况下，上文所述的修饰与离子通道蛋白相对于其野生型的增强或改善的同质性相关。在一些情况下，上文所述的修饰与gpcr相对于其野生型的增强或改善的同质性相关。

在一些实施方案中，物理化学性质是改善或增强的蛋白质结晶。在一些情况下，改善或增强的蛋白质结晶是指多跨膜多肽易于结晶的倾向。例如，促使多跨膜多肽及其复合物在过饱和条件下形成晶体。在这些条件下，单个蛋白质分子以重复阵列包装，通过非共价相互作用保持在一起。然后将这些晶体用于结构生物学以研究蛋白质的分子结构，和/或用于工业或生物技术目的。在一些情况下，由于水性环境的限制，难以获得高质量的蛋白质样品，或者诸如蛋白质样品对温度、ph和离子强度的敏感性的因素，因此蛋白质结晶被认为具有挑战性。在一些情况下，同一组多跨膜蛋白中的多跨膜蛋白的物理化学特征不同，并且因此特别感兴趣的蛋白质的结晶是不可预测的。在一些情况下确定，给定蛋白质的适当结晶条件需要在发现成功的结晶条件之前对许多条件进行经验测试。在一些情况下，本文所述的改善或增强的蛋白质结晶是指增加的高质量蛋白质样品、增加的蛋白质晶体衍射、降低的异质性或改善的稳定性。

在一些情况下，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的蛋白质结晶相关。在一些情况下，该多跨膜多肽是离子通道蛋白或gpcr。在一些情况下，上文所述的修饰与离子通道蛋白相对于其野生型的增强或改善的蛋白质结晶相关。在一些情况下，上文所述的修饰与gpcr相对于其野生型的增强或改善的蛋白质结晶相关。

在一些实施方案中，物理化学性质是改善或增强的抗原性。在一些情况下，抗原性是化学结构(例如，抗原)与抗体或其结合片段或体液和/或与细胞介导的免疫应答的产物相互作用或特异性结合的能力。

在一些情况下，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的抗原性相关。在一些情况下，该多跨膜多肽是离子通道蛋白或gpcr。在一些情况下，上文所述的修饰与离子通道蛋白相对于其野生型的增强或改善的抗原性相关。在一些情况下，上文所述的修饰与gpcr相对于其野生型的增强或改善的抗原性相关。

在一些实施方案中，物理化学性质是改善或增强的免疫原性。在一些情况下，免疫原性是化学结构(例如，免疫原)诱导体液和/或细胞介导的免疫应答的能力。

在一些情况下，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的免疫原性相关。在一些情况下，该多跨膜多肽是离子通道蛋白或gpcr。在一些情况下，上文所述的修饰与离子通道蛋白相对于其野生型的增强或改善的免疫原性相关。在一些情况下，上文所述的修饰与gpcr相对于其野生型的增强或改善的免疫原性相关。

在一些实施方案中，物理化学性质是改善或增强的途径激活选择性。在一些情况下，改善或增强的途径激活选择性是指多跨膜多肽从多个可用的代谢或信号传导途径中选择性激活一个或多个数目的代谢或信号传导途径的能力。

在一些情况下，上文所述的修饰与多跨膜多肽相对于其野生型的增强或改善的途径激活选择性相关。在一些情况下，该多跨膜多肽是离子通道蛋白或gpcr。在一些情况下，上文所述的修饰与离子通道蛋白相对于其野生型的增强或改善的途径激活选择性相关。在一些情况下，上文所述的修饰与gpcr相对于其野生型的增强或改善的途径激活选择性相关。

在一些实施方案中，改善的热稳定性和/或同质性进一步调节(例如，改善)本文所述的经修饰的多跨膜多肽的蛋白质结晶、抗原性、免疫原性、途径激活选择性和/或其他物理化学性质。

在一些实施方案中，修饰包括插入、缺失或突变。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包含插入、缺失、突变或其组合。在一些情况下，突变包括无义突变或错义突变。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽进一步包含截短。在一些情况下，截短位于经修饰的多跨膜多肽的n末端、经修饰的多跨膜多肽的c末端或二个末端。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽还包含内部缺失或内部插入。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包含内部缺失。在其他情况下，经修饰的多跨膜多肽包含内部插入。

在一些情况下，修饰包括对疏水性或非极性氨基酸残基的突变。在一些情况下，疏水性或非极性氨基酸包括小疏水性氨基酸和大疏水性氨基酸。示例性的小疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及其类似物。示例性的大疏水性氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及其类似物。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽包含对小疏水性氨基酸的突变(例如，对甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及其类似物的突变)。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽包含对大疏水性氨基酸的突变(例如，对缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及其类似物的突变)。

在一些情况下，修饰包括对极性氨基酸残基的突变。在一些情况下，极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸及其类似物。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽包含对极性氨基酸残基的突变(例如，对丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸及其类似物的突变)。

在另外的情况下，修饰包括对带电荷氨基酸残基的突变。在一些情况下，带电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或其类似物。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽包含对带电荷的氨基酸残基的突变(例如，对赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或其类似物的突变)。

在一些实施方案中，本文所述的经修饰的多跨膜多肽包含对非必需氨基酸的修饰。在一些情况下，非必需氨基酸残基是从多肽的野生型序列改变而没有消除或基本上改变其基本生物学或生物化学活性(例如，受体结合或激活)的残基。在一些情况下，本文提供的经修饰的多跨膜多肽包含必需氨基酸。在一些情况下，必需氨基酸残基是当从多肽的野生型序列改变时导致消除或基本上消除多肽的基本生物学或生物化学活性的残基。

在一些实施方案中，本文所述的经修饰的多跨膜多肽包含保守氨基酸置换。在一些情况下，保守氨基酸置换是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括，例如，具有碱性侧链(例如，k、r、h)、酸性侧链(例如，d、e)、不带电荷的极性侧链(例如，g、n、q、s、t、y、c)、非极性侧链(例如，a、v、l、i、p、f、m、w)、β-支链侧链(例如，t、v、i)和芳族侧链(例如，y、f、w、h)的氨基酸。因此，例如，多肽中预测的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的另一氨基酸残基替换。可接受的置换的其他实例包括基于等排考虑(例如，用正亮氨酸置换甲硫氨酸)或其他性质(例如，用2-噻吩丙氨酸置换苯丙氨酸，或用6-cl-色氨酸置换色氨酸)的置换。

选择标记

在一些实施方案中，选择标记基因包括抗生素抗性基因或营养缺陷型基因。在一些情况下，选择标记基因不编码报告蛋白(例如，荧光蛋白)。如上所述，选择标记在一些情况下有助于本文所述的经修饰的多跨膜多肽的稳定且正确的折叠。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽的稳定且正确的折叠是指多肽的结构架构经翻译后加工后使该多肽能够实现其生物学功能的多肽。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽的稳定且正确的折叠进一步指具有生物学活性功能的多肽。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽的稳定且正确的折叠不是指具有错误折叠结构架构的多肽或具有阻止多肽经历其生物学功能或活性的结构架构的多肽。

在一些情况下，选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、编码绿色荧光蛋白的基因、编码红色荧光蛋白的基因、编码tdtomato荧光蛋白的基因或编码荧光素酶的基因。在一些情况下，选择标记基因编码氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因。在一些情况下，选择标记基因是第一选择标记基因或第二选择标记基因。在一些情况下，第一选择标记基因和/或第二选择标记基因不包含报告基因。

在一些情况下，选择标记基因是第一选择标记基因。在一些实施方案中，第一选择标记基因包括抗生素抗性基因或营养缺陷型基因。在一些情况下，第一选择标记基因不编码报告蛋白(例如，荧光蛋白)。在一些情况下，第一选择标记基因编码氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因。

在一些情况下，选择标记基因是第二选择标记基因。在一些实施方案中，第二选择标记基因包括抗生素抗性基因或营养缺陷型基因。在一些情况下，第二选择标记基因不编码报告蛋白(例如，荧光蛋白)。在一些情况下，第二选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因。

在一些情况下，第一选择标记基因和第二选择标记基因是相同的。在其他情况下，第一选择标记基因和第二选择标记基因是不同的。

在一些实施方案中，第一选择标记基因和/或第二选择标记基因直接可操作地连接至编码经修饰的多跨膜多肽的多核苷酸，或通过编码约1至约60个氨基酸残基的连接体基因间接连接。在一些情况下，第一选择标记基因直接可操作地连接至编码经修饰的多跨膜多肽的多核苷酸，或通过编码约1至约60个氨基酸残基的连接体基因间接连接。在一些情况下，第二选择标记基因直接可操作地连接至编码经修饰的多跨膜多肽的多核苷酸，或通过编码约1至约60个氨基酸残基的连接体基因间接连接。在一些情况下，该连接体基因编码约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，第一和第二选择标记对选择剂具有选择性。在一些实施方案中，该选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，该抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，该毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。在一些实施方案中，该选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。

在一些实施方案中，所述选择剂包括第一选择剂和第二选择剂。在一些实施方案中，第一选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，第二选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，该抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，该毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。

在一些实施方案中，第一选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。

式i-iv的经修饰的跨膜多肽

在一些实施方案中，本文公开了生成式(i)的经修饰的多跨膜多肽：

sp2x-l2m-msmpy-l1n-sp1z

式i

其中：

msmp为包含至少一个修饰的多跨膜多肽；

sp1为连接至msmp的c末端的第一选择多肽，其中sp1对第一选择剂具有抗性；

sp2为连接至msmp的n末端的第二选择多肽，其中sp2对第二选择剂具有抗性；

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；

x独立地为0-3；

y独立地为1-5；

z独立地为1-3；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些实施方案中，经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些实施方案中，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些实施方案中，经修饰的gpcr包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，经修饰的gpcr包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。

在一些实施方案中，通过随机诱变方法生成所述至少一个修饰。在一些情况下，该随机诱变方法包括易错pcr方法。在一些情况下，该随机诱变方法包括dna改组方法。

在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括插入、缺失或突变。在一些实施方案中，该突变包括无义突变或错义突变。在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括n末端截短、c末端截短或其组合。

在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是哺乳动物gpcr。在一些实施方案中，所述经修饰的gpcr是人gpcr。

在一些实施方案中，第一选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第一选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第一选择多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些实施方案中，第二选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第二选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第二选择多肽多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分中，而当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞外部分中。

在一些情况下，sp1和sp2是相同的。在其他情况下，sp1和sp2是不同的。在一些情况下，sp1和sp2分别通过l1和l2进一步连接至msmp。在一些情况下，l1的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。在一些情况下，l2的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，sp1z为sp12-3，并且每个sp1与另一个不同。在一些情况下，sp1z为sp13，并且三个sp1中的两个是相同的。在一些情况下，每个sp1进一步直接或通过连接体多肽间接连接至另一个sp1。在一些情况下，该连接体多肽包含约1至约60个氨基酸残基，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，sp2x为sp22-3，并且每个sp2与另一个不同。在一些情况下，sp2x为sp23，并且三个sp1中的两个是相同的。在一些情况下，每个sp2直接或通过连接体多肽间接连接至另一个sp2。在一些情况下，该连接体多肽包含约1至约60个氨基酸残基，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，第一选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，第二选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，该抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，该毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。

在一些实施方案中，第一选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽进一步包含标签。在一些实施方案中，该标签连接至经修饰的多跨膜多肽的n末端、经修饰的多跨膜多肽的c末端或其组合。在一些实施方案中，该标签包括mbp、trxa、flag标签、avi标签或histag。

在一些实施方案中，本文公开了生成式(ia)的经修饰的多跨膜多肽：

sp2-l2m-msmp-l1n-sp1

式ia

其中：

msmp为包含至少一个修饰的多跨膜多肽；

sp1为连接至msmp的c末端的第一选择多肽，其中sp1对第一选择剂具有抗性；

sp2为连接至msmp的n末端的第二选择多肽，其中sp2对第二选择剂具有抗性；

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体。在一些实施方案中下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些实施方案中，经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些实施方案中，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些实施方案中，经修饰的gpcr包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，经修饰的gpcr包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。

在一些实施方案中，通过随机诱变方法生成所述至少一个修饰。在一些情况下，该随机诱变方法包括易错pcr方法。在一些情况下，该随机诱变方法包括dna改组方法。

在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括插入、缺失或突变。在一些实施方案中，该突变包括无义突变或错义突变。在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括n末端截短、c末端截短或其组合。

在一些实施方案中，经修饰的gpcr是哺乳动物gpcr。在一些实施方案中，经修饰的gpcr是人gpcr。

在一些实施方案中，第一选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第一选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第一选择多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些实施方案中，第二选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第二选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第二选择多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分中，而当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞外部分中。

在一些情况下，sp1和sp2是相同。在其他情况下，sp1和sp2是不同的。在一些情况下，sp1和sp2分别通过l1和l2进一步连接至msmp。在一些情况下，l1的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。在一些情况下，l2的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，第一选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，第二选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，该抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，该毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。

在一些实施方案中，第一选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。

在一些实施方案中，经修饰的多跨膜多肽进一步包含标签。在一些实施方案中，该标签连接至经修饰的多跨膜多肽的n末端、经修饰的多跨膜多肽的c末端或其组合。在一些实施方案中，该标签包括mbp、trxa、flag标签、avi标签或histag。

在一些实施方案中，本文公开了生成式(ii)的经修饰的多跨膜多肽：

sp2x-l2m-rpy-l1n-sp1z

式ii

其中：

rp为选自离子通道多肽或gpcr的受体多肽，其中rp包含至少一个修饰；

sp1为连接至rp的c末端的第一选择多肽，其中sp1对第一选择剂具有抗性；

sp2为连接至rp的n末端的第二选择多肽，其中sp2对第二选择剂具有抗性；

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；

x独立地为0-3；

y独立地为1-5；

z独立地为1-3；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，rp为经修饰的离子通道多肽。在一些情况下，经修饰的离子通道多肽是电压门控离子通道多肽或瞬时受体电位通道多肽。在一些实施方案中，经修饰的离子通道多肽是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，rp为经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些实施方案中，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些实施方案中，经修饰的gpcr包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，经修饰的gpcr包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。

在一些实施方案中，通过随机诱变方法生成所述至少一个修饰。在一些情况下，该随机诱变方法包括易错pcr方法。在一些情况下，该随机诱变方法包括dna改组方法。

在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括插入、缺失或突变。在一些实施方案中，该突变包括无义突变或错义突变。在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括n末端截短、c末端截短或其组合。

在一些实施方案中，经修饰的gpcr是哺乳动物gpcr。在一些实施方案中，经修饰的gpcr是人gpcr。

在一些实施方案中，第一选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第一选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第一选择多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些实施方案中，第二选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第二选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第二选择多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分中，而当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞外部分中。

在一些情况下，sp1和sp2是相同的。在其他情况下，sp1和sp2是不同的。在一些情况下，sp1和sp2分别通过l1和l2进一步连接指rp。在一些情况下，l1的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。在一些情况下，l2的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，sp1z为sp12-3，并且每个sp1与另一个不同。在一些情况下，sp1z为sp13，并且三个sp1中的两个是相同的。在一些情况下，每个sp1直接或通过连接体多肽间接连接至另一个sp1。在一些情况下，该连接体多肽包含约1至约60个氨基酸残基，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，sp2x为sp22-3，并且每个sp2与另一个不同。在一些情况下，sp2x为sp23，并且三个sp1中的两个是相同的。在一些情况下，每个sp2直接或通过连接体多肽间接连接至另一个sp2。在一些情况下，该连接体多肽包含约1至约60个氨基酸残基，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，第一选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，第二选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，该抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，该毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。

在一些实施方案中，第一选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。

在一些实施方案中，式(ii)的经修饰的多跨膜多肽进一步包含标签。在一些实施方案中，该标签连接至经修饰的多跨膜多肽的n末端、经修饰的多跨膜多肽的c末端或其组合。在一些实施方案中，该标签包括mbp、trxa、flag标签、avi标签或histag。

在一些实施方案中，本文公开了生成式(iii)的经修饰的多跨膜多肽：

sp2x-l2m-gpcry-l1n-sp1z

式iii

其中：

gpcr为包含至少一个修饰的gpcr；

sp1为连接至gpcr的c末端的第一选择多肽，其中当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分中并且对第一选择剂具有抗性。

sp2为连接至gpcr的n末端的第二选择多肽，其中当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞外部分中并且对第二选择剂具有抗性。

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；

x独立地为0-3；

y独立地为1-5；

z独立地为1-3；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些实施方案中，经修饰的gpcr包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，经修饰的gpcr包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。

在一些实施方案中，通过随机诱变方法生成所述至少一个修饰。在一些情况下，该随机诱变方法包括易错pcr方法。在一些情况下，该随机诱变方法包括dna改组方法。

在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括插入、缺失或突变。在一些实施方案中，该突变包括无义突变或错义突变。在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括n末端截短、c末端截短或其组合。

在一些实施方案中，经修饰的gpcr是哺乳动物gpcr。在一些实施方案中，经修饰的gpcr是人gpcr。

在一些实施方案中，第一选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第一选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第一选择多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些实施方案中，第二选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第二选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第二选择多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些情况下，sp1和sp2是相同的。在其他情况下，sp1和sp2是不同。在一些情况下，sp1和sp2分别通过l1和l2进一步连接至gpcr。在一些情况下，l1的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。在一些情况下，l2的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，sp1z为sp12-3，并且每个sp1与另一个不同。在一些情况下，sp1z为sp13，并且三个sp1中的两个是相同的。在一些情况下，每个sp1直接或通过连接体多肽间接连接至另一个sp1。在一些情况下，该连接体多肽包含约1至约60个氨基酸残基，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，sp2x为sp22-3，并且每个sp2与另一个不同。在一些情况下，sp2x为sp23，并且三个sp1中的两个是相同的。在一些情况下，每个sp2直接或通过连接体多肽间接连接至另一个sp2。在一些情况下，该连接体多肽包含约1至约60个氨基酸残基，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，第一选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，第二选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，该抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，该毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。

在一些实施方案中，第一选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。

在一些实施方案中，式(iii)的经修饰的多跨膜多肽进一步包含标签。在一些实施方案中，该标签连接至经修饰的多跨膜多肽的n末端、经修饰的多跨膜多肽的c末端或其组合。在一些实施方案中，该标签包括mbp、trxa、flag标签、avi标签或histag。

在一些实施方案中，本文公开了生成式(iv)的经修饰的多跨膜多肽：

sp2x-l2m-icpy-l1n-sp1z

式iv

其中：

icp为包含至少一个修饰的离子通道多肽；

sp1为连接至icp的c末端的第一选择多肽，其中sp1对第一选择剂具有抗性；

sp2为连接至icp的n末端的第二选择多肽，其中sp2对第二选择剂具有抗性；

l1为第一连接体；

l2为第二连接体；

x独立地为0-3；

y独立地为1-5；

z独立地为1-3；并且

m和n各自独立地为0-60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些实施方案中，经修饰的离子通道蛋白包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个经修饰的氨基酸残基。在一些实施方案中，经修饰的离子通道蛋白包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％或更多的修饰。

在一些实施方案中，通过随机诱变方法生成所述至少一个修饰。在一些情况下，该随机诱变方法包括易错pcr方法。在一些情况下，该随机诱变方法包括dna改组方法。

在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括插入、缺失或突变。在一些实施方案中，该突变包括无义突变或错义突变。在一些实施方案中，所述至少一个修饰包括n末端截短、c末端截短或其组合。

在一些实施方案中下，经修饰的离子通道蛋白是哺乳动物离子通道蛋白。在一些实施方案中下，经修饰的离子通道蛋白是人离子通道蛋白。

在一些实施方案中，第一选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第一选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第一选择多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些实施方案中，第二选择多肽由抗生素抗性基因或营养缺陷型基因编码。在一些实施方案中，第二选择多肽不是报告蛋白。在一些实施方案中，第二选择多肽多肽是由氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、庆大霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、红霉素抗性基因、四环素抗性基因、链霉素抗性基因、pyre基因、pyrf基因、his3基因、ura3基因、lys2基因、ade1-2基因、β-半乳糖苷酶基因或碱性磷酸酶基因编码的多肽。

