本发明涉及重组细胞、及异戊二烯或萜的生产方法,更具体而言,本发明涉及能够生产异戊二烯或萜的作为古生菌的重组细胞,以及将该重组细胞用于生产异戊二烯或萜的方法。
背景技术:
近年来,正在进行着使用微生物来由废弃物等的燃烧气体即合成气(co、co2、h2的混合气体)制造石化替代化学品的技术开发。其中,构建作为轮胎原料的异戊二烯的石化替代工艺是相当重要的,并且已经研究了使用属于梭菌(clostridium)属的重组合成气体利用性细菌的异戊二烯和萜的生产技术(例如专利文献1~3)。然而,在现有技术中,尽管在强力的组成型表达启动子下表达外源靶合成基因,但由于受到宿主细胞的负控制,故仅能获得低生产性。
另一方面,过去也尝试过通过野生型枯草菌、重组大肠杆菌、重组酵母等来生产异戊二烯或萜,然而它们仍然是昂贵的并且目前难以投入实际使用。此外,异戊二烯和萜的合成代谢在大多数生物体中受到严谨控制,并且没有例子证明重组微生物生产的异戊二烯和萜已经达到了与商业化相称的水平。在专利文献1和3中,已经证明了使用组成型表达系统的异戊二烯生产,但其生产率极低,与野生型相比相差数倍。
通过导入了异源甲羟戊酸途径基因和异戊二烯合成酶基因的重组大肠杆菌,由葡萄糖大量地生产异戊二烯(收率:60g/l)也已经被证实(非专利文献1)。在该技术中,基于iptg的诱导促进了由葡萄糖生产异戊二烯。然而,使用葡萄糖作为原料的工艺中,存在限制原料供给这样的缺点。此外,就使用诱导型表达系统的物质生产而言,其碳转化率低(15%以下),并且是分批式工艺而不是持续式工艺,因此在商业上不适于生产异戊二烯。
此外,报道了,当通过作为甲基营养菌(methylotroph)的methonobacteriumextroquence,组成型地表达包含异源甲羟戊酸途径基因和α-葎草萜(c15环状萜)合成酶基因的操纵子基因时,由于本途径基因表达引起的毒性而不能获得转化体,并且仅能通过具有严谨控制活性的诱导型表达法来有效地生产α-葎草萜(非专利文献2)。
如上所述,尽管已经对通过微生物来生产异戊二烯和萜进行了大量研究,但是达到了实际应用水平的生产性的情况很少,因而需要建立更有效的微生物工艺。
现有技术文献
专利文献
[专利文献1]国际公开第2013/180584号
[专利文献2]国际公开第2013/181647号
[专利文献3]国际公开第2014/065271号
非专利文献
[非专利文献1]whitedgmetal.,industrialbiotechnology2010,6(3),152-163
[非专利文献2]sonntagf.etal.,metabolicengineering2015,32,82-94
技术实现要素:
发明所解决的技术问题
另一方面,仍没有关于使用天然古生菌、古生菌突变体、古生菌重组体等古生菌生产异戊二烯或萜的技术的具体报道。因此,本发明提供了一种能够从合成气、甲醇、甲烷等丰富且廉价的原料出发来有效地生产异戊二烯或萜的重组古细胞、以及使用了该重组古生菌的异戊二烯或萜的生产方法。
解决技术问题的技术手段
本发明的一个方案为一种重组细胞,其是厌氧性古生菌的重组细胞,所述重组细胞具有下述基因作为所述第一外源基因:编码异戊二烯合成酶的基因、编码单萜合成酶的基因、编码倍半萜合成酶的基因、编码双萜合成酶的基因、编码角鲨烯合成酶的基因、或编码八氢番茄红素合成酶的基因,该第一外源基因表达,所述重组细胞能够生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。
重组细胞优选其能够以选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种作为唯一碳源进行生长。
重组细胞优选具有一氧化碳脱氢酶。
重组细胞优选具有由甲基四氢蝶呤、一氧化碳以及coa来合成乙酰coa的功能。
重组细胞优选具有甲烷生成能力。
重组细胞优选能够将二氧化碳作为唯一碳源,将氢作为能源进行生长。
重组细胞优选能够将甲醇作为唯一碳源进行生长。
重组细胞优选能够将甲烷作为唯一碳源进行生长。
重组细胞优选属于甲烷八叠球菌(methanosarcina)属、甲烷球菌(methanococcus)属、产甲烷热球菌(methanothermococcus)属、甲烷热杆菌(methanothermobacter)属、甲烷丝菌(methanothrix)属、热球菌(thermococcus)属、热丝菌(thermofilum)属、或古生球菌(archaeoglobus)属。
重组细胞优选属于甲烷八叠球菌(methanosarcina)属、甲烷球菌(methanococcus)属、或产甲烷热球菌(methanothermococcus)属。
重组细胞优选为巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)、梅氏甲烷八叠球菌(methanosarcinamazei)、噬乙酸甲烷八叠球菌(methanosarcinaacetivorans)、沃氏甲烷球菌(methanococcusvoltae)、万氏甲烷球菌(methanococcusvannielii)、海沼甲烷球菌(methanococcusmaripaludis)或methanothermococcus(methanococcus)thermolithotrophicus。
重组细胞优选还含有编码一氧化碳脱氢酶的基因作为第二外源基因。
重组细胞,其优选所述第一外源基因是编码异戊二烯合成酶的基因,所述重组细胞能够生产异戊二烯,所述异戊二烯合成酶源于植物。
重组细胞,中优选所述异戊二烯合成酶是下述(a-1)、(a-2)或(a-3)的蛋白质:
(a-1)是包含序列编号1所示的氨基酸序列的蛋白质;
(a-2)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列通过在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1~20个氨基酸而形成;
(a-3)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列与序列编号1所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性。
重组细胞优选还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第三外源基因。
重组细胞,其优选,所述第一外源基因是编码倍半萜合成酶的基因,所述重组细胞能够生产碳原子数为15的萜,所述倍半萜合成酶是法呢烯合成酶。
重组细胞,其优选所述第一外源基因是编码倍半萜合成酶的基因,所述重组细胞能够生产碳原子数为15的萜,所述倍半萜合成酶是环状倍半萜合成酶。
重组细胞,其优选所述法呢烯合成酶是下述(d-1)、(d-2)或(d-3)的蛋白质:
(d-1)是包含序列编号4所示的氨基酸序列的蛋白质;
(d-2)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列通过在序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1~20个氨基酸而形成;
(d-3)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列与序列编号4所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性。
重组细胞优选还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第四外源基因。
重组细胞优选还含有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因和编码法呢基二磷酸合成酶的基因中的至少一种基因作为第五外源基因。
重组细胞,其优选所述第一外源基因是编码单萜合成酶的基因,
所述重组细胞能够生产碳原子数为10的萜,所述单萜合成酶是环状单萜合成酶。
重组细胞优选还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第六外源基因。
重组细胞优选还含有编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因作为第七外源基因。
重组细胞优选还含有编码橙花基二磷酸合成酶的基因作为第八外源基因。
重组细胞,其优选所述环状单萜合成酶是水芹烯合成酶。
