本发明尤其涉及一种包含含有突变衣壳蛋白质的减毒重组活甲病毒的疫苗。本发明还涉及一种预防受试者感染甲病毒感染的方法，否则该甲病毒感染会产生疾病的临床症状。在一个优选实施方案中，突变衣壳蛋白质是具有突变的核仁定位信号/序列(nols)的基孔肯雅病毒(chikungunyavirus)(chikv)衣壳蛋白质。
背景技术：
：：基孔肯雅病毒(chikv)是蚊虫传播的正义单链rna病毒，并且是塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus)血清群和甲病毒属的成员。该群包括导致多关节痛和人类关节疾病的其他甲病毒，诸如罗斯河病毒(rossrivervirus)(在澳大利亚和太平洋地区流行)、奥-奈氏病毒(o’nyong-nyongvirus)(非洲)、辛德毕斯病毒(sindbisvirus)(sinv)(导致波戈斯塔病(pogostadisease)[芬兰]、奥克尔布病(ockelbodisease)[瑞典]和卡累利阿热(karelianfever)[俄罗斯])、巴马森林病毒(澳大利亚)和马亚罗病毒(南美洲和中美洲)。所有这些病毒都是由蚊子传播的，并且能够引起巨大的流行病并在新的地方出现。chikv复制在宿主细胞的细胞质中发生。进入细胞后，chikv颗粒经历解装配，并且病毒rna基因组从两个开放阅读框翻译以产生非结构多聚蛋白质和结构多聚蛋白质。这些多聚蛋白质经历顺式和反式切割以形成成熟的病毒蛋白质。非结构蛋白质主要形成复制复合体的一部分，从而合成基因组和亚基因组rna。结构蛋白质包装基因组rna，并且在通过内质网和高尔基体转移时，被加入到从含有脂质双层的细胞出芽的成熟病毒体中。衣壳蛋白质是从chikv的亚基因组rna表达的五种结构蛋白质之一，并且经由其丝氨酸蛋白酶活性而从新生结构多聚蛋白质经历顺式切割以形成成熟的病毒蛋白质。在结构能力方面，衣壳蛋白质识别病毒基因组rna中存在的包装信号，从而允许核衣壳核心的有效组装。多功能衣壳蛋白质在甲病毒生命周期中具有许多关键作用。chikv衣壳蛋白质定位于宿主细胞的核仁。塞姆利基森林病毒(sfv)衣壳蛋白质是据报道定位于宿主细胞的核仁的唯一其他甲病毒衣壳蛋白质[favred1,studere,michelmr.archvirol.1994；137(1-2):149-55.twonucleolartargetingsignalspresentinthen-terminalpartofsemlikiforestviruscapsidprotein(塞姆利基森林病毒衣壳蛋白质的n末端部分中存在的两种核仁靶向信号)]。先前已在sfv衣壳蛋白质的n末端部分中鉴定出了两种核仁靶向信号。在人类中，chikv感染通常引起严重关节痛、严重发烧和皮疹的急剧发作。关节疾病的范围从轻度关节痛到严重、无力性关节炎(debilitatingarthritis)，伴有发红、肿胀和滑膜囊积液。虽然chikv疾病往往是自限性的并且很少致命，但关节痛是极度疼痛和使人虚弱的，通常持续1周但往往更长。慢性关节痛/关节炎往往在急性感染恢复后发生，并且与滑膜巨噬细胞和肌肉中的病毒rna和蛋白质持久存在有关[hoarauj等人，persistentchronicinflammationandinfectionbychikungunyaarthritogenicalphavirusinspiteofarobusthostimmuneresponse.(尽管有强劲的宿主免疫反应，但是存在因基孔肯雅致关节炎甲病毒导致的持续性慢性炎症和感染。)jimmunol2010184:5914.27.labadiek等人，chikungunyadiseaseinnonhumanprimatesinvolveslong-termviralpersistenceinmacrophages.(非人灵长类动物的基孔肯雅病涉及巨噬细胞中的长期病毒持久存在。)jclininvest.2010120:894]。急性关节痛和慢性疾病都会导致生产力的重大损失。chikv、慢性关节病、偶尔严重的临床表现和死亡(婴儿和老年人)的非常高(高达人口的50％)和快速(1周45,000例)的发病率导致了相当大的经济和社会负担。在大暴发期间，chikv也已经被证明是中枢神经系统(cns)疾病的重要原因，特别是在婴儿和老年人中，其中chikv相关脑炎的病死率估计为16.6％[gérardinp,couderct,bintnerm等人，chikungunyavirus-associatedencephalitis:acohortstudyonlaréunionisland(基孔肯雅病毒相关脑炎：留尼旺岛的一项定群研究),2005-2009.neurology.10.1212/wnl.0000000000002234.(2015)]。chikv目前是全球性问题，其中大多数大陆上都报导有其疫情。最近chikv传播到美洲，影响了43个国家，并在2013年到2015年期间导致了超过200万例chikv疾病。目前尚无抗病毒药物或可商购的疫苗来预防chikv疾病。如上所述，塞姆利基森林病毒(sfv)血清群包括与chikv密切相关、引起多关节痛和人类关节病症的其他甲病毒。这些甲病毒包括但不限于罗斯河病毒(rrv)、奥-奈氏病毒(onnv)、辛德毕斯病毒(sinv)(导致波戈斯塔病、奥克尔布病和卡累利阿热)、巴马森林病毒(bfv)和马亚罗病毒(mayv)。越来越多的证据表明甲病毒抗体的交叉反应性在体外和体内都具有广泛的中和效应。目前正使用许多策略来设计chikv特异性疫苗。这些疫苗包括嵌合活疫苗，其在小鼠中高度减毒且是免疫原性的[wange,kimdy,weaversc,frolovi.chimericchikungunyavirusesarenonpathogenicinhighlysensitivemousemodelsbutefficientlyinduceaprotectiveimmuneresponse.(嵌合基孔肯雅病毒在高度敏感的小鼠模型中是非致病性的，但是有效地诱导保护性免疫应答。)j.virol.85(17),9249-9252(2011).plantek,wange,partidoscd等人，novelchikungunyavaccinecandidatewithanires-basedattenuationandhostrangealterationmechanism(具有基于ires的衰减和宿主范围改变机制的新型基孔肯雅疫苗候选物).plospathog.7(7),e1002142(2011)]；基于病毒样颗粒的疫苗，其在激发后保护猴子免受病毒血症的影响[kahataw,yangzy,andersenh等人，avirus-likeparticlevaccineforepidemicchikungunyavirusprotectsnonhumanprimatesagainstinfection(针对流行基孔肯雅病毒的病毒样颗粒疫苗保护非人灵长类动物免受感染).nat.med.16(3),334-338(2010)]；以及基于共有包膜蛋白序列的dna疫苗设计[muthumanik,lankaramankm,laddydj等人，immunogenicityofnovelconsensus-baseddnavaccinesagainstchikungunyavirus.(抗基孔肯雅病毒的新型基于共有序列的dna疫苗的免疫原性。)vaccine26(40),5128-5134(2008)]。与减毒活疫苗不同，这些疫苗策略中的一些将需要多次免疫并且将是造价昂贵的。技术实现要素：本文尤其描述了一种包含含有突变衣壳蛋白质的减毒重组活甲病毒的疫苗。根据本发明的第1形式，提供了一种分离、纯化、合成或重组的甲病毒突变衣壳蛋白质，或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)。根据本发明的第2形式，提供了一种包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的分离、纯化、合成或重组的甲病毒新生结构多聚蛋白质。根据本发明的第3形式，提供了一种编码突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的重组甲病毒基因组。根据本发明的第4形式，提供了一种包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的重组甲病毒。根据本发明的第5形式，提供了一种包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的减毒重组活甲病毒。根据本发明的第6形式，提供了一种包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的嵌合甲病毒。根据本发明的第7形式，提供了一种包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的减毒嵌合活甲病毒。根据本发明的第8形式，提供了一种疫苗，所述疫苗包含：分离的、纯化的、合成或重组的甲病毒突变衣壳蛋白质，或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)；包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的分离的、纯化的、合成或重组的甲病毒新生结构多聚蛋白质；编码突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的重组甲病毒基因组；包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的重组甲病毒；包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的减毒重组活甲病毒；包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的嵌合甲病毒；包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的减毒嵌合活甲病毒。根据本发明的第9形式中，提供了一种亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包含：包含突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的重组甲病毒；包含突变的衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的重组甲病毒新生结构多聚蛋白质；或编码突变衣壳蛋白质或其突变的核仁定位区/信号/序列(nols)的重组甲病毒基因组。根据本发明的第10形式，提供了一种血清，所述血清含有从用本发明的第8形式或本发明的第9形式的疫苗、本发明的第1形式的蛋白、本发明的第2形式的多聚蛋白、本发明的第3形式的基因组、或本发明的第4形式到第7形式中的任一项的甲病毒免疫或施用的受试者获得的甲病毒中和抗体。根据本发明的第11形式，提供了从用本发明的第8形式或本发明的第9形式的疫苗、本发明的第1形式的蛋白、本发明的第2形式的多聚蛋白、本发明的第3形式的基因组、或本发明的第4形式到第7形式中的任一项的甲病毒免疫的受试者获得的至少一种甲病毒中和抗体。根据本发明的第12形式，提供了一种药物制剂，所述药物制剂包含：(1)本发明的第1形式的蛋白或其药学上可接受的衍生物；(2)本发明的第2形式的多聚蛋白或其药学上可接受的衍生物；(3)本发明的第3形式的基因组或其药学上可接受的衍生物；(4)本发明的第4形式到第7形式中的任一项的甲病毒或其药学上可接受的衍生物；(5)本发明的第8形式或第9形式的疫苗或其药学上可接受的衍生物；(6)本发明的第10形式的血清或其药学上可接受的衍生物；或(7)本发明的第11形式的至少一种甲病毒中和抗体或其药学上可接受的衍生物，以及至少一种药学上可接受的载体。