用于海藻宿主细胞的CRISPR-Cas系统的制作方法

本申请要求2016年7月13日提交的美国临时专利申请号62/361,741的申请日的权益，其公开内容通过提述以其整体并入本文。背景本公开涉及分子生物学和细胞生物学领域。更具体地，本发明涉及用于海藻网粘菌纲(labyrinthulomycete)宿主细胞的crispr-cas系统。相关
技术领域：
的描述基因组技术和分析方法的最新进展已经显著加速了编目和定位与多种生物功能和疾病相关的遗传因子的能力。需要精确的基因组工程技术，通过允许选择性扰动个体遗传原件以实现因果遗传变异的系统逆向工程，以及推进合成生物学、生物技术和医学应用。虽然基因组编辑技术如设计者锌指、转录激活因子样效应核酸酶(talens)或归巢大型核酸酶可用于产生靶向基因组扰动，但仍需要新的基因组工程技术，这些技术价格合理、易于设置、可扩展且能够靶向基因组内的多个位点。对于大多数的学术研究者而言，大型核酸内切酶设计具有挑战性，因为这些酶的dna识别和切割功能在单个域中交织在一起。由于需要考虑系列中各个指域之间的依赖于上下文的影响，因此对于许多实验室而言，工程化锌指系列的稳固构造也被证明是困难的。因此，迫切需要用于靶向具有广泛应用的宿主细胞内的特定序列的替代的和稳固的技术。此技术问题的解决方案是提供权利要求书中表征的实施方案。技术实现要素：本发明基于crispr-cas系统，所述系统不需要产生针对靶特异性序列的定制的蛋白质，而需要可通过引导多核苷酸编程以识别特定的多核苷酸靶物的单个cas酶；换言之，可使用所述的引导多核苷酸分子将cas酶募集至特定的多核苷酸靶物。将crispr-cas系统增加至基因组技术和分析方法的库(repertoire)中可显著简化分子生物学领域中的现有方法。本发明提供非天然存在或工程化的组合物，其包含crispr-cas系统的来源，所述crispr-cas系统包含引导多核苷酸和cas蛋白，其中所述引导多核苷酸包含基本上为宿主细胞中靶多核苷酸的反向互补物的序列，且所述引导多核苷酸可指导cas蛋白在宿主细胞中靶多核苷酸处的结合以形成crispr-cas复合物。本发明进一步涉及调控细胞中多核苷酸表达的方法，其包括使宿主细胞与根据本发明的组合物接触，其中所述引导多核苷酸指导cas蛋白在所述宿主细胞中的靶多核苷酸处的结合以形成crispr-cas复合物。本发明进一步涉及包含根据本发明的组合物的宿主细胞。本发明进一步涉及产生宿主细胞的方法，其包括使宿主细胞与根据本发明的组合物接触，其中所述引导多核苷酸指导cas蛋白在所述宿主细胞中的靶多核苷酸处的结合以形成crispr-cas复合物。本发明进一步涉及用于产生感兴趣的化合物的方法，其包括在有益于产生所述感兴趣的化合物的条件下培养根据本发明的宿主细胞，以及任选纯化或分离所述感兴趣的化合物。附图简述为了进一步理解本公开的性质、目的和优点，应结合以下附图参考以下详细描述，其中相同的附图数字表示相同的要素。图1描绘典型的引导多核苷酸的实例。两种引导多核苷酸是包含引导序列(crrna)和引导多核苷酸结构组分的引导rna。在上图中，该引导多核苷酸结构组分由两个彼此杂交的单独分子组成；单个组分可称为tracr序列和tracr配对序列。在下图中，所述引导多核苷酸结构组分由具有内部杂交的单个分子组成。此图改编自sander和joung,2014和mali等,natmethods.10(10):957-63,2013。图2描绘所述引导多核苷酸(引导rna自处理核酶，其缩写为grsr)是怎样构建的。锤头状核酶和hdv核酶剪切rna分子形成最终且功能性成熟的引导多核苷酸(引导rna)。图3显示在1％的琼脂糖凝胶上运行的消化的质粒和pcr扩增的片段。图4显示由pyb32和pyb33细菌转化产生的转化子的菌落pcr的结果。图5显示琼脂糖凝胶，其中源自t188和t189转化子的基因组dna的扩增子是分离的，其测试启动子和部分cas9的存在。图6显示在琼脂糖凝胶上运行的源自t188和t189转化子的基因组dna的扩增子，其验证cas9整合至orfa/pfa1基因座。