重组细胞,其优选所述水芹烯合成酶是下述(b-1)、(b-2)或(b-3)的蛋白质:
(b-1)是包含序列编号2所示的氨基酸序列的蛋白质;
(b-2)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列通过在序列编号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1~20个氨基酸而形成;
(b-3)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列与序列编号2所示的氨基酸序列具有90%以上的同源。
重组细胞,其优选所述水芹烯合成酶是下述(c-1)、(c-2)或(c-3)的蛋白质:
(c-1)是包含序列编号3所示的氨基酸序列的蛋白质;
(c-2)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列通过在序列编号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1~20个氨基酸而形成;
(c-3)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列与由序列编号3所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性。
重组细胞,其优选所述第一外源基因是编码双萜合成酶的基因,所述重组细胞能够生产碳原子数为20的萜,所述双萜合成酶是环状双萜合成酶。
重组细胞优选还含有编码柯巴基二磷酸合成酶的基因作为第九外源基因。
重组细胞优选还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第十外源基因。
重组细胞优选还具有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因、编码法呢基二磷酸合成酶的基因以及编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶的基因中的至少一种基因作为第十一外源基因。
重组细胞,其优选所述第一外源基因是编码角鲨烯合成酶的基因,所述重组细胞能够生产碳原子数为30的萜,所述重组细胞还含有编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第十二外源基因。
重组细胞优选还含有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因及编码法呢基二磷酸合成酶的基因中的至少一种基因作为第十三外源基因。
重组细胞,其优选,所述第一外源基因是编码八氢番茄红素合成酶的基因,所述重组细胞能够生产碳原子数为40的萜,所述重组细胞还包含编码异戊烯基二磷酸异构酶的基因作为第十四外源基因。
重组细胞优选还含有选自编码牻牛儿基二磷酸合成酶的基因、编码法呢基二磷酸合成酶的基因及牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶中的至少一种基因作为第十五外源基因。
重组细胞优选具有选自乙酰乙酰coa硫解酶、hmg-coa合成酶、hmg-coa还原酶、甲羟戊酸-5-激酶、5-磷酸甲羟戊酸脱羧酶及异戊烯磷酸激酶中的至少一种基因作为第十六外源基因。
重组细胞,其优选所述第一外源基因在组成型表达启动子下进行了表达。
本发明的另一方案为一种异戊二烯或萜的生产方法,其包括:使权利要求1~37中任一项所述的重组细胞与选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇及乙酸中的至少一种碳源接触,在所述重组细胞中由所述碳源生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。
所述方法,其优选用选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇及乙酸中的至少一种碳源来培养所述重组细胞,并且从该培养物中取得异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。
所述方法,其优选生长稳定期的培养液的细胞浓度为1g干细胞/l以上,持续地进行培养基的供应和培养液的排出。
所述方法,其优选在培养槽中培养所述重组细胞,并且将包含一氧化碳、二氧化碳及氢气的混合气体供给至所述培养槽。
所述方法,其优选所述混合气体的一氧化碳浓度为20%以上。
所述方法,其优选所述混合气体的二氧化碳浓度为5%以上。
所述方法,其优选所述混合气体的硫化氢浓度为10ppm以下。
所述方法,其优选进一步向培养液中添加甲醇和/或乙酸。
发明的效果
根据本发明,可以高效地进行使用了重组细胞的异戊二烯或萜的生产。
附图说明
图1是表示古生菌中的甲羟戊酸途径和膜脂质合成途径的说明图。
图2是表示由甲羟戊酸合成异戊烯基二磷酸酯的途径的多样性的说明图。
图3是表示甲烷生成古生菌噬乙酸甲烷八叠球菌(methanosarcinaacetivorans)的一氧化碳和乙酸利用代谢途径的说明图。
图4是表示古生菌中甲醇和甲烷利用途径的说明图。
图5是表示用于生产异戊二烯的穿梭载体pac:pmcr-idi-isps的构成的说明图。
图6是表示用于生产法呢烯的穿梭载体pac:pmcr-idi-fns的构成的说明图。
图7是表示用于生产法呢烯的穿梭载体pac:pmcr-idi-fns-fps的构成的说明图。
图8是表示用于生产异戊二烯的穿梭载体pac:pmcr-mva1-idi-isps的构成的说明图。
具体实施方式
在下文中,对本发明的实施例进行说明。需要说明的是,在本发明中,术语“基因”可以全部用术语“核酸”或“dna”来代替。
本发明的重组细胞属于厌氧性古生菌。通常,古生菌的膜脂质是包含异戊二烯骨架的烃(碳原子数为20~40)醚键合到甘油骨架上而得到的醚型极性脂质。如图1所示,就该古生菌特有的膜脂质而言,由作为c20的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyldiphosphate(ggpp))及甘油-1-磷酸(sn-glycerol1-phosphate)生成牻牛儿基牻牛儿基甘油磷酸酯(3-o-geranylgeranylsn-glycerol-1-phosphate(gggp)),然后通过两步反应合成上述膜脂质。如图1所示,牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(碳原子数20)是经过通过古生菌具有的内源性甲羟戊酸途径提供的异戊烯基二磷酸(isopentenyldiphosphate(ipp),碳原子数5)、牻牛儿基二磷酸(geranyldiphosphate(gpp),碳原子数10)、以及法呢基二磷酸(farnesyldiphosphate(fpp),碳原子数15)而合成的。因此,与其他生物不同,在古生菌中,总是通过甲羟戊酸途径提供大量的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸以用于随生长进行的膜脂质合成。本发明利用上述古生菌特有的主要代谢,通过重组细胞有效地生产异戊二烯或碳原子数为10~40的萜。
厌氧性古生菌是指,在几乎不存在分子氧(100ppm以下)的条件下可以生长的古生菌。本发明中的厌氧性古生菌包含绝对厌氧性和兼性厌氧性古生菌这两者。
在本发明中,具有异戊二烯合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞可以生产异戊二烯。此外,具有单萜合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞能够生产单萜(碳原子数为10的萜)。此外,具有倍半萜合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞能够生产倍半萜(碳原子数为15的萜)。此外,具有双萜合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞能够生产双萜(碳原子数为20的萜)。此外,具有角鲨烯合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞能够生产三萜(碳原子数为30的萜)。此外,具有八氢番茄红素合成酶基因作为第一外源基因的重组细胞可以生产四萜(碳原子数为40的萜)。各酶和基因将在下面依次说明。
<异戊二烯合成酶>