根据本发明的第13形式，提供了一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：(1)本发明的第一形式的蛋白；(2)本发明的第二形式的多聚蛋白；(3)本发明的第三形式的基因组；(4)本发明的第四形式到第七形式中的任一项的甲病毒；(5)本发明的第8形式或第9形式的疫苗；(6)本发明的第10形式的血清；或(7)本发明的第11形式的至少一种甲病毒中和抗体。根据本发明的第14形式，提供了一种方法，所述方法用于：(1)预防受试者自然感染甲病毒感染；(2)预防受试者发展出甲病毒疾病；(3)引发受试者的甲病毒保护性免疫应答；或者(4)刺激受试者的抗甲病毒免疫应答，所述方法包括向受试者施用以下物质的步骤：(1)本发明的第一形式的蛋白；(2)本发明的第二形式的多聚蛋白；(3)本发明的第三形式的基因组；(4)本发明的第四形式到第七形式中的任一项的甲病毒；或(5)本发明的第8形式或第9形式的疫苗。或者，提供了(1)本发明的第一形式的蛋白；(2)本发明的第二形式的多聚蛋白；(3)本发明的第三形式的基因组；(4)本发明的第四形式到第七形式中的任一项的甲病毒；或(5)本发明的第8形式或第9形式的疫苗(在药物制备中)用于(1)预防受试者自然感染甲病毒感染；(2)预防受试者发展出甲病毒疾病；(3)引发受试者的甲病毒保护性免疫应答；或者(4)刺激受试者的抗甲病毒免疫应答的用途。根据本发明的第15形式，提供了一种方法，所述方法用于：(1)治疗患有甲病毒疾病的受试者，或者(2)降低甲病毒疾病的严重程度，所述方法包括向受试者施用以下物质的步骤：(1)本发明的第10形式的血清或其药学上可接受的衍生物；或者(2)本发明的第11形式的至少一种甲病毒中和抗体或其药学上可接受的衍生物。或者，提供了(1)本发明的第10形式的血清或其药学上可接受的衍生物；或者(2)本发明的第11形式的至少一种甲病毒中和抗体或其药学上可接受的衍生物(在药物制备中)用于(1)治疗患有甲病毒疾病的受试者，或者(2)降低甲病毒疾病的严重程度的用途。根据本发明的第16形式，提供了一种筛选或诊断受试者是否患有甲病毒感染或疾病的方法，所述方法包括以下步骤：(1)测试所述受试者或从所述受试者获得的生物样品与本发明的第10形式的血清或本发明的第11形式的至少一种甲病毒中和抗体的反应性，其中反应性指示所述受试者患有甲病毒感染或疾病；并且任选地：(2)治疗所述受试者。根据本发明的第17形式，提供了一种编码根据本发明的第1形式的甲病毒衣壳蛋白质或根据本发明的第2形式的多肽的分离、纯化、合成或重组的核酸。根据本发明的第18形式，提供了一种编码突变衣壳蛋白质的分离、纯化、合成或重组的甲病毒基因组。根据本发明的第19形式，提供了一种包含根据本发明的第17形式的核酸或根据本发明的第18形式的基因组的载体。根据本发明的第20形式，提供了一种包含根据本发明的第19形式的所述载体的细胞。根据本发明的第21形式，提供了一种用于执行根据本发明的第14形式到第16形式中的任一项的方法的试剂盒。根据本发明的第22形式，提供了一种制备(1)本发明的第8形式或第9形式的疫苗，或(2)本发明的第4形式到第7形式中的任一项的重组甲病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(1)使甲病毒的衣壳蛋白质突变以产生重组甲病毒；以及(2)使所述重组甲病毒复制。本发明的优选特征、实施方案和变化形式可从以下具体实施方式中分辨出，具体实施方式为本领域技术人员提供了足够的信息来实施本发明。具体实施方式不应被视为以任何方式限制前述
发明内容的范围。本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应被视为承认或以任何形式暗示现有技术构成公知常识的一部分。具体实施方式本发明人已经主要开发了具有突变衣壳蛋白质的减毒重组活基孔肯雅病毒(chikv)疫苗。本发明人已经鉴定出chikv野生型衣壳蛋白质中对于核仁定位和病毒复制具有重要意义的氨基酸，然后将所述氨基酸突变以产生优选形式的重组疫苗。在chikv疾病模型中，与野生型chikv感染的小鼠相比，用重组疫苗/突变chikv感染的小鼠没有显示疾病病征，病毒滴度显著降低并且促炎介质水平降低。与用野生型chikv激发的模拟感染小鼠相比，用野生型chikv激发的突变chikv感染小鼠没有显示疾病病征并且病毒血症显著减少。从突变chikv感染的小鼠回收的血清能够在感染30天后体外中和chikv感染性。由于中和抗体在甲病毒家族的密切成员之间发挥交叉反应性，所以重组疫苗也可以潜在地充当针对其他致关节炎甲病毒(诸如罗斯河病毒(rrv)、巴马森林病毒(bfv)、奥-奈氏病毒(onnv)、马亚罗病毒(mayv)、辛德毕斯病毒群(导致波戈斯塔病、奥克尔布病和卡累利阿热)，以及塞姆利基森林病毒(sfv))的疫苗。类似地，认为来自除chikv之外的密切相关甲病毒(诸如来自sfv)的突变衣壳蛋白质可用于开发基于sfv的减毒重组活疫苗。此外，含有突变衣壳蛋白质的嵌合甲病毒可以针对所需的甲病毒提供更好的疫苗保护、更高的免疫原性和/或中和作用，不仅对于致关节炎甲病毒而且对于脑炎甲病毒也是如此。突变衣壳蛋白质可以基于任何合适类型的甲病毒来开发，包括chikv、rrv、bfv、辛德毕斯病毒群(导致波戈斯塔病、奥克尔布病和卡累利阿热)、sfv、onnv和mayv。在一些实施方案中，与野生型衣壳蛋白质相比，突变衣壳蛋白质可包含突变的核仁定位区/信号/序列(nols)。例如，一个或多个极性氨基酸(例如丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸和酪氨酸)或荷电氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)可以移位、缺失和/或替换为疏水性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)。例如，荷电氨基酸可以被非荷电氨基酸取代。在一些实施方案中，突变衣壳蛋白质可包含除在nols中之外的一种或多种突变。在一些实施方案中，突变衣壳蛋白质可包含突变nols以及除在nols中之外的一种或多种突变。在一些实施方案中，突变衣壳蛋白质可包含与不同多肽融合的突变的甲病毒nols，所述不同多肽已经衍生自相同类型的甲病毒或来自不同类型的甲病毒。例如，不同的多肽可以衍生自来自相同或不同甲病毒的衣壳蛋白质。在其他实施方案中，所述不同的蛋白质可以不是衍生自甲病毒。突变衣壳蛋白质优选是野生型衣壳蛋白质的突变体。优选地，突变衣壳蛋白质基于chikv衣壳蛋白质[参见seq.idno.1]。在一个实施方案中，突变衣壳蛋白质不能或基本上不能进行核仁定位。在另一个实施方案中，突变衣壳蛋白质使得能够组装重组甲病毒的核衣壳核心，但实质上降低了重组甲病毒的复制能力。在另一个实施方案中，当施用于受试者时，突变衣壳蛋白质导致减轻或没有甲病毒疾病的临床症状。在另一个实施方案中，突变衣壳蛋白质不能或基本上不能进行核仁定位，所述突变衣壳蛋白质使得能够组装重组甲病毒的核衣壳核心，但是实质上降低了重组甲病毒的复制能力，并且当施用于受试者时，突变衣壳蛋白质导致减轻或没有甲病毒疾病的临床症状。在另一个实施方案中，突变衣壳蛋白质导致感染性病毒颗粒形成的缺陷，从而导致病毒后代的释放减少和延迟。突变衣壳蛋白质可以具有与野生型衣壳蛋白质不同的任何合适数量的氨基酸取代、添加和/或缺失，包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个或甚至更多个氨基酸取代、添加和/或缺失。优选地，突变衣壳蛋白质是野生型chikv衣壳蛋白质的突变体。示例显示在图1中[seq.idnos.4到7]。在一些实施方案中，野生型chikv衣壳蛋白质的nols的一个或多个氨基酸可以被移位、取代和/或缺失。在一些实施方案中，野生型chikv衣壳蛋白质的氨基酸位置58到110中的一个或多个氨基酸位置可以被移位、取代和/或缺失。在一些实施方案中，野生型chikv衣壳蛋白质的氨基酸位置62、63、65、66、68、69、84、85、95、96、101和102中的一个或多个氨基酸位置可以被移位、取代和/或缺失。在一些实施方案中，野生型chikv衣壳蛋白质的至少氨基酸位置62、63、65、66、68、69、84、85、95、96、101和102可以被移位、取代和/或缺失。在一个实施方案中，突变衣壳蛋白质通过与野生型衣壳蛋白质相比在核仁定位区/信号/序列(nols)中具有至少一个突变而不能或基本上不能进行核仁定位。“至少一个突变”是指突变衣壳蛋白质可以具有至少一个氨基酸取代、添加和/或缺失，包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个或甚至更多个氨基酸取代、添加和/或缺失。示例显示在图1中[seq.idnos.4到7]。优选地，突变衣壳蛋白质是野生型chikv衣壳蛋白质的nols突变体。例如，核仁定位所需的野生型chikv衣壳蛋白质的一个或多个氨基酸可以被一个或多个其他类型的氨基酸取代，或者核仁定位所需的氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被缺失。示例显示在图1中[seq.idnos.4到7]。在一些实施方案中，突变衣壳蛋白质可以具有在野生型chikv衣壳蛋白质的残基58与110之间存在的一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失。示例显示在图1中[seq.idnos.4到7]。在一些实施方案中，突变衣壳蛋白质可以具有在野生型塞姆利基森林病毒衣壳蛋白质的残基66到83和/或92到105之间的一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失[参见图11，seq.idno.2]。在另一个实施方案中，突变衣壳蛋白质可以使得能够组装重组甲病毒的核衣壳核心，但通过具有至少一个突变来显著降低重组甲病毒的复制能力。同样，突变衣壳蛋白质可以具有至少一个氨基酸取代、添加和/或缺失，包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个或甚至更多个氨基酸取代、添加和/或缺失。优选地，突变衣壳蛋白质是野生型chikv衣壳蛋白质的突变体。例如，野生型chikv衣壳蛋白质的一个或多个氨基酸可以被一个或多个其他类型的氨基酸取代，或者所述氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被缺失。示例显示在图1中[seq.idnos.4到7]。具有突变的nols信号/序列的合适突变衣壳蛋白质(部分)序列显示于图1(a)中，并且包括突变体nls101/95[seq.idno.7]和nls101[seq.idno.6]。对于突变体nls101/95，核仁转运所需的带正电荷的氨基酸已被丙氨酸取代。为清楚起见，突变体nls101/95和nls101各自具有与野生型chikv衣壳蛋白质相同的蛋白质序列，区别在于图1(a)中所示的氨基酸差异。chikv衣壳蛋白质的全长野生型序列可以在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/kt449801.1处找到并且还在图11中显示[seq.idno.1]。如果发现衣壳nols信号/序列的突变不提供显著水平的减毒，那么可以进行进一步使含有nols突变的病毒毒性减弱的一个或多个另外的突变(例如氨基酸取代、插入和/或缺失)。一个或多个另外的突变(例如氨基酸取代、插入和/或缺失)可以在衣壳蛋白质中或在甲病毒基因组中的其他地方进行。同样，合适的突变衣壳蛋白质可以从其他甲病毒的衣壳蛋白质(诸如sfv的衣壳蛋白质)开发。图11显示了sfv野生型衣壳蛋白质序列的nols区[seq.idno.2]。可以对sfv野生型衣壳蛋白质进行如上所述对chkv衣壳蛋白质的突变。“不能或基本上不能进行核仁定位”是指突变衣壳蛋白质基本上不存在于核仁中。该情况一个示例是突变体nls101/95[参见seq.idno.7]。“使得能够组装重组甲病毒的核衣壳核心但显著降低重组甲病毒的复制能力”意谓重组甲病毒的复制能力显著降低，但该甲病毒仍然能够引发有效的免疫应答。该情况一个示例是突变体nls101/95[参见seq.idno.7]。“减毒活”是指当施用于受试者时病毒显显示显著降低的或优选没有疾病的临床症状。