在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞内部分或细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞外部分中。在一些情况下，当在宿主细胞中表达时，sp1位于宿主细胞的细胞内部分中，而当在宿主细胞中表达时，sp2位于宿主细胞的细胞外部分中。

在一些情况下，sp1和sp2是相同的。在其他情况下，sp1和sp2是不同的。在一些情况下，sp1和sp2分别通过l1和l2进一步连接至icp。在一些情况下，l1的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。在一些情况下，l2的长度为约0至约60个氨基酸残基，例如长度为约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，sp1z为sp12-3，并且每个sp1与另一个不同。在一些情况下，sp1z为sp13，并且三个sp1中的两个是相同的。在一些情况下，每个sp1直接或通过连接体多肽间接连接至另一个sp1。在一些情况下，该连接体多肽包含约1至约60个氨基酸残基，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，sp2x为sp22-3，并且每个sp2与另一个不同。在一些情况下，sp2x为sp23，并且三个sp1中的两个是相同的。在一些情况下，每个sp2直接或通过连接体多肽间接连接至另一个sp2。在一些情况下，该连接体多肽包含约1至约60个氨基酸残基，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

在一些实施方案中，第一选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，第二选择剂包括抗生素或毒性代谢物。在一些实施方案中，该抗生素包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素、卡那霉素、链霉素或四环素。在一些实施方案中，该毒性代谢物包括5-氟乳清酸或3-氨基-1,2,4-三唑。

在一些实施方案中，第一选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。在一些实施方案中，第二选择剂包括升高的温度、降低的温度、缺乏营养物或缺乏辅因子。

在一些实施方案中，式(iv)的经修饰的多跨膜多肽进一步包含标签。在一些实施方案中，该标签连接至经修饰的多跨膜多肽的n末端、经修饰的多跨膜多肽的c末端或其组合。在一些实施方案中，该标签包括mbp、trxa、flag标签、avi标签或histag。

随机诱变

在一些实施方案中，通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽。在一些情况下，随机诱变是生成具有不同功能性质的蛋白质突变体文库的方法。例如，首先将随机突变引入基因中以生成含有该基因的数十亿不同版本的文库。然后表达该基因的版本或变体，随后评价每种表达的蛋白质的功能性质。在一些情况下，使用易错pcr、滚环易错pcr、增变菌株、暂时增变菌株、插入诱变、甲磺酸乙酯、亚硝酸或dna改组来实现随机诱变。在一些情况下，使用例如uv、电离辐射、x射线、γ射线或通过化学试剂如芥子气、环磷酰胺或顺铂生成随机诱变。

在一些情况下，使用易错pcr方法实现随机诱变。在一些情况下，易错pcr是采用低保真度聚合酶(例如，具有高错误率的聚合酶)的pcr方法。在一些情况下，这样的pcr方法在具有点突变或单核苷酸突变作为最常见的突变类型的野生型序列的扩增期间导致最多2％的错误。在一些实施方案中，通过易错pcr方法生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽。

在一些情况下，使用滚环易错pcr方法实现随机诱变。例如，在滚环易错pcr中，首先将野生型序列克隆到质粒中，随后在易错pcr条件下扩增整个质粒。在一些实施方案中，通过滚环易错pcr方法生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽。

在一些情况下，使用增变菌株方法实现随机诱变。在一些情况下，增变菌株方法利用增变菌株如xl1-red(strategene)，xl1-red是缺乏三种dna修复途径(muts、mutd和mutt)的大肠杆菌菌株，因此在复制期间诱导错误。在一些实施方案中，通过增变菌株方法生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽。

在一些情况下，使用临时增变菌株方法实现随机诱变。在一些情况下，临时增变菌株方法缺乏一种dna修复途径(mutd5)而非三种dna修复途径。在一些实施方案中，通过临时增变菌株方法生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽。

在一些情况下，使用插入诱变实现随机诱变。在一些情况下，插入诱变利用基于转座子的系统在整个感兴趣的序列中随机插入15-碱基序列。在一些实施方案中，通过插入诱变生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽。

在一些情况下，使用甲磺酸乙酯(ems)方法实现随机诱变。在一些情况下，甲基磺酸乙酯(ems)方法利用化学ems使胍残基发生烷基化，从而导致其在dna复制期间得以错误地复制。在一些实施方案中，通过甲磺酸乙酯方法生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽。

在一些情况下，使用亚硝酸实现随机诱变。在一些情况下，亚硝酸是通过去氨基化腺嘌呤和胞嘧啶残基引入突变从而导致颠换点突变的化学诱变剂。在一些实施方案中，通过亚硝酸生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽。

在一些情况下，使用dna改组实现随机诱变。在一些情况下，通过用dna酶i随机消化感兴趣的序列或序列文库，随后使用自引发pcr随机重新连接片段来实现dna改组。在一些实施方案中，通过dna改组方法生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽。

非随机诱变

在一些实施方案中，通过非随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽。示例性的非随机诱变方法包括定点诱变。定点诱变是允许在感兴趣的基因内进行特定改变或修饰的方法。在一些情况下，定点诱变利用盒式诱变、pcr定点诱变、全质粒诱变、kunkel方法或体内定点诱变方法。例如，盒式诱变允许使用限制酶和连接方法将合成的dna片段插入质粒中。在一些情况下，该盒式诱变不涉及聚合。在一些情况下，pcr定点诱变与盒式诱变相似，但其中获得较大片段，通过凝胶电泳从模板片段分离，随后连接到感兴趣的基因中。全质粒诱变，如方法，允许使用一种或多种引物插入突变，随后扩增整个质粒。在一些情况下，该方法与pcr定点诱变的不同之处在于质粒呈线性形式，并且不需要像pcr那样以指数方式扩增。例如，kunkel方法是基于引物的定点方法，并且与先前的方法的不同之处在于其利用缺乏dutp酶(一种在dna复制期间防止细菌掺入尿嘧啶的酶)的大肠杆菌菌株，以区分产物与模板菌株，从而允许更容易地选择含有所需突变的质粒。在一些情况下，体内定点诱变方法包括delittoperfetto方法、移位“pop-inpop-out”方法、直接基因缺失和用pcr进行位点特异性诱变以及一个可回收标记、直接基因缺失和用pcr进行位点特异性诱变以及使用长同源区进行一次可回收标记，或用合成寡核苷酸进行体内定点诱变。

表达载体

在一些实施方案中，载体包括来源于真核或原核来源的任何合适的载体。在一些情况下，载体获自细菌(例如，大肠杆菌)、昆虫、酵母(例如，巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris))、藻类或哺乳动物来源。示例性的细菌载体包括pacyc177、pask75、pbad载体系列、pbadm载体系列、pet载体系列、petm载体系列、pgex载体系列、phat、phat2、pmal-c2、pmal-p2、pqe载体系列、prseta、prsetb、prsetc、ptrchis2系列、pza31-luc、pze21-mcs-1、pflagats、pflagcts、pflagmac、pflagshift-12c、ptac-mat-1、pflagctc或ptac-mat-2。

示例性的昆虫载体包括pfastbac1、pfastbacdual、pfastbacet、pfastbachta、pfastbachtb、pfastbachtc、pfastbacm30a、pfastbactm30b、pfastbacm30c、pvl1392、pvl1393、pvl1393m10、pvl1393m11、pvl1393m12、flag载体如ppolh-flag1或ppolh-mat2，或mat载体如ppolh-mat1或ppolh-mat2。

在一些情况下，酵母载体包括pdest^tm14载体、pdest^tm15载体、pdest^tm17载体、pdest^tm24载体、pyes-dest52载体、pbad-dest49目的载体、pao815毕赤酵母载体、pfld1巴斯德毕赤酵母载体、pgapza、pgapza、pgapzb和pgapzc巴斯德毕赤酵母载体、ppic3.5k毕赤酵母载体、ppic6a、ppic6b和ppic6c毕赤酵母载体、ppic9k毕赤酵母载体、ptef1/zeo、pyes2酵母载体、pyes2/ct酵母载体、pyes2/nta、pyes2/ntb和pyes2/ntc酵母载体，或pyes3/ct酵母载体。

示例性的藻类载体包括pchlamy-4载体或mcs载体。

哺乳动物载体的实例包括瞬时表达载体或稳定表达载体。哺乳动物瞬时表达载体包括，例如，p3xflag-cmv8、pflag-myc-cmv19、pflag-myc-cmv23、pflag-cmv2、pflag-cmv6a、pflag-cmv6b、pflag-cmv6c、pflag-cmv5.1、pflag-cmv5a、pflag-cmv5b、pflag-cmv5c、p3xflag-cmv7.1、pflag-cmv20、p3xflag-myc-cmv24、pcmv-flag-mat1、pcmv-flag-mat2、pbicep-cmv3或pbicep-cmv4。哺乳动物稳定表达载体包括，例如，pflag-cmv3、p3xflag-cmv9、p3xflag-cmv13、pflag-myc-cmv21、p3xflag-myc-cmv25、pflag-cmv4、p3xflag-cmv10、p3xflag-cmv14、pflag-myc-cmv22、p3xflag-myc-cmv26、pbicep-cmv1或pbicep-cmv2。

在一些情况下，无细胞系统是来自细胞的细胞质组分和/或核组分的混合物，并用于体外核酸合成。在一些情况下，无细胞系统利用原核细胞组分或真核细胞组分。有时，在基于例如果蝇细胞、非洲爪蟾卵或hela细胞的无细胞系统中获得核酸合成。示例性的无细胞系统包括但不限于大肠杆菌s30extract系统、大肠杆菌t7s30系统或

宿主细胞

在一些实施方案中，宿主细胞包括任何合适的细胞，如天然衍生的细胞或遗传修饰的细胞。在一些情况下，宿主细胞是生产宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞是真核细胞。在其他情况下，宿主细胞是原核细胞。在一些情况下，真核细胞包括真菌(例如，酵母细胞)、动物细胞或植物细胞。在一些情况下，原核细胞是细菌细胞。细菌细胞的实例包括革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。有时革兰氏阴性细菌是厌氧的、棒状的或两者兼而有之。

在一些情况下，革兰氏阳性细菌包括放线菌门(actinobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)或柔膜菌门(tenericutes)。在一些情况下，革兰氏阴性细菌包括产水菌门(aquificae)、异常球菌-栖热菌门(aquificae-thermus)、纤维杆菌门-绿菌门/拟杆菌门(fibrobacteres-chlorobi/bacteroidetes)(fcb群)、梭杆菌门(fusobacteria)、芽单胞菌门(gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(nitrospirae)、浮霉菌门-疣微菌门/衣原体门(planctomycetes-verrucomicrobia/chlamydiae)(pvc群)、变形菌门(proteobacteria)、螺旋体门(spirochaetes)或互养菌门(synergistetes)。其他细菌包括，例如，酸杆菌门(acidobacteria)、绿弯菌门(chloroflexi)、产金菌门(chrysiogenetes)、蓝细菌(cyanobacteria)、脱铁杆菌门(deferribacteres)、网团菌门(dictyoglomi)、热脱硫杆菌门(thermodesulfobacteria)或热袍菌门(thermotogae)。细菌细胞是，例如，大肠杆菌(escherichiacoli)、肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)或大肠杆菌(colibacilli)。

示例性的原核宿主细胞包括但不限于bl21、mach1^tm、dh10b^tm、top10、dh5α、dh10bac^tm、omnimax^tm、megax^tm、dh12s^tm、inv110、top10f’、invαf、top10/p3、ccdbsurvival、pir1、pir2、stbl2^tm、stbl3^tm或stbl4^tm。

在一些情况下，动物细胞包括来自脊椎动物或来自无脊椎动物的细胞。在一些情况下，动物细胞包括来自海洋无脊椎动物、鱼、昆虫、两栖动物、爬行动物或哺乳动物的细胞。在一些情况下，真菌细胞包括酵母细胞，如啤酒酵母、面包酵母或葡萄酒酵母。

真菌包括子囊菌，如酵母、霉菌、丝状真菌(filamentousfungi)、担子菌(basidiomycetes)或接合菌(zygomycetes)。在一些情况下，酵母包括子囊菌门(ascomycota)或担子菌门(basidiomycota)。在一些情况下，子囊菌门包括酵母菌亚门(saccharomycotina)(真酵母，例如，酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)(面包酵母))或外囊菌亚门(taphrinomycotina)(例如，裂殖酵母纲(schizosaccharomycetes)(裂殖酵母))。在一些情况下，担子菌门包括伞菌亚门(agaricomycotina)(例如，银耳纲(tremellomycetes))或柄锈菌亚门(pucciniomycotina)(例如，微球黑粉菌纲(microbotryomycetes))。

示例性的酵母或丝状真菌包括，例如，以下属：酵母菌属(saccharomyces)、裂殖酵母菌属(schizosaccharomyces)、假丝酵母属(candida)、毕赤酵母属(pichia)、汉逊酵母属(hansenula)、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、接合酵母属(zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(yarrowia)、毛孢子菌属(trichosporon)、红冬孢酵母属(rhodosporidi)、曲霉菌属(aspergillus)、镰胞菌属(fusarium)或木霉属(trichoderma)。示例性的酵母或丝状真菌包括例如，以下种：酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、产朊假丝酵母(candidautilis)、博伊丁假丝酵母(candidaboidini)、白色假丝酵母(candidaboidini)、热带假丝酵母(candidatropicalis)、类星形假丝酵母(candidastellatoidea)、光滑假丝酵母(candidaglabrata)、克鲁斯假丝酵母(candidakrusei)、近平滑假丝酵母(candidaparapsilosis)、季也蒙假丝酵母(candidaguilliermondii)、维斯假丝酵母(candidaviswanathii)、葡萄牙假丝酵母(candidalusitaniae)、胶红酵母(rhodotorulamucilaginosa)、甲醇毕赤酵母(pichiametanolica)、安格斯毕赤酵母(pichiaangusta)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母(pichiaanomala)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)、鲁氏接合酵母(zygosaccharomycesrouxii)、耶氏解脂酵母(yarrowialipolytica)、茁芽丝孢酵母(trichosporonpullulans)、类酵母红冬孢-黑曲霉(rhodosporidiumtoru-aspergillusniger)、构巢曲霉(aspergillusnidulans)、泡盛曲霉(aspergillusawamori)、米曲霉(aspergillusoryzae)、里氏木霉(trichodermareesia)、耶氏解脂酵母、布鲁塞尔酒香酵母(brettanomycesbruxellensis)、星形假丝酵母(candidastellata)、粟酒裂殖酵母、戴尔有孢圆酵母(torulasporadelbrueckii)、拜氏接合酵母(zygosaccharomycesbailii)、新型隐球酵母(cryptococcusneoformans)、加特隐球酵母(cryptococcusgattii)或布拉酵母(saccharomycesboulardii)。

示例性的酵母宿主细胞包括但不限于巴斯德毕赤酵母酵母菌株，如gs115、km71h、smd1168、smd1168h和x-33；和酿酒酵母酵母菌株，如invsc1。

在一些情况下，另外的动物细胞包括获自软体动物、节肢动物、环节动物或海绵动物的细胞。在一些情况下，另外的动物细胞是哺乳动物细胞，例如，来自灵长类动物、猿、马、牛、猪、犬、猫或啮齿动物的细胞。在一些情况下，啮齿动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、仓鼠、灰鼠、褐鼠(fancyrat)或豚鼠。

示例性的哺乳动物宿主细胞包括但不限于293a细胞系、293ft细胞系、293f细胞、293h细胞、chodg44细胞、cho-s细胞、cho-k1细胞、expi293f^tm细胞、flp-in^tmt-rex^tm293细胞系、flp-in^tm-293细胞系、flp-in^tm-3t3细胞系、flp-in^tm-bhk细胞系、flp-in^tm-cho细胞系、flp-in^tm-cv-1细胞系、flp-in^tm-jurkat细胞系、freestyle^tm293-f细胞、freestyle^tmcho-s细胞、griptite^tm293msr细胞系、gs-cho细胞系、heparg^tm细胞、t-rex^tmjurkat细胞系、per.c6细胞、t-rex^tm-293细胞系、t-rex^tm-cho细胞系和t-rex^tm-hela细胞系。

在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是稳定的细胞系，或已将感兴趣的遗传物质掺入其基因组中并在多代细胞分裂后具有表达遗传物质产物的能力的细胞系。在一些情况下，哺乳动物宿主细胞是瞬时的细胞系，或未将感兴趣的遗传物质掺入其基因组中并在多代细胞分裂后不具有表达遗传物质产物的能力的细胞系。

示例性的昆虫宿主细胞包括但不限于果蝇s2细胞、sf9细胞、sf21细胞、highfive^tm细胞和细胞。

在一些情况下，植物细胞包括来自藻类的细胞。示例性的昆虫细胞系包括但不限于莱茵衣藻137c(chlamydomonasreinhardtii137c)或细长聚球藻ppc7942(synechococcuselongatesppc7942)的菌株。

用于表征物理化学性质的分析技术

在一些实施方案中，利用一种或多种分析技术表征本文所述的经修饰的多跨膜多肽的物理化学性质。如上所述，物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性和/或途径激活选择性。在一些情况下，所述一种或多种分析技术包括x射线晶体学、电子晶体学、冷冻电子显微术、核磁共振光谱(nmr)、热变性技术或化学变性技术。

在一些情况下，用于表征本文所述的经修饰的多跨膜多肽的物理化学性质的分析技术是x射线晶体学。在一些情况下，一种或多种结晶方法用于生成蛋白质晶体。例如，蒸汽扩散方法有时用于生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽的蛋白质晶体。其他时候，脂质立方相(lcp)结晶方法用于生成本文所述的经修饰的多跨膜多肽的蛋白质晶体。在一些情况下，蛋白质(例如，本文所述的经修饰的多跨膜多肽)的结晶包括将纯化的蛋白质与旨在驱动蛋白质过饱和、晶体成核和晶体生长的溶液混合。

在一些情况下，基于其蛋白质结晶性质，例如，其形成蛋白质晶体的能力、形成能够被收获的晶体的时间、形成能够通过x射线检测器筛选的晶体的时间、形成单晶而不是多晶融合在一起的能力和衍射分辨率来评价本文所述的经修饰的多跨膜多肽。在一些情况下，形成能被收获的晶体的时间包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30天或更多天。在一些情况下，能够被收获或能够被x射线检测器筛选的晶体大小包括直径约5微米、10微米、15微米、20微米、30微米、40微米、50微米、80微米、100微米、150微米、200微米、250微米、300微米、400微米或更大的晶体。在一些情况下，衍射分辨率包括或更高的分辨率。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽具有改善或优异的性质，例如，在以下一种或多种性质方面：其形成蛋白质晶体的能力、形成能够被收获的晶体的时间、形成能够通过x射线检测器筛选的晶体的时间、形成单晶而不是融合在一起的多晶的能力和衍射分辨率；相对于野生型多跨膜多肽或不同的经修饰的多跨膜多肽。

在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽是经修饰的gpcr。在一些情况下，基于其蛋白质结晶性质，例如，其形成蛋白质晶体的能力、形成能够被收获的晶体的时间、形成能够通过x射线检测器筛选的晶体的时间、形成单晶而不是融合在一起的多晶的能力和衍射分辨率来评价本文所述的经修饰的gpcr。在一些情况下，本文所述的经修饰的gpcr具有改善或优异的性质，例如，在以下一种或多种性质方面：其形成蛋白质晶体的能力、形成能够被收获的晶体的时间、形成能够通过x射线检测器筛选的晶体的时间、形成单晶而不是融合在一起的多晶的能力和衍射分辨率；相对于野生型gpcr或不同的经修饰的gpcr。