异戊二烯合成酶(异戊二烯合成酶、isoprenesynthase、isps)具有将作为异戊烯基二磷酸(ipp)异构体的二甲基烯丙基二磷酸(dmapp)转化为异戊二烯的作用。需要说明的是,异戊烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸之间的结构转化由异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyldiphosphateisomerase(idi))进行催化。异戊烯基二磷酸异构酶存在于所有生物体中。
用于本发明的异戊二烯合成酶(isps)没有特别限制,例如可以使用源于植物等真核生物的异戊二烯合成酶。作为源于植物的异戊二烯合成酶,通常可举出源于黑杨(populusnigra)、黧豆、野葛的异戊二烯合成酶,但不限于这些。作为异戊二烯合成酶的具体实例,可举出q50l36、q6ej97、q9ar86、q7xas7、a0pfk2、a0a0m4uqh9、a0a0m5msl0(以上为uniprotkbentry)等。
序列编号1表示编码源于黑杨的异戊二烯合成酶(genbankaccessionno.:am410988.1)的核酸(dna)的核苷酸序列和相应的氨基酸序列、序列编号2仅表示氨基酸序列。
关于本发明中使用的异戊二烯合成酶,除了在自然界中发现并且分离的异戊二烯合成酶之外,还可以是其改性体。例如,可以是现有的异戊二烯合成酶的部分片段;或是其氨基酸取代突变体并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质。
例如,本发明中使用的异戊二烯合成酶中至少包含下述(a-1)、(a-2)或(a-3)的蛋白质:
(a-1)是包含序列编号1所示的氨基酸序列的蛋白质;
(a-2)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列通过在序列编号1所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1~20个氨基酸而形成;
(a-3)是包含下述氨基酸序列并且具有异戊二烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列与序列编号1所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性。
需要说明的是,(a-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92%以上,进一步优选为95%以上,特别优选为98%以上。
在优选的实施方案中,除异戊二烯合成酶基因外,还具有编码异戊烯基二磷酸异构酶(idi)的基因作为外源基因。通过导入idi基因,增强了从ipp向dmapp的转化,并且可以增强异戊二烯合成能力。本发明中使用的idi没有特别限制,其实例可举出p61615、q13907、q46822、p50740、q8tt35、p15496、q10132、q9kwg2(以上为uniprotkbentry)等。此外,在本发明中,可以使用源于古生菌的idi,优选使用例如源于甲烷八叠球菌(methanosarcina)属菌的q8tt35、q8pw37、q46cl4、a0a0e3lm81、a0a0e3qqi3(以上为uniprotkbentry)等。
<单萜合成酶>
单萜是碳原子数为10的萜,其包含两个异戊二烯单元。单萜有非环状和环状。非环状单萜包含牻牛儿醇、桂叶烯、柠檬醛、芳樟醇、橙花醇等。环状单萜包含柠檬烯、α-水芹烯、β-水芹烯、薄荷醇、百里酚、α-蒎烯、β-蒎烯、蒈烯、香芹酮、桉油醇、樟脑等。
单萜合成酶是将牻牛儿基二磷酸(gpp)或橙花基二磷酸(neryldiphosphate(npp))转化为单萜的酶的总称。作为单萜的合成途径,可举出:通过gpp合成酶(gppsynthase(gpps))或npp合成酶(nppsynthase(npps))的作用,由异戊烯基二磷酸(ipp)合成gpp或npp。随后,通过单萜合成酶的作用,由gpp或npp合成单萜。
在优选的实施方案中,单萜合成酶是环状单萜合成酶。更优选的是,环状单萜合成酶是水芹烯合成酶,具体而言,是α-水芹烯合成酶或β-水芹烯合成酶。
作为α-水芹烯合成酶,可以使用任何酶,只要其具有由作为底物的gpp或npp生成α-水芹烯的活性即可。α-水芹烯合成酶的实例包含g5cv35、e5gag2(以上为uniprotkbentry)、gn65-37361(solcycgeneid)等,但不限定于这些。
作为β-水芹烯合成酶,可以使用任何酶,只要其具有由作为底物的gpp或npp生成β-水芹烯的活性即可。β-水芹烯合成酶的实例包含q9m7d1、c1k5m3、q1xbu4、r9qmw3、r9qmr4、r9qmw7、e9n3u9、c0pth8、f2xfa5、f2xfa1、f2xfa4、a0a0b0p314(以上为uniprotkbentry)等,但不限定于这些。
至于本发明中使用的单萜合成酶,除了在自然界中发现且分离的单萜合成酶外,还可以使用它们的修饰体。例如,可以是现有单萜合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体,并且具有单萜合成酶活性的蛋白质。
例如,本发明中使用的水芹烯合成酶(单萜合成酶的一个实例)至少包含下述(b-1)~(b-3)的蛋白质。
(b-1)是包含序列编号2所示的氨基酸序列的蛋白质;
(b-2)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列通过在序列编号2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1~20个氨基酸而形成;
(b-3)是包含下述氨基酸序列并且具有α-水芹烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列与序列编号2所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性。
需要说明的是,(b-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92%以上,进一步优选为95%以上,特别优选为98%以上。
此外,本发明中使用的水芹烯合成酶(单萜合成酶的一个实例)至少包含下述(c-1)~(c-3)的蛋白质。
(c-1)是包含序列编号3所示的氨基酸序列的蛋白质;
(c-2)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列通过在序列编号3所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1~20个氨基酸而形成;
(c-3)是包含下述氨基酸序列并且具有β-水芹烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列与序列编号3所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性。
需要说明的是,(c-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92%以上,进一步优选为95%以上,特别优选为98%以上。
在优选的实施方案中,除了单萜合成酶基因外,还具有编码异戊烯基二磷酸异构酶(idi)作为外源基因的基因。通过导入idi基因,可以增强从由ipp向dmapp的转化,并且增强gpp合成能力或npp合成能力。其结果,可以增强单萜合成能力。
在优选的实施方案中,除了单萜合成酶基因等外,还具有编码gpp合成酶(gpps)或npp合成酶(npps)基因作为外源基因的基因。通过导入这些基因,可以增强由gpp或npp合成单萜的能力。gpps的实例包含s4s927、s4s8d9、d8lhy4、h6vlf6、h6vlf3、d8rv97、q6v4k1、q8lkj3、q8lkj2、q8lkj1、q9fsw8、h6vlf7、v5reb1、q58ge8(以上为uniprotkbentry)。npps的实例包含源于番茄的ndps1(schilmilleraletal.,pnas2009,106(26),10865-10870)等。需要说明的是,在gpps的情况下,可以使用源于古生菌的gpps,特别优选使用例如源于甲烷八叠球菌(methanosarcina)属菌的msbrm_0487、ma_0606、mm_1767、msbrw_3310、mbar_a1417(keggentry)等。