疫苗可包含活病毒或灭活病毒。如果灭活，则可以以任何合适的方式灭活(例如使用高温灭活或低温灭活，或化学灭活)。优选地，疫苗为受试者提供长期免疫。例如，如果用突变体chikv衣壳蛋白质接种，则优选地向受试者提供了针对chikv疾病的长期免疫。优选地，疫苗能够防御不同基因型的chikv分离株(来自不同位点和区域的大量分离株)。还可以向受试者提供对一种或多种其他类型的甲病毒的长期免疫。疫苗，特别是减毒活疫苗，可以提供针对其他致关节炎甲病毒的交叉保护，所述其他致关节炎甲病毒为诸如chikv、rrv、bfv、辛德毕斯病毒群(导致波戈斯塔病、奥克尔布病和卡累利阿热)、sfv、mayv或onnv，所述其他致关节炎甲病毒与chikv共享较高程度的结构和遗传同源性。也就是说，基于chkv突变蛋白质的减毒活疫苗可以提供针对rrv、bfv、辛德毕斯病毒群、sfv、mayv和/或onnv的交叉保护。嵌合甲病毒可有效对抗脑炎甲病毒，诸如东部马脑炎病毒(eeev)和委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，它们是更远亲相关的。嵌合甲病毒可包含突变衣壳蛋白质以及脑炎甲病毒的全部或部分结构多聚蛋白质或非结构多聚蛋白质。在一个实施方案中，嵌合甲病毒包含chikv或其他密切相关的甲病毒的突变衣壳蛋白质以及脑炎甲病毒的全部或部分结构多聚蛋白质或非结构多聚蛋白质。含有chikv的突变nls101/95衣壳蛋白质[参见seq.idno.7]和所需甲病毒的蛋白质的嵌合甲病毒可提供针对所需甲病毒的更高免疫原性和/或中和作用。嵌合甲病毒可以以任何合适的方式制备。这些技术在以下参考文献中描述：roycj,adamsap,wange,lealg,seymourrl,sivasubramanisk,megaw,frolovi,didierpj,weaversc.vaccine.2013。基于辛德毕斯的嵌合疫苗保护食蟹猴(cynomolgusmacaques)免受东部马脑炎病毒的致命气溶胶激发。包含突变衣壳蛋白质的重组甲病毒可以以任何合适的方式制备。包含含有突变衣壳蛋白质的减毒重组活甲病毒的疫苗可以为任何合适的形式，并且可以以任何合适的方式制备。类似地，包含突变衣壳蛋白质的减毒重组活甲病毒可以为任何合适的形式，并且可以以任何合适的方式制备。此类技术在以下参考文献中描述，所述参考文献的全部内容以交叉引用方式并入本文：chuh,dassc,fuchsjf,sureshm,weaversc,stinchcombdt,partidoscd,osorioje.decipheringtheprotectiveroleofadaptiveimmunitytochikv/iresanovelcandidatevaccineagainstchikungunyainthea129mousemodel(对chikv/ires，一种针对基孔肯雅病的新型候选疫苗在a129小鼠模型中的适应性免疫保护作用的解读).vaccine.2013年7月18日；31(33):3353-60.数字资源标识符：10.1016/j.vaccine.2013.05.059.电子出版，2013年5月29日。在一些实施方案中，可以通过使重组甲病毒通过过滤器(诸如0.22μm亲水性pvdf膜或亲水性聚醚砜膜)来制备疫苗。在一些实施方案中，疫苗可以在约-20℃与约-80℃之间的温度下长期储存并保持存活。“长期”是指疫苗可以保持存活至少30天、31天、32天、33天、34天、35天、36天、37天、38天、39天、40天、41天、42天、43天、44天、45天、46天、47天、48天、49天、50天、51天、52天、53天、54天、55天、56天、57天、58天、59天或60天。在一些实施方案中，有可能疫苗可以保持存活超过60天。包含突变衣壳蛋白质的减毒重组活甲病毒可以为分离物形式。所述分离物可包含细胞，诸如哺乳动物细胞，昆虫(例如蚊子)细胞或其他类型的细胞。含有甲病毒中和抗体的血清可以为任何合适的形式，并且可以以任何合适的方式制备。所述至少一种甲病毒中和抗体可以以任何合适的方式制备。可以分离，重组或纯化抗体。优选地，存在许多甲病毒中和抗体。此类技术在以下参考文献中描述，所述参考文献的全部内容以交叉引用方式并入本文：foxjm,longf,edelingma,linh,vanduijl-richtermk,fongrh,kahlekm,smitjm4,jinj,simmonsg,doranzbj,crowejejr,fremontdh,rossmannmg,diamondms.broadlyneutralizingalphavirusantibodiesbindanepitopeone2andinhibitentryandegress(广泛中和的甲病毒抗体结合e2上的表位并抑制进出).cell.2015年11月19日；163(5):1095-107.数字资源标识符：10.1016/j.cell.2015.10.050.电子出版，2015年11月6日。药物制剂可以以任何合适的方式制备。可以以任何合适的方式进行预防受试者感染甲病毒感染、治疗患有甲病毒感染的受试者或降低甲病毒感染严重程度的方法。疫苗、减毒重组活甲病毒、药物制剂和免疫原性组合物(下文称为“组合物”)可以独立地通过本领域的任何标准方法全身或局部地施用，例如皮下地、静脉内地、肠胃外地、腹膜内地、皮内地、肌内地、局部地或经鼻地施用。所述组合物可包含适用于给药方法并且为本领域普通技术人员所熟知的常规无毒、生理学或药学上可接受的成分或介质。所述组合物可以例如包含佐剂。如本文所用的术语“药学上可接受的载体”旨在包括稀释剂，诸如盐水和缓冲水溶液。组合物可以为水溶液或冻干形式。本领域已知多种用于递送组合物的装置，包括但不限于注射器和针注射器、分叉针给药、用皮内贴剂或泵给药、皮内无针喷射递送(皮内等)、皮内颗粒递送、或气溶胶粉末递送。组合物可以独立施用一次或多次以实现、维持或改善所需的效应/结果。确定剂量或组合物的合适剂量是包含单次施用剂量还是多次施用剂量完全在技术人员的能力范围内。适当的剂量取决于受试者的健康、免疫应答的诱导和/或对由甲病毒引起的感染的预防、给药途径以及所用制剂。例如，化合物的治疗活性量可以根据诸如以下因素而变化：受试者的疾病状态、年龄、性别和体重以及组合物在受试者中引发所需应答的能力。可以调整剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，可以在初次施用后一周或两周时对受试者施用‘加强’疫苗接种。筛选或诊断受试者是否患有甲病毒感染或疾病的方法可以以任何合适的方式进行。本发明的一些形式涉及生物样品或从受试者分离一个或多个生物样品的步骤。通常，涉及对受试者等的测试的本发明的任何形式可以涉及从受试者分离一个或多个生物样品并测试该生物样品/那些生物样品的步骤。所述生物样品可以是来源于受试者的任何合适的样品——非侵入地或侵入地获得的。它可以是来源于细胞或细胞外的，或两者兼而有之。例如：1.颊黏膜(口腔)细胞——通过用漱口水漱口或者通过用药签或刷子拭取或刷洗颊内部而获得；2.血——通过刺破手指并收集血滴(干血斑)或通过静脉穿刺(全血)而获得；3.皮肤——通过(穿孔)活组织检查获得；4.器官组织——通过活组织检查获得；5.血浆——通过血浆分级分离获得；6.尿——通过排尿获得；7.粪便——通过粪便样品获得；8.脑脊液——通过脊椎穿刺获得；以及9.痰——通过咳痰或鼻气管抽痰获得。用于生物样品收集的技术是技术人员所熟知的。分离的、纯化的、合成或重组的甲病毒衣壳蛋白质或多聚蛋白质或基因组可以以任何合适的方式制备。编码甲病毒衣壳蛋白质的分离的、纯化的、合成或重组的基因组或核酸可以以任何合适的方式制备。载体也可以以任何合适的方式制备。包含载体的细胞(昆虫细胞、哺乳动物细胞或其他细胞)可以以任何合适的方式制备。用于实施上述方法的试剂盒可包含任何合适的组分或制品——例如，包含减毒活甲病毒、减毒重组活甲病毒、药物制剂等的疫苗；血清或一种或多种抗体；用于实施所述方法的一种或多种制品和/或试剂，诸如用于提供测试样品本身的装置；以及说明书。用于实施上述技术中的一项或多项技术的合适方案可见于"currentprotocolsinmolecularbiology"，2008年7月，johnwileyandsons；d.m.weirandccblackwell,"handbookofexperimentalimmunology"，第i-iv卷，1986；johne.coligan,adam.kruisbeek,davidh.margulies,ethanm.shevach,warrenstrober,"currentprotocolsinimmunology"，2001,johnwiley&sons；"immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology"，1987,academicpress；sambrook等人，"molecularcloning:alaboratorymanual，第3版"，2001,coldspringharborlaboratorypress；"vaccinedesign,methodsandprotocols"，第2卷，vaccinesforveterinarydiseases,,,sunilthomasinmethodsinmolecularbiology(2016)；以及"vaccinedesign,methodsandprotocols"，第1卷：vaccinesforhumandiseases,sunilthomasinmethodsinmolecularbiology(2016)，这些参考文献的全部内容以交叉引用方式并入本文。可以使用任何合适类型的受试者。受试者可以是任何合适的哺乳动物。哺乳动物包括人、灵长类动物、牲畜和农场动物(例如马、绵羊和猪)、伴侣动物(例如狗和猫)以及实验室试验动物(例如大鼠、小鼠和兔子)。受试者优选是人。如本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常是指dna或rna的聚合物，其可以是单链或双链的、合成或从天然来源获得的(例如，分离和/或纯化的)，其可含有天然、非天然或改变的核苷酸，并且其可含有天然、非天然或改变的核苷酸间连键，诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯键。如本文所用的术语“重组”是指(i)通过将天然或合成的核酸区段连接到可在活细胞中复制的核酸分子而在活细胞外构建的分子，或者(ii)由在上文(i)中描述的那些分子复制而产生的分子。出于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。本文所用的术语“分离的”或“纯化的”意指基本上不与其他生物组分/污染物缔合，例如作为已经通过使用抗体或其他方法与细胞污染物和其他污染物分离的天然存在的蛋白质或作为重组宿主细胞培养物的纯化产物。在本发明的范围内，本文描述的任何特征可以与本文描述的其他特征中的任何一个或多个特征以任意组合进行组合。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可用于本发明的实践或测试。在本说明书和权利要求书(如果有的话)中，词语“包括(comprising)”及其衍生词(包括“包含(comprises/comprise)”)包括所述整数中的每一个，但不排除包括一个或多个其他整数。以下定义本发明的特别优选的实施方案。1.一种分离、纯化、合成或重组的基孔肯雅病毒(chikv)或塞姆利基森林病毒(sfv)甲病毒突变衣壳蛋白质。2.一种包含突变衣壳蛋白质的分离、纯化、合成或重组的chkv或sfv甲病毒新生结构多聚蛋白质。3.一种编码突变衣壳蛋白质的重组chkv或sfv甲病毒基因组。4.一种包含突变衣壳蛋白质的重组chkv或sfv甲病毒。5.一种包含突变衣壳蛋白质的减毒重组活chkv或sfv甲病毒。6.一种包含突变衣壳蛋白质的嵌合chkv或sfv甲病毒。7.一种包含突变衣壳蛋白质的减毒嵌合活chkv或sfv甲病毒。8.