在一些情况下，用于表征本文所述的经修饰的多跨膜多肽的物理化学性质的分析技术是电子晶体学。在一些情况下，电子晶体学是使用透射电子显微镜(tem)确定靶多肽的原子排列的方法。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽是经修饰的gpcr。在一些情况下，电子晶体学(例如，tem)用于表征经修饰的gpcr的物理化学性质。

在一些情况下，用于表征本文所述的经修饰的多跨膜多肽的物理化学性质的分析技术是冷冻电子显微术(cryo-em)。在一些情况下，cryo-em是tem的一种形式，其中在低温下分析样品。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽是经修饰的gpcr。在一些情况下，冷冻电子显微术(例如，cryo-em)用于表征经修饰的gpcr的物理化学性质。

在一些情况下，用于表征本文所述的经修饰的多跨膜多肽的物理化学性质的分析技术是核磁共振光谱(nmr)。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽是经修饰的gpcr。在一些情况下，nmr用于表征经修饰的gpcr的物理化学性质。

在一些情况下，用于表征本文所述的经修饰的多跨膜多肽的物理化学性质的分析技术是热变性技术(例如，圆二色性或差示扫描量热法)。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽是经修饰的gpcr。在一些情况下，热变性技术(例如，圆二色性或差示扫描量热法)用于表征经修饰的gpcr的物理化学性质。

在一些情况下，用于表征本文所述的经修饰的多跨膜多肽的物理化学性质的分析技术是化学变性技术(例如，尿素、胍-hcl或强力去污剂如短链去污剂、阴离子去污剂或阳离子去污剂)。在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽是经修饰的gpcr。在一些情况下，化学变性技术(例如，尿素、胍-hcl或强力去污剂如短链去污剂、阴离子去污剂或阳离子去污剂)用于表征经修饰的gpcr的物理化学性质。

筛选治疗剂的方法

在一些实施方案中，本文公开了用于针对本文所述的经修饰的多跨膜多肽筛选治疗剂的方法和平台。在一些情况下，该治疗剂是多肽或小分子。在一些实施方案中，该治疗剂是多肽。在其他实施方案中，该治疗剂是小分子。

在一些情况下，本文描述了针对经修饰的多跨膜多肽筛选治疗剂的方法，其包括a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；d)生成生产载体，该生产载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；e)在第二多个宿主细胞中表达生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；f)将由步骤e)的生产载体生成的多跨膜多肽产物与治疗剂一起温育；以及g)检测该多跨膜多肽产物与治疗剂之间的结合。在一些情况下，该方法进一步包括a)生成第二组生产载体，其中每个生产载体包含来自以上步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽的多跨膜多肽产物；b)在第三多个宿主细胞中表达第二组生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；以及c)通过分析方法来分析一组多跨膜多肽产物，以确定来自该组的、具有增强或改善的物理化学性质的经表达的稳定折叠的多跨膜多肽，以用于针对以上步骤f)的治疗剂进行筛选，其中该增强或改善的物理化学性质是相对于对照多跨膜多肽的。在一些情况下，该增强或改善的物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性或途径激活选择性。在一些情况下，该对照包括野生型多跨膜多肽或具有不同修饰的经修饰的多跨膜多肽。在一些情况下，通过流式细胞术方法、通过酶联免疫吸附测定(elisa)、通过反向散射干涉法、荧光偏振法、表面等离子体共振(spr)法、等离子体-波导共振法、核磁共振(nmr)法、等温滴定量热法、热变性测定、荧光配体结合测定或放射性配体结合测定来检测以上步骤g)中的结合。在一些情况下，通过流式细胞术方法或通过酶联免疫吸附测定(elisa)来检测以上步骤g)中的结合。在一些情况下，该流式细胞术方法包括磁激活细胞分选(macs)或荧光激活细胞分选(facs)。

在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些情况下，经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些情况下，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。

筛选多肽的方法

在一些实施方案中，所述治疗剂是多肽。在一些情况下，该多肽是与多跨膜多肽相互作用的多肽。在一些情况下，该多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体。在一些情况下，该治疗剂是与质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体相互作用的多肽。在一些情况下，该治疗剂是与受体相互作用的多肽。在一些情况下，该受体是离子通道蛋白。在一些情况下，该治疗剂是与离子通道蛋白相互作用的多肽。在一些情况下，该受体是gpcr。在一些情况下，该治疗剂是与gpcr相互作用的多肽。

在一些实施方案中，所述多肽是抗体或其结合片段。在一些情况下，所述治疗剂是抗体或其结合片段。在一些情况下，抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价fab’、二价fab2、单链可变片段(scfv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)或骆驼抗体或其结合片段。

在一些实施方案中，本文描述了针对经修饰的多跨膜多肽筛选抗体或其结合片段的方法，该方法包括a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；d)生成生产载体，该生产载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；e)在第二多个宿主细胞中表达生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；f)将由步骤e)的生产载体生成的多跨膜多肽产物与抗体或其结合片段一起温育；以及g)检测该多跨膜多肽产物与抗体或其结合片段之间的结合。在一些情况下，该抗体或其结合片段通过噬菌体展示或酵母展示方法产生。在一些情况下，该抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价fab’、二价fab2、单链可变片段(scfv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)或骆驼抗体或其结合片段。

在一些情况下，所述方法进一步包括a)生成第二组生产载体，其中每个生产载体包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码来自以上步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；b)在第三多个宿主细胞中表达第二组生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；以及c)通过分析方法来分析一组多跨膜多肽产物，以确定来自该组的、具有增强或改善的物理化学性质的经表达的稳定折叠的多跨膜多肽，以用于针对以上步骤f)的抗体或其结合片段进行筛选，其中该增强或改善的物理化学性质是相对于对照多跨膜多肽的。在一些情况下，该增强或改善的物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性或途径激活选择性。在一些情况下，该对照包括野生型多跨膜多肽或具有不同修饰的经修饰的多跨膜多肽。在一些情况下，通过流式细胞术方法、通过酶联免疫吸附测定(elisa)、通过反向散射干涉法、荧光偏振法、表面等离子体共振(spr)法、等离子体-波导共振法、核磁共振(nmr)法、等温滴定量热法或热变性测定来检测以上步骤g)中的结合。在一些情况下，通过流式细胞术方法或通过酶联免疫吸附测定(elisa)来检测以上步骤g)中的结合。在一些情况下，该流式细胞术方法包括磁激活细胞分选(macs)或荧光激活细胞分选(facs)。

在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽包括质膜蛋白、核膜蛋白、外周膜蛋白、细胞内膜蛋白、转运蛋白、通道蛋白(例如，离子通道蛋白)、黏附素、移位酶或受体。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些情况下，经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些情况下，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。

在一些实施方案中，本文还描述了通过本文所述方法产生的抗体或其结合片段。在一些情况下，本文描述了分离并纯化的抗体或其结合片段，其包含重链cdr1、cdr2和cdr3序列以及轻链cdr1、cdr2和cdr3序列，其中该重链和轻链cdr与经修饰的多跨膜多肽相互作用，并且其中该抗体或其结合片段通过以下过程产生：(a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；(b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；(c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达所述第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；(d)生成生产载体，该生产载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(e)在第二多个宿主细胞中表达所述生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；(f)将由步骤e)的生产载体生成的多跨膜多肽产物与一组抗体或其结合片段一起温育；以及(g)选择与该多跨膜多肽产物特异性结合的抗体或其结合片段。在一些情况下，该抗体或其结合片段通过噬菌体展示或酵母展示方法产生。在一些情况下，该抗体或其结合片段包括人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价fab’、二价fab2、单链可变片段(scfv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)或骆驼抗体或其结合片段。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些情况下，经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些情况下，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。

在一些情况下，宿主细胞是原核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞或昆虫宿主细胞。在一些情况下，第一多个宿主细胞包括原核宿主细胞。在一些情况下，该原核宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一些情况下，第二多个宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞或昆虫宿主细胞。

“抗体”和“免疫球蛋白”(ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。这两个术语同义使用。在一些情况下，免疫球蛋白的抗原特异性是已知的。

术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖完全组装的抗体、可以结合抗原的抗体片段(例如fab、f(ab’)2、fv、单链抗体、双抗体、抗体嵌合体、杂合抗体、双特异性抗体、人源化抗体等)和包含前述的重组肽。

如本文所用的术语“单克隆抗体”和“mab”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即除了可能少量存在的可能天然发生的突变之外，构成该群体的单个抗体是相同的。

“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是约150,000道尔顿的由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链组成的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变域(vh)，随后具有许多恒定域。每条轻链在一端具有可变域(vl)并且在其另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，并且轻链可变域与重链的可变域对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链可变域与重链可变域之间形成界面。

术语“可变”是指可变域的某些部分在抗体之间的序列上差异很大的事实。可变区赋予抗原结合特异性。然而，可变性并非均匀地分布在抗体的整个可变域中。它集中在轻链和重链可变域中被称为互补决定区(cdr)或高变区的三个区段中。可变域的更高保守的部分被称为框架(fr)区。天然重链和轻链的可变域各自包含四个fr区，这四个fr区主要采用β-折叠片构型，通过三个cdr连接，该三个cdr形成连接β-折叠片结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠片结构的一部分。每条链中的cdr通过fr区紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的cdr一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应功能，如fc受体(fcr)结合、抗体参与抗体依赖性细胞毒性、启动补体依赖性细胞毒性和肥大细胞脱粒。

当在本文中使用时，术语“高变区”是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基(例如，轻链可变域中的残基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)和重链可变域中的31-35(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)；kabat等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstituteofhealth,bethesda,md.)和/或来自“高变环”的残基(例如，轻链可变域中的残基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)和重链可变域中的(h1)、53-55(h2)和96-101(13)；clothia和lesk,(1987)j.mol.biol.,196:901-917)。如本文所认为的，“框架”或“fr”残基是除了高变区残基之外的可变域残基。

“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括fab、fab、f(ab’)2和fv片段；双抗体；线性抗体(zapata等人(1995)proteineng.10:1057-1062)；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，每个片段具有单个抗原结合位点和残留的“fc”片段，该残留的“fc”片段的名称反映其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并仍然能够交联抗原的f(ab’)2片段。

fv是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在该构型中每个可变域的三个cdr相互作用以限定vh-vl二聚体表面上的抗原结合位点。总的来说，六个cdr赋予对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变域(或仅包含三个对抗原特异的cdr的fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，但是其亲和力低于整个结合位点。

fab片段也含有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(ch1)。fab片段与fab’片段的不同之处在于在重链ch1结构域的羧基末端添加了几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。fab’-sh是本文对其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离巯基的fab’的名称。通过还原f(ab’)2片段的重链二硫键产生fab’片段。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。

来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可基于其恒定域的氨基酸序列被分成两种明显不同的类型之一，称为κ和λ。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成不同的类别。有五大类人免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，并且其中一些可进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。不同的同种型具有不同的效应功能。例如，人igg1和igg3同种型具有adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)活性。

噬菌体展示

在一些实施方案中，抗体或其结合片段通过噬菌体展示方法产生。在一些情况下，使用展示结合抗体的10¹⁰个噬菌体变体。在一些情况下，在哺乳动物细胞系(例如，稳定的哺乳动物细胞系)中表达在选择过程中鉴定的候选的经修饰的多跨膜多肽，然后将表达的多肽纯化并固定化到纳米颗粒上或固定化到表面(例如，板的涂覆表面)上。在一些情况下，将表达的多肽固定化到纳米颗粒上。在一些情况下，该纳米颗粒包括顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒或无机纳米管。在一些情况下，该纳米颗粒是顺磁性纳米颗粒。在一些情况下，用反应性标签，例如链霉亲和素标签、生物素标签或能够与本文所述的经修饰的多跨膜多肽缀合的反应性部分使纳米颗粒进一步衍生化。

在一些情况下，然后针对噬菌体文库筛选包含本文所述的经修饰的多跨膜多肽的固定化纳米颗粒，其中例如使用磁分离来分离展示出对经修饰的多跨膜多肽靶标具有选择性亲和力的抗体的噬菌体。在一些情况下，将富集的噬菌体群体分离成克隆分离物，并对噬菌体编码的抗体基因进行测序，并将其克隆到哺乳动物表达载体中以供生产。

在一些情况下，利用一种或多种方法筛选与本文所述的固定化的经修饰的多跨膜多肽结合的抗体或其结合片段。在一些情况下，利用流式细胞术方法筛选与本文所述的固定化的经修饰的多跨膜多肽结合的抗体或其结合片段。在一些情况下，该流式细胞术包括磁激活细胞分选(macs)或荧光激活细胞分选(facs)。在一些情况下，利用酶联免疫吸附测定(elisa)筛选与本文所述的固定化的经修饰的多跨膜多肽结合的抗体或其结合片段。

在一些情况下，在针对噬菌体文库筛选之前，用脂质体，例如脂质体包封的纳米颗粒(例如，用聚合物amphipol(a8-35))进一步配制本文所述的经修饰的多跨膜多肽，其中例如使用磁分离来分离展示出对经修饰的多跨膜多肽靶具有选择性亲和力的抗体的噬菌体。

在一些情况下，噬菌体展示抗体文库包括griffin-1文库(hgriffin,mrc,cambridge,uk)、tomlinsoni文库或诸如schofield,等人,“applicationofphagedisplaytohighthroughputantibodygenerationandcharacterization,”genomebiology8:r254(2007)中所述的文库。

酵母展示

在一些实施方案中，抗体或其结合片段通过酵母展示方法产生。在一些情况下，酵母表面展示包括真核表达装置，该真核表达装置促进哺乳动物(例如，人)蛋白质折叠和翻译后修饰，并进一步能够使用荧光激活细胞分选(facs)进行定量和可视化选择。在一些情况下，酵母展示系统利用酿酒酵母。

在一些情况下，对选择过程中鉴定的候选的经修饰的多跨膜多肽进行表达、纯化并随后固定化到纳米颗粒上或固定化到表面(例如，板的涂覆表面)上。在一些情况下，将表达的多肽固定化到纳米颗粒上。在一些情况下，该纳米颗粒包括顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒、金属纳米颗粒或无机纳米管。在一些情况下，该纳米颗粒是顺磁性纳米颗粒。在一些情况下，用反应性标签，例如链霉亲和素标签、生物素标签或能够与本文所述的经修饰的多跨膜多肽缀合的反应性部分使纳米颗粒进一步衍生化。

在一些情况下，然后针对酵母展示文库筛选包含本文所述的经修饰的多跨膜多肽的固定化纳米颗粒，其中例如使用磁分离来分离展示出对经修饰的多跨膜多肽靶标具有选择性亲和力的抗体的酵母。

在一些情况下，利用一种或多种方法筛选与本文所述的固定化的经修饰的多跨膜多肽结合的抗体或其结合片段。在一些情况下，利用流式细胞术方法筛选与本文所述的固定化的经修饰的多跨膜多肽结合的抗体或其结合片段。在一些情况下，该流式细胞术包括磁激活细胞分选(macs)或荧光激活细胞分选(facs)。在一些情况下，利用酶联免疫吸附测定(elisa)筛选与本文所述的固定化的经修饰的多跨膜多肽结合的抗体或其结合片段。

facs限于选择相对较小的细胞群体。为了有效选择较大文库，需要额外的磁激活细胞分选步骤(macs)来将文库减小到facs可以分类的大小。鉴于与噬菌体相比，相对大量的酵母细胞和较低的文库密度(10⁹个细胞/ml)，为了有效地选择约1x10¹⁰个实体的文库，需要多个具有数十至数百毫升的起始酵母的平行macs和facs过程。

在一些实施方案中，酵母展示抗体文库的实例包括feldhaus等人,“flow-cytometricisolationofhumanantibodiesformanonimmunesaccharomycescerevisiaesurfacedisplaylibrary,”21(2):163-170(2003)、weaver-feldhaus等人,“yeastmatingforcombinatorialfablibrarygenerationandsurfacedisplay,”564(1-2):24-34(2004)中描述的酵母展示抗体文库。

筛选多肽的另外的方法

在一些实施方案中，使用另外的方法筛选本文所述的候选的经修饰的多跨膜多肽。在一些情况下，所述另外的方法包括生成或产生抗体或其结合片段，随后针对本文所述的候选的经修饰的多跨膜多肽进行筛选。在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用本文所述的经修饰的多跨膜多肽片段、用表达经修饰的多跨膜多肽抗原的培养细胞、用表达经修饰的多跨膜多肽的树突细胞、用树突状细胞衍生的外来体、用含有候选的经修饰的多跨膜多肽的芽殖病毒形式的重组细胞外杆状病毒、用包含候选的经修饰的多跨膜多肽的细胞膜或用纯化的候选的经修饰的多跨膜多肽来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。

在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用本文所述的经修饰的多跨膜多肽片段接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，该多肽片段的长度包含约15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸残基。在一些情况下，该多肽片段包含gpcr片段。在一些情况下，该gpcr片段包含n末端部分、c末端部分、一个或多个tm核心、外环、细胞内环或其组合。在一些情况下，该方法进一步包括收获并纯化针对多肽片段(例如，gpcr片段)的抗体。

在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用表达经修饰的多跨膜多肽抗原的培养细胞来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽抗原是经修饰的gpcr抗原。在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用表达经修饰的gpcr抗原的培养细胞来接种哺乳动物(例如，小鼠，大鼠或兔)。在一些情况下，该方法进一步包括收获并纯化针对表达经修饰的多跨膜多肽抗原(例如，经修饰的gpcr抗原)的培养细胞的抗体。

在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用表达经修饰的多跨膜多肽的树突细胞来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，该树突细胞表达经修饰的gpcr。在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用表达经修饰的gpcr的树突细胞来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，该方法进一步包括收获并纯化针对表达经修饰的多跨膜多肽的树突细胞(例如，表达经修饰的gpcr的树突细胞)的抗体。

在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用树突状细胞衍生的外来体来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，树突细胞衍生的外来体包含随后诱导抗原特异性b细胞抗体应答激活的抗原(例如，多跨膜多肽抗原)。在一些情况下，树突细胞衍生的外来体包含多跨膜多肽抗原。在一些情况下，该多跨膜多肽抗原是gpcr抗原。在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用包含gpcr抗原的树突细胞衍生的外来体来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，该方法进一步包括收获并纯化针对树突细胞衍生的外来体的抗体。

在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用含有经修饰的多跨膜多肽的芽殖病毒形式的重组细胞外杆状病毒来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的gpcr。在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用含有经修饰的gpcr的芽殖病毒形式的重组细胞外杆状病毒来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，该方法进一步包括收获并纯化针对含有经修饰的多跨膜多肽(例如，经修饰的gpcr)的芽殖病毒形式的重组细胞外杆状病毒的抗体。

在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用包含经修饰的多跨膜多肽的细胞膜来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的gpcr。在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用包含经修饰的gpcr的细胞膜来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，该方法进一步包括收获并纯化针对包含经修饰的多跨膜多肽(例如，经修饰的gpcr)的细胞膜的抗体。

在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用纯化的经修饰的多跨膜多肽来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的gpcr。在一些情况下，生成或产生抗体或其结合片段的方法包括用纯化的经修饰的gpcr来接种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。在一些情况下，该方法进一步包括收获并纯化针对纯化的经修饰的多跨膜多肽(例如，纯化的经修饰的gpcr)的抗体。

筛选小分子的方法

在一些实施方案中，所述治疗剂是小分子。在一些情况下，该小分子是药物或小分子片段。在一些情况下，该药物是展现出治疗作用的分子(例如，化学分子或生物制剂)。在其他情况下，该药物是未展现出治疗作用的分子(例如，化学分子或生物制剂)。在一些情况下，本文所述的治疗剂是展现出治疗作用的分子(例如，化学分子或生物制剂)。在其他情况下，本文所述的治疗剂是未展现出治疗作用的分子(例如，化学分子或生物制剂)。

在一些实施方案中，本文描述了针对经修饰的多跨膜多肽筛选小分子的方法，该方法包括a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；d)生成生产载体，该生成载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；e)在第二多个宿主细胞中表达生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；f)将由步骤e)的生产载体生成的多跨膜多肽产物与小分子一起温育；以及g)检测该多跨膜多肽产物与小分子之间的结合。