<倍半萜合成酶>
倍半萜是碳原子数为15的萜,其由三个异戊二烯单元组成。倍半萜有非环状、单环状、双环状、以及三环状的。非环状倍半萜包含法呢烯、法呢醇等。单环状倍半萜包含姜烯(zingiberene)、蛇麻烯(humulene)、脱落酸等。双环状倍半萜包含石竹烯(caryophyllene)、桉叶烷(eudesman)、eremophilan、缬草萜类(valeran)、杜松烷(cadinan)、杜松烯(cadinene)、guajan、driman、雪松醇(cedrol)、诺卡酮(nootkatone)等。三环状倍半萜包含illudan、prezizaan、marasman、cedran、thujopsan、hirsutan等。
倍半萜合成酶是将法呢基二磷酸(fpp)转化为倍半萜的酶的总称。作为倍半萜的合成路线,可举出:通过gpp合成酶的作用,由ipp合成gpp。随后,通过fpp合成酶的作用,由gpp合成fpp。接着,通过倍半萜合成酶的作用,由fpp合成倍半萜。
在优选的实施方案中,倍半萜合成酶是环状倍半萜合成酶。在另一优选的实施方案中,倍半萜合成酶是法呢烯合成酶。
作为法呢烯合成酶,可以使用具有由作为底物的法呢基二磷酸(fpp)生成法呢烯的活性的任何酶。法呢烯合成酶的实例包含:用于合成法呢烯的α体((3e,6e)-alpha-farnesene)的q84lb2,b9rxw0、b2ksj6、q84kl5(以上为uniprotkbentry)等;用于合成法呢烯的β体((e)-beta-farnesene)的q9fxy7、o48935、q2nm15、c7e5v9、c7e5v7、q94js8、c7e5w0、c7e5v8(以上为uniprotkbentry)等,但不限于此。
关于本发明中使用的倍半萜合成酶,除了天然发现和分离的倍半萜合成酶外,还可以使用其修饰体。例如,可以为是现有倍半萜合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体,并且具有倍半萜合成酶活性的蛋白质。
例如,本发明中使用的法呢烯合成酶(倍半合成酶的一个实例)至少包含下述(d-1)~(d-3)的蛋白质。
(d-1)是包含序列编号4所示的氨基酸序列的蛋白质;
(d-2)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列通过在序列编号4所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加1~20个氨基酸而形成;
(d-3)是包含下述氨基酸序列并且具有法呢烯合成酶活性的蛋白质,其中,所述氨基酸序列与序列编号4所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性。
需要说明的是,(d-3)中的氨基酸序列的同一性更优选为92%以上,进一步优选为95%以上,特别优选为98%以上。
在优选的实施方案中,除了倍半萜合成酶基因外,还具有编码idi作为外源基因的基因。通过导入idi基因,可以增强gpp合成能力。其结果,fpp合成能力增强,并且可以提高倍半萜合成能力。
在优选的实施方案中,除了倍半萜合成酶基因等之外,还具有编码gpp合成酶(gpps)的基因和/或fpp合成酶(fpps)基因作为外源基因。通过导入这些基因,增强了gpp和/或fpp的合成能力,其结果,可以提高倍半萜的合成能力。gpps的实例包含上述例举的那些。fpps的实例包含p08524、p09152、p49349、p14324、p05369、o014230(以上为uniprotkbentry)等。需要说明的是,可以使用源于古生菌的fpps,特别优选使用例如源于甲烷八叠球菌(methanosarcina)属菌的msbrm_0487、ma_0606、mm_1767、msbrw_3310、mbar_a1417(keggentry)等。对于gpps基因和fpps基因,可以导入任一种,也可以导入这两种。
<双萜合成酶>
双萜是碳原子数为20的萜,其包含四个异戊二烯单元。双萜有非环状、单环状、双环状、以及三环状的双萜。非环状双萜包含α-生育酚、视黄醇、植醇等。环状双萜包含枞烷(abietane)、松香酸(abieticacid)、新松香酸(neoabieticacid)、levomaricacid、杉皮酸(sapieticacid)、atisane、beyerane、赤霉素烷(gibbane)、赤霉酸(gibberellicacid)、贝壳杉烷(kaurane)、卡哈苡苷的非糖部分(steviol)、半日花烷(labdane)、picrasane、海松烷(pimarane)、罗汉松烷(podocarpane)、rosane、紫杉烷(taxane)、视黄醛,视黄酸,视黄醇等。
双萜合成酶是将牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(ggpp)转化为双萜的酶的总称。作为双萜的合成途径,可举出:通过gpp合成酶的作用,由ipp合成gpp。随后,通过fpp合成酶的作用,由gpp合成fpp。随后,通过ggpp合成酶(ggppsynthase(ggpps))的作用,由fpp合成ggpp。随后,通过双萜合成酶的作用,由ggpp合成双萜。
作为双萜合成酶,可以使用具有由ggpp生成双萜的活性的任何酶。双萜合成酶的实例包含q38710、p9wj61、g9man7、m4hy05、h8zm70、m1vdx3、a2pza5、q675l5、q0e088、p9wj60、q6z5j6、m4hyp3(uniprotkbentry)等,但不限于这些。
关于本发明中使用的双萜合成酶,除了天然发现和分离的双萜合成酶外,还可以使用其修饰体。例如,可以是现有双萜合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体,并且具有双萜合成酶活性的蛋白质。
在优选的实施方案中,除了双萜合成酶基因外,还具有编码idi的基因作为外源基因。通过导入idi基因,可以增强gpp合成能力。其结果,fpp合成能力和gpp合成能力增强,并且可以增强双萜合成能力。
在优选的实施方案中,除了双萜合成酶基因等外,还具有至少一种选自下述的基因作为外源基因:编码gpp合成酶(gpps)的基因、编码fpp合成酶(fpps)的基因、以及编码ggpp合成酶(ggpps)的基因。通过导入这些基因,gpp、fpp、或ggpp的合成能力增强,其结果,可以增强双萜合成能力。gpps和fpps的实例包含上述的那些。ggpps的实例,可以列举出:q12051、q84j75、p34802、p80042、q94id7、q9slg2、q9c446、q54bk1、q9lue1、q92236、q39108、o95749、q12051、q9p885、p24322(uniprotkbentry)等。需要说明的是,可以使用源于古生菌的ggpps,特别优选使用例如源于甲烷八叠球菌(methanosarcina)属菌的msbrm_0487、ma_0606、mm_1767、msbrw_3310、mbar_a1417(keggentry)等。
对于gpps基因、fpps基因、ggpps基因,可以导入任一种,也可以导入两种以上。
在优选的实施方案中,除了双萜合成酶基因等之外,还具有编码柯巴基二磷酸合成酶(cpps)作为外源基因的基因。柯巴基二磷酸(copalyldiphosphate(cpp))是碳原子数为20的ggpp衍生物。通过导入cpp合成酶基因,可以应对双萜合成酶底物为cpp的情况。作为cpps的实例,包含g8hzg6、o22667、a0a0n7i618、q0q2g7(uniprotkbentry)等。
<角鲨烯合成酶>
三萜是碳原子数为30的萜,其包含六个异戊二烯单元。通常,通过fpp(c15)的二聚体化,生成作为非环状三萜的角鲨烯(squalene)(c30)(由角鲨烯合成酶进行催化),由角鲨烯生成鲨烯-2,3-环氧化物(2,3-oxidosqualene(2,3-epoxy-2,3-dihydroaqualene)),经过鲨烯-2,3-环氧化物(2,3-oxidosqualene)的环化而生物合成200种以上的三萜骨架。然而,由于由角鲨烯生成鲨烯-2,3-环氧化物(2,3-oxidosqualene)是需氧的,因此通过作为厌氧古生菌的本发明的重组细胞而可以生产的三萜主要为:通过角鲨烯的环化生产的藿烯(hopene)、藿烷醇(hopanol)、以及其衍生物即藿烷类(hopanoid)化合物。