一种疫苗，所述疫苗包含：分离的、纯化的、合成或重组的chkv或sfv甲病毒突变衣壳蛋白质；包含突变衣壳蛋白质的分离的、纯化的、合成或重组的chkv或sfv甲病毒新生结构多聚蛋白质；编码突变衣壳蛋白质的重组chkv或sfv甲病毒基因组；包含突变衣壳蛋白质的重组chkv或sfv甲病毒；包含突变衣壳蛋白质的减毒重组活chkv或sfv甲病毒；包含突变衣壳蛋白质的嵌合chkv或sfv甲病毒；或包含突变衣壳蛋白质的减毒嵌合活chkv或sfv甲病毒。9.一种亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包含：包含突变衣壳蛋白质的重组chkv或sfv甲病毒；包含突变衣壳蛋白质的重组chkv或sfv甲病毒新生结构多聚蛋白质；或编辑突变衣壳蛋白质的重组chkv或sfv甲病毒基因组。10.一种血清，所述血清含有从用根据段落8或根据段落9所述的疫苗、根据段落1所述的蛋白质、根据段落2所述的多聚蛋白质、段落3所述的基因组或段落4到7中任一段所述的甲病毒免疫或施用的受试者获得的甲病毒中和抗体。11.至少一种甲病毒中和抗体，所述甲病毒中和抗体是从用段落8或段落9所述的疫苗、段落1所述的蛋白质、段落2所述的多聚蛋白质、段落3所述的基因组或段落4到7中任一段所述的甲病毒免疫或施用的受试者获得的。12.一种药物制剂，所述药物制剂包含：(1)段落1所述的蛋白质或其药学上可接受的衍生物；(2)段落2所述的多聚蛋白质或其药学上可接受的衍生物；(3)段落3所述的基因组或其药学上可接受的衍生物；(4)段落4到7中任一段所述的甲病毒或其药学上可接受的衍生物；(5)段落8或段落9所述的疫苗或其药学上可接受的衍生物；(6)段落10所述的血清或其药学上可接受的衍生物；或者(7)段落11所述的至少一种甲病毒中和抗体或其药学上可接受的衍生物，以及至少一种药学上可接受的载体。13.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：(1)段落1所述的蛋白质；(2)段落2所述的多聚蛋白质；(3)段落3所述的基因组；(4)段落4到7中任一段所述的甲病毒；(5)段落8或段落9所述的疫苗；(6)段落10所述的血清；或者(7)段落11所述的至少一种甲病毒中和抗体。14.一种方法，所述方法用于：(1)预防受试者自然感染甲病毒感染；(2)预防受试者发展出甲病毒疾病；(3)引发受试者的甲病毒保护性免疫应答；或者(4)刺激受试者的抗甲病毒免疫应答，所述方法包括向所述受试者施用以下物质的步骤：(1)段落1所述的蛋白质；(2)段落2所述的多聚蛋白质；(3)段落3所述的基因组；(4)段落4到7中任一段所述的甲病毒；或者(5)段落8或段落9所述的疫苗。15.一种方法，所述方法用于(1)治疗患有甲病毒疾病的受试者，或(2)降低甲病毒疾病的严重程度，所述方法包括向所述受试者施用以下物质的步骤：(1)段落10所述的血清或其药学上可接受的衍生物；或者(2)段落11所述的至少一种甲病毒中和抗体或其药学上可接受的衍生物。16.一种筛选或诊断受试者是否患有甲病毒感染或疾病的方法，所述方法包括以下步骤：(1)测试所述受试者或从所述受试者获得的生物样品与段落10所述的血清或段落11所述的至少一种甲病毒中和抗体的反应性，其中反应性指示所述受试者患有甲病毒感染或疾病；并且任选地：(2)治疗所述受试者。17.一种编码段落1所述的甲病毒衣壳蛋白质或段落2所述的多肽的分离、纯化、合成或重组的核酸。18.一种编码突变衣壳蛋白质的分离、纯化、合成或重组的chikv或sfv甲病毒基因组。19.一种包含段落17所述的核酸或段落18所述的基因组的载体。20.一种包含段落19所述的载体的细胞。21.一种用于实施根据段落14、15或16所述的方法的试剂盒。22.一种用于制备(1)段落8或段落9所述的疫苗，或(2)段落4到7中任一段所述的重组甲病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(1)使chickv或sfv甲病毒的衣壳蛋白质突变以产生重组甲病毒；以及(2)使重组甲病毒能够复制。23.段落1所述的蛋白质，段落2所述的多聚蛋白质，段落3所述的基因组，段落4到6中任一段所述的甲病毒，段落8或9所述的疫苗，段落10所述的血清，段落11所述的至少一种抗体，段落12所述的药物制剂，段落13所述的免疫原性组合物，段落14到16中任一段所述的方法，段落17所述的核酸，段落18所述的基因组，段落19所述的载体，段落20所述的细胞，段落21所述的试剂盒，或段落22所述的方法，其中所述突变衣壳蛋白质具有：与野生型衣壳蛋白质相比突变的核仁定位区/信号/序列(nols)；除nols中之外的一个或多个突变；突变的nols以及除nols中之外的一个或多个突变；野生型chikv衣壳蛋白质的nols的一个或多个氨基酸被移位、取代和/或缺失；野生型chikv衣壳蛋白质的氨基酸位置58到110中的一个或多个氨基酸位置被移位、取代和/或缺失；野生型chikv衣壳蛋白质的氨基酸位置62、63、65、66、68、69、84、85、95、96、101和102中的一个或多个氨基酸位置被移位、取代和/或缺失；野生型chikv衣壳蛋白质的至少氨基酸位置62、63、65、66、68、69、84、85、95、96、101和102被移位、取代和/或缺失；或者如seq.idnos.1和4到7中任一项所示或大致如seq.idnos.1和4到7中任一项所示的序列。24.段落1所述的蛋白质，段落2所述的多聚蛋白质，段落3所述的基因组，段落4到6中任一段所述的甲病毒，段落8或9所述的疫苗，段落10所述的血清，段落11所述的至少一种抗体，段落12所述的药物制剂，段落13所述的免疫原性组合物，段落14到16中任一段所述的方法，段落17所述的核酸，段落18所述的基因组，段落19所述的载体，段落20所述的细胞，段落21所述的试剂盒，或段落22所述的方法，其中所述突变衣壳蛋白质是衣壳-101/95(chikv-nols)[seq.idno.7]。25.一种分离的、纯化的、合成或重组的甲病毒突变衣壳蛋白质。26.一种包含突变衣壳蛋白质的分离的、纯化的、合成或重组的甲病毒新生结构多聚蛋白质。27.一种编码突变衣壳蛋白质的重组甲病毒基因组。28.一种包含突变衣壳蛋白质的重组甲病毒。29.一种包含突变衣壳蛋白质的减毒重组活甲病毒。30.一种包含突变衣壳蛋白质的嵌合甲病毒。31.一种包含突变衣壳蛋白质的减毒嵌合活甲病毒。32.一种疫苗，所述疫苗包含：分离的、纯化的、合成或重组的甲病毒突变衣壳蛋白质；包含突变衣壳蛋白质的分离的、纯化的、合成或重组的甲病毒新生结构多聚蛋白质；编码突变衣壳蛋白质的重组甲病毒基因组；包含突变衣壳蛋白质的重组甲病毒；包含突变衣壳蛋白质的减毒重组活甲病毒；包含突变衣壳蛋白质的嵌合甲病毒；或包含突变衣壳蛋白质的减毒嵌合活甲病毒。33.一种亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包含：包含突变衣壳蛋白质的重组甲病毒；包含突变衣壳蛋白质的重组甲病毒新生结构多聚蛋白质；或编辑突变衣壳蛋白质的重组甲病毒基因组。34.一种血清，所述血清含有从用段落32或段落33所述的疫苗、段落25所述的蛋白质、段落26所述的多聚蛋白质、段落27所述的基因组或段落28到31中任一段所述的甲病毒免疫或施用的受试者获得的甲病毒中和抗体。35.至少一种甲病毒中和抗体，所述甲病毒中和抗体是从用段落32或段落33所述的疫苗、段落25所述的蛋白质、段落26所述的多聚蛋白质、段落27所述的基因组或段落28到31中任一段所述的甲病毒免疫的受试者获得的。36.一种药物制剂，所述药物制剂包含：(1)段落25所述的蛋白质或其药学上可接受的衍生物；(2)段落26所述的多聚蛋白质或其药学上可接受的衍生物；(3)段落27所述的基因组或其药学上可接受的衍生物；(4)段落28到31中任一段所述的甲病毒或其药学上可接受的衍生物；(5)段落32或段落33所述的疫苗或其药学上可接受的衍生物；(6)段落34所述的血清或其药学上可接受的衍生物；或者(7)段落35所述的至少一种甲病毒中和抗体或其药学上可接受的衍生物，以及至少一种药学上可接受的载体。37.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含：(1)段落25所述的蛋白质；(2)段落26所述的多聚蛋白质；(3)段落27所述的基因组；(4)段落28到31中任一段所述的甲病毒；(5)段落32或段落33所述的疫苗；(6)段落34所述的血清；或者(7)段落35所述的至少一种甲病毒中和抗体。38.一种方法，所述方法用于：(1)预防受试者自然感染甲病毒感染；(2)预防受试者发展出甲病毒疾病；(3)引发受试者的甲病毒保护性免疫应答；或者(4)刺激受试者的抗甲病毒免疫应答，所述方法包括向所述受试者施用以下物质的步骤：(1)段落25所述的蛋白质；(2)段落26所述的多聚蛋白质；(3)段落27所述的基因组；(4)段落28到31中任一段所述的甲病毒；或者(5)段落32或段落33所述的疫苗。39.一种方法，所述方法用于(1)治疗患有甲病毒疾病的受试者，或(2)降低甲病毒疾病的严重程度，所述方法包括向所述受试者施用以下物质的步骤：(1)段落34所述的血清或其药学上可接受的衍生物；或者(2)段落35所述的至少一种甲病毒中和抗体或其药学上可接受的衍生物。40.一种筛选或诊断受试者是否患有甲病毒感染或疾病的方法，所述方法包括以下步骤：(1)测试所述受试者或从所述受试者获得的生物样品与段落34所述的血清或段落35所述的至少一种甲病毒中和抗体的反应性，其中反应性指示所述受试者患有甲病毒感染或疾病；并且任选地：(2)治疗所述受试者。41.一种编码根据段落25所述的甲病毒衣壳蛋白质或根据段落26所述的多肽的分离、纯化、合成或重组的核酸。42.一种编码突变衣壳蛋白质的分离、纯化、合成或重组的甲病毒基因组。43.一种包含根据段落41所述的核酸或根据段落42所述的基因组的载体。44.一种包含根据段落43所述的载体的细胞。45.一种用于实施根据段落38到40中任一段落所述的方法的试剂盒。46.一种用于制备(1)段落32或段落33所述的疫苗，或(2)段落28到31中任一段所述的重组甲病毒的方法，所述方法包括以下步骤：(1)使甲病毒的衣壳蛋白质突变以产生重组甲病毒；以及(2)使所述重组甲病毒复制。47.段落25所述的蛋白质，段落26所述的多聚蛋白质，段落27所述的基因组，段落28到31中任一段所述的甲病毒，段落32或33所述的疫苗，段落34所述的血清，段落35所述的至少一种抗体，段落36所述的药物制剂，段落37所述的免疫原性组合物，段落38到40中任一段所述的方法，段落41所述的核酸，段落42所述的基因组，段落43所述的载体，段落44所述的细胞，段落45所述的试剂盒，或段落46所述的方法，其中所述突变衣壳蛋白质具有：与野生型衣壳蛋白质相比突变的核仁定位区/信号/序列(nols)；除nols中之外的一个或多个突变；突变的nols以及除nols中之外的一个或多个突变；野生型chikv衣壳蛋白质的nols的一个或多个氨基酸被移位、取代和/或缺失；野生型chikv衣壳蛋白质的氨基酸位置58到110中的一个或多个氨基酸位置被移位、取代和/或缺失；野生型chikv衣壳蛋白质的氨基酸位置62、63、65、66、68、69、84、85、95、96、101和102中的一个或多个氨基酸位置被移位、取代和/或缺失；野生型chikv衣壳蛋白质的至少氨基酸位置62、63、65、66、68、69、84、85、95、96、101和102被移位、取代和/或缺失；或者如seq.idnos.1和4到7中任一项所示或大致如seq.idnos.1和4到7中任一项所示的序列。48.段落25到46中任一段所述的发明，其中所述甲病毒突变衣壳蛋白质来源于甲病毒，诸如罗斯河病毒(rrv)、巴马森林病毒(bfv)、奥-奈氏病毒(onnv)、马亚罗病毒(mayv)、辛德毕斯病毒群(导致波戈斯塔病、奥克尔布病和卡累利阿热)、或塞姆利基森林病毒(sfv)。49.段落38或39所述的方法，其中所述甲病毒感染或疾病是由罗斯河病毒(rrv)、巴马森林病毒(bfv)、奥-奈氏病毒(onnv)、马亚罗病毒(mayv)、辛德毕斯病毒群(导致波戈斯塔病、奥克尔布病和卡累利阿热)或塞姆利基森林病毒(sfv)，或其他类型的甲病毒导致的。