在一些情况下，所述方法进一步包括a)生成第二组生产载体，其中每个生产载体包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码来自以上步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；b)在第三多个宿主细胞中表达第二组生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；以及c)通过分析方法来分析一组多跨膜多肽产物，以确定来自该组的、具有增强或改善的物理化学性质的经表达的稳定折叠的多跨膜多肽，以用于针对以上步骤f)的小分子进行筛选，其中该增强或改善的物理化学性质是相对于对照多跨膜多肽的。在一些情况下，该增强或改善的物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性或途径激活选择性。在一些情况下，该对照包括野生型多跨膜多肽或具有不同修饰的经修饰的多跨膜多肽。在一些情况下，通过分析技术，如等温滴定量热法、表面等离子共振(spr)、反向散射干涉法、核磁共振(nmr)法、荧光偏振法、等离子体-波导共振法、荧光配体结合测定、放射性配体结合测定等来检测以上步骤g)中的结合。

在一些情况下，所述小分子为小分子片段。在一些情况下，该小分子片段是非天然存在的分子。在一些情况下，该小分子片段不包括天然和/或非天然肽片段或在哺乳动物体内天然产生的小分子(例如，代谢物)。

在一些情况下，所述小分子片段具有约100道尔顿或更高的分子量。在一些实施方案中，该小分子片段具有约120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000道尔顿或更高的分子量。

在一些情况下，所述小分子片段具有微摩尔或毫摩尔的结合亲和力。在一些情况下，该小分子片段具有约1μm、10μm、100μm、500μm、1mm、10mm或更高的结合亲和力。

在一些情况下，所述小分子片段具有高配体效率(le)。配体效率是每原子配体与其结合配偶体(例如，gpcr)的结合能的量度。在一些情况下，配体效率被定义为吉布斯自由能(δg)与化合物的非氢原子数(n)的比率：

le＝(δg)/n。

在一些情况下，le也被安排为：

le＝1.4(-logic50)/n。

在一些情况下，le得分为约0.3kcalmol^-1ha^-1、约0.35kcalmol^-1ha^-1、约0.4kcalmol^-1ha^-1或更高。

在一些实施方案中，基于3的规则来设计小分子片段。在一些实施方案中，3的规则包括非极性溶剂-极性溶剂(例如，辛醇-水)分配系数logp约为3或更小、分子量约为300道尔顿或更小、约3个或更少的氢键供体、约3个或更少的氢键受体和约3个或更少的可旋转键。

在一些实施方案中，所述小分子片段进一步具有药代动力学参数，该药代动力学参数不适合作为在不进一步优化该小分子片段的情况下用于施用的治疗剂。在一些情况下，适合作为治疗剂的药代动力学参数包括符合fda指南的参数或者符合来自美国以外的同等食品和药物管理局的指南的参数。在一些情况下，药代动力学参数包括峰值血浆浓度(cmax)、治疗剂的最低浓度(cmin)、分布体积、达到cmax的时间、消除半衰期、清除率等。在一些实施方案中，小分子片段的药代动力学参数超出了由fda指南或由美国以外的同等食品和药物管理局所设定的参数。在一些情况下，技术人员根据本文所述的小分子片段的药代动力学参数而理解，该小分子片段在未进一步优化的情况下不适合作为治疗剂。

在一些情况下，示例性的小分子片段文库包括但不限于chembridge片段文库、基于pyramidplatform片段的药物发现、maybridge片段文库、来自analyticon的frgx、来自ancorex的tci-frag、来自asinex的biobuildingblocks、来自charlesriver的biofocus3d、来自emeraldbio的fragmentsoflife(fol)、enamine片段文库、iotadiverse1500、bionet片段文库、lifechemicals片段收集、otava片段文库、prestwick片段文库、selcia片段文库、基于timtec片段的文库、来自vitas-mlaboratory的allium或zenobia片段文库。

疫苗

在一些实施方案中，本文进一步描述了基于本文所述的经修饰的多跨膜多肽的疫苗和疫苗制剂。在一些情况下，疫苗是由活的减毒病原体或已被例如化学品、热量或辐射灭活的灭活病原体制备的。在一些情况下，疫苗含有本文所述的经修饰的多跨膜多肽的亚单位或部分，其中该亚单位或部分任选地缀合。在一些情况下，疫苗被制备为基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗或基于抗原呈递细胞的疫苗。

在一些情况下，使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制疫苗，该载体包括促进将活性剂加工成药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。适当的制剂取决于选定的施用途径。适当地且如本领域所理解的，使用任何公知的技术、载体和赋形剂。

在一些情况下，所述疫苗被配制为基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗或基于细胞的疫苗。例如，疫苗组合物有时包括阳离子脂质制剂中的裸cdna；脂肽(例如，vitiello,a.等人,j.clin.invest.95:341,1995)、例如在聚(dl-丙交酯-共-乙交酯)(“plg”)微球中包封的裸cdna或肽(参见，例如，eldridge等人,molec.immunol.28:287-294,1991；alonso等人,vaccine12:299-306,1994；jones等人,vaccine13:675-681,1995)；免疫刺激复合物(iscoms)中含有的肽组合物(参见，例如，takahashi等人,nature344:873-875,1990；hu等人,clinexpimmunol.113:235-243,1998)；或多抗原肽系统(map)(参见，例如，tam,j.p.,proc.natlacad.sci.u.s.a.85:5409-5413,1988；tarn,j.p.,j.immunol.methods196:17-32,1996)。有时，疫苗被配制为基于肽的疫苗或基于核酸的疫苗，其中该核酸编码本文所述的经修饰的多跨膜多肽。有时，疫苗被配制为基于抗体的疫苗。有时，疫苗被配制为基于细胞的疫苗。

基于抗体的疫苗

在一些实施方案中，疫苗是基于抗体的疫苗。在一些情况下，抗体或其结合片段与本文所述的经修饰的多跨膜多肽结合。在一些情况下，疫苗包含分离并纯化的抗体或其结合片段，该分离并纯化的抗体或其结合片段包含重链cdr1、cdr2和cdr3序列以及轻链cdr1、cdr2和cdr3序列，其中该重链和轻链cdr与经修饰的多跨膜多肽相互作用，并且其中该抗体或其结合片段通过以下过程产生：(a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；(b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；(c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；(d)生成生产载体，该生成载体包含第二多核苷酸，该第二多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(e)在第二多个宿主细胞中表达生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；(f)将由步骤e)的生产载体生成的多跨膜多肽产物与一组抗体或其结合片段一起温育；以及(g)选择与该多跨膜多肽产物特异性结合的抗体或其结合片段。在一些情况下，该抗体或其结合片段通过噬菌体展示或酵母展示方法产生。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些情况下，经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些情况下，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些情况下，所述疫苗进一步包含佐剂。在一些情况下，该佐剂包括gm-csf。

在一些情况下，适当地并且如本领域所理解的，使用任何公知的技术、载体和赋形剂来配制基于抗体的疫苗。如上所述，抗体或其结合片段包括，例如，人源化抗体或其结合片段、嵌合抗体或其结合片段、单克隆抗体或其结合片段、单价fab’、二价fab2、单链可变片段(scfv)、双抗体、微抗体、纳米抗体、单结构域抗体(sdab)或骆驼抗体或其结合片段。在一些情况下，抗体是天然抗体、嵌合抗体、人源化抗体或抗体片段。在一些情况下，单克隆抗体可从任何合适的物种例如鼠、兔、绵羊、山羊或人单克隆抗体获得。

基于核酸的疫苗

在一些实施方案中，疫苗被配制为基于核酸的疫苗。在一些情况下，适当地并且如本领域所理解的，使用任何公知的技术、载体和赋形剂来配制基于核酸的疫苗。在一些情况下，该核酸是dna(基因组dna和cdna)、rna或杂合体，其中该核酸含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤在内的碱基的组合。在一些情况下，通过化学合成方法或通过重组方法获得核酸。在一些情况下，该疫苗是基于dna的疫苗、基于rna的疫苗、基于杂合dna/rna的疫苗或基于杂合核酸/肽的疫苗。

在一些情况下，本文所述的基于核酸的疫苗包含编码经修饰的多跨膜多肽的多核苷酸，其中该经修饰的多跨膜多肽通过以下过程产生：(a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；(b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；(c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；(d)生成第二组生产载体，其中每个生产载体包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(e)在第二多个宿主细胞中表达第二组生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；以及(f)用分析方法来分析由步骤e)的第二组生产载体生成的一组多跨膜多肽产物，以确定来自该组的、具有增强或改善的物理化学性质的多跨膜多肽产物，以用于生成疫苗，其中该增强或改善的物理化学性质是相对于对照多跨膜多肽的。在一些情况下，该增强或改善的物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性或途径激活选择性。在一些情况下，该对照包括野生型多跨膜多肽或具有不同修饰的经修饰的多跨膜多肽。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些情况下，经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些情况下，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些情况下，所述疫苗进一步包含佐剂。在一些情况下，该佐剂包括gm-csf。

在一些情况下，如本文所用的核酸分子是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。本文所述的核酸含有，例如，磷酸二酯键，但是在一些情况下，如下所述(例如在引物和探针如标记探针的构建中)，包括具有备选骨架的核酸类似物，该备选骨架包含，例如，磷酰胺(beaucage等人,tetrahedron49(10):1925(1993)及其参考文献；letsinger,j.org.chem.35:3800(1970)；sprinzl等人,eur.j.biochem.81:579(1977)；letsinger等人,nucl.acidsres.14:3487(1986)；sawai等人,chem.lett.805(1984)；letsinger等人,j.am.chem.soc.110:4470(1988)；以及pauwels等人,chemicascripta26:14191986))、硫代磷酸酯(mag等人,nucleicacidsres.19:1437(1991)；和美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(briu等人,j.am.chem.soc.111:2321(1989))、o-甲基亚磷酰胺连接(参见eckstein,oligonucleotidesandanalogues:apracticalapproach,oxforduniversitypress)和肽核酸(在本文中也称为“pna”)骨架和连接(参见egholm,j.am.chem.soc.114:1895(1992)；meier等人,chem.int.ed.engl.31:1008(1992)；nielsen,nature,365:566(1993)；carlsson等人,nature380:207(1996))。其他类似物核酸包括具有双环结构的核酸，包括锁定核酸(在本文中也称为“lna”)(koshkin等人,j.am.chem.soc.120.132523(1998))、正骨架(positivebackbones)(denpcy等人,proc.natl.acad.sci.usa92:6097(1995))、非离子骨架(美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863；kiedrowshi等人,angew.chem.intl.ed.english30:423(1991)；letsinger等人,j.am.chem.soc.110:4470(1988)；letsinger等人,nucleoside&amp；nucleotide13:1597(1994)；第2章和第3章,ascsymposiumseries580,“carbohydratemodificationsinantisenseresearch”,ed.y.s.sanghui和p.dancook；mesmaeker等人,bioorganic&medicinalchem.lett.4:395(1994)；jeffs等人,j.biomolecularnmr34:17(1994)；tetrahedronlett.37:743(1996))和非核糖骨架，包括美国专利号5,235,033和5,034,506以及ascsymposiumseries580,“carbohydratemodificationsinantisenseresearch”,ed.y.s.sanghui和p.dancook第6章和第7章中所述的非核糖骨架。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义范围内(参见jenkins等人,chem.soc.rev.(1995)pp169176)。几种核酸类似物描述于rawls,c&enewsjun.2,1997第35页。“锁定核酸”也包括在核酸类似物的定义范围内。lna是一类核酸类似物，其中核糖环被连接2′-o原子与4′-c原子的亚甲基桥“锁定”。可进行这些核糖-磷酸骨架的修饰以增加这样的分子在生理环境中的稳定性和半衰期。例如，pna：dna和lna-dna杂合体可展现出更高的稳定性，因此可以在一些实施方案中使用。靶核酸可以是指定的单链或双链，或含有双链序列或单链序列的部分。取决于应用，该核酸可以是dna(包括例如，基因组dna、线粒体dna和cdna)、rna(包括例如，mrna和rrna)或杂合体，其中该核酸包含脱氧核糖核酸和核糖核苷酸的任何组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶、异鸟嘌呤等碱基的任何组合。

在一些情况下，所述载体是环状质粒或线性核酸。在一些情况下，该环状质粒或线性核酸能够指导特定核苷酸序列在合适的主题细胞中的表达。在一些情况下，该载体具有与编码多肽的核苷酸序列可操作地连接的启动子，该核苷酸序列可操作地连接至终止信号。在一些情况下，该载体还含有正确翻译该核苷酸序列所需的序列。包含感兴趣的核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其至少一种组分相对于其至少一种其他组分是异源的。表达盒中该核苷酸序列的表达可以在只有当宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时才能启动转录的组成型启动子或诱导型启动子的控制下。

在一些情况下，所述载体是质粒。在一些情况下，该质粒可用于使用编码多肽的核酸来转染细胞，经转化的宿主细胞可以在其中发生多肽表达的条件下培养并维持。

在一些情况下，所述质粒包含编码本文公开的一种或多种经修饰的多跨膜多肽的核酸序列。例如，单个质粒含有单个多肽的编码序列或超过一个多肽的编码序列。有时，该质粒进一步包含编码佐剂如免疫刺激分子或如细胞因子的编码序列。在一些情况下，该质粒进一步包含起始密码子、终止密码子、与编码序列可操作连接的启动子和编码序列上游的增强子。

在一些情况下，所述质粒包含哺乳动物复制起点，以便在染色体外维持质粒并在细胞中产生质粒的多个拷贝。该质粒可以是来自invitrogen(sandiego,ca)的pvaxi、pcep4或prep4。

在一些情况下，所述质粒进一步包含调节序列，该调节序列能够在施用该质粒的细胞中进行基因表达。在一些情况下，编码序列进一步包含允许编码序列在宿主细胞中更有效转录的密码子。

示例性的质粒包括pse420(invitrogen,sandiego,calif)，其可用于大肠杆菌中的蛋白质生产；pyes2(invitrogen,sandiego,calif)，其用于酿酒酵母酵母菌株中的蛋白质生产；maxbac^tm完整杆状病毒表达系统(invitrogen,sandiego,calif)，其用于昆虫细胞中的蛋白质生产；以及pcdnai或pcdna3(invitrogen,sandiego,calif)，其用于哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(cho)细胞中的蛋白质生产。

在一些情况下，所述载体是通过整合到细胞基因组中或存在于染色体外来转化靶细胞的环状质粒(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。示例性的载体包括pvax、pcdna3.0或provax，或能够表达编码抗原的dna并使细胞能够将该序列翻译成被免疫系统识别的抗原的任何其他表达载体。

在一些情况下，基于核酸的疫苗是能够经由电穿孔而有效地递送至受试者并表达本文公开的一种或多种多肽的线性核酸疫苗或线性表达盒(“lec”)。该lec可以是任何没有任何磷酸骨架的线性dna。该dna可编码本文公开的一种或多种多肽。该lec可含有启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。多肽的表达可通过启动子控制。在一些情况下，该lec不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。在一些情况下，该lec不含有与多肽表达不相关的其他核酸序列。

基于肽的疫苗

在一些情况下，疫苗被配制为基于肽的疫苗。在一些情况下，本文所述的基于肽的疫苗包含经修饰的多跨膜多肽，其中该经修饰的多跨膜多肽通过以下过程产生：(a)通过随机诱变方法生成经修饰的多跨膜多肽文库；(b)生成第一组表达载体，其中每个表达载体包含：第一多核苷酸，其编码来自步骤a)的文库的经修饰的多跨膜多肽；第一选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的c末端；以及可选的第二选择标记基因，其可操作地连接至多核苷酸的n末端；(c)在存在或不存在至少一种选择剂的情况下，在第一多个宿主细胞中表达第一组表达载体，以针对一组稳定折叠的多跨膜多肽进行选择；(d)生成第二组生产载体，其中每个生产载体包含第三多核苷酸，该第三多核苷酸编码来自步骤c)中鉴定的那组稳定折叠的多跨膜多肽中的稳定折叠的多跨膜多肽；(e)在第二多个宿主细胞中表达第二组生产载体，其中该宿主细胞是生产宿主细胞；以及(f)用分析方法来分析由步骤e)的第二组生产载体产生的一组多跨膜多肽产物，以确定来自该组的、具有增强或改善的物理化学性质的多跨膜多肽产物，以用于生成疫苗，其中该增强或改善的物理化学性质是相对于对照多跨膜多肽的。在一些情况下，该增强或改善的物理化学性质包括表达水平、稳定性、构象选择性、同质性、蛋白质结晶、抗原性、免疫原性或途径激活选择性。在一些情况下，该对照包括野生型多跨膜多肽或具有不同修饰的经修饰的多跨膜多肽。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的离子通道蛋白。在一些情况下，经修饰的离子通道蛋白是经修饰的trpv3、kca3.1或trpc6。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是经修饰的g蛋白偶联受体(gpcr)。在一些情况下，经修饰的gpcr是经修饰的ccr7、ccr10、gpr55、ntr1、ep2或ep4受体。在一些情况下，所述疫苗进一步包含佐剂。在一些情况下，该佐剂包括gm-csf。

在一些情况下，适当地并且如本领域所理解的，使用任何公知的技术、载体和赋形剂来配制基于肽的疫苗。在一些情况下，将一种或多种经修饰的多跨膜多肽配制为含有相同序列的多种多肽的混合物或不同多肽的多个拷贝的混合物。在一些情况下，对肽进行修饰，例如通过脂化或附接至载体蛋白。在一些情况下，脂化是脂质基团与多肽的共价附接。在一些情况下，脂化肽或脂化多肽使得结构变稳定，并增强疫苗治疗的功效。

在一些情况下，将脂化肽进一步掺入脂质体中。例如，脂化肽的脂质部分自发地整合到脂质体的脂双层中。因此，脂肽呈现于脂质体的“表面”上。在一些情况下，脂化肽是指包封在脂质体内的经修饰的多跨膜多肽。

适合于掺入制剂中的示例性的脂质体包括但不限于多层囊泡(mlv)、寡层囊泡(olv)、单层囊泡(uv)、小单层囊泡(suv)、中等大小单层囊泡(muv)、大单层囊泡(luv)、巨大单层囊泡(guv)、多泡囊泡(mvv)、通过反相蒸发法(rev)制备的单层或寡层囊泡、通过反相蒸发法制备的多层囊泡(mlv-rev)、稳定的多层囊泡(splv)、冷冻和解冻的mlv(fatmlv)、通过挤压法制备的囊泡(vet)、通过法式压滤法制备的囊泡(fpv)、通过融合制备的囊泡(fuv)、脱水-再水合囊泡(drv)和泡状体(bubblesome)(bsv)。在一些情况下，脂质体包含amphipol(a8-35)。用于制备脂质体的技术描述于，例如，colloidaldrugdeliverysystems,第66卷(j.kreuter编著,marceldekker,inc.(1994))。

取决于制备方法，脂质体是单层或多层的，并且在大小上有所不同，其直径范围为约0.02μm至大于约10μm。

在一些情况下，脂质体吸附许多类型的细胞，随后释放掺入的药剂(例如，本文所述的经修饰的多跨膜多肽)。在一些情况下，脂质体与靶细胞融合，由此脂质体的内容物随后被排空到靶细胞中。在一些情况下，脂质体被吞噬细胞内吞。然后内吞作用之后是脂质体脂质的溶酶体内降解和包封剂的释放。scherphof等人,ann.n.yacad.sci.,446:368(1985)。