如上所述,角鲨烯合成酶(squalenesynthase(ss))(ec2.5.1.21)具有使fpp二聚体化的作用。在合成藿烷类化合物(hopanoids)的情况下,除角鲨烯合成酶基因外,至少还导入角鲨烯/藿烯环化酶(squalene/hopenecyclase)(ec5.4.99.17)基因、或角鲨烯/藿烷醇环化酶(squalene/hopanolcyclase)(ec4.2.1.129)基因即可。通常,角鲨烯/藿烯环化酶具有角鲨烯/藿烷醇环化酶活性。角鲨烯合成酶(ss)的实例,可以列举出:p53799、p36596、p29704、p37268、p52020、q9hgz6、q9y753、q9sdw9、p78589(uniprotkbentry)等。角鲨烯/藿烯环化酶(角鲨烯/藿烷醇环化酶)的实例包含p33247、p33990、p54924、p55348(uniprotkbentry)等。
通过进一步导入除ss基因之外的idi基因,可以增强角鲨烯合成能力。此外,通过导入牻牛儿基二磷酸合成酶(gpps)基因和/或法呢基二磷酸合成酶(fpps)基因,可以增强合成角鲨烯的能力。gpps和fpps的实例可以列举出上述示例的那些。
关于本发明中使用的角鲨烯合成酶,除了在自然界中发现和分离的角鲨烯合成酶之外,还可以使用其修饰体。例如,可以是现有角鲨烯合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体,并且具有角鲨烯合成酶活性的蛋白质。
<八氢番茄红素合成酶>
四萜是包含八个异戊二烯单元并且碳原子数为40的萜,主要包含类胡萝卜素的化合物组。四萜中存在许多非环状或环状四萜。非环状四萜包含八氢番茄红素、番茄红素、链孢红素等。单环状四萜包含γ-胡萝卜素等。双环状四萜包含α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、虾青素、抗青黄素、角黄素、辣椒红素、β-隐黄质、叶黄素、蓝溪藻黄素(myxoxanthophyll)、玉米黄质、岩藻黄质、紫罗兰红素、新黄质、毛莨黄素等。
八氢番茄红素合成酶(phytoenesynthase(pys))(ec2.5.1.32)具有使牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(ggpp)二聚体化的作用。作为pys的实例,可以列举出:q7z859、q9p854、p37272、q67gh9、d5kxj0、p21683、q9uuq6、p08196、b2atb0、q2u4x9、a2qm49、p37271、p37273、p49085、p54975、p9whp3、p54977、p22872、p17056(uniprotkbentry)等。
通过导入除psy基因之外的idi基因,可以增强八氢番茄红素的合成能力。此外,通过导入选自gpp合成酶基因、fpp合成酶基因、以及ggpp合成酶基因中的至少一种基因,可以增强八氢番茄红素的合成能力。gpps、fpps、ggpps的实例可以例举出上述示例的那些。
关于本发明中使用的八氢番茄红素合成酶,除了在自然界中发现和分离的八氢番茄红素合成酶之外,还可以使用其修饰体。例如,可以是现有八氢番茄红素合成酶的部分片段或氨基酸取代突变体,并且具有八氢番茄红素合成酶活性的蛋白质。
如上所述,本发明的重组细胞具有异戊二烯合成酶基因、单萜合成酶基因、倍半萜合成酶基因、双萜合成酶基因、角鲨烯合成酶基因、或八氢番茄红素合成酶基因作为外源基因。并且还任选具有idi基因、gpps基因、npps基因、ggpps基因、cpps基因、ss基因等。
就本发明中采用的上述外源基因而言,从作为宿主的古生菌出发,可以是异源基因或同源基因。
如上所述,古生菌的膜脂质组分具有异戊二烯骨架。因此,古生菌通过图1中所示的古生菌型甲羟戊酸途径(mva途径),与其他生物相比大量地合成ipp,上述ipp具有异戊二烯或类异戊二烯化合物的单元结构。以进一步生产大量的异戊二烯或萜为目的,可以采用使ipp合成能力进一步提高的措施。例如,为了进一步生产大量的异戊二烯或萜而不影响重组细胞的生长,可以进一步导入mva途径基因作为外源基因。作为导入的mva途径基因,只要其在重组细胞中正常发挥作用即可,没有特别限制。例如,可以使用与宿主相同的来源(内源性)、源于其他古生菌、源于古生菌以外的生物等的mva途径基因。
此外,可以改善内源性mva途径的功能,而不是从外部导入mva途径基因。例如,可以通过启动子修饰增加内源性mva途径基因的表达水平。
图1中表示构成代表性的源于古生菌的mva途径的酶,但是如图2所示,在真核生物和原核生物中,由甲羟戊酸到ipp的生物合成途径是多样的。导入的上述mva途径基因是编码图1或图2中所示的酶的部分或全部的基因。同样地,功能得到提高的上述内源性mva途径的酶是这些酶的部分或全部。
具体而言,图1或图2中所示的酶为:
乙酰乙酰coa硫解酶(acetoacetyl-coathiolase)(ec:2.3.1.9)、
hmg-coa合成酶(hmg-coasynthase)(ec:2.3.3.10)、
hmg-coa还原酶(hmg-coareductase)(ec:1.1.1.34;1.1.1.88)、
甲羟戊酸-5-激酶(mevalonate-5-kinase)(ec:2.7.1.36)、
5-磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mevalonate-5-phosphatedecarboxylase)(ec:4.1.1.99)、
异戊烯基磷酸激酶(isopentenylphosphatekinase)(ec:2.7.4.26)、
异戊烯基二磷酸异构酶(isopentenyldiphosphateisomerase)(ec:5.3.3.2)、
磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonatekinase)(ec:2.7.4.2)、
甲羟戊酸二磷酸脱羧酶(mevalonatediphosphatedecarboxylase)(ec:4.1.1.33)、
甲羟戊酸-3-激酶(mevalonate-3-kinase)(ec:2.7.1.185)、
3-磷酸甲羟戊酸-5-激酶(mevalonate-3-phosphate-5-kinase)(ec:2.7.1.186)、
3,5-二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(mevalonate-3,5-bisphosphatedecarboxylase)。
其中,特别优选选自乙酰乙酰coa硫解酶、hmg-coa合成酶、hmg-coa还原酶、甲羟戊酸-5-激酶、5-磷酸甲羟戊酸脱羧酶以及异戊烯基磷酸激酶中的一种或两种以上的酶。
此外,导入的上述mva途径基因的来源没有特别限制。优选源于古生菌,更优选源于甲烷八叠球菌(methanosarcina)属、甲烷球菌(methanococcus)属、产甲烷热球菌属(methanothermococcus)属、甲烷热杆菌属(methanothermobacter)属、甲烷丝菌属(methanothrix)属、嗜热球菌(thermococcus)、thermofilum属、热原体属(thermoplasma)、或古生球菌(archaeoglobus)属。
本发明的重组细胞属于厌氧性古生菌,具体而言,外源基因被导入作为宿主的厌氧性古生菌中。
通常,古生菌可以以选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种作为唯一碳源而生长。它们具有如图3所示的还原型乙酰coa途径,由甲基四氢蝶呤、一氧化碳以及coa合成乙酰coa的同时,进行乙酸生成和甲烷生成,并将其作为基础代谢。codh/acs(carbonmonoxidedehydrogenase/acetyl-coasynthase)复合物在还原型乙酰coa途径中的一氧化碳和二氧化碳的同化及异化中发挥重要作用。