附图说明图1(a)野生型chikv衣壳蛋白质(wt-也称为“capsid-wt”)[seq.idno.3]与突变的chikv衣壳蛋白质(capsid-nls63/66/69[seq.idno.4]、capsid-nls85/95/101[seq.idno.5]、capsid-101[seq.idno.6]和capsid-101/95[seq.idno.7]-也称为“capsid-nols”)的部分序列比对。(b)egfp标记的衣壳蛋白质亚细胞定位。用pegfp、pcapsid-wtegfp、pcapsid-nls63/66/69-egfp、pcapsid-nls85/95/101-egfp、pcapsid-101-egfp和pcapsid-nolsegfp单独转染的绿猴肾细胞(verocell)。顶部图中的绿猴肾细胞显示增强型绿色荧光蛋白质(egfp)荧光。中间图中的绿猴肾细胞显示使用核仁蛋白特异性抗体的间接免疫荧光。底部图中的绿猴肾细胞显示顶部图和中间图的融合。图2(a)对用pcapsid-wtegfp(标记为“wt”)或衣壳蛋白质突变体pcapsid-101-egfp(标记为“101”)和pcapsid-nolsegfp(标记为“101/95”)转染的活绿猴肾细胞执行的光漂白荧光损失(flip)分析。(b)在对细胞核的一部分进行连续光漂白期间，评估在280秒的时段内细胞质中的荧光损失。构建荧光恢复曲线；在漂白时段后对数据进行归一化，使得初始预漂白设定为1，并且完全漂白的荧光强度设定为0。图3衣壳蛋白质nols的突变不影响衣壳蛋白质的自身蛋白酶活性。将绿猴肾细胞用pegfp、pcapsid-egfp、pcapsid-101-egfp或pcapsid-nols-egfp或表达egfp标记的wtcapsid-w、capsid-101-w和capsid-nols-w的质粒转染。egfp标记的wtcapsid-w、capsid-101-w和capsid-nols-w含有衣壳蛋白质自我蛋白酶解所需的c末端色氨酸(w261)。将细胞在转染后24小时进行裂解，并用蛋白质印迹法和egfp特异性抗体分析细胞裂解物中来自衣壳蛋白质的egfp切割。图4(a)和(b)chikv-wt或chikv-nols感染的哺乳动物细胞和蚊子细胞中的衣壳蛋白质的亚细胞定位。将绿猴肾(a)或c6/36(b)细胞用chikv-wt或chikv-nols以1pfu/细胞的感染复数(moi)进行感染。将细胞在感染后24小时固定和透化，并使用衣壳蛋白质特异性抗体进行间接免疫荧光。图像代表至少6个视野。白色条表示15μm。图4(c)、(d)和(e)在衣壳蛋白质中含有nols突变的chikv显示体外减毒。通过用chikv-wt或chikv-nols以0.1pfu/细胞的moi感染细胞获得的bhk-21(c)和c6/36(d)细胞中的多步生长动力学。在指定的时间点收集上清液，并通过噬菌斑测定法定量感染性病毒。使用双因素方差分析以及bonferroni事后检验，**，p<0.01；***，p<0.001。每个符号代表3次独立实验的平均值±标准误差。(e)感染的bhk-21细胞中的噬菌斑大小(mm)。使用学生非配对t检验，***，p<0.001。每个符号代表单个噬菌斑的直径。图5.感染后的病毒血症。(a)显示在感染后第3天通过噬菌斑测定法滴定的chikv感染小鼠的踝关节中chikv-wt和chikv-nols病毒滴度的图。(b)显示在感染后第3天通过qrt-pcr分析的踝关节中chikv疾病的炎症介质的mrna表达的图，所述炎症介质是单核细胞趋化蛋白质-1(mcp-1)、干扰素γ(ifnγ)和肿瘤坏死因子α(tnfα)。(c)显示在感染后通过噬菌斑测定法滴定的chikv感染小鼠的血清和踝关节中的chikv-wt和chikv-nols病毒滴度的图。图6(a)chikv-wt和chikv-nols感染的c57bl/6小鼠在感染后第3天的照片。(b)显示每日监测的chikv诱导的足跖肿胀(宽度×幅度)的图。图7(a)激发/感染的chikv-nols免疫c57bl/6小鼠在激发/感染后第6天的照片。左侧照片显示模拟激发，中间照片显示用chikv-wt(标记为“wt激发”)激发的chikv-nols免疫小鼠，并且右侧照片显示用chikv-nols(标记为“nols激发”)激发的chikv-nols免疫小鼠。(b)显示用chikv-wt(标记为“wt激发”)、chikv-nols(标记为“nols激发”)或模拟激发进行激发的chikv-nols免疫小鼠的chikv滴度的图。(c)显示每日监测的激发/感染的chikv-nols免疫小鼠的chikv诱导的足跖肿胀(宽度×幅度)的图——模拟激发(标记为“mock-chikvch”)、chikv-wt激发(标记为“chikv-wt-chikvch”)和chikv-nols激发(标记为“chikv-nols-chikvch”)。图8.在用模拟激发(标记为“模拟”)、chikv-wt激发(标记为“wt”)和chikv-nols激发(标记为“nols”)感染后第7天、第15天和第30天收集的合并小鼠血清的中和作用能力。(a)将合并的小鼠血清(n>7)连续稀释并与chikv-zsgreen(moi1)混合2小时，然后感染绿猴肾细胞1小时并在37℃下温育六小时。通过流式细胞术测量计为％zsgreen+ve活细胞的感染率。(b)显示第7天、第15天和第30天的％zsgreen+ve活细胞的图。图9.显示chikv-nols免疫小鼠(免疫后第30天)在罗斯河病毒(rrv)激发——模拟激发(标记为“模拟激发”)、chikv-wt激发(标记为“wt激发”)和chikv-nols激发(标记为“nols激发”)后防御病毒血症发展的能力的图。双因素方差分析anova和bonferoni事后检验；***p<0.001；*p<0.05。图10.对衣壳蛋白质egfp标记的构建体进行蛋白质印迹以确认绿猴肾细胞中的表达水平。印迹使用egfp和肌动蛋白特异性抗体比较了pegfp(标记为“gfp”)、pcapsid-wtegfp(标记为“cprotwt”)、pcapsid-101-egfp(标记为“101”)和pcapsid-nolsegfp(标记为“101/95”)的表达水平。肌动蛋白用作负载对照。图11.chikv野生型衣壳蛋白质[seq.idno.1]与sfv野生型衣壳蛋白质[seq.idno.2]的蛋白质序列比对，其中被发现对核仁转运很重要的氨基酸以下划线显示。图12.chikvrna合成不受衣壳蛋白质nols的突变影响。将bhk-21细胞和c6/36细胞用chikv-wt或chikv-nols以0.1pfu/细胞的moi感染。通过在感染后指定时间处进行定量rt-pcr测定培养上清液中的病毒基因组拷贝数和感染细胞中的病毒rna拷贝数。(a)bhk-21细胞相关的病毒，(b)c6/36细胞相关的病毒，(c)bhk-21培养上清液，(d)c6/36培养上清液。使用双因素方差分析以及bonferroni事后检验，***，p<0.001。每个条代表3次独立实验的平均值±标准误差。图13病毒滴度对照感染后小时数的图，显示了chikv-wt和chikv-nols在绿猴肾细胞中的多步生长动力学以评估表型稳定性。使用双因素方差分析以及bonferroni事后检验，**，p<0.01并且***，p<0.001。图14.将chikv-nols或chikv-wt噬菌斑大小(mm)对照感染的绿猴肾细胞中的病毒传代数绘制曲线图。每个符号代表单个噬菌斑的直径，所述直径具有平均值±标准偏差。图15.在0.22μm过滤之前和之后的平均chikv-nols滴度的图。将含p0chikv-nols的t-175烧瓶解冻，并将细胞悬浮液以2000rpm旋转5min以沉淀细胞碎片。收集(未过滤的)上清液，并将约10ml上清液滤过0.22μm孔径的亲水性聚醚砜(pes)膜或0.22μm孔径的亲水性pvdf膜。图16.(a)显示在长期储存期间温度对chikv-nols的滴度的影响的图。(b)显示在长期储存期间温度对chikv-wt的滴度的影响的图。将chikv-nols和chikv-wt稀释到5×105pfu/ml并将小管储存在21℃、4℃、-20℃和-80℃下。在所指示的时间点通过噬菌斑测定法定量感染性chikv-nols(a)和chikv-wt(b)。材料和方法衣壳蛋白质的定点诱变从icres载体(universityoftartu)扩增衣壳蛋白质cdna，并克隆到市售的egfp(增强型gfp)质粒中。根据制造商的说明书，使用quikchangeii定点诱变试剂盒(agilent)产生chikv衣壳蛋白质的定点突变体。蛋白质印迹分析根据制造商的说明书，使用2000转染试剂(thermofisherscientific)将细胞用pegfp、pcapsid-wtegfp(野生型衣壳蛋白质)或衣壳蛋白质突变体pcapsid-nls63/66/69-egfp、pcapsid-nls85/95/101-egfp、pcapsid-101-egfp和pcapsid-nolsegfp转染。24h后，使用egfp和肌动蛋白特异性抗体通过蛋白质印迹分析来分析细胞裂解物。肌动蛋白充当负载对照。共聚焦成像使细胞在用聚赖氨酸处理过的盖玻片上生长。将细胞在4％多聚甲醛中固定，并在1％tritonx-100中透化。然后将细胞在pbs中制备的1％牛血清白蛋白(bsa)中封闭，并在37℃下温育1h。将一抗、核仁蛋白在1％bsa中以1:100稀释并与细胞在37℃下温育1h。将德克萨斯红(texasred)抗小鼠(vectorlaboratories)在1％bsa中以1:500稀释并与细胞在37℃下温育1h。将盖玻片在vectorshield封固剂(vectorlaboratories)中封片，并在olympusfv1000共聚焦显微镜上观察染色。活细胞成像将细胞接种在基于玻璃的33mm培养皿上，并在转染后24h使用uprightlsm510metaaxioplan2共聚焦显微镜(zeiss)成像。将细胞维持在37℃，并且在成像期间，将细胞培养基更换为不依赖于co2的培养基(thermofisher)。使用lsm510软件的roi平均模块测量荧光损失。针对细胞毒性的流式细胞术收集转染的细胞并用1μg/ml碘化丙啶染色。将细胞固定在4％多聚甲醛中，并使用具有kaluza软件的cyanadp流式细胞仪(beckmancoutler)进行分析。多步生长动力学将细胞以0.1pfu/细胞的感染复数(moi)感染。在37℃下吸附病毒1h后，洗涤细胞单层并加入新鲜的生长培养基。在指定的时间点收集上清液，并通过噬菌斑测定法定量感染性病毒。踝关节细胞因子根据制造商的说明书，使用trizol(invitrogen,melbourne,victoria,australia)从小鼠组织中提取rna。根据制造商的说明书，使用随机引物和逆转录酶(sigmaaldrich,sydney,australia)逆转录1μg的rna。在cfx96touchtm实时pcr系统中用50ng模板cdna、quantitect引物测定试剂盒(qiagen,hilden,germany)和绿色实时pcr试剂执行定量pcr。将数据归一化为持家基因hprt1，并使用δδct方法计算每种基因相对于模拟感染的pbs处理样品的信使rna(mrna)表达倍数变化。简而言之，δδct＝δct(rrv感染)-δct(模拟感染)，其中δct＝ct(所关注基因)-ct(持家基因-hprt)。每种基因的倍数变化计算为2-δδct。体内感染和疾病监测将21日龄的c57bl/6小鼠在足腹侧/足外侧用104pfu的chikv-wt或chikv-nols皮下感染，并每天监测chikv诱导的足跖肿胀(宽度×幅度)的病征。动物实验由格里菲斯大学动物伦理委员会(animalethicscommitteeofgriffithuniversity)批准(gly/05/15/aec)。所有涉及动物的程序均符合澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于用于科学目的的动物护理和使用操作守则(nationalhealthandmedicalresearchcouncilaustraliancodeofpracticeforthecareanduseofanimalsforscientificpurposes)(2013年第8版)。