在一些情况下，本文提供的脂质体还包含载体脂质。在一些实施方案中，该载体脂质是磷脂。能够形成脂质体的载体脂质包括但不限于二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、磷脂酰胆碱(pc；卵磷脂)、磷脂酸(pa)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰乙醇胺(pe)或磷脂酰丝氨酸(ps)。其他合适的磷脂进一步包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二硬脂酰磷脂酰甘油(dspg)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(dmpg)、二棕榈酰磷脂酸(dppa)；二肉豆蔻酰磷脂酸(dmpa)、二硬脂酰磷脂酸(dspa)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(dpps)、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(dmps)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(dsps)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(dspe)等，或其组合。在一些实施方案中，该脂质体进一步包含调节脂质体形成的甾醇(例如，胆固醇)。该载体脂质可以是任何已知的非磷酸盐极性脂质。

在一些情况下，本文所述的经修饰的多跨膜多肽也附接至载体蛋白以便作为疫苗递送。在一些情况下，该载体蛋白是免疫原性载体元件并通过任何重组技术附接。示例性的载体蛋白包括海洋生物匙孔血蓝蛋白(mcklh)、聚乙二醇化的mcklh、bluecarrier*蛋白、牛血清白蛋白(bsa)、阳离子化bsa、卵清蛋白和细菌蛋白质如破伤风类毒素(tt)。

在一些情况下，将多肽制备为多种抗原肽(map)。在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽在n末端或c末端附接至小的非免疫原性核心。在一些情况下，该核心包含树枝状核心残基或由双功能单元组成的基质。用于构建map的合适的核心分子包括，例如，氨、乙二胺、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸。如本文所用的，map系统结构的“线性部分或分子”是指与核心基质连接的抗原性肽。因此，一簇抗原表位形成map的表面且小的基质形成其核心。在一些情况下，使用经典的merrifield合成方法在固体树脂上合成树枝状核心和整个map。map合成一般描述于，例如，美国专利号5,580,563和6,379,679以及tam,proc.natl.acad.sci.usa85:5409-5413,1988。

在一些情况下，经修饰的多跨膜多肽是化学合成的，或在细胞系统或无细胞系统中重组表达的。例如，通过液相合成、固相合成或通过微波辅助肽合成来合成肽。

在生成多肽后，有时使该多肽经历一轮或多轮纯化步骤以去除杂质。在一些情况下，纯化步骤包括利用分离方法如基于亲和力、基于尺寸排阻、基于离子交换等的层析步骤。在一些情况下，该多肽是至多30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或100％纯的或不存在杂质。在一些情况下，该多肽是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、99.9％或100％纯的或不存在杂质。

如本文所用的，多肽包括天然氨基酸、非天然氨基酸或其组合。在一些情况下，氨基酸残基是指含有氨基基团和羧基基团的分子。合适的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的d-异构体和l-异构体，以及通过有机合成或其他代谢途径制备的非天然存在的氨基酸。如本文所用的，术语氨基酸包括但不限于α-氨基酸、天然氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物。

在一些情况下，α-氨基酸是指含有与被称为α-碳的碳结合的氨基基团和羧基基团的分子。

在一些情况下，β-氨基酸是指以β构型含有氨基基团和羧基基团的分子。

在一些情况下，天然存在的氨基酸是指在自然界中合成的肽中常见的并以单字母缩写a、r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y和v所知的二十种氨基酸中的任何一种。

在一些情况下，疏水性氨基酸包括小的疏水性氨基酸和大的疏水性氨基酸。小的疏水性氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及其类似物。大的疏水性氨基酸是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸及其类似物。极性氨基酸是丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、酪氨酸及其类似物。带电荷的氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及其类似物。

在一些情况下，氨基酸类似物是指在结构上与氨基酸相似并在拟肽大环化合物的形成中置换氨基酸的分子。氨基酸类似物包括但不限于β-氨基酸和其中氨基基团或羧基基团被类似的反应性基团替换(例如，用仲胺或叔胺替换伯胺，或用酯替换羧基基团)的氨基酸。

在一些情况下，非天然氨基酸是指不是在自然界中合成的肽中常见的并以单字母缩写a、r、n、c、d、q、e、g、h、i、l、k、m、f、p、s、t、w、y和v所知的二十种氨基酸之一的氨基酸。

在一些实施方案中，非天然氨基酸或氨基酸类似物包括但不限于以下：

β-氨基酸类似物，如下：环状β-氨基酸类似物；β-丙氨酸；(r)-β-苯丙氨酸；(r)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(r)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(r)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-氯苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-氟苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；(r)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(r)-3-氨基-5-己烯酸；(r)-3-氨基-5-己炔酸；(r)-3-氨基-5-苯基戊酸；(r)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；(s)-1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-乙酸；(s)-3-氨基-4-(1-萘基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2,4-二氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-呋喃基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-萘基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(2-三氟甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3,4-二氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(3,4-二氟苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-苯并噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氯苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-氟苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-吡啶基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-噻吩基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(3-三氟甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-溴苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氯苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氰基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-氟苯基)丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-碘苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-硝基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-吡啶基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-(4-三氟甲基苯基)-丁酸；(s)-3-氨基-4-五氟-苯基丁酸；(s)-3-氨基-5-己烯酸；(s)-3-氨基-5-己炔酸；(s)-3-氨基-5-苯基戊酸；(s)-3-氨基-6-苯基-5-己烯酸；1,2,5,6-四氢吡啶-3-羧酸；1,2,5,6-四氢吡啶-4-羧酸；3-氨基-3-(2-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(2-噻吩基)-丙酸；3-氨基-3-(3-溴苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-氯苯基)-丙酸；3-氨基-3-(4-甲氧基苯基)-丙酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氨基己二酸；d-β-苯丙氨酸；β-亮氨酸；l-β-高丙氨酸；l-β-高天冬氨酸γ-苄酯；l-β-高谷氨酸δ-苄酯；l-β-高异亮氨酸；l-β-高亮氨酸；l-β-高甲硫氨酸；l-β-高苯丙氨酸；l-β-高脯氨酸；l-β-高色氨酸；l-β-高缬氨酸；l-nω-苄氧基羰基β-高赖氨酸；nω-l-β-高精氨酸；o-苄基l-β-高羟基脯氨酸；o-苄基-l-β高丝氨酸；o-苄基l-β-高苏氨酸；o-苄基l-β-高酪氨酸；γ-三苯甲基-l-β-高天冬氨酸；(r)-β-苯丙氨酸；l-β-高天冬氨酸γ-叔丁酯；l-β-高谷氨酸δ-叔丁酯；l-nω-β-高赖氨酸；nδ-三苯甲基-l-β-高谷氨酰胺；nω-2,2,4,6,7-五甲基-二氢苯并呋喃-5-磺酰基-l-β-高精氨酸；o-叔丁基-l-β-高羟基-脯氨酸；o-叔丁基-l-β高丝氨酸；o-叔丁基-l-β-高苏氨酸；o-叔丁基-l-β-高酪氨酸；2-氨基环戊烷羧酸；和2-氨基环己烷羧酸。

丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸或亮氨酸类似物，如下：α-甲氧基甘氨酸；α-烯丙基-l-丙氨酸；α-氨基异丁酸；α-甲基-亮氨酸；β-(1-萘基)-d-丙氨酸；β-(1-萘基)-l-丙氨酸；β-(2-萘基)-d-丙氨酸；β-(2-萘基)-l-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-d-丙氨酸；β-(2-吡啶基)-l-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-d-丙氨酸；β-(2-噻吩基)-l-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-d-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-l-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-d-丙氨酸；β-(3-吡啶基)-l-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-d-丙氨酸；β-(4-吡啶基)-l-丙氨酸；β-氯-l-丙氨酸；β-氰基-l-丙氨酸；β-环己基-d-丙氨酸；β-环己基-l-丙氨酸；β-环戊烯-1-基-丙氨酸；β-环戊基-丙氨酸；β-环丙基-l-丙氨酸-oh二环己基铵盐；β-叔丁基-d-丙氨酸；β-叔丁基-l-丙氨酸；γ-氨基丁酸；l-α,β-二氨基丙酸；2,4-二硝基-苯基甘氨酸；2,5-二氢-d-苯基甘氨酸；2-氨基-4,4,4-三氟丁酸；2-氟-苯基甘氨酸；3-氨基-4,4,4-三氟-丁酸；3-氟-缬氨酸；4,4,4-三氟-缬氨酸；4,5-脱氢-l-亮氨基-oh二环己基铵盐；4-氟-d-苯基甘氨酸；4-氟-l-苯基甘氨酸；4-羟基-d-苯基甘氨酸；5,5,5-三氟-亮氨酸；6-氨基己酸；环戊基-d-甘氨酸-oh二环己基铵盐；环戊基-甘氨酸-oh二环己基铵盐；d-α,β-二氨基丙酸；d-α-氨基丁酸；d-α-叔丁基甘氨酸；d-(2-噻吩基)甘氨酸；d-(3-噻吩基)甘氨酸；d-2-氨基己酸；d-2-茚满基甘氨酸；d-烯丙基甘氨酸-二环己基铵盐；d-环己基甘氨酸；d-正缬氨酸；d-苯基甘氨酸；β-氨基丁酸；β-氨基异丁酸；(2-溴苯基)甘氨酸；(2-甲氧基苯基)甘氨酸；(2-甲基苯基)甘氨酸；(2-噻唑基)甘氨酸；(2-噻吩基)甘氨酸；2-氨基-3-(二甲基氨基)-丙酸；l-α,β-二氨基丙酸；l-α-氨基丁酸；l-α-叔丁基甘氨酸；l-(3-噻吩基)甘氨酸；l-2-氨基-3-(二甲基氨基)-丙酸；l-2-氨基己酸二环己基铵盐；l-2-茚满基甘氨酸；l-烯丙基甘氨酸二环己基铵盐；l-环己基甘氨酸；l-苯基甘氨酸；l-炔丙基甘氨酸；l-正缬氨酸；n-α-氨基甲基-l-丙氨酸；d-α,γ-二氨基丁酸；l-α,γ-二氨基丁酸；β-环丙基-l-丙氨酸；(n-β-(2,4-二硝基苯基))-l-α,β-二氨基丙酸；(n-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-d-α,β-二氨基丙酸；(n-β-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-l-α,β-二氨基丙酸；(n-β-4-甲基三苯甲基)-l-α,β-二氨基丙酸；(n-β-烯丙氧基羰基)-l-α,β-二氨基丙酸；(n-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-d-α,γ-二氨基丁酸；(n-γ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-l-α,γ-二氨基丁酸；(n-γ-4-甲基三苯甲基)-d-α,γ-二氨基丁酸；(n-γ-4-甲基三苯甲基)-l-α,γ-二氨基丁酸；(n-γ-烯丙氧基羰基)-l-α,γ-二氨基丁酸；d-α,γ-二氨基丁酸；4,5-脱氢l-亮氨酸；环戊基-d-甘氨酸-oh；环戊基-甘氨酸-oh；d-烯丙基甘氨酸；d-高环己基丙氨酸；l-1-芘基丙氨酸；l-2-氨基己酸；l-烯丙基甘氨酸；l-高环己基丙氨酸；和n-(2-羟基-4-甲氧基-苄基)-甘氨酸-oh。

氨基酸类似物可包括精氨酸或赖氨酸的类似物。精氨酸和赖氨酸的氨基酸类似物的实例包括但不限于以下：瓜氨酸；l-2-氨基-3-胍基丙酸；l-2-氨基-3-脲基丙酸；l-瓜氨酸；lys(me)2-oh；lys(n3)-oh；nδ-苄氧羰基-l-鸟氨酸；nω-硝基-d-精氨酸；nω-硝基-l-精氨酸；α-甲基-鸟氨酸；2,6-二氨基庚二酸；l-鸟氨酸；(nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-d-鸟氨酸；(nδ-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环己-1-亚基)乙基)-l-鸟氨酸；(nδ-4-甲基三苯甲基)-d-鸟氨酸；(nδ-4-甲基三苯甲基)-l-鸟氨酸；d-鸟氨酸；l-鸟氨酸；arg(me)(pbf)-oh；arg(me)2-oh(不对称的)；arg(me)2-oh(对称的)；lys(ivdde)-oh；lys(me)2-oh.hcl；lys(me3)-oh氯化物；nω-硝基-d-精氨酸；和nω-硝基-l-精氨酸。

天冬氨酸或谷氨酸类似物，如下：α-甲基-d-天冬氨酸；α-甲基-谷氨酸；α-甲基-l-天冬氨酸；γ-亚甲基-谷氨酸；(n-γ-乙基)-l-谷氨酰胺；[n-α-(4-氨基苯甲酰基)]-l-谷氨酸；2,6-二氨基庚二酸；l-α-氨基辛二酸；d-2-氨基己二酸；d-α-氨基辛二酸；α-氨基庚二酸；亚氨基二乙酸；l-2-氨基己二酸；苏氨酸-β-甲基-天冬氨酸；γ-羧基-d-谷氨酸γ,γ-二叔丁酯；γ-羧基-l-谷氨酸γ,γ-二叔丁酯；glu(oall)-oh；l-asu(otbu)-oh；和焦谷氨酸。

半胱氨酸和甲硫氨酸类似物，如下：cys(法呢基)-oh、cys(法呢基)-ome、α-甲基-甲硫氨酸、cys(2-羟乙基)-oh、cys(3-氨基丙基)-oh、2-氨基-4-(乙基硫基)丁酸、丁硫氨酸、丁硫氨酸亚砜亚胺、乙硫氨酸、甲硫氨酸甲基氯化锍、硒代甲硫氨酸、半胱磺酸、[2-(4-吡啶基)乙基]-dl-青霉胺、[2-(4-吡啶基)乙基]-l-半胱氨酸、4-甲氧基苄基-d-青霉胺、4-甲氧基苄基-l-青霉胺、4-甲基苄基-d-青霉胺、4-甲基苄基-l-青霉胺、苄基-d-半胱氨酸、苄基-l-半胱氨酸、苄基-dl-高半胱氨酸、氨基甲酰基-l-半胱氨酸、羧乙基-l-半胱氨酸、羧甲基-l-半胱氨酸、二苯甲基-l-半胱氨酸、乙基-l-半胱氨酸、甲基-l-半胱氨酸、叔丁基-d-半胱氨酸、三苯甲基-l-高半胱氨酸、三苯甲基-d-青霉胺、胱硫醚、高胱氨酸、l-高胱氨酸、(2-氨基乙基)-l-半胱氨酸、硒-l-胱氨酸、胱硫醚、cys(stbu)-oh和乙酰氨基甲基-d-青霉胺。

苯丙氨酸和酪氨酸类似物，如下：β-甲基-苯丙氨酸、β-羟基苯丙氨酸、α-甲基-3-甲氧基-dl-苯丙氨酸、α-甲基-d-苯丙氨酸、α-甲基-l-苯丙氨酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、2,4-二氯-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、2-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、2-溴-d-苯丙氨酸、2-溴-l-苯丙氨酸、2-氯-d-苯丙氨酸、2-氯-l-苯丙氨酸、2-氰基-d-苯丙氨酸、2-氰基-l-苯丙氨酸、2-氟-d-苯丙氨酸、2-氟-l-苯丙氨酸、2-甲基-d-苯丙氨酸、2-甲基-l-苯丙氨酸、2-硝基-d-苯丙氨酸、2-硝基-l-苯丙氨酸、2,4,5-三羟基-苯丙氨酸、3,4,5-三氟-d-苯丙氨酸、3,4,5-三氟-l-苯丙氨酸、3,4-二氯-d-苯丙氨酸、3,4-二氯-l-苯丙氨酸、3,4-二氟-d-苯丙氨酸、3,4-二氟-l-苯丙氨酸、3,4-二羟基-l-苯丙氨酸、3,4-二甲氧基-l-苯丙氨酸、3,5,3'-三碘-l-甲状腺原氨酸、3,5-二碘-d-酪氨酸、3,5-二碘-l-酪氨酸、3,5-二碘-l-甲状腺原氨酸、3-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、3-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、3-氨基-l-酪氨酸、3-溴-d-苯丙氨酸、3-溴-l-苯丙氨酸、3-氯-d-苯丙氨酸、3-氯-l-苯丙氨酸、3-氯-l-酪氨酸、3-氰基-d-苯丙氨酸、3-氰基-l-苯丙氨酸、3-氟-d-苯丙氨酸、3-氟-l-苯丙氨酸、3-氟-酪氨酸、3-碘-d-苯丙氨酸、3-碘-l-苯丙氨酸、3-碘-l-酪氨酸、3-甲氧基-l-酪氨酸、3-甲基-d-苯丙氨酸、3-甲基-l-苯丙氨酸、3-硝基-d-苯丙氨酸、3-硝基-l-苯丙氨酸、3-硝基-l-酪氨酸、4-(三氟甲基)-d-苯丙氨酸、4-(三氟甲基)-l-苯丙氨酸、4-氨基-d-苯丙氨酸、4-氨基-l-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-d-苯丙氨酸、4-苯甲酰基-l-苯丙氨酸、4-双(2-氯乙基)氨基-l-苯丙氨酸、4-溴-d-苯丙氨酸、4-溴-l-苯丙氨酸、4-氯-d-苯丙氨酸、4-氯-l-苯丙氨酸、4-氰基-d-苯丙氨酸、4-氰基-l-苯丙氨酸、4-氟-d-苯丙氨酸、4-氟-l-苯丙氨酸、4-碘-d-苯丙氨酸、4-碘-l-苯丙氨酸、高苯丙氨酸、甲状腺原氨酸、3,3-二苯丙氨酸、甲状腺原氨酸、乙基酪氨酸和甲基酪氨酸。

脯氨酸类似物，如下：3,4-脱氢-脯氨酸、4-氟-脯氨酸、顺式-4-羟基-脯氨酸、噻唑烷-2-羧酸和反式-4-氟-脯氨酸。

丝氨酸和苏氨酸类似物，如下：3-氨基-2-羟基-5-甲基己酸、2-氨基-3-羟基-4-甲基戊酸、2-氨基-3-乙氧基丁酸、2-氨基-3-甲氧基丁酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-氨基-3-苄氧基丙酸、2-氨基-3-苄氧基丙酸、2-氨基-3-乙氧基丙酸、4-氨基-3-羟基丁酸和α-甲基丝氨酸。

色氨酸类似物，如下：α-甲基-色氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-d-丙氨酸；β-(3-苯并噻吩基)-l-丙氨酸；1-甲基-色氨酸；4-甲基-色氨酸；5-苄氧基-色氨酸；5-溴-色氨酸；5-氯-色氨酸；5-氟-色氨酸；5-羟基-色氨酸；5-羟基-l-色氨酸；5-甲氧基-色氨酸；5-甲氧基-l-色氨酸；5-甲基-色氨酸；6-溴-色氨酸；6-氯-d-色氨酸；6-氯-色氨酸；6-氟-色氨酸；6-甲基-色氨酸；7-苄氧基-色氨酸；7-溴-色氨酸；7-甲基-色氨酸；d-1,2,3,4-四氢-去甲哈尔满-3-羧酸；6-甲氧基-1,2,3,4-四氢去甲哈尔满-1-羧酸；7-氮杂色氨酸；l-1,2,3,4-四氢-去甲哈尔满-3-羧酸；5-甲氧基-2-甲基-色氨酸；和6-氯-l-色氨酸。

在一些实施方案中，氨基酸类似物是外消旋混合物。在一些情况下，使用氨基酸类似物的d异构体。在一些情况下，使用氨基酸类似物的l异构体。在一些情况下，该氨基酸类似物包含r或s构型的手性中心。有时，β-氨基酸类似物的氨基基团任选被保护基例如叔丁氧羰基(boc基)、9-芴基甲氧羰基(fmoc)、甲苯磺酰基等取代。有时，β-氨基酸类似物的羧酸官能团被保护，例如作为其酯衍生物。在一些情况下，使用氨基酸类似物的盐。

基于抗原呈递细胞(apc)的疫苗

在一些情况下，疫苗是基于抗原呈递细胞(apc)的疫苗。在一些情况下，适当地并且如本领域所理解的，使用任何公知的技术、载体和赋形剂来配制基于apc的疫苗。apc包括单核细胞、单核细胞衍生的细胞、巨噬细胞和树突细胞。有时，基于apc的疫苗可以是基于树突细胞的疫苗。