作为本发明中使用的古生菌,可举出属于甲烷杆菌(methanobacterium)属、甲烷短杆菌(methanobrevibacter)属、甲烷砾菌(methanocalculus)属、甲烷球菌(methanococcus)属、甲烷八叠球菌(methanosarcina)属、甲烷球形菌(methanosphaera)属、甲烷热杆菌属(methanothermobacter)属、甲烷丝菌属(methanothrix)属,、甲烷囊菌(methanoculleus)属、甲烷泡菌属(methanofollis)属、产甲烷菌(methanogenium)属、甲烷螺菌(methanospirillium)属、甲烷鬃毛菌(methanosaeta)属、嗜热球菌(thermococcus)属、thermofilum属、古生球菌(archaeoglobus)属等。其中,优选甲烷八叠球菌(methanosarcina)属、甲烷球菌(methanococcus)属、产甲烷热球菌属(methanothermococcus)属、甲烷热杆菌属(methanothermobacter)属、甲烷丝菌属(methanothrix)属、嗜热球菌(thermococcus)属、热丝菌(thermofilum)属、或古生球菌(archaeoglobus)属,此外,从一氧化碳和二氧化碳利用性的观点出发,特别优选甲烷八叠球菌(methanosarcina)属、甲烷球菌(methanococcus)属、或产甲烷热球菌属(methanothermococcus)属。作为具体实例,可举出巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)、梅氏甲烷八叠球菌(methanosarcinamazei)、噬乙酸甲烷八叠球菌(methanosarcinaacetivorans)、沃氏甲烷球菌(methanococcusvoltae)、万氏甲烷球菌(methanococcusvannielii)、海沼甲烷球菌(methanococcusmaripaludis)、或methanothermococcus(methanococcus)thermolithotrophicus)等。
另一方面,一氧化碳脱氢酶(一氧化碳脱氢酶,codehydrogenase,codh)是一氧化碳代谢的重要的酶之一,并且具有由一氧化碳生成二氧化碳和质子的活性。该活性属于ec1.2(oxidoreductase),具体而言,属于ec1.2.7.4(以前的ec1.2.99.2)等。由一氧化碳和水生成二氧化碳和质子(water-gasshift)的反应,是该酶反应的代表例。
在优选的实施方案中,重组细胞具有一氧化碳脱氢酶。即,从应用于合成气发酵的观点出发,本发明的重组细胞优选具有上述酶活性。一氧化碳脱氢酶可以是宿主原本拥有的,也可以是外源基因表达而得的。当宿主没有codh活性或具有低活性时,可用于导入codh基因作为外源基因。作为此时的codh的来源,例如,在细菌的情况下,存在一氧化碳利用性的红假单胞菌(rhodopseudomonas)属、红螺菌(rhodospirillum)属、红长命菌属(rubrivivax)属、红环菌(rhodocyclus)属、梭菌属(clostridium)属、消化链球菌属(peptostreptococcus)属、醋酸杆菌属(acetobacterium)属、moorella属、carboxydothermus属等。另一方面,在古生菌中,存在源于carboxydothermus属、热丝菌(thermofilum)属、古生球菌(archaeoglobus)属、甲烷八叠球菌(methsanosarcina)属、甲烷球菌(methanococcus)属、产甲烷热球菌属(methanothermococcus)属、甲烷热杆菌属(methanothermobacter)属等的codh。
由于本发明的重组细胞通常具有图3所示的还原型乙酰coa途径,因此可以以二氧化碳作为唯一碳源,并且以氢作为能源而生长。利用二氧化碳和氢气而生长的能力,可用于将废弃物燃烧气体或钢铁废气等工业废气转化为有价值物质。
在优选的实施方案中,重组细胞能够将甲醇作为唯一碳源而生长。即,本发明的重组细胞包含具有甲醇:辅酶m甲基转移酶(ec:2.1.1.246;methanol:coenzymemmethyltransferase)的细胞。由于由甲醇和com生成甲基com,所以它们能够在将甲醇作为唯一碳源的培养基中生长(图4)。由于甲醇由天然气、煤、废弃物燃烧气体等廉价地大量生产,因此具有甲醇利用能力的本发明的重组细胞可用于将甲醇转化为有价值物质。
在优选的实施方案中,重组细胞能够将甲烷作为唯一碳源而生长。即,本发明的重组细胞包含具有甲基辅酶m还原酶(ec2.8.4.1;methyl-comreductase)的细胞。由于由甲烷生产甲基com,所以它们能够在将甲烷作为唯一碳源的培养基中生长(图4)。具有甲烷利用能力的本发明的重组细胞可用于将天然气和生物质处理生成的甲烷转化为有价值物质。
将基因(核酸)导入古生菌的方法没有特别限定,可以根据作为宿主细胞的古生菌的种类进行适当选择。例如,可以使用可导入宿主细胞并且可表达整合基因的载体。作为该载体,可以使用能够在宿主细胞中自主复制的载体,或能够整合到染色体中并且在能够转录插入的上述基因的位置上含有启动子的载体。例如,优选使用该载体,在宿主细胞内构建包含启动子、核糖体结合序列、上述外源基因、以及转录终止序列的一系列构成。
如果对宿主细胞为甲烷八叠球菌(methanosarcina)属的情况进行说明,例如可以使用以噬乙酸甲烷八叠球菌(methanosarcinaacetivorans)(dsm2834)中固有的质粒pc2a为基础的大肠杆菌的穿梭载体(sowersk.r.etal.,j.bacteriol.1988,170,4979-4982;metcalfw.w.etal.,pnas1997,94,2626-2631)。存在通过同源重组而导入、缺乏基因的实例(rotherm.,etal.,j.bacteriol2005,187,5552-5559;conwayd.m.,j.mol.biol.1996,262,12-20),这些方法也可用于本发明。
在宿主细胞是甲烷球菌(methanococcus)属或产甲烷热球菌属(methanothermococcus)属的情况下,可以由海沼甲烷球菌(methanococcusmaripaludis)、甲烷球菌属(methanococcus)st.ag83等固有的质粒purb500、purb900等,构建穿梭载体(langem.etal.,femsmicrobiol.2001,25,553-571)。
组成型表达启动子可用作使外源基因表达的启动子。组成型表达启动子没有特别限制,从许多古菌具有甲烷生成能力的观点出发,可以使用例如甲基辅酶m还原酶启动子(methylco-enzymemreductasepromoter(pmcr))(buann.etal.,methodsinenzymology2011,494,23-42)。另一方面,作为诱导型表达系统,可以利用使用了源于tn10转座子的四环素抗性基因表达的控制系统的方法(guessa.m.etal.,archaea2008,2,193-203)等。
此外,当使用载体将多种外源基因导入宿主时,各基因可以整合到一个载体中,也可以整合到各自的载体中。此外,当将多个基因整合到一个载体中时,各基因可以在共同的启动子下表达,或者可以在单独的启动子下表达。为了以融合蛋白的形式表达多种酶,可以导入其中连接有多种基因的融合基因。
转化方法没有特别限制,但脂质体法(metcalfww.etal.,pnas1997,94,2626-2631)可用于甲烷八叠球菌(methanosarcina)属。此外,在甲烷球菌(methanococcus)属或产甲烷热球菌属(methanothermococcus)属的情况下,peg法(gernhardtp.etal.,mol.gen.genet.1990,221,273-279)是有效的。
除了如上所述的外源基因导入之外,还可以通过进一步实施突变或细胞融合,来培育异戊二烯和萜的生产性显著提高了的菌株。
在本发明的异戊二烯或萜的生产方法中,使选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种碳源与上述重组细胞接触,由该重组细胞中的上述碳源生产异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜。通常,将选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种作为碳源来培养上述重组细胞,并且由该培养物获得异戊二烯或碳原子数为10、15、20、30或40的萜
由于本发明的重组细胞通常具有还原型乙酰coa途径、以及甲醇利用途径、可逆的乙酸合成途径、可逆的甲烷生成途径,因此能够使用选自一氧化碳、二氧化碳、甲烷、甲醇以及乙酸中的至少一种碳源来生产异戊二烯或萜。对于这些c1化合物或乙酸,可以单独使用一种,也可以组合使用两种以上。