病毒滴度测定收集踝关节和血清并使用噬菌斑测定法测定病毒滴度。将组织样品在1ml的pbs中匀浆化，并将10倍连续稀释的匀浆和血清一式三份加入到绿猴肾细胞中。使病毒在5％co2培养箱中于37℃下温育1h，然后去除病毒，并将细胞用含有3％fcs和1％琼脂糖(sigmaaldrich,sydney,australia)的opti-mem(invitrogen,melbourne,victoria,australia)覆盖并在5％co2培养箱中温育48h。将细胞在1％福尔马林中固定，并通过用0.1％结晶紫染色使病毒噬菌斑可见。体内免疫和激发将21日龄的c57bl/6小鼠在足腹侧/足外侧用一剂104pfu的chikv-wt或chikv-nols进行皮下免疫。在免疫后30天时，将小鼠在足腹侧/足外侧用104pfu的chikv-wt激发并每天监测chikv诱导的足跖肿胀的病征，或在胸部用104pfu的罗斯河病毒(rrv)皮下激发并测量病毒血症。动物实验由格里菲斯大学动物伦理委员会批准(gly/05/15/aec)。所有涉及动物的程序均符合澳大利亚国家卫生与医学研究委员会关于用于科学目的的动物护理和使用操作守则(2013年第8版)。体外中和作用将合并的小鼠血清((n>7)连续稀释并与chikv-zsgreen(moi1)混合2h，然后感染绿猴肾细胞1h并在37℃下温育6h。通过流式细胞术测量计为％zsgreen+ve活细胞的感染率。寡核苷酸、质粒和抗体.为了产生pcapsid-egfp，使用引物chikcprotf(5′gcggcgcaagcttatggagttcatcccaaccc3′-seq.idno.8)和chikcprotr(5′cgcggatccgactcttcggccccctcg3′-seq.idno.9)将对应于chikv衣壳蛋白质的cdna通过pcr扩增并克隆到pegfp-n1(takarabiousa,inc.)中。为了产生含有在衣壳蛋白质的c末端进行衣壳蛋白质自我蛋白酶解所需的色氨酸残基的pcapsidw-egfp，使用引物chikcprotf和chikcprotwr(5′cgcggatccgaccactcttcggcc3′-seq.idno.10)，并将所获得的片段克隆到pegfp-n1中。使用如前所述的lareunionchikv分离株lr2006-opy1的全长感染性cdna克隆构建psp6-chikv-zsgreen，psp6-chikv-zsgreen是一种含有表达zsgreen标记蛋白的chikv变体的cdna的质粒(pohjalal,utta,varjakm,lullaa,meritsa,aholat,tammelap.2011.inhibitorsofalphavirusentryandreplicationidentifiedwithastablechikungunyarepliconcelllineandvirus-basedassays(用稳定的基孔肯雅复制子细胞系和基于病毒的测定法鉴定出的甲病毒进入和复制的抑制剂).plosone6)。用于定点诱变的寡核苷酸列于表1中。使用quikchangeii定点诱变试剂盒(agilenttechnologiesusa,inc.)产生突变体。针对核仁蛋白(santacruzbiotechusa,inc.)、egfp(bdbiosciences,usa)和肌动蛋白(santacruzbiotechusa,inc.)的抗体购自相应的供应商。单克隆衣壳蛋白质抗体是自制的并且如前所述进行表征(gohlyh,hobson-petersj,prowna,gardnerj,bielefeldt-ohmannh,suhrbiera,hallra.2015.monoclonalantibodiesspecificforthecapsidproteinofchikungunyavirussuitableformultiple,applications(特异于基孔肯雅病毒衣壳蛋白质的单克隆抗体适用于多种应用).journalofgeneralvirology96:507-512；gohlyh,hobson-petersj,prowna,bakerk,piyasenatbh,taylorct,ranaa,hastieml,gormanjj,hallra.2015.thechikungunyaviruscapsidproteincontainslinearbcellepitopesinthen-andc-terminalregionsthataredependentonanintactc-terminusforantibodyrecognition(基孔肯雅病毒衣壳蛋白质在n末端区域和c末端区域含有线性b细胞表位，所述区域取决于用于抗体识别的完整c-末端).viruses-basel7:2943-2964。将抗衣壳单克隆抗体(1.7b2和4.1h11)的混合物用于免疫荧光。表1-用于定点诱变的寡核苷酸细胞培养、转染和病毒繁殖。将绿猴肾细胞和bhk-21细胞在补充有3％胎牛血清(fcs)的opti-mem,(thermofisherscientific,australia)中培养。将c6/36细胞在补充有10％胰蛋白磷酸盐肉汤和10％fcs的leibovitz的l-15培养基(thermofisherscientific,australia)中培养。根据制造商的说明书，用lipofectamine2000(thermofisherscientific,australia)进行质粒转染。小鼠c57bl/6wt小鼠获自动物资源中心(perth,australia)并在室内繁殖。所有动物实验均按照格里菲斯大学动物伦理委员会制定的指南进行。将等量分布的二十一日龄c57bl/6雄性和雌性小鼠在足腹侧/足外侧接种用pbs稀释到20μl体积的104个噬斑形成单位(pfu)的chikv-wt或chikv-nols。用单独pbs接种模拟感染的小鼠。将小鼠称重并每24h对疾病病征进行评分，并在实验终点通过co2窒息处死。通过使用kincrome数字游标卡尺测量后足周围区域的高度和宽度来评估chikv诱导的足跖肿胀。在感染后30天，将小鼠在足腹侧/足外侧用104pfu的chikv-wt激发，称重并每24h对疾病病征进行评分，并在激发后第1天、第2天和第3天测量病毒血症，或在胸部用104pfu的罗斯河病毒(rrv)皮下激发并在激发后第1天和第2天测量病毒血症。中和作用测定使用绿猴肾细胞和chikv-zsgreen通过基于免疫荧光的细胞感染测定法来分析感染后第30天来自chikv-wt或chikv-nols感染的小鼠的抗体的中和作用能力。将以足以达到0.4的感染复数(moi)的量获取的感染性病毒与经稀释(10-1、10-2和10-3)、热灭活(56℃下30min)的合并小鼠血清混合，然后在37℃下温育2h。将病毒-抗体混合物加入到绿猴肾细胞中并在37℃下温育1h。去除病毒接种物，用pbs洗涤细胞并加入含有3％fcs的opti-mem，然后在37℃下温育6h。将细胞轻轻地重悬，用近红外细胞染色剂(thermofisherscientific,australia)染色并在4％多聚甲醛中固定。使用bdlsriifortessa细胞分析仪测量计为％zsgreen+ve活细胞的感染率，并用flowjo软件(treestarusainc.)定量。免疫荧光显微镜和flip(光漂白中的荧光损失)将在用聚赖氨酸处理过的盖玻片上生长的细胞在4％多聚甲醛中固定，并在1％tritonx-100中透化。然后将细胞在pbs中制备的1％牛血清白蛋白(bsa)中封闭，并在37℃下孵育1h。将一抗在1％bsa中以1:100稀释并与细胞在37℃下温育1h。将alexafluor647缀合的二抗invitrogentm(thermofisherscientific,australia)在1％bsa中1:500稀释，并与细胞在37℃下温育1h。将盖玻片在vectorshield封固剂(vectorlaboratories,usa)中封片，并在olympusfluoviewtmfv1000共聚焦显微镜上观察染色。对于flip分析，将绿猴肾细胞接种在基于玻璃的33mm培养皿上，并在转染后24h使用lsm510meta共聚焦显微镜(zeiss,oberkochen,germany)成像。将细胞维持在37℃，并且在成像期间，将细胞培养基更换为不依赖于co2的培养基invitrogentm(thermofisherscientific,australia)。使用来自lsm510软件的相对荧光强度归一化所关注区域(roi)的荧光损失；将初始荧光强度设定为1。体外病毒复制动力学将bhk-21细胞和c6/36细胞用chikv-wt或chikv-nols以为0.1的moi感染，并在5％co2培养箱中于37℃下温育1h，然后去除病毒，并且将细胞用pbs洗涤并用含3％fcs的opti-mem覆盖。在感染后的不同时间，收获上清液等分试样，并通过如下所述的噬菌斑测定法测量小管滴度。为了确定培养上清液中的病毒rna基因组拷贝数和感染细胞中的病毒正链rna拷贝数，收集上清液并在pbs中洗涤单层细胞三次。根据制造商的说明书，使用invitrogentm(thermofisherscientific,australia)执行rna提取。根据制造商的说明书，使用随机九聚体引物和m-mlv逆转录酶(sigma-aldrichusa,inc.)来逆转录所提取的rna。使用lareunionchikv分离株lr2006-opy1的全长感染性cdna克隆的连续稀释液产生标准曲线。使用绿色实时pcr试剂在12.5μl反应体积中执行对病毒负载的定量以检测e1区域。使用引物chikve1f(5′cccggtaagagcggtgaa3′-seq.idno.23)和chikve1r(5′cttccggtatgtcgatg3′-seq.idno.24)来检测chikv基因组、反基因组和亚基因组rna。所有反应均使用cfx96touchtm实时pcr系统执行。绘制标准曲线，并使用graphpadprism软件从标准曲线内插扩增产物的拷贝数以确定病毒rna拷贝数。病毒滴度测定在感染后第1天、第2天、第3天和第4天处死小鼠，然后收集踝关节和血清并使用噬菌斑测定法测定病毒滴度。将组织样品在1ml的pbs中匀浆化，并将10倍连续稀释的匀浆和血清一式三份加入到绿猴肾细胞中。使病毒在5％co2培养箱中于37℃下温育1h，然后去除病毒，并将细胞用含有3％fcs和1％琼脂糖(sigma-aldrichusa,inc.)的opti-mem覆盖并在5％co2培养箱中温育48h。将细胞在1％福尔马林中固定，并通过用0.1％结晶紫染色使病毒噬菌斑可见。结果表示为pfu/ml或每克组织的pfu(pfu/g)。定量rt-pcr根据制造商的说明书，使用invitrogentm(thermofisherscientific,australia)从组织中提取rna。根据制造商的说明书，使用随机九聚体引物和m-mlv逆转录酶(sigma-aldrichusa,inc.)逆转录1μg总rna。使用标准的三步解链程序(95℃达15s，55℃达30s并且72℃达30s)，在cfx96touchtm实时pcr系统中使用50ng模板cdna、quantitect引物测定试剂盒(qiagen,hilden,germany)和绿色实时pcr试剂执行定量pcr。将数据归一化为hprt1，并使用δδct方法计算每种基因相对于模拟感染的pbs处理样品的mrna表达倍数变化。简而言之，δδct＝δct(病毒感染的)-δct(模拟感染的)，其中δct＝ct(所关注基因)-ct(持家基因)。每种基因的倍数变化计算为2-δδct。统计分析使用双因素方差分析以及bonferroni事后检验来检查体外病毒生长动力学数据和病毒血症。使用学生未配对t检验来分析感染后第3天的定量rt-pcr和踝关节滴度。使用单因素方差分析以及bonferroni事后检验来检查中和作用测定。p值<0.05被认为是显著的。结果和讨论实施例1-chikv衣壳蛋白质核仁定位序列的鉴定为了鉴定最小的chikv衣壳蛋白质核仁定位序列(nols)，对egfp标记的重组chikv衣壳蛋白质的富含碱性氨基酸的n末端区域进行定点诱变。