在一些情况下，通过本领域公知的任何方法制备基于树突细胞的疫苗。在一些情况下，通过离体或体内方法制备基于树突细胞(dc)的疫苗。离体方法包括，例如，使用本文所述多肽离体脉冲的自体dc以在施用于患者之前激活或加载dc。在一些情况下，体内方法包括使用与本文所述多肽偶联的抗体来靶向特异性dc受体。基于dc的疫苗可进一步包含dc激活剂，如tlr3、tlr-7-8和cd40激动剂。基于dc的疫苗可进一步包含佐剂和药学上可接受的载体。

基于病毒的疫苗

在一些实施方案中，疫苗是基于病毒的疫苗。在一些情况下，基于活病毒或灭活病毒生成基于病毒的疫苗。基于活病毒的疫苗使用减毒病毒或冷适应的病毒。在一些情况下，基于灭活病毒的疫苗包含完整病毒体、裂解病毒体或纯化的表面抗原(例如，来自甲型流感病毒的ha和/或n)。用于灭活病毒的化学方法可包括用有效量的一种或多种以下试剂进行处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(c60)、二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或其组合。病毒灭活的非化学方法是本领域已知的，如uv光或γ辐射。

在一些情况下，通过各种方法从含病毒的流体中收获病毒体。例如，纯化过程可涉及使用包含去污剂的线性蔗糖梯度溶液来破坏病毒体的区带离心。在任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。

在一些情况下，通过用去污剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三-n-丁基磷酸酯、tritonx-100、tritonn101、十六烷基三甲基溴化铵、tergitolnp9等)处理纯化的病毒体以产生亚病毒体制剂来获得裂解病毒体，包括“吐温-醚”分裂过程。

佐剂

在一些情况下，本文所述的疫苗进一步包含佐剂。在一些情况下，佐剂用于增强在接受该疫苗的患者中引发的免疫应答(体液和/或细胞免疫应答)。有时，佐剂引起th1型应答。其他时候，佐剂引起th2型应答。在一些情况下，与特征在于产生诸如il-4、il-5和il-10的细胞因子的th2型应答相反，th1型应答的特征在于产生诸如ifn-γ的细胞因子。

在一些方面，基于脂质的佐剂如mpla和mdp可与本文公开的疫苗一起使用。例如，单磷酰脂质a(mpla)是导致脂质体抗原向特定t淋巴细胞呈递增加的佐剂。另外，胞壁酰二肽(mdp)也可与本文所述的疫苗制剂一起用作合适的佐剂。

在一些情况下，佐剂包括刺激分子，如细胞因子。细胞因子的非限制性实例包括：ccl20、α-干扰素(ifn-α)、β-干扰素(ifn-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(pdgf)、tnfa、tnfp、gm-csf、表皮生长因子(egf)、皮肤t细胞吸引趋化因子(ctack)、上皮胸腺表达的趋化因子(teck)、粘膜相关上皮趋化因子(mec)、il-12、il-15、il-28、mhc、cd80、cd86、il-1、il-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-18、mcp-1、mip-la、mip-1-、il-8、l-选择蛋白、p-选择蛋白、e-选择蛋白、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、pl50.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-18的突变形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、fit、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、drs、killer、trail-r2、trick2、dr6、胱天蛋白酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、不活跃的nik、sapk、sap-i、jnk、干扰素响应基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rankligand、ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tapi和tap2。

另外的佐剂包括：mcp-1、mip-la、mip-lp、il-8、rantes、l-选择蛋白、p-选择蛋白、e-选择蛋白、cd34、glycam-1、madcam-1、lfa-1、vla-1、mac-1、pl50.95、pecam、icam-1、icam-2、icam-3、cd2、lfa-3、m-csf、g-csf、il-4、il-18的突变形式、cd40、cd40l、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、il-7、il-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、fas、tnf受体、fit、apo-1、p55、wsl-1、dr3、tramp、apo-3、air、lard、ngrf、dr4、dr5、killer、trail-r2、trick2、dr6、胱天蛋白酶ice、fos、c-jun、sp-1、ap-1、ap-2、p38、p65rel、myd88、irak、traf6、ikb、不活跃的nik、sapk、sap-1、jnk、干扰素响应基因、nfkb、bax、trail、trailrec、trailrecdrc5、trail-r3、trail-r4、rank、rankligand、ox40、ox40ligand、nkg2d、mica、micb、nkg2a、nkg2b、nkg2c、nkg2e、nkg2f、tap1、tap2及其功能片段。

在一些方面，佐剂是toll样受体的调节剂。toll样受体调节剂的实例包括tlr-9激动剂，并不限于toll样受体的小分子调节剂如咪喹莫特。与本文所述的疫苗组合使用的佐剂的其他实例可包括但不限于皂苷、cpgodn等。

有时，佐剂是负责蛋白质的运输和重折叠的热休克蛋白分子伴侣，如hsp60、hsp70、groel、groes、dnak和dnaj。

有时，佐剂选自细菌类毒素、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物、铝盐、脂质体、cpg聚合物、水包油乳液或其组合。

有时，佐剂是水包油乳液。水包油乳液可包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中该油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)和生物相容的。乳液中油滴的直径通常小于5μm，并且甚至可具有亚微米直径，其中用高压均质器实现这些较小的尺寸以提供稳定的乳液。尺寸小于220nm的液滴是优选的，因为其可经历过滤除菌。

在一些情况下，使用的油包括诸如来自动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源可包括坚果、种子和谷物。最常见的花生油、大豆油、椰子油和橄榄油举例说明了坚果油。可使用例如从荷荷巴豆中获得的荷荷巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。谷物组可包括：玉米油和其他谷物如小麦、燕麦、黑麦、大米、苔麸、黑小麦等的油。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然没有天然存在于种子油中，但可通过从坚果油和种子油开始的适当物质的水解、分离和酯化来制备。来自哺乳动物乳的脂肪和油可以是可代谢的，并且可因此与本文所述的疫苗一起使用。从动物来源获得纯油所必需的分离、纯化、皂化和其他手段的程序是本领域公知的。鱼可含有可容易回收的可代谢的油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡可举例说明几种可在本文中使用的鱼油。许多支链油可在5-碳异戊二烯单元中生物化学合成，并通常可被称为萜类化合物。鲨鱼肝油含有被称为角鲨烯2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯的支链不饱和萜类化合物。也可使用角鲨烯的饱和类似物角鲨烷。包括角鲨烯和角鲨烷的鱼油可容易地从商业来源获得或者可通过本领域已知的方法获得。

其他有用的油包括，例如，生育酚，其包含在用于老年患者(例如，年龄在60岁或60岁以上)的疫苗中，因为据报道维生素e对该患者组的免疫应答具有积极作用。此外，生育酚具有可有助于稳定乳液的抗氧化性质。存在各种生育酚(α、β、γ、δ、ε或ξ)，但通常使用α。α-生育酚的实例是dl-α-生育酚。α-生育酚琥珀酸酯可与流感疫苗相容，并且作为汞化合物的替代物可以是有用的防腐剂。

有时使用油的混合物，该混合物包含例如角鲨烯和α-生育酚。有时使用2-20％(体积)范围内的油含量。

在一些情况下，表面活性剂按其“hlb”(亲水/亲脂平衡)进行分类。在一些情况下，表面活性剂具有至少10、至少15和/或至少16的hlb。表面活性剂可包括但不限于：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(通常被称为吐温)，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以dowfaxtm商品名出售的环氧乙烷(eo)、环氧丙烷(po)和/或环氧丁烷(bo)的共聚物，如线性eo/po嵌段共聚物；辛羟苯酚，其重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)基团的数目可与辛苯聚醇-9(tritonx-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)不同；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(igepalca-630/np-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚乙氧基化物，如tergitol^tmnp系列；衍生自月桂醇、十六醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为brij表面活性剂)，如三乙二醇单月桂醚(brij30)；以及脱水山梨糖醇酯(通常称为span)，如脱水山梨糖醇三油酸酯(span85)和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。本文可使用非离子表面活性剂。

所用的表面活性剂的混合物包括，例如，吐温80/span85混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和辛苯聚醇的组合也可以是合适的。另一组合可包含月桂醇聚醚9加聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

在一些情况下，表面活性剂的量(重量％)包括：聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01％至1％，特别是约0.1％；辛基苯氧基聚氧乙醇或壬基苯氧基聚氧乙醇(如tritonx-100或triton系列中的其他去污剂)0.001％至0.1％，特别是0.005％至0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1％至20％，优选0.1％至10％，并且特别是0.1％至1％或约0.5％。

载体和赋形剂

在一些情况下，疫苗包含载体和赋形剂(包括但不限于缓冲剂、碳水化合物、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂)、水、油(包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)、盐水溶液、右旋糖水溶液和甘油溶液、调味剂、着色剂、除粘剂和其他可接受的添加剂、佐剂或粘合剂、接近生理条件所需的其他药学上可接受的辅助物质如ph缓冲剂、张力调节剂、乳化剂、润湿剂等。赋形剂的实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。在另一种情况下，药物制剂基本上不含防腐剂。在其他情况下，药物制剂可含有至少一种防腐剂。关于药物剂型的一般方法可见于ansel等人,pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(lippencottwilliams&wilkins,baltimoremd.(1999))。应当认识到，虽然本领域普通技术人员已知的任何合适的载体可用于施用本文所述的药物组合物，但载体的类型将根据施用方式而变化。

在一些情况下，使用公知的技术将疫苗的药物组合物包封在脂质体内。可生物降解的微球也可用作本发明药物组合物的载体。合适的可生物降解的微球体公开于，例如，美国专利号4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344和5,942,252。

在一些情况下，所述药物组合物以脂质体或微球(或微粒)进行施用。制备用于施用于患者的脂质体和微球的方法是本领域技术人员公知的。例如，美国专利号4,789,734描述了用于将生物材料包封在脂质体中的方法。基本上，将材料溶解于水溶液中，如果需要，添加适当的磷脂和脂质以及表面活性剂，并且必要时对材料进行透析或声处理。g.gregoriadis,第14章,“liposomes,”drugcarriersinbiologyandmedicine,pp.2.sup.87-341(academicpress,1979)提供了已知方法的综述。

由聚合物或蛋白质形成的微球是本领域技术人员公知的，并且可以被定制用于通过胃肠道直接进入血流。或者，可掺入化合物并植入微球或微球复合物，以供在数天至数月的时间内缓慢释放。参见，例如，美国专利号4,906,474、4,925,673和3,625,214以及jein,tips19:155-157(1998)。

在一些情况下，疫苗包含防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。在一些情况下，疫苗基本上不含(例如，<10μg/ml)汞物质，例如，不含硫柳汞。α-生育酚琥珀酸酯可用作汞化合物的替代物。

为了控制张力，生理盐如钠盐任选地包含在疫苗中。其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二钠和/或氯化镁等。

在一些情况下，疫苗的重量摩尔渗透压浓度为约200mosm/kg至约400mosm/kg、约240mosm/kg至360mosm/kg或290mosm/kg至310mosm/kg。

在一些情况下，疫苗包含一种或多种缓冲液，例如tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(例如，用氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。在一些情况下，以5-20mm的范围包含缓冲液。

在一些情况下，疫苗的ph为约5.0至约8.5、约6.0至约8.0、约6.5至约7.5或约7.0至约7.8。

在一些情况下，疫苗是无菌的。在一些情况下，疫苗是无热原的，例如，每剂含有<1eu(内毒素单位，标准量)，并且可为每剂<0.1eu。

在一些情况下，疫苗包含去污剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(称为“吐温”)、辛苯聚醇(如辛苯聚醇-9(tritonx-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、十六烷基三甲基溴化铵(“ctab”)或脱氧胆酸钠，特别适用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗可包含各自小于1mg/ml的辛苯聚醇-10和聚山梨醇酯80。痕量的其他残余组分任选地是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、链霉素、多粘菌素b)。

在一些情况下，在本领域公知的合适媒介物中将疫苗配制为无菌溶液或悬浮液。药物组合物可通过常规的公知的灭菌技术进行灭菌，或者可以过滤除菌。所得水溶液可原样包装以供使用，或冻干，在施用前将冻干制剂与无菌溶液混合。合适的制剂和另外的载体描述于remington“thescienceandpracticeofpharmacy”(第20版lippincottwilliams&wilkins,baltimoremd.)。

在一些情况下，疫苗与一种或多种药学上可接受的盐一起配制。药学上可接受的盐可包括无机离子如钠、钾、钙、镁离子等的盐。这样的盐可包括无机酸或有机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、扁桃酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸或马来酸的盐。另外，如果药剂含有羧基基团或其他酸性基团，则可将其转化为无机碱或有机碱的药学上可接受的加成盐。合适的碱的实例包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨、环己胺、二环己基胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等。

包含与一种或多种佐剂组合的活性剂如肽、核酸、抗体或其片段和/或本文所述的apc的药物组合物可被配制成具有一定的摩尔比。例如，可使用摩尔比约99:1至约1:99的与一种或多种佐剂组合的活性剂如肽、核酸、抗体或其片段和/或本文所述的apc。在一些情况下，与一种或多种佐剂组合的活性剂如肽、核酸、抗体或其片段和/或本文所述的apc的摩尔比范围可选自约80:20至约20:80、约75:25至约25:75、约70:30至约30:70、约66:33至约33:66、约60:40至约40:60、约50:50和约90:10至约10:90。与一种或多种佐剂组合的活性剂如肽、核酸、抗体或其片段和/或本文所述的apc的摩尔比可为约1:9，并且在一些情况下可为约1:1。与一种或多种佐剂组合的活性剂如肽、核酸、抗体或其片段和/或本文所述的apc可以在相同的剂量单元例如一个小瓶、栓剂、片剂、胶囊、气雾喷雾剂中配制在一起；或者每种药剂、形式和/或化合物可以在单独的单元例如两个小瓶、栓剂、片剂、两个胶囊、片剂和小瓶、气雾喷雾剂等中配制。

用衍生自经修饰的跨膜多肽的疫苗治疗疾病或病况

在一些实施方案中，本文所述的疫苗被配制用于治疗疾病或病况，如癌症。在一些情况下，癌症是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，癌症是转移性癌症，或复发性或难治性癌症。在一些情况下，实体瘤包括肛门癌、阑尾癌、胆管癌(即胆管上皮癌)、膀胱癌、脑肿瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、原发灶不明癌(cup)、食道癌、眼癌、输卵管癌、胃肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺疾病、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、直肠癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌。

在一些情况下，血液系统恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、t细胞恶性肿瘤或b细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，t细胞恶性肿瘤是非特指型外周t细胞淋巴瘤(ptcl-nos)、间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、成人t细胞白血病/淋巴瘤(atll)、母细胞性nk细胞淋巴瘤、肠病型t细胞淋巴瘤、血红素γ-δt细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、鼻型nk/t细胞淋巴瘤或治疗相关的t细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，b细胞恶性肿瘤包括慢性淋巴细胞白血病(cll)、小淋巴细胞性淋巴瘤(sll)、高风险cll、非cll/sll淋巴瘤或幼淋巴细胞白血病(pll)。在一些实施方案中，癌症是滤泡性淋巴瘤(fl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、套细胞淋巴瘤(mcl)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤、结外边缘区b细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤、伯基特(burkitt)淋巴瘤、非伯基特高级别b细胞淋巴瘤、原发性纵隔b细胞淋巴瘤(pmbl)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体b淋巴母细胞淋巴瘤、b细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、浆细胞瘤、纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤或淋巴瘤样肉芽肿。

在一些情况下，本文所述的基于抗体的疫苗用于治疗癌症。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其他情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症，或复发性或难治性癌症。

在一些情况下，本文所述的基于核酸的疫苗用于治疗癌症。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其他情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症，或复发性或难治性癌症。

在一些情况下，本文所述的基于肽的疫苗用于治疗癌症。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其他情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症，或复发性或难治性癌症。

在一些情况下，本文所述的基于树突细胞的疫苗用于治疗癌症。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其他情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症，或复发性或难治性癌症。

在一些情况下，本文所述的基于抗原呈递细胞(apc)的疫苗用于治疗癌症。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其他情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症，或复发性或难治性癌症。

在一些情况下，本文所述的基于病毒的疫苗用于治疗癌症。在一些情况下，该癌症是实体瘤。在其他情况下，该癌症是血液系统恶性肿瘤。在一些情况下，该癌症是转移性癌症，或复发性或难治性癌症。

疫苗制剂

在一些实施方案中，使用一种或多种生理学上可接受的载体以常规方式配制与一种或多种佐剂组合使用的本文所述的疫苗，该一种或多种生理学上可接受的载体包括赋形剂、稀释剂和/或助剂，例如促进将活性剂加工成可施用的制剂的助剂。合适的制剂至少部分取决于选定的施用途径。可以使用多种施用途径或方式，包括口服、口腔、局部、直肠、透皮、经粘膜、皮下、静脉内和肌肉内施加以及通过吸入，将本文所述的药剂递送至患者。

在一些情况下，活性剂被配制用于肠胃外施用(例如，通过注射，例如推注或连续输注)，并且可以在安瓿、预填充注射器、小体积输注液或添加有防腐剂的多剂量容器中以单位剂量形式呈现。组合物可以采取诸如油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液，例如聚乙二醇水溶液中的溶液的形式。

对于可注射制剂，媒介物可选自本领域已知的合适的媒介物，包括水溶液或油悬浮液，或乳液，其含有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及酏剂、甘露醇、右旋糖或无菌水溶液，以及类似的药物媒介物。所述制剂还可包含生物相容的或可生物降解的聚合物组合物，如聚(乳酸-共-乙醇酸)。这些材料可制成装载有药物并进一步涂覆或衍生化以提供优异的持续释放性能的微米球或纳米球。适用于眼周或眼内注射的媒介物包括，例如，治疗剂在注射级水、脂质体和适用于亲脂性物质的媒介物中的悬浮液。用于眼周或眼内注射的其他媒介物是本领域公知的。

当通过注射施用时，活性剂有时配制在水溶液中，特别是在生理上相容的缓冲液如hanks溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。该溶液可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性化合物可以是在使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原水)重建的粉末形式。在另一实施方案中，药物组合物不包含佐剂或用于增强肽刺激的免疫应答的任何其他添加的物质。在另一实施方案中，药物组合物包含抑制对肽的免疫应答的物质。配制方法是本领域已知的，例如，如remington的pharmaceuticalsciences,latestedition,mackpublishingco.,eastonp中所公开的。

对于口服施用，有时通过将活性剂与本领域公知的药学上可接受的载体组合来容易地配制活性剂。这样的载体能够将本发明的药剂配制成片剂，包括用于由待治疗的患者口服摄入的可咀嚼片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、锭剂、硬糖、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、粉末、悬浮液、酏剂、晶片等。这样的制剂可包含药学上可接受的载体，包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂。固体载体可以是也可作为稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料的一种或多种物质。在粉末中，载体通常是细碎的固体，该固体是与细碎的活性组分的混合物。在片剂中，活性组分通常以合适的比例与具有必需结合能力的载体混合，并被压制成所需的形状和大小。粉末和片剂优选含有约百分之一(1)至约百分之七十(70)的活性化合物。合适的载体包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。通常，活性剂的浓度水平可以是按重量计口服剂型总组合物的约0.5％、约5％、约10％、约20％或约30％至约50％、约60％、约70％、约80％或约90％，其量足以提供所需剂量单位。

在一些情况下，所述疫苗被配制成气雾剂溶液、悬浮液或干粉。气雾剂可以通过呼吸系统或鼻道施用。例如，本领域技术人员将认识到，本发明的组合物可以悬浮或溶解在合适的载体，例如药学上可接受的推进剂中，并使用鼻喷雾剂或吸入剂直接施用于肺部。例如，包含转运蛋白、载体或离子通道抑制剂的气雾剂制剂可以溶解、悬浮或乳化在推进剂或溶剂与推进剂的混合物中，例如用作鼻喷雾剂或吸入剂施用。气雾剂制剂可以在压力下含有任何可接受的推进剂，例如本领域常规使用的美容上或皮肤病学上或药学上可接受的推进剂。