当主要碳源、能源是气体组分时,优选通过在0.2~0.3mpa(绝对压力)左右的加压状态下进行培养,来提高气体组分的利用性。此外,为了使初始生长和到达细胞密度达到良好,可以添加少量有机物质,例如维生素、酵母提取物、玉米浆、bactotrypton等。
可以在不进行培养的情况下生产异戊二烯或萜。即,无论是否涉及细胞分裂(细胞生长),都可以使重组细胞与上述c1化合物或乙酸接触,生产异戊二烯或萜。例如,可以将上述c1化合物或乙酸持续供应给固定化的重组细胞,以持续生产异戊二烯或萜。同样在该实施方案中,对于这些作为碳源的c1化合物或乙酸,可以单独使用一种,也可以组合使用两种以上。此外,优选同时使氢气(h2)作为能源接触。
在优选的实施方案中,将上述重组细胞在培养槽中培养,并且将包含一氧化碳、二氧化碳和氢气的混合气体供应到上述培养槽中。优选混合气体中的一氧化碳浓度为20%以上。优选上述混合气体中的二氧化碳浓度为5%以上。优选上述混合气体中的硫化氢浓度为10ppm以下。
需要说明的是,当使用上述混合气体来培养本发明的重组细胞时,如果向培养基中添加甲醇和/或乙酸,则在某些情况下可以将培养稳定化。例如,本发明的重组细胞包含能够进行化学自养生长(co/co2/h2利用)和异养生长(甲醇利用)这两者。在这种情况下,使用如下所述的碳源和能源的组合,而使有效且稳定的培养变得可能。
co/co2/h2/甲醇
co/h2/甲醇
co/甲醇
co2/h2/甲醇
co2/甲醇
co/co2/h2/乙酸
co/h2/乙酸
co/乙酸
co2/h2/乙酸
co2/乙酸
上述气体组分(co、co2、h2)和液体组分(甲醇、乙酸)可以总是共存,也可以在培养阶段单独使用。例如,可以单独使用甲醇来使细胞生长至稳定状态,然后仅转换气体组分,或转换为气体组分和甲醇的组合。通过使甲醇在合成气(co、co2、h2的混合气体)发酵中共存,可以在长期持续培养中实现合成气利用性的稳定化。能够期待通过甲醇来减少杂菌污染。
本发明可以应用于废弃物燃烧废气和炼钢废气等的再循环中。即,向上述重组细胞提供混合气体,该混合气体含有上述废气中的主要碳及作为能量组分的一氧化碳(co)、二氧化碳(co2)和氢气(h2)作为主要成分。即,使用混合气体作为碳源来培养重组细胞,或者使混合气体与重组细胞接触,由混合气体中的一氧化碳或二氧化碳出发生产异戊二烯或萜。在该情况下,氢气被用作能源。在上述工业废气的主要成分组成是废弃物燃烧废气的情况下,例如,为co/co2/h2=30-50/10-40/25-45%,在上述工业废气的主要成分组成是炼钢废气的情况下,例如,为co/co2/h2=50-70/10-40/2-10%。
还可以根据使用的古生菌的气体利用性来改变上述气体组成。例如,通过水煤气变换反应等,可以容易地在水蒸汽存在下将上述混合气体中的一氧化碳转化为二氧化碳和氢气,并且可以增加二氧化碳和氢气的浓度。
此外,上述工业废气中存在硫化氢,一般暴露于1000ppm以上时,古生菌的生长会急剧恶化。因此,在将上述废气供应到培养槽之前,通过湿石灰石膏法、加氢脱硫法等,优选将硫化氢的浓度降低至100ppm以下,更优选10ppm以下。
在优选的实施方案中,培养液在生长稳定期的细胞浓度为1g干燥细胞/l以上,并且持续地进行培养基的供给和培养液的排出。即,培养方法是持续的,并且细胞密度保持的很高。
持续培养是指,在细胞密度达到一定水平后,通过持续进行新鲜培养基和气体的供给、以及培养液(含有菌体)的排出,使细胞密度及目标物质的生产速度保持恒定,并且经过长时间(例如一个月以上)来进行培养。与批量生产相比,由此可以显著提高异戊二烯或萜的生产性,并且还可以廉价地进行生产。上述持续培养中的细胞密度通常为1g干燥细胞/l以上,优选为5g干燥细胞/l,更优选为10g干燥细胞/l。
生产的异戊二烯或萜可以从细胞外,即培养液或气相级分中回收。
在下文中,将参考实施例更详细地说明本发明,但本发明不限于这些实施例。
实施例
[实施例1]
用于在古生菌中生产异戊二烯的异戊二烯合成基因导入载体的制备
在本实施例中,制备如图5中所示的古生菌中异戊二烯合成用载体pac:pmcr-idi-isps。该载体为具有噬乙酸甲烷八叠球菌(methanosarcinaacetivorans)的内源性质粒所含有的复制区、以及大肠杆菌中的复制区p15a的穿梭载体,并且可以通过源于沃氏甲烷球菌(methanococcusvoltae)的启动子pmcrb(methylcoenzymemreductase),来使源于saccharomycescerevisiae的idi(isopentenyldiphosphateisomerase)基因、以及源于popluscanescens的isps(isoprenesynthase)基因进行组成型表达。
用hindiii和bcli来对质粒pacyc184(nippongene株式会社)进行酶切,得到含有氯霉素抗性基因(cat)和复制区p15a的片段,导入包含序列编号5和序列编号6的接头序列,获得质粒pamcs。将序列编号7的嘌呤霉素(puromycin)抗性基因(pur,genewiz公司)导入pamcs的sphi-asci酶切位点,构建pay:pur。通过将含有序列编号8的idi-isps基因的基因片段(genewiz公司)导入本质粒载体的paci-noti酶切位点,构建质粒pay:pmcr-idi-isps。
另一方面,根据sowerskr等人的方法(sowerskretal.,1988j.bacterial.,170(10),4979-4982),通过m.acetivorans(dsm2834)的培养菌体,制备内源性质粒pc2a(genbankno.u78295)。使通过spei进行的酶切而发生了直链化的pc2a、和通过spei进行了酶切而发生了直链化的上述pay:pmcr-idi-isps融合,构建在古生菌中对异戊二烯合成基因进行组成型表达的穿梭载体pac:pmcr-idi-isps(序列编号9,图5)。
通过同样地步骤,将pay:pur和pc2a融合,制备对照用的穿梭载体pac:pur(序列编号10)。
[实施例2]
巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)的转化、及由各种碳源生成异戊二烯
根据metcalfww等人的方法(metcalfwwetal.,pnas1997,94,1997),进行巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)(dsm800)的单细胞化培养和感受态细胞的制备。即,通过atcc2825改性培养基(其中,1l中含有10克氯化镁六水合物、0.76克氯化钾、24克氯化钠)(ph6.8),在严谨的厌氧条件下,培养至对数生长期(od600=0.3-0.6)。在厌氧室(coy公司)中通过离心分离来回收菌体。将回收的菌体悬浮在0.85m蔗糖水溶液中,得到感受态细胞悬浮液(约109cells/ml)。
将15μl的dotap脂质体(boehringermannheim公司)、100μl的20mmhepes-koh(ph7.4)、以及2μg的pac:pmcr-idi-isps(在50μl的hepes-koh(ph7.4)中)混合,进行15分钟培养。添加1ml上述感受态细胞悬浮液,再培养4小时。将该混合溶液(1.165ml)通过10ml的atcc2825改性培养基在35℃下进行恢复培养12~16小时,然后回收菌体。将回收的菌体悬浮于2ml的含有0.5%琼脂糖的atcc2825改性培养基(45℃)中,然后涂布在含有1.4%琼脂糖和嘌呤霉素(2μg/ml)的atcc2825改性琼脂培养基上。琼脂培养基上的培养,气相为n2/co2/h2s=80/20/0.1%的混合气体置换后的厌氧罐内,在35℃下,进行10~14天。
使用200μl的atcc2825改性培养基(其中,1l含有500mg酵母提取物、500mgcasitone、5g氯化钠,并且不含甲醇)和指定的碳源,将生长了的菌落在35℃下培养3天。在表1所示的五种条件下,将整个培养液的菌体在35℃下振荡培养7~10天。在实验1~4中,将各种气体填充至绝对压力为2.5atm。在实验5和6中,使用n2作为气相进行填充,直至绝对压力为1.5atm。培养在由丁基橡胶塞密封的hs-20用20ml小瓶中(15ml气相、5ml培养液)进行。各实验中,一次进行3克隆(n=3)培养。培养结束后,对气相进行顶空gcms分析(gcms-qp2010ultra/hs-20,株式会社岛津制作所),测定异戊二烯浓度。