所述蛋白质的氨基酸被丙氨酸取代。鉴定出构成chikv衣壳蛋白质的最小nols的十种氨基酸。产生四种突变衣壳蛋白质，并且它们的序列差异与野生型chikv衣壳蛋白质的序列(“衣壳-wt”，标记为“wt”)一起显示在图1(a)的的序列比对中。突变的chikv衣壳蛋白质是capsid-nls63/66/69(标记为“nls63/66/69”)、capsid-nls85/95/101(标记为“nls85/95/10”)、capsid-101(标记为“101”)和capsid-101/95(标记为“101/95”)，它们还在本文中被称为“capsid-nols”。capsid-101/95中的10个氨基酸变化可能是衣壳蛋白质的核仁定位所需的最少残基。实施例2-突变chikv衣壳蛋白质的亚细胞定位使用共聚焦显微镜研究绿猴肾细胞中突变衣壳蛋白质的亚细胞定位。如图1(b)所示，capsid-wt(标记为“wt”)定位于核仁。capsid-101(标记为“101”)显显示降低的定位到细胞核的能力，但仍在核仁中被观察到。capsid-101/95(标记为“101/95”)包含最小核仁定位序列并显示为完全不存在于核仁中。使用衣壳特异性抗体的间接免疫荧光进一步用于分析在chikv-wt和chikv-nols感染的绿猴肾细胞和蚊子(白纹伊蚊)来源的c6/36细胞中chikv衣壳蛋白质的亚细胞定位。结果显示，在chikv-wt感染的绿猴肾细胞中，衣壳蛋白质在感染后24小时在类似于核仁的亚核体中累积(图4a)。在chikv-nols感染的绿猴肾细胞中，这些斑点不存在。因此，在病毒的情况下，nols突变导致对感染的绿猴肾细胞中衣壳蛋白质亚核定位的类似破坏。因此，nols突变在病毒中是稳定的，从而导致对衣壳蛋白质亚核定位的表型破坏。有趣的是，在chikv-wt感染的c6/36细胞中，衣壳蛋白质不在亚核体中积累，而是在感染后24小时主要在细胞质中发现(图12b)。在chikv-nols感染的c6/36细胞中，还发现衣壳蛋白质在细胞质中占优势，类似于在chikv-wt感染的c6/36细胞中观察到的定位。因此，衣壳蛋白质的亚核定位不是昆虫细胞中chikv感染的特征，并且nols的突变对感染的c6/36细胞中的衣壳蛋白质的亚细胞定位没有影响。实施例3-突变chikv衣壳蛋白质的运输能力对用egfp标记的野生型衣壳蛋白质或衣壳蛋白质突变体转染的活绿猴肾细胞执行光漂白荧光损失(flip)分析。使用flip分析来研究capsid-101/95(标记为“101/95”)与capsid-wt(标记为“wt”)和突变体capsid-101(标记为“101”)相比的迁移率。在对细胞核的一部分进行连续光漂白期间，评估在280秒的时段内细胞质中的荧光损失。这允许分析突变体的核运输率。构建荧光恢复曲线；在漂白时段后对数据进行归一化，使得初始预漂白设定为1，并且完全漂白的荧光强度设定为0。如图2(a)和图2(b)所示，capsid-wt在280秒后显示几乎完全的荧光损失，从而指示了蛋白质的迁移率和从细胞质到细胞核中的运输。然而，突变体capsid-101和capsid-101/95表现为明显不能进入荧光强度保持相对较高的细胞核。在稍后的时间，似乎还存在另外突变的累积效应，其中capsid-101/95比capsid-101更不稳定。这些结果表明，核仁定位序列的突变对衣壳蛋白质的运输能力具有重要影响，并可能因此对衣壳蛋白质的亚细胞定位具有重要影响。实施例4-nols的突变不影响衣壳蛋白质的自我蛋白酶解分析了nols的突变及其对衣壳蛋白质的自身蛋白酶活性的影响。产生表达egfp标记的wtcapsid-w、capsid-101-w和capsid-nols-w的构建体，所述构建体含有衣壳蛋白质自我蛋白酶解所需的c-末端色氨酸(w261)。图3显示，缺少来自保守切割位点的w261残基的所有构建体都不能从衣壳蛋白质切割egfp。然而，在包含w261的所有构建体中，衣壳蛋白质酶有效地从衣壳蛋白质切割egfp，所述构建体包括衣壳蛋白质的nols突变体(图3)。因此，nols的突变对chikv衣壳蛋白质的自催化蛋白酶活性没有影响。实施例5-在衣壳蛋白质中含有nol突变的chikv显显示体外衰减为了评估衣壳蛋白质核仁定位对chikv复制的重要性，检查了nols突变在全长chikv感染性克隆来源的病毒的情形下的效应。含有衣壳蛋白质中的nols突变的chikv(chikv-nols)被提取并在绿猴肾细胞中繁殖。病毒的噬菌斑纯化和整个chikv基因组的sanger测序证实，在没有另外突变的情况下，nols突变在传代病毒中保持。使用衣壳特异性抗体的间接免疫荧光用于分析在chikv-wt和chikv-nols感染的绿猴肾细胞和蚊子(白纹伊蚊)来源的c6/36细胞中chikv衣壳蛋白质的亚细胞定位。结果显示，在chikv-wt感染的绿猴肾细胞中，衣壳蛋白质在感染后24小时在类似于核仁的亚核体中累积(图4a)。在chikv-nols感染的绿猴肾细胞中，这些斑点不存在。因此，在病毒的情况下，nols突变导致对感染的绿猴肾细胞中衣壳蛋白质亚核定位的类似破坏。因此，nols突变在病毒中是稳定的，从而导致对衣壳蛋白质亚核定位的表型破坏。有趣的是，在chikv-wt感染的c6/36细胞中，衣壳蛋白质不在亚核体中积累，而是在感染后24小时主要在细胞质中发现(图4b)。在chikv-nols感染的c6/36细胞中，还发现衣壳蛋白质在细胞质中占优势，类似于在chikv-wt感染的c6/36细胞中观察到的定位。因此，衣壳蛋白质的亚核定位不是昆虫细胞中chikv感染的特征，并且nols的突变对感染的c6/36细胞中的衣壳蛋白质的亚细胞定位没有影响。为了检查chikv-wt和chikv-nols在哺乳动物(bhk-21)细胞和蚊子(c6/36)细胞中的复制动力学，将细胞以0.1pfu/细胞的感染复数(moi)感染并分析多步生长动力学。在bhk-21细胞(图4c)和c6/36细胞(图4d)两者中，chikv-nols生长为滴度显著低于chikv-wt。此外，chikv-nols在bhk-21细胞中具有小的噬菌斑表型(图4e)，表明病毒从感染的初始位点扩散的能力降低并因此衰减。实施例6-chikv突变衣壳蛋白质——对疾病和病毒血症的影响在突变体capsid-101/95感染的小鼠中研究血清和踝关节中的病毒滴度，以及chikv疾病的炎性介质的表达。结果显示在图5(a)到图5(c)和图6(a)和6(b)中。与capsid-wt感染的小鼠相比，在capsid-101/95感染的小鼠中血清和踝关节中的病毒滴度和chikv疾病的炎性介质的表达显著降低。在感染后第3天，通过qrt-pcr分析踝关节中chikv疾病的炎性介质的表达。相较于capsid-wt(标记为“chikv-wt”)感染小鼠，单核细胞趋化蛋白质-1(mcp-1)、干扰素γ(ifnγ)和肿瘤坏死因子α(tnfα)在capsid-101/95(标记为“chikv-nols”)感染小鼠的踝关节中显著地低表达(参见图5(b))。这些可溶性免疫介质是chikv感染的小鼠的疾病进展和严重程度的关键标志物。这些介质的低表达可能与capsid-101/95(chikv-nols)感染的小鼠中缺乏疾病病征有关。血液和关节组织中的感染性病毒的量与chikv感染的小鼠中的疾病严重程度密切相关。在感染后第3天，与capsid-wt(标记为“chikv-wt”)感染的小鼠相比，capsid-101/95(chikv-nols)感染小鼠的血清和踝组织中的活病毒量显著减少(参见图5(a))。降低的capsid-101/95(chikv-nols)滴度也可能与capsid-101/95(chikv-nols)感染的小鼠的疾病严重程度降低有关。如图6(a)和图6(b)所示，capsid-101/95(chikv-nols)感染的小鼠未显示急性chikv疾病的病征。capsid-101/95(chikv-nols)感染的小鼠没有发展出足跖肿胀。结果表明，capsid-101/95(chikv-nols)在小鼠中高度减毒。由于低反应原性，所以capsid-101/95(chikv-nols)是减毒活疫苗的合适候选者。实施例7-用chikv衣壳蛋白质免疫的小鼠显示保护性免疫如图7(a)到图7(c)所示，当用capsid-wt(标记为“chikv-wt”)激发时，capsid-101/95(chikv-nols)免疫小鼠受保护而免受chikv疾病的影响。用capsid-101/95(chikv-nols)免疫的小鼠在免疫后第30天用capsid-wt激发时没有显示足跖肿胀病征(参见图7(c))并且从激发后第1天到第3天没有发展出可检测的病毒血症(参见图7(b))。用chikv-nols免疫保护小鼠免受chikv激发长达30天，表明capsid-101/95(chikv-nols)在一次剂量后具有免疫原性并且免疫力是长期的。实施例8-来自chikv衣壳蛋白质感染的小鼠的血清中和传染性chikv如图8(a)和图8(b)所示，来自用chikv预温育的capsid-101/95(chikv-nols)感染小鼠的血清能够在体外中和感染性chikv。由capsid-101/95(chikv-nols)感染诱导的抗体在体外有效中和chikv。实施例9-chikv衣壳蛋白质免疫减少罗斯河病毒激发的小鼠的高峰病毒血症如图9所示，capsid-101/95(chikv-nols)免疫减少了罗斯河病毒(rrv)激发的小鼠的高峰病毒血症。在用相关甲病毒rrv激发后，capsid-101/95(chikv-nols)免疫小鼠在激发后第1天和第2天显显示显著减少的高峰(第2天)和早期病毒血症。通过减少病毒血症，疾病预后指标capsid-101/95(chikv-nols)有可能提供针对由其他致关节炎甲病毒如rrv、bfv、sfv、mayv和/或onnv引起的疾病的交叉保护。实施例10-chikv衣壳蛋白质免疫减少罗斯河病毒激发的小鼠的高峰病毒血症为了确定突变体chikv衣壳蛋白质capsid-101(标记为“101”)和capsid-101/95(标记为“101/95”)是否以与野生型capsid-wt(标记为“cprotwt”)相似的水平表达，将每种突变体转染到绿猴肾细胞中，并使用gfp特异性抗体和上样对照、肌动蛋白抗体通过蛋白质印迹分析来测定细胞裂解物。结果显示capsid-101(标记为“101”)和capsid-101/95(标记为“101/95”)的表达水平与野生型衣壳蛋白质capsid-wt的水平相似。实施例11-sfv衣壳蛋白质nolssfv衣壳蛋白质是目前已知定位于核仁的唯一其他甲病毒衣壳蛋白质[favred1,studere,michelmr.archvirol.1994；137(1-2):149-55.twonucleolartargetingsignalspresentinthen-terminalpartofsemlikiforestviruscapsidprotein(塞姆利基森林病毒衣壳蛋白质的n末端部分中存在的两种核仁靶向信号)]。先前已在sfv衣壳蛋白质的n末端部分中鉴定出了两种核仁靶向信号。图11显示了chikv野生型衣壳蛋白质与sfv野生型衣壳蛋白质的蛋白质序列比对，其中被发现对核仁转运很重要的氨基酸以下划线显示。基于chikv和sfv序列的相似性，可以开发出不定位在核仁内的突变sfv衣壳蛋白质——也就是说，可以开发出与突变chikv衣壳蛋白质capsid-101和capsid-101/95相似的sfv突变衣壳蛋白质。sfv的nols突变，衣壳蛋白质会减弱其复制并随后充当sfv疫苗，并提供针对其他甲病毒的交叉保护。实施例12-甲病毒抗体和嵌合甲病毒的交叉反应性越来越多的证据表明甲病毒抗体的交叉反应性在体外和体内都具有广泛的中和效应。包含突变的chikv衣壳蛋白质的减毒活疫苗可能提供针对其他关节炎甲病毒如rrv、bfv、sfv、onnv和mayv的交叉保护，相较于其他类型的甲病毒，这些其他关节炎甲病毒共享与chikv更大程度的结构和遗传同源性。它不太可能有效对抗脑炎甲病毒，诸如东部马脑炎病毒(eeev)和委内瑞拉马脑炎病毒(veev)，它们是更远亲相关的。