用于鼻腔施用的气雾剂制剂通常是被设计成以滴剂或喷雾剂施用于鼻道的水溶液。鼻溶液可类似于鼻分泌物，因为它们通常是等渗的且稍微缓冲以维持约5.5至约6.5的ph，但是可以另外使用该范围之外的ph值。制剂中还可包含抗微生物剂或防腐剂。

在一些情况下，设计用于吸入的气雾剂制剂和吸入剂，使得当通过鼻或口呼吸途径施用时，该药剂或药剂组合被携带到受试者的呼吸树中。可以例如通过喷雾器施用吸入溶液。包含精细粉末或液体药物的吸入剂或吹入剂可作为药剂或药剂组合在推进剂中的溶液或悬浮液的药用气雾剂递送到呼吸系统，例如以帮助分配。推进剂可以是液化气体，包括卤代烃，例如氟碳化合物如氟氯烃、氢氯氟烃和氢氯烃，以及烃和烃醚。

卤代烃推进剂可包括其中所有氢被氟替代的氟碳化合物推进剂、其中所有氢被氯和至少一种氟替代的氯氟烃推进剂、含氢的氟碳化合物推进剂和含氢的氯氟烃推进剂。卤代烃推进剂描述于johnson，美国专利号5,376,359；byron等人,美国专利号5,190,029；和purewal等人,美国专利号5,776,434中。可用于本发明的烃推进剂包括，例如，丙烷、异丁烷、正丁烷、戊烷、异戊烷和新戊烷。烃的混合物也可用作推进剂。醚推进剂包括，例如，二甲醚以及醚类。在一些情况下，气雾剂制剂还包含超过一种推进剂。例如，气雾剂制剂可包含超过一种来自相同类别的推进剂，如两种或更多种氟碳化合物；或者超过一种、超过两种、超过三种来自不同类别的推进剂，如氟代烃和烃。在一些情况下，疫苗也用压缩气体，例如，惰性气体如二氧化碳、一氧化二氮或氮气来分配。

气雾剂制剂还可包含其他组分，例如乙醇、异丙醇、丙二醇以及表面活性剂或其他组分如油和去污剂。这些组分可用于稳定该制剂和/或润滑阀门组件。

在一些情况下，在压力下包装气雾剂制剂并使用溶液、悬浮液、乳液、粉末和半固体制剂将其配制成气雾剂。例如，溶液气雾剂制剂可包含本发明的药剂的溶液，如转运蛋白、载体或离子通道抑制剂在(基本上)纯的推进剂中或作为推进剂和溶剂的混合物。溶剂可用于溶解药剂和/或延缓推进剂的蒸发。溶剂可包括，例如，水、乙醇和乙二醇。可以使用任何合适溶剂的组合，任选地与防腐剂、抗氧化剂和/或其他气雾剂组分组合。

在一些情况下，气雾剂制剂是分散体或悬浮液。悬浮液气雾剂制剂可包含本发明的药剂或药剂组合例如转运蛋白、载体或离子通道抑制剂和分散剂的悬浮液。分散剂可包括，例如，脱水山梨糖醇三油酸酯、油醇、油酸、卵磷脂和玉米油。悬浮液气雾剂制剂还可包括润滑剂、防腐剂、抗氧化剂和/或其他气雾剂组分。

在一些情况下，气雾剂制剂被配制为乳液。乳液气雾剂制剂可包含，例如，醇如乙醇、表面活性剂、水和推进剂，以及本发明的药剂或药剂组合，例如转运蛋白、载体或离子通道抑制剂。使用的表面活性剂可以是非离子的、阴离子的或阳离子的。乳液气雾剂制剂的一个实例包括，例如，乙醇、表面活性剂、水和推进剂。乳液气雾剂制剂的另一实例包括，例如，植物油、单硬脂酸甘油酯和丙烷。

疫苗剂量、施用途径和治疗方案

在一些情况下，疫苗经由各种途径递送。示例性的递送途径包括口服(包括颊部和舌下)、直肠、鼻腔、局部、透皮贴剂、肺部、阴道、栓剂或肠胃外(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下和静脉内)施用或者以适合于通过雾化、吸入或吹入施用的形式。药物递送系统的一般信息可见于ansel等人,pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(lippencottwilliams&wilkins,baltimoremd.(1999))。在一些情况下，将本文所述的疫苗施用于肌肉，或者可以经由皮内或皮下注射施用，或透皮如通过离子电渗疗法施用。在一些情况下，采用疫苗的表皮施用。

在一些情况下，所述疫苗被配制用于经由鼻道施用。其中载体是固体的适合于鼻腔施用的制剂可包括粒径例如在约10至约500微米范围内的粗粉末，该粗粉末以摄入鼻烟的方式施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末容器中快速吸入。制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过雾化器的气雾剂施用。该制剂可包括疫苗的水性或油性溶液。

在一些情况下，所述疫苗是液体制剂，如悬浮液、糖浆或酏剂。所述疫苗还可以是用于肠胃外施用、皮下施用、皮内施用、肌肉内施用或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，如无菌悬浮液或乳液。

在一些情况下，所述疫苗包括用于单次免疫的材料，或可包括用于多次免疫的材料(即“多剂量”试剂盒)。在一些情况下，多剂量设置中包含防腐剂。作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代物(或除在多剂量组合物中包含防腐剂之外)，组合物可包含在具有用于去除材料的无菌适配器的容器中。

在一些情况下，所述疫苗以约0.5ml的剂量体积施用，但是可以向儿童施用半剂量(即约0.25ml)。有时，所述疫苗可以以更高的剂量施用，例如约1ml。

在一些情况下，所述疫苗以1、2、3、4、5个或更多个剂量疗程方案施用。有时，所述疫苗以2、3或4个剂量疗程方案施用。有时，所述疫苗以2个剂量疗程方案施用。

在一些情况下，将2个剂量疗程方案的第一剂量和第二剂量的施用分开约0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2个月、4个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年、3年、4年或更长。

在一些情况下，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年施用本文所述的疫苗。有时，每2、3、4、5、6、7年或更多年施用本文所述的疫苗。有时，每4、5、6、7年或更多年施用本文所述的疫苗。有时，施用一次本文所述的疫苗。

剂量实例不是限制性的，并仅用于举例说明用于施用本文所述疫苗的特定剂量方案。可以从动物模型确定用于人类的有效量。例如，可以配制用于人类的剂量以实现已经发现在动物中有效的循环浓度、肝脏浓度、局部浓度和/或胃肠道浓度。基于动物数据和其他类型的类似数据，本领域技术人员可以确定适用于人类的疫苗组合物的有效量。

当提及药剂或药剂组合时的有效量通常意指已由任何医学或制药领域的各种管理或咨询组织(例如，fda、ama)或由制造商或供应商推荐或批准的剂量范围、施用方式、制剂等。

在一些情况下，所述疫苗可以在与疾病或病况(例如，癌症)相关的症状发作之前、期间或之后施用。示例性的症状可包括发烧、咳嗽、喉咙痛、流鼻涕和/或鼻塞、头痛、发冷、疲劳、恶心、呕吐、腹泻、疼痛或其组合。在一些情况下，施用所述疫苗以用于治疗癌症。在一些情况下，施用所述疫苗以用于预防，如预防性治疗癌症。在一些情况下，施用所述疫苗以引发患者的免疫应答。

在一些方面，将本文所述的疫苗和试剂盒储存在2℃至8℃之间。在一些情况下，该疫苗不是冷冻保存的。在一些情况下，将该疫苗储存在如-20℃或-80℃的温度下。在一些情况下，将该疫苗远离阳光储存。

试剂盒/制品

在某些实施方案中，本文公开了与本文所述的一种或多种方法和平台一起使用的试剂盒和制品。这样的试剂盒包括载体、包装或被分隔以容纳一个或多个容器如小瓶、管等的容器，每个容器包含将在本文所述的方法中使用的单独元件之一。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器和试管。在一个实施方案中，该容器由多种材料如玻璃或塑料形成。

本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、袋子、容器、瓶子和适用于选定的制剂和可选的预期施用方式和治疗方式的任何包装材料。

例如，所述容器包括纯化的经修饰的多跨膜多肽(例如，离子通道多肽或gpcr)、经修饰的多跨膜多肽(例如，离子通道多肽或gpcr)构建体、针对经修饰的多跨膜多肽(例如，离子通道多肽或gpcr)的抗体、或基于本文所述的经修饰的多跨膜多肽(例如，离子通道多肽或gpcr)的疫苗。这样的试剂盒任选地包括关于其在本文所述方法中的使用的标识性描述或标签或说明。

试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明的标签，以及具有使用说明的包装插页。通常还将包括一套说明书。

在一个实施方案中，标签处于容器上或与容器相关联。在一个实施方案中，当构成标签的字母、数字或其他字符附着、模制或蚀刻到容器本身中时，标签处于容器上；当标签存在于也容纳容器的贮器或载具内时，标签与容器相关联，例如作为包装插页。在一个实施方案中，标签用于指示内容物将用于特定治疗应用。标签还指示内容物的使用指南，如在本文所述的方法中的使用指南。

在某些实施方案中，基于本文所述的经修饰的多跨膜多肽(例如，离子通道多肽或gpcr)的疫苗在包装或分配器装置中提供，该包装或分配器装置包含一种或多种含有本文提供的化合物的单位剂型。例如，该包装包含金属或塑料箔，如泡罩包装。在一个实施方案中，该包装或分配器装置附有施用说明。在一个实施方案中，该包装或分配器还附有与容器相关联的通知，其形式由管理药品制造、使用或销售的政府机构规定，该通知反映了该机构批准该药物形式用于人类或兽医施用。例如，这样的通知是由美国食品药品管理局批准用于处方药的标签或批准的产品插页。在一个实施方案中，还制备了含有在相容的药物载体中配制的本文提供的化合物的组合物，将其置于合适的容器中，并标注出用于治疗指定的病况。

某些术语

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。应当理解，一般描述和详细描述仅为示例性和解释性的，并不限制任何所要求保护的主题。在本申请中，除非另外明确指出，否则单数的使用包括复数。应当注意，如在本说明书中所用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”、“该”包括复数指示对象。在本申请中，除非另外指出，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”、“含有”和“包括”的使用并非限制性的。

如本文所用，范围和量可表示为“约”特定值或范围。约还包括确切量。因此，“约5μl”意指“约5μl”并且还意指“5μl”。通常，术语“约”包括通常预期在实验误差(例如，±5％、±10％或±15％)内的量。

本文所用的章节标题仅仅是为了组织编排目的，而不应理解为限制所描述的主题。

如本文所用，术语“个体”、“受试者”和“患者”意指任何哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物是人。在一些实施方案中，该哺乳动物不是人。这些术语均不要求或仅限于以医疗工作者(例如，医生、注册护士、执业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)的监督(例如，持续或间歇的)为特征的情况。

如本文所用的，术语“可操作地连接”意指，例如，第一核酸分子在框内(或在阅读框中)与第二核酸分子连接并且第一核酸分子和第二核酸分子在翻译时分别编码第一多肽和第二多肽。在一些情况下，“可操作地连接”进一步包括直接连接或间接连接，例如，第一核酸分子与第二核酸分子直接连接或通过连接体序列间接连接。在一些情况下，在第一选择标记基因和第二选择标记基因的背景下，第一选择标记基因可操作地连接(或框内连接)至本文所述多核苷酸的编码的c末端。在一些情况下，第二选择标记可操作地连接(或框内连接)至本文所述多核苷酸的编码的n末端。在一些情况下，第一选择标记基因和/或第二选择标记基因进一步与本文所述的多核苷酸直接连接至或通过连接体序列与本文所述的多核苷酸间接连接。在一些情况下，连接体序列编码长度为约1至约60个氨基酸残基的连接体多肽，例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或约60个氨基酸残基。

如本文所用的，术语“生产载体”意指用于产生感兴趣的蛋白质的表达载体。例如，在本文所述的经修饰的多跨膜多肽的背景下，生产载体是用于经修饰的多跨膜多肽的蛋白质生产的表达载体。在一些情况下，生产载体是细菌(例如，大肠杆菌)表达载体、昆虫表达载体、酵母表达载体、藻类表达载体或哺乳动物表达载体。在一些情况下，生产载体不包含与编码经修饰的多跨膜多肽的基因可操作地连接(例如，直接连接或间接连接至n末端和/或c末端)并编码经修饰的多跨膜多肽-选择标记多肽融合蛋白的如本文所述的选择标记基因。在一些情况下，生产载体不编码式i-iv的经修饰的多跨膜多肽。

实施例

提供这些实施例仅用于说明性目的，而并非限制本文提供的权利要求的范围。

实施例1-文库生成阶段

任选地与dna改组偶合的随机诱变同时在多个位置利用全范围的组合氨基酸替代物。利用易错pcr生成基因的文库(第一级文库)，其中每1kb的dna编码区在翻译后随机突变2-8个氨基酸残基(相当均匀的突变频率)。任选地，随后使用dna改组(step，交错延伸pcr)生成具有以每1kb的dna编码区约1至15个不同氨基酸随机突变的基因的第二文库(第二级)。

这些结构域全部被各种小寡肽连接体分开，以便允许构建体的各种组分的功能性折叠。使用组成型启动子(例如plac)或诱导型启动子(例如arabad、t7)，在添加化学诱导剂(例如阿拉伯糖、iptg)的情况下将构建体在选择宿主大肠杆菌中永久转录。

实施例2-用于多跨膜多肽变体选择的构建体设计

将突变的基因插入预先形成的构建体(质粒形式)中，该构建体含有：

·信号序列，

·在其c末端侧的第一选择标记蛋白质/酶(例如卡那霉素抗性基因)，以及

·麦芽糖结合蛋白(mbp)或在受体n末端侧的第二选择标记蛋白质/酶(例如β-内酰胺酶基因)。

实施例3-选择阶段

然后使用含有经修饰的基因的构建体文库转化大肠杆菌菌株(例如bl21或dh10β)。在液体培养物和琼脂平板中，在具有不同浓度的卡那霉素(用于未转化细胞的mic为大约10mg/l)的lb培养基上测试生长。

使用来自大鼠的野生型神经降压肽受体1(ntsr1,uniprotp20789)的n末端截短(aa43-424)作为对照系统。

用包含以下组合的野生型ntsr1生成约25种构建体：

·3种不同的信号序列(giiiss、dsbass、mbpss)；

·2种融合伴侣(trxa、mbp)；

·几种寡肽连接体；以及

·抗生素抗性酶(卡那霉素抗性的nptii、庆大霉素抗性的aac(3)-1、羧苄青霉素抗性的tem-1β-内酰胺酶)。

当大肠杆菌表达含有ntsr1的某些构建体时(>50mg/l卡那霉素、>75mg/l羧苄青霉素)，所测试的两种抗生素(羧苄青霉素和庆大霉素)的表观mic显著增加。

当大肠杆菌含有编码来自人的野生型跨膜蛋白受体gpr55(uniprotq9y2t6)的质粒时(大约25mg/l卡那霉素、40mg/l羧苄青霉素)，所测试的两种抗生素(羧苄青霉素和卡那霉素)的mic也增加。

产生每个基因含有约3-15个随机突变(残基)的突变gpr55基因文库。含有增强受体突变体的质粒的选择在50mg/l卡那霉素下进行。

用这些文库转化大肠杆菌菌株导致突变gpr55克隆的分离，该突变gpr55克隆可赋予对高浓度卡那霉素(>50mg/l)或羧苄青霉素(>80mg/l)的抗性。

使用pcdna3.1载体通过转染将突变的克隆转移至包括hek293t的哺乳动物表达宿主。如通过电泳技术(图2)和fsec技术所判断的，观察到表达比含有野生型gpr55的构建体增加>5倍。

表达并纯化突变的克隆；得到的蛋白质-去污剂复合物样品在一轮诱变后显示出比野生型提高最多7℃的热稳定性(如通过fsec(图3)和荧光技术所判断的)。

当以无配体形式纯化受体样品时，与野生型相比，突变克隆也显示出更均匀的寡聚状态(图4)。

当使用超嗜热物种(例如，嗜热栖热菌(thermusthermophilus))作为选择宿主时，与在大肠杆菌中进行的选择过程相比，预期所鉴定的突变体的蛋白质熔解温度(以热解折叠形式)是优异的(即比野生型高10℃以上)。

实施例4-用于蛋白质生产的构建体设计

设计一组构建体以生成经修饰的多跨膜蛋白，该经修饰的多跨膜蛋白被表达、从细胞膜提取、分离并纯化至同质，并适用于化合物筛选、抗体选择或结晶。在一些情况下，经修饰的多跨膜蛋白包含n末端截短和c末端截短、表面突变和包括内部截短和/或多肽插入的其他修饰。

这些构建体用c末端或n末端组氨酸标签进行工程化以便于纯化，并含有烟草蚀纹病毒蛋白酶或prescission蛋白酶切割位点，以便可以在纯化之后切割标签或融合蛋白。

将多跨膜蛋白的cdna克隆到适于在适合大规模表达和纯化的选定宿主(例如细菌细胞或真核细胞。哺乳动物细胞或昆虫细胞特别适用于人多跨膜蛋白)中表达的载体中。

实施例5-药理学(基于细胞的测定)

对在用于药物化合物筛选或结晶之前的多跨膜蛋白的功能进行评估，因为它提供了蛋白质以生物学相关形式折叠的证据。通过测定受体对具有激动或拮抗性质的小分子化合物、肽或蛋白质结合物(配体)的反应来确定受体功能。这通过在体外培养的真核细胞系统如hek293或cos中表达膜蛋白来完成。通过激活一种或多种直接效应蛋白质来评估对添加的调节剂的功能性反应，该直接效应蛋白质导致随后产生可测定的代谢物，如环腺苷一磷酸(camp)或钙离子(ca²⁺)的量的累积或减少。通过例如电化学电位梯度的变化来测定经修饰的多跨膜蛋白如离子通道多肽对细胞生理学的影响。

由添加的配体激活经修饰的多跨膜蛋白如gpcr可引发导致产量或camp增加或减少的特定g蛋白信号传导途径。由激动剂配体激活gpcr可导致camp水平的增加，该camp水平用于确定实现50％响应所必需的有效浓度(称为ec50)。拮抗剂配体可以反过来抑制camp的产生，从而表明与激动剂配体信号传导竞争，该竞争表达为50％抑制浓度(ic50)。ec50和ic50值用于比较具有激动剂或拮抗剂性质的配体的相对功效。

通过测定响应于已知激动剂的存在的细胞内ca²⁺水平对经修饰的多跨膜蛋白的药理学功能进行评估。稳定表达或瞬时表达gpcr或具有显著ca²⁺渗透性的离子通道的哺乳动物细胞系预装载有细胞可渗透的染料并响应于细胞内ca²⁺发出荧光。在用已知配体刺激后，经由读板器或荧光成像读板器或基于荧光激活细胞分选(facs)的ca++动员检测技术来测量荧光。

使用因为跟随细胞内带正电荷的离子而荧光信号增加，并且相反地因为跟随细胞外带正电荷的离子而荧光信号减少的染料，在稳定表达或瞬时表达离子通道的哺乳动物细胞系中测量响应于已知配体的膜电位的变化。

实施例6-样品纯化和qc

样品纯化

使用层析法，使用去污剂并在使用或未使用配体(化合物、肽或抗体)的情况下对多跨膜蛋白(本文中也称为“启用的膜蛋白”或“emp”)进行纯化。使用截留分子量为100kda的旋转柱对样品进行浓缩。图5a图示了样品纯化步骤的示意图表示。