作为对照,使用pac:pur代替pac:pmcr-idi-isps进行相同的操作。
结果如表1所示。即,当导入了pac:pmcr-idi-isps(图5)时,即使在使用co2/h2(实验1)、co/co2/h2(实验2)、co/h2/n2(实验3)中的任意碳源的情况下,可以确认显著的异戊二烯生成。此外,即使在使用甲醇(实验4)和乙酸(实验5)作为碳源的情况下,也可以确认显著的异戊二烯生成。它们的异戊二烯生产量均超过1mg/g干燥菌体。另一方面,在不存在主要碳源的情况下(实验6),异戊二烯生成微乎其微。需要说明的是,当导入了pac:pur时,几乎均没有检测到异戊二烯。
由此可以确认,通过重组古生菌生成源于co、co2、甲醇以及乙酸的全部碳的异戊二烯。
该异戊二烯生产量(1g干燥菌体中超过1mg)明显高于现有报道的通过合成气利用性的梭菌属(clostridium)细菌的异戊二烯生产(专利文献1、3等)的生产量,从而表明古生菌中的异戊二烯生产是高效的。此外,由于使用co/co2/h2、co2/h2作为碳源来生产异戊二烯,因此在工业上可以使用作为废弃物燃烧气体等的合成气体作为碳源。
此外,在使用包含上述梭菌(clostridium)属中的研究实例的细菌等作为宿主的现有技术中,需要导入由6种以上的外源酶基因构成的mva途径基因。即,表明了:从基因操作的便利性出发,也可以利用古生菌内源性的mva途径基因,即,不需要外源mva途径基因的本发明是有效的。
如上所述,表明了本发明可以应用于由廉价且丰富地制造出的废弃物燃烧气体、甲醇、乙酸等生产异戊二烯。
[表1]
[实施例3]
用于在古生菌中生产法呢烯的载体的制备
在本实施例中,制备古细胞中的法呢烯合成用载体pac:pmcr-idi-fns(图6)与pac:pmcr-idi-fns-fps(图7)。pac:pmcr-idi-fns含有源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的idi和源于青蒿(artemisiaannua)的法呢烯合成酶(farnesenesynthase)(fns)基因。pac:pmcr-idi-fns-fps含有上述idi、源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的法呢基二磷酸合成酶(farnesenesynthase)(fps)、以及上述fns基因。
用mlui-noti对实施例1中制备的pac:pmcr-idi-isps(图5)进行酶切,除去idi-isps区域,获得直链片段。将该直链片段与含有idi-fns(序列编号11)的基因片段融合,构建pac:pmcr-idi-fns(序列编号13,图6)。此外,将该直链片段与含有idi-fns-fps基因(序列编号12)(genewiz公司)的基因片段融合,构建pac:pmcr-idi-fns-fps基因(序列编号14,图7)。在图6和7中,scidi表示源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的idi,aafns表示源于青蒿(artemisiaannua)的fns,scfps表示源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的法呢基二磷酸合成酶。
[实施例4]
基于重组巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)进行的由各种碳源生成法呢烯
通过与实施例2中相同的脂质体法的转化方法,将pac:pmcr-idi-fns或pac:pmcr-idi-fns-fps导入巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)(dsm800),分别获得转化体。接下来,在与实施例2相同的条件下培养这些转化体。然而,为了提取、吸收所生成的法呢烯,将10%(v/v)的十二烷叠层在培养液上。培养完成后,通过离心分离从各培养液中回收十二烷层。将回收的十二烷层用正己烷稀释10倍,并通过gcms(gcms-qp2010ultra,株式会社岛津制作所)分析来测定法呢烯浓度。
作为对照,使用pac:pur(实施例1)代替pac:pmcr-idi-fns或pac:pmcr-idi-fns-fps并进行相同的操作。
结果如表2所示。即,当导入了pac:pmcr-idi-fns(图6)或pac:pmcr-idi-fns-fps(图7)时,即使在使用co2/h2(实验7)、co/co2/h2(实验8)、co/h2/n2(实验9)中的任一碳源、能源的情况下,也可以确认显著地生成法呢烯。此外,即使在使用甲醇(实验10)和乙酸(实验11)作为碳源的情况下,也可以确认显著地生成法呢烯。它们的法呢烯生产量均超过1mg/g干燥菌体。
另一方面,即使在导入pac:pmcr-idi-fns(图6)或pac:pmcr-idi-fns-fps(图7)的情况下,在不存在主要碳源的情况下(实验12),生成的法呢烯微乎其微。由于可以使用co/co2/h2、co2/h2、co/h2作为碳源生产法呢烯,因此表示了,本发明可以应用于由废弃物燃烧气体等合成气生产法呢烯。
需要说明的是,当导入pac:pur时,几乎没有检测到法呢烯。
由上可知,本发明可以应用于由廉价且丰富制造出的废弃物燃烧气体、甲醇、乙酸等来生产法呢烯。
[表2]
[实施例5]
外源异戊二烯二磷酸异构酶(idi)基因对重组甲烷八叠球菌(巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri))生产异戊二烯的影响
制备载体pac:pmcr-isps(序列编号15)。该载体对应于从pac:pmcr-idi-isps(图5)中切除idi基因而得的载体。
以与实施例2中相同的方式将pac:pmcr-isps或pac:pmcr-idi-isps导入巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)(dsm800),获得各自的转化体。在与实施例2相同的条件下培养各转化体,测定气相中的异戊二烯浓度。使用co2/h2(实验13)或甲醇(实验14)作为培养的碳源。
结果如表3所示。即,在使用任何碳源的情况下,当导入idi基因时,异戊二烯的生产量均更高。由此发现,通过idi同时进行作用而增加异戊二烯的生产量。
[表3]
[实施例6]
通过导入mva途径酶基因的异戊二烯生产的增强
制备载体pac:pmcr-mva1-idi-isps(序列编号16,图8)。除了源于酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)的idi基因(实施例1)、源于银灰杨(popluscanescens)的isps基因(实施例1)之外,本载体还具有源于噬乙酸甲烷八叠球菌(methanosarcinaacetivotans)的hmg-coa合成酶(keggentry:ma_4041)基因和hmg-coa还原酶(ma_3073)基因。
以与实施例2中相同的方式将pac:pmcr-mva1-idi-isps或pac:pmcr-idi-isps(实施例1)导入巴氏甲烷八叠球菌(methanosarcinabarkeri)(dsm800)中,获得各自的转化体。在与实施例2相同的条件下培养各转化体,测定气相中的异戊二烯浓度。使用co2/h2(实验16)或甲醇(实验17)作为培养的碳源。
结果如表4所示。即,在使用任何碳源的情况下,导入了pac:pmcr-mva1-idi-isps的转化体具有较大的异戊二烯生产量。由此,发现了仅通过增强构成mva途径的酶的一部分,可以增加异戊二烯生产量。
[表4]
序列列表
<110>积水化学株式会社
<120>重组细胞、以及异戊二烯或萜的生产方法
<130>17p01130
<150>jp2016-211836
<151>2016-10-28
<160>16
<170>专利版本3.1
<210>1
<211>595
<212>prt
<213>银灰杨
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lyssertyrmetlysserphephevalhisprometvalval
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