为此，可以构建嵌合甲病毒(诸如由roycj,adamsap,wange,lealg,seymourrl,sivasubramanisk,megaw,frolovi,didierpj,weaversc.vaccine.2013.achimericsindbis-basedvaccineprotectscynomolgusmacaquesagainstalethalaerosolchallengeofeasternequineencephalitisvirus(基于辛德毕斯的嵌合疫苗保护食蟹猴免受东部马脑炎病毒的致命气溶胶激发)所教导的)，所述嵌合甲病毒含有脑炎甲病毒的全部或部分的结构多聚蛋白质或非结构多聚蛋白质，以及例如chikv的nols突变衣壳蛋白质。关于这一点，必须记住，甲病毒的整个结构多聚蛋白质可以从一种甲病毒交换到另一种形成嵌合病毒。含有具有nols突变的chikv衣壳的嵌合甲病毒可以针对所需的甲病毒提供更好的疫苗保护、更高的免疫原性和/或中和作用，不仅对于致关节炎甲病毒而且对于脑炎甲病毒也是如此(具有相似的减毒水平)。实施例13--抗体亚型的鉴定可以测量用突变chikv衣壳蛋白质(或其他甲病毒衣壳蛋白质)接种疫苗后受试者的体液应答和细胞应答。可以获得抗体应答的全局视图(即，鉴定不同的抗体亚型)。减毒重组活疫苗可能将诱导强烈的抗体应答，其中一些抗体亚型主导应答。鉴定与强中和作用相关的这些抗体亚型可能具有诊断价值。例如，在感染chikv的未接种疫苗的受试者中不存在chikv特异性抗体亚型可以作为具有增加的可发展为慢性疾病的严重疾病的风险的受试者的特异性标记物。此外，任何被鉴定为中和的抗体亚型可以施用于患有高病毒血症的受试者。疫苗还可以影响细胞应答和t细胞应答，所述细胞应答和t细胞应答也可以被测量。实施例14-基于病毒rna的合成和病毒基因拷贝数对哺乳动物细胞和昆虫细胞中的chikvnol减毒为了进一步研究chikv-nols在哺乳动物细胞和昆虫细胞中的减毒作用，对培养上清液中的病毒基因组拷贝数和感染细胞中的病毒rna拷贝数进行互补rt-qpcr分析。结果表明，在bhk-21(图12a)细胞和c6/36(图12b)细胞中病毒rna的合成保持不受nols突变的干扰。此外，在感染后12小时，感染的bhk-21(图12a)细胞和c6/36(图12b)细胞中chikv-nolsrna的拷贝数显著超过chikv-wt感染细胞中的拷贝数。差异可能是由于chikv-nols感染细胞的存活增加，从而允许病毒rna的延长或更有效的合成，和/或由于病毒复制酶与用于结合病毒基因组rna的衣壳蛋白质之间的竞争减少。然而，在bhk-21(图12c)细胞和c6/36(图12d)细胞中培养上清液中chikv-nols的基因组拷贝数在感染后直到12小时未显示任何增加，从而表明没有病毒释放或释放了非常少的病毒。该结果与从培养上清液中回收的感染性chikv-nols的延迟释放和降低的滴度相关(图4c和图4d)。相反，对于chikv-wt感染的细胞，病毒滴度在感染后8h开始增加。结果表明，虽然感染细胞中病毒rna的合成没有减少，但衣壳蛋白质nols的突变导致感染性病毒颗粒形成的缺陷，从而导致病毒后代的释放减少和延迟。总之，这些数据表明chikv衣壳蛋白质的亚核定位不是不同宿主细胞感染的标志，并且chikv-nols在哺乳动物细胞和昆虫细胞中的减毒可能是由于nols突变造成的感染性病毒颗粒形成缺陷导致的。实施例15-p5chikv-nols的多步生长动力学将chikv-nols疫苗候选物在绿猴肾细胞中传代以评估表型稳定性。使t-75烧瓶生长到90-95％融汇，并用chikv-nols或chikv-wt以0.1pfu/细胞的感染复数(moi)感染。在37℃温育24h后，用培养基以0.1的moi感染另一烧瓶绿猴肾细胞。在5次连续传代后，将p5chikv-nols的生长动力学与第0代(p0)的chikv-wt和chikv-nols进行比较。以0.1pfu/细胞的感染复数(moi)感染c636昆虫细胞。在37℃下吸附病毒1h后，洗涤细胞单层并加入新鲜的生长培养基。在指定的时间点收集上清液，并通过噬菌斑测定法定量感染性病毒。如图13所示，p5chikv-nols显示与p0chikv-nols类似的多步复制动力学。p0chikv-nols和p5chikv-nols在感染后24小时和48小时显显示显著降低的感染滴度。这表明在绿猴肾细胞中传代5代后，与chikv-wt相比，昆虫细胞中的chikv-nols的复制仍然显著受损。在绿猴肾细胞中传代5代后，chikv-nols的减毒复制表型保持稳定。实施例16-细胞培养传代后的chikvnols稳定性——噬菌斑大小将chikv-nols疫苗候选物在绿猴肾细胞中传代以评估表型稳定性。使t-75烧瓶生长到90-95％融汇，并用chikv-nols或chikv-wt以0.1pfu/细胞的感染复数(moi)感染。在37℃温育24h后，用培养基以0.1的moi感染另一烧瓶绿猴肾细胞。在10代连续传代后，测量绿猴肾噬菌斑大小并进行比较以评估稳定性。结果显示于图14中。chikv-nols在哺乳动物细胞中具有小的噬菌斑表型，表明病毒从感染的初始位点扩散的能力降低并因此衰减。为了评估其表型稳定性，使用0.1pfu/细胞的感染复数，将chikv-nols在37℃下在绿猴肾细胞中传代10次。经过10代传代后，chikv-nols的平均噬菌斑大小保持明显小于chikv-wt。chikv-nols还表现出比chikv-wt更均匀的噬菌斑形态。结果显示，在10代传代后，chikv-nols不会恢复到chikv-wt噬菌斑表型，并且表明chikv-nols疫苗候选物的从感染的初始位点扩散的能力仍然被减弱。实施例17-过滤对chikvnols的影响该实施例表明，可以大量生产可存活的减毒活疫苗候选物，过滤后几乎没有疫苗产量损失。为了检查病毒繁殖过滤期间chikv-nols产量的损失，测量0.22μm过滤之前和之后chikv-nols滴度。结果显示于图15中。过滤前后的平均chikv-nols滴度：未过滤-1.57×106pfu/ml；pvdf(亲水性pvdf膜，0.22μm孔径)-1.09×106pfu/ml；和pes(亲水性聚醚砜膜，0.22μm孔径)-1.19×106pfu/ml。实施例18-在长期储存期间温度对chikvnols的影响该实施例表明，可存活的减毒活疫苗候选物可以在-20℃或-80℃下长期储存。虽然能够在-80℃稳定储存，但在-20℃或4℃储存chikv-nols可降低储存chikv-nols的成本。在-20℃(常规冷冻室的温度)储存也会增加chikv-nols对更广泛人群的可及性。温度(21℃、4℃、-20℃和-80℃)对长期chikv-nols储存的影响显示于图16(a)中，并且温度(21℃、4℃、-20℃和-80℃)对长期chikv-wt储存的影响显示于图16(b)中。当在室温21℃储存时，28天后未检测到感染性chikv-nols或chikv-wt。在4℃56天后，chikv-nols的滴度降到110pfu/ml，并且chikv-wt的滴度降到450pfu/ml。当在-20℃或-80℃下储存时，chikv-nols和chikv-wt的滴度在56天后保持稳定。以上实施例展示了以下内容：使chikv衣壳蛋白质的nols突变减弱了chikv体外复制。capsid-101/95(chikv-nols)感染的小鼠未显示疾病病征、病毒血症减少并且炎症介质表达减少，从而使得capsid-101/95(chikv-nols)成为理想的减毒活疫苗候选物。当用chikv野生型衣壳蛋白质激发时，capsid-101/95(chikv-nols)免疫小鼠被保护而免受疾病。capsid-101/95(chikv-nols)免疫小鼠产生chikv特异性中和抗体。capsid-101/95(chikv-nols)可能提供甲病毒交叉保护，包括罗斯河病毒激发后的病毒血症。可以大量生产可存活的减毒活疫苗候选物，过滤后几乎没有疫苗产量损失。可存活的减毒活疫苗候选物可以在-20℃或-80℃长期储存。根据法规，已经用或多或少特定于结构或方法特征的语言描述了本发明。应理解，本发明不限于所示或所述的具体特征，因为本文所述的手段包括使本发明生效的优选形式。因此，本发明是在所附权利要求(如果有的话)的适当范围内以本领域技术人员适当解释的任何形式或修改要求保护的。序列表<110>格里菲斯大学<120>针对致关节炎甲病毒的疫苗<130>160758pc/gs<160>24<170>patentinversion3.5<210>1<211>261<212>prt<213>基孔肯雅病毒<400>1metglupheileprothrglnthrphetyrasnargargtyrglnpro151015argprotrpthrproargprothrileglnvalileargproargpro202530argproglnargglnalaglyglnleualaglnleuileseralaval354045asnlysleuthrmetargalavalproglnglnlysproargargasn505560arglysasnlyslysglnlysglnlysglnglnalaproglnasnasn65707580thrasnglnlyslysglnproprolyslyslysproalaglnlyslys859095lyslysproglyargarggluargmetcysmetlysilegluasnasp100105110cysilephegluvallyshisgluglylysvalthrglytyralacys115120125leuvalglyasplysvalmetlysproalahisvallysglythrile130135140aspasnalaaspleualalysleualaphelysargserserlystyr145150155160aspleuglucysalaglnileprovalhismetlysseraspalaser165170175lysphethrhisglulysprogluglytyrtyrasntrphishisgly180185190alavalglntyrserglyglyargphethrileprothrglyalagly195200205lysproglyaspserglyargproilepheaspasnlysglyargval210215220valalailevalleuglyglyalaasngluglyalaargthralaleu225230235240servalvalthrtrpasnlysaspilevalthrlysilethrproglu245250255glyalagluglutrp260<210>2<211>267<212>prt<213>塞姆利基森林病毒<400>2metasntyrileprothrglnthrphetyrglyargargtrpargpro151015argproalaalaargprotrpproleuglnalathrprovalalapro202530valvalproasppheglnalaglnglnmetglnglnleuileserala354045valasnalaleuthrmetargglnasnalailealaproalaargpro505560prolysprolyslyslyslysthrthrlysprolysprolysthrgln65707580prolyslysileasnglylysthrglnglnglnlyslyslysasplys859095glnalaasplyslyslyslyslysproglylysarggluargmetcys100105110metlysilegluasnaspcysilephegluvallyshisgluglylys115120125valthrglytyralacysleuvalglyasplysvalmetlysproala130135140hisvallysglyvalileaspasnalaaspleualalysleualaphe145150155160lyslysserserlystyraspleuglucysalaglnileprovalhis165170175me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