样品qc

如通过蛋白质-去污剂复合物形式的分析型尺寸排阻色谱法(图5b和图5c)所评估的，验证多跨膜多肽的纯化产率、同质性、寡聚状态和稳定性，并与野生型多跨膜蛋白进行比较。使用与考马斯染色或其他染色相结合的sds-page来评估纯度。通过使用热荧光测定来评估蛋白质稳定性，例如，如图5d所示的cpm测定。

通过蛋白质-去污剂复合物形式的分析型尺寸排阻色谱法来评估emp样品质量和产率。使用cpm测定来评估蛋白质稳定性。所有emp都作为包含egfp部分的融合蛋白生成。

实施例7-使用表面等离子体共振(spr)测得的emp结合和动力学数据

结合数据

使用表面等离子体共振(spr)来监测双分子相互作用的亲和力(结合和解离速率常数的分析、双分子相互作用动力学的建模、平衡结合分析和配体特异性研究)。使用nhs/edc耦合器将说明性emp-005与biacore芯片耦合(图6a)。将his标记的emp-005与nta芯片结合(图6b)。两个传感图均示出了emp-005样品的最佳结合性质。

动力学数据

使用两种小分子化合物(～450da)来确定emp-005质量和结合动力学。传感器表面具有足以观察和测定两种小分子化合物的结合动力学(ka、kd、kd)的密度(图6c)。图6c示出了仅两种化合物之一的示范数据。化学偶联受体与非共价捕获的受体具有相同的功能，从而表明该蛋白质耐受偶联化学。

实施例8-使用基于纳米技术的dna递送系统用gpr55emps^tm克隆012进行免疫

遗传免疫和蛋白质加强

在一些实施方案中，emps^tm能够生成针对野生型或内源性gpcr靶标的抗体。使用体内dna免疫并随后用纯化的emp^tm蛋白质进行蛋白质加强，在小鼠中测试gpr55emps^tm的免疫原性。

在in-cell-art(nantes,france)使用进行遗传免疫工作。是针对遗传免疫进行优化的dna传递系统，其中递送的遗传物质用不同化学家族的脂质和聚合物的混合物配制而成。

将对应于gpr55受体的emp012的cdna克隆到基于pcmv的载体中，并经由在免疫原施用之前瞬时转染hek293t和hela细胞来确认细胞表面表达。

对于初级攻击，用配制到中的50μgemp012cdna构建体来免疫c57bl6小鼠，然后每隔两周使用相同的基于的制剂进行2次50μg的加强，然后使用ifa佐剂中的50μg纯化的emp012蛋白质进行1次加强。在一些情况下，通过初级抗体应答的体细胞超突变来对体内亲和力成熟进行加强。使用用不相关的gpcr(左图)或wt-gpr55(右图)转染的hela细胞，通过facs分析定期评估免疫应答水平(图7)。

如通过facs分析特异性识别野生型gpr55转染的hek293细胞的多克隆抗体所示(图7)，gpr55受体的emp012产生针对wt-gpr55的强大且特异性的免疫应答。

图9和图10中分别图示了野生型gpr55和gpr55-emp-012的序列。

实施例9-固定化的emp^tm在elisa形式中结合wt受体特异性抗体

在elisa形式中使用纯化的趋化因子受体(emp^tm)检测wt受体特异性抗体的结合。在冷冻/解冻事件之前和之后测定抗体的结合，并且当使用荧光标记的抗体时两者都给出相同的优异的荧光信号(图8)。

实施例10-药理学(基于蛋白质的测定)

通过直接或间接监测激动配体或拮抗配体(小分子、肽或蛋白质)与表达的经修饰的多跨膜蛋白的结合的方法，在蛋白质水平上评估多跨膜蛋白的结合药理学。分离从表达感兴趣的多跨膜蛋白的真核或原核宿主中纯化的细胞膜的制备物，并在结合测定形式中使用，其中将含有感兴趣的经修饰的多跨膜蛋白的膜与放射性标记的化合物一起温育，并在彻底清洗样品以去除过量标记物后测定残留结合标记的化合物。通过闪烁计数器测定残留结合标记的放射性。

使用闪烁亲近测定法来确定小分子化合物、肽和蛋白质与去污剂溶解和纯化的经修饰的多跨膜蛋白的结合。使用去污剂从细胞膜中提取在原核或真核宿主中表达的经修饰的多跨膜蛋白，随后纯化经修饰的多跨膜蛋白并将其附接至闪烁亲近珠。将放射性标记的配体与珠子一起温育，随后清洗它们以去除未结合的配体，并在闪烁计数器上读取信号。

实施例11-多轮诱变

所鉴定的经修饰的多跨膜蛋白编码基因经历随后的一轮诱变，以便鉴定赋予变异多跨膜蛋白的物理化学性质额外的益处的其他突变。

将多个鉴定的经修饰的多跨膜蛋白编码基因混合并使其经历dna改组和选择，以便鉴定先前鉴定但存在于不同经修饰的多跨膜蛋白基因中的协同突变。这些协同突变赋予变异多跨膜蛋白的物理化学性质额外的益处。

通过使用经修饰的多跨膜蛋白的基因和野生型基因的混合物进行dna改组，从含有大量突变的鉴定的经修饰的多跨膜蛋白中消除不必需的突变。用该产物再次转化选择宿主，并进行最后一轮选择，以便鉴定能够维持原始经修饰的多跨膜蛋白的物理化学性质的最小突变组。

实施例12-结晶和结构确定

对于结晶试验，将纯化并浓缩的样品与结晶缓冲液混合，并在某些温度下在蒸气扩散条件下温育。或者，将蛋白质样品与脂质混合以便形成脂质立方相，随后分配到夹心玻璃板中，其中lcp在某些温度下在温育之前与结晶剂缓冲液接触。

使用尼龙环并在蒸气扩散结晶法的情况下收获晶体，转移晶体并用含有冷冻保护剂的母液浸泡，并在液氮中快速冷冻。或者，从lcp基质中收获晶体并直接在液氮中快速冷冻。

在同步加速器光束线上收集数据集，并使用晶体学软件处理数据，如模型建立和细化一样。通过使用来自已知和结构相似的膜蛋白的原子坐标作为例如从rcsb蛋白质数据库(pdb)获得的搜索模型进行分子置换来解析该结构。

实施例13-使用经修饰的多跨膜蛋白的另外的免疫方法遗传免疫和蛋白质加强。

将编码相应的经修饰的多跨膜蛋白的cdna克隆到特化的遗传免疫载体中，并在通过基因枪或其他使用其他dna递送系统的免疫途径进行皮内施用之前，经由瞬时转染hek293、cos-7、hela或hek293t细胞来确认细胞表面表达。由合同研究组织使用其专有免疫和筛选载体或内部开发的遗传免疫载体进行免疫。

免疫相关的t辅助(th)表位包括在免疫载体序列中，以便优化用于小鼠免疫的程序。另外，将免疫和筛选载体工程化成含有检测标签，从而能够区分免疫和表达构建体的成功表达，例如，通过对整个细胞上的血清进行荧光激活细胞分选(facs)分析。

对于初级攻击，用50-100μg的多跨膜多肽cdna构建体来免疫包括balb-c小鼠和wistar大鼠的不同物种，然后每隔两周用同一多跨膜多肽的50-100μgcdna进行3-6次加强，然后使用50μg纯化的多跨膜多肽进一步进行1-3次加强。

通过初级抗体应答的体细胞超突变进行体内亲和力成熟需要加强免疫。通过facs分析和elisa定期评估免疫应答水平。

通过facs对免疫应答中的血清滴度的评价。

将来自小鼠、大鼠或兔的免疫前血清样品与中期出血进行比较，以监测经免疫的动物中在表达经修饰的多跨膜蛋白的细胞上引发的免疫应答。使用facs分析，监测免疫应答的特异性，从而观察经免疫的组群中的免疫应答的显著差异，这些组群使用表达经修饰的多跨膜蛋白的细胞与用不相关的cdna转染的细胞和未转染的细胞。

对于每个血清样品，将平均荧光强度(mfi)绘制为条形图，其具有小鼠或大鼠血清样品的直方图。这表明免疫应答产生特异性抗体应答。通过elisa对免疫应答中的血清滴度的评价。

将his-标记的经修饰的多跨膜蛋白固定化在96孔镍螯合物板上，并对用于分析的血清样品进行稀释，以量化和评价与多跨膜多肽及其wt对应物的结合。在小鼠中，用经修饰的多跨膜蛋白进行加强可使滴度维持在相同水平或增加滴度。

免疫荧光。

免疫荧光数据用于证明经修饰的多跨膜蛋白与用相应的野生型受体观察到的相比的表达和亚细胞定位。用经修饰的多跨膜蛋白或相应的wt编码基因来瞬时或稳定转染宿主细胞(例如hek293、hek293t、cos-7或hela)。将小鼠和大鼠血清样品与表达经修饰的多跨膜蛋白、wt的细胞和未转染的细胞一起温育，并分别使用抗小鼠alexafluor488和抗大鼠alexafluor488检测结合的血清。

实施例14-呈激动剂或拮抗剂构象的经修饰的多跨膜蛋白

遗传免疫

将在体内选择以保留激动剂或拮抗剂构象的经修饰的多跨膜蛋白的编码dna序列克隆到遗传免疫载体中，并在例如使用基因枪方法皮内施用之前经由瞬时或稳定转染hek293、cos-7、hela或hek293t细胞来确认细胞表面表达。对于初级攻击，用50-100μg多跨膜多肽cdna构建体或用wtcdna免疫balb-c或c57b16小鼠，然后每隔两周用50-100μgcdna进行3-6次加强。通过facs分析来定期评估免疫应答水平。

hek293、cos-7、hela或hek293t细胞中的细胞表面表达的确认。

通过抗flag抗体检测经修饰的多跨膜蛋白表达，并由第一条结合曲线表示；由第二条结合曲线表示阴性对照，即不相关的cdna。

使用facs分析进行对经修饰多跨膜多肽的免疫应答中血清滴度的评价

第一条结合曲线表示来自用经修饰的多跨膜蛋白cdna或与经修饰的多跨膜蛋白表达细胞结合的纯化蛋白免疫的小鼠的血清；第三条曲线表示与相应的野生型膜受体表达细胞结合的相同血清样品；第四条曲线表示用不相关的cdna转染的细胞。

免疫组群中的显著免疫应答的特征在于小鼠多克隆血清与野生型和经修饰的多跨膜蛋白类似地结合。

使用facs分析用相应的wt受体免疫的小鼠。

第一条结合曲线表示来自用与经修饰的多跨膜蛋白表达细胞结合的wtcdna免疫的小鼠的血清；第三条结合曲线表示与野生型经修饰的多跨膜蛋白表达细胞结合的相同血清样品；第四条结合曲线表示用不相关的cdna转染的细胞。

免疫组群中的显著免疫应答的特征在于小鼠或大鼠多克隆血清与野生型和经修饰的多跨膜蛋白受体类似地结合。

elisa分析。

分析血清样品与固定化在镍螯合物板表面的相关经修饰的多跨膜蛋白的溶解的膜制剂的结合。通过使用具有tmb底物的抗小鼠hrp缀合物完成检测，并且通过抗膜蛋白多克隆并使用抗豚鼠或其他物种的hrp缀合物来提供阳性对照。

elisa数据反映了先前的facs分析，例如，基于经修饰的多跨膜蛋白的dna免疫与wtdna免疫产生相似的抗体应答，其中如通过比较出血前与中期出血(ib)(例如：(ib1)、(ib2))和最终出血所示，在整个加强期间检测到增加的血清滴度。以不同稀释度(1:50、1:100、1:500、1:1000和1:5000)来评价血清样品。

实施例15-显示经修饰的多跨膜蛋白作为疫苗的用途的功能数据

经修饰的多跨膜蛋白作为疫苗引发影响或测试经修饰的多跨膜蛋白功能活性的多克隆抗体。

通过宿主免疫应答中生成的功能活性，即多克隆抗体，证明了经修饰的多跨膜蛋白或其编码遗传物质作为有效疫苗的用途。主要通过基因枪接种/免疫使用编码经修饰的多跨膜蛋白的基因来免疫不同的动物物种。

用于评估所得血清的功能活性的一个读出是对camp信号传导的影响。

使用cre-luc报告基因测定，其中来自ac-camp-pka途径激活的cre响应是读出。

随后的分析揭示了当在wt转染的hek293或其他细胞系上进行测定时，多克隆血清显示出与相应的激动剂化合物的激动协同作用以及单独的激动剂活性。如通过由兔分析生成的数据所证明的并与免疫前血清进行比较，在免疫方案的早期检测出该活性。在任何免疫前血清样品中未检测出活性。使用未转染或用编码不相关的多跨膜受体的dna转染的hek293或其他细胞系来显示靶标特异性。

实施例16-用佐剂增强对经修饰的多跨膜蛋白的免疫应答

用gm-csf增强免疫应答。

gm-csf或其他基于细胞因子的分子佐剂(例如，il-4、il-10、il-17、ifn-γ、ifn-β等)与编码dna的经修饰的多跨膜蛋白(即，基因佐剂)共同施用，以便增强免疫应答。这可以是物种特异性的，并已经证明增加施用于非人灵长类动物表皮的h1n1流感dna疫苗的粘膜免疫原性和全身免疫原性。增强所用免疫应答的其他方法是，例如，将破伤风和白喉类毒素作为佐剂、使用th表位作为表达构建体的一部分，如啮齿动物中padreth表位和卵清蛋白th表位已显示的。已从患者或免疫群体中鉴定了其他cd4+表位，并将其在hiv和疟疾疫苗开发中实施，或者甚至在最近开发的佐剂如单磷酰脂质a中实施。用于实施佐剂的策略采取与多跨膜蛋白完整性相容的遗传组分或化合物制剂的形式。使用大肠杆菌groel增强免疫应答。

除了可能的标准免疫载体效应之外，groel的佐剂活性可能通过toll样受体4涉及炎性细胞因子介质。使用groel的dna免疫用作产生用于功能分析的抗体或诱导针对经修饰的多跨膜蛋白的抗体的方法。与大肠杆菌groel或groel片段融合或与编码groel或groel片段的dna序列共注射的经修饰的多跨膜蛋白

对用编码与大肠杆菌groel在其c末端融合的经修饰的多跨膜蛋白的质粒进行的小鼠或大鼠的dna免疫，测试其诱导对wt和经修饰的多跨膜蛋白的特异性抗体应答。还测试了表达相同组合的经修饰的多跨膜蛋白和groel或groel片段编码基因的质粒的共注射。

与hsp70或fc片段融合或与编码hsp70或fc片段的dna序列共注射的经修饰的多跨膜蛋白。

将经修饰的多跨膜蛋白与hsp70或fc片段融合或与编码hsp70或fc片段的dna序列共注射，以增强树突细胞的摄取。fc与其fcgr和/或hsp蛋白与cd91的相互作用通过上调参与抗原呈递的表面分子和细胞因子来激活树突细胞。此外，树突细胞表面受体途径的利用还可以代表经由充分表征的交叉呈递机制，树突细胞(除了mhcii类)的有效mhci类限制性抗原呈递的特权抗原内化途径。

与sflt-1融合或与编码sflt-1的dna序列共注射的经修饰的多跨膜蛋白。

在免疫疗法/抗血管生成联合疗法中，经修饰的多跨膜蛋白也与sflt-1融合。与可能延迟肿瘤生长的单独使用免疫疗法或单独使用抗血管生成疗法相反，这两种疗法的组合有机会提供肿瘤生长的完全抑制。在与抗血管生成疗法联合的同时使用肿瘤靶向免疫疗法为治疗实体瘤提供了更有效的策略。

与活性tlr激动剂如鞭毛蛋白、tlr5激动剂融合或与编码鞭毛蛋白或tlr5的dna序列共注射的经修饰的多跨膜蛋白。

来自沙门氏菌(salmonella)的1期鞭毛蛋白(称为flic)是单体亚单位蛋白，其聚合形成细菌鞭毛。已经进行了广泛的研究，并且已定义了tlr5相互作用所需的鞭毛蛋白的区域和残基。已经证明，使用dna编码的ag可以增强对感染性疾病的免疫应答，从而影响诱导th1样应答的事件的级联，但在某些情况下，也观察到th2样应答的诱导。这些观察结果表明flic诱导类似于tlr激活的炎性免疫应答。

与钙网蛋白(crt)融合或与编码crt的dna序列共注射的经修饰的多跨膜蛋白。

补偿由编码野生型ag的dna转染的dc生成的弱免疫应答的策略：这些策略中的一些策略包括taa抗原与钙网蛋白(crt)的融合，或与溶酶体相关膜蛋白1(lamp-1)的分选信号的融合。

实施例17-用经修饰的多跨膜蛋白进行免疫使用配体结合试验来测试佐剂/经修饰的多跨膜蛋白制剂对经修饰的多跨膜蛋白稳定性的影响。

将分离的经修饰的多跨膜蛋白与多种不同的佐剂组合，并在配体结合试验中在两个小时的过程研究它们在37℃下的稳定性。评价的佐剂包括单磷酰脂质a(mpl)、mm(市售用于生成小鼠单克隆抗体gerbu)和pharma(gerbu)、classicadjuvant(titermaxusa/sigma-aldrich)、adjuprime^tm免疫调节剂(pierce)。与对照未配制的样品相比，所有佐剂与多跨膜多肽组合进行测试，并且在配体结合试验中在37℃下温育2小时后显示出不同程度的稳定性。设计配体结合试验测试条件以显示在体温下测试的免疫佐剂与纯化的多跨膜蛋白免疫原的相对相容性。

使用facs和elisa测试佐剂/经修饰的多跨膜蛋白制剂对诱导的免疫应答的影响。

使用1:1比率将经修饰的多跨膜蛋白与多种佐剂一起配制。通过腹膜内注射用所得的不同抗原/佐剂制剂来免疫balb-c小鼠和wistar大鼠，其中免疫方案使用蛋白质引发和加强至中期出血1(4×50μg的经修饰的多跨膜蛋白)，然后使用蛋白质进行更短的加强免疫阶段至中期出血2(2×50μg多跨膜蛋白)。评价不同实验条件下的免疫应答，从而通过facs和elisa测试来自免疫动物的各种稀释度的血清。

在兔中也生成对经修饰的多跨膜蛋白的功能性抗体应答。

还在第三宿主物种(新西兰白兔)中使用蛋白质免疫、遗传免疫以及遗传和蛋白质免疫策略的组合生成激动和拮抗剂抗体。最初的dna或蛋白质攻击(免疫引发)加上标准dna或蛋白质加强之后是短暂的中期加强期和最终蛋白质加强。通过elisa评估来自免疫动物的血清与纯化的wt的结合和与经修饰的多跨膜蛋白wt的结合以及与经修饰的多跨膜蛋白的结合，并使用facs评估细胞表面与用wt和经修饰的多跨膜编码基因瞬时或稳定转染的哺乳动物细胞的结合。引发的血清激动活性也作为使用基于细胞的报告测定的功能评价进行测试。用早在第一次中期出血时检测到的功能活性可见强烈的免疫应答。

在一些情况下，使用经修饰的多跨膜蛋白的免疫用于生成具有固有长cdr-h3区的抗体，例如，类似于牛抗体、鲨抗体、骆驼抗体、人自身抗体或人抗hiv抗体的cdr-h3区。在一些情况下，具有延伸的cdr-h3区的抗体用于靶向难以结合的表位，如gpcr、离子通道和其他多跨膜蛋白。在一些情况下，具有延伸的cdr-h3区的抗体进一步经历人源化过程，以生成靶向本文所述的经修饰的多跨膜蛋白的人源化抗体。

虽然本文中已经示出并描述了本公开内容的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。本领域技术人员在不脱离本公开内容的情况下现将会想到多种变化、改变和替换。应当理解，本文中所述的本公开内容实施方案的各种替代方案可用于实施本公开内容。旨在以下述权利要求限定本公开内容的范围，并由此涵盖这些权利要求范围内的方法及其等同项。

序列表

<110>阿比利塔生物公司

<120>用于制备多跨膜蛋白的方法和平台

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