图7显示从基因组dna扩增且在1％琼脂糖凝胶上运行的裂殖壶菌属(schizochytrium)脂肪酸合酶(fas)。图8显示将巴龙霉素(paromomycin)和grna盒pcr克隆至载体pcl400中的fas基因座的结果。图9显示分别进行扩增包含前3个csgrna靶物的整个区域作为一个扩增子的pcr结果，以及扩增grna3cs4靶物的另一个pcr结果。图10显示分别从t206转化子的基因组dna扩增grna3cs1靶物的pcr结果。图11显示plc122-cas9和pyb30质粒的消化的结果。图12显示由pyb61细菌转化产生的转化子的菌落pcr的结果。图13显示1％琼脂糖凝胶上的消化pcl122质粒的结果。图14显示1％琼脂糖凝胶上的用于pyb66克隆的grna3cs1盒的扩增子。图15显示1％琼脂糖凝胶上的消化grna3cs1(pyb66片段)的结果。图16描绘由pyb66细菌转化产生的转化子的菌落pcr的结果。图17显示1％琼脂糖凝胶上的消化pyb61质粒的结果。图18显示1％琼脂糖凝胶上的用于pyb73克隆的grna3cs1盒的扩增子。图19显示由pyb73细菌转化产生的转化子的菌落pcr的结果。图20显示琼脂糖凝胶，其中源自t212转化子的基因组dna的扩增子得到分离，其测试carg基因的存在。图21显示琼脂糖凝胶，其中源自t280、t281、t285和t286转化子的基因组dna的扩增子得到分离，其测试部分启动子和cas9序列的存在。图22显示琼脂糖凝胶，其中源自t281和t286转化子的基因组dna的扩增子得到分离，其测试grna盒的存在。图23显示琼脂糖凝胶，其中源自t282和t287转化子的基因组dna的扩增子得到分离，其测试部分grna盒的存在。图24显示分别自t281、t282、t286和t287转化子的基因组dna进行扩增grna3cs1靶物的pcr结果。序列表说明seqidno:1列出了pcl122-cas9载体核苷酸序列。seqidno:2列出了pyb31载体核苷酸序列。seqidno:3列出了pyb32载体核苷酸序列。seqidno:4列出了pyb33载体核苷酸序列。seqidno:5列出了pcl399载体核苷酸序列。seqidno:6列出了pcl400载体核苷酸序列。seqidno:7列出了pcl401载体核苷酸序列。seqidno:8列出了pcl402载体核苷酸序列。seqidno:9列出了pyb36载体核苷酸序列。seqidno:10列出了pyb37载体核苷酸序列。seqidno:11列出了pyb38载体核苷酸序列。seqidno:12列出了pyb39载体核苷酸序列。seqidno:13列出了121tubseqf引物核苷酸序列。seqidno:14列出了pyb32/3cr1引物核苷酸序列。seqidno:15列出了csprokpniff1引物核苷酸序列。seqidno:16列出了csprobamhifr1引物核苷酸序列。seqidno:17列出了csprobamhiff2引物核苷酸序列。seqidno:18列出了csprondeifr2引物核苷酸序列。seqidno:19列出了oa1-kof引物核苷酸序列。seqidno:20列出了pyb32/3sv40r1引物核苷酸序列。seqidno:21列出了oa1-kor引物核苷酸序列。seqidno:22列出了pyb32/3cf1引物核苷酸序列。seqidno:23列出了5’faspmende引物核苷酸序列。seqidno:24列出了3’faspmehpa引物核苷酸序列。seqidno:25列出了pcl402iff引物核苷酸序列。seqidno:26列出了pcl402ifr引物核苷酸序列。seqidno:27列出了pyb36cs1f引物核苷酸序列。seqidno:28列出了pyb36cs1r引物核苷酸序列。seqidno:29列出了pyb36cs3r引物核苷酸序列。seqidno:30列出了pyb36cs4f引物核苷酸序列。seqidno:31列出了pyb36cs4r引物核苷酸序列。seqidno:32列出了pyb30载体核苷酸序列。seqidno:33列出了pyb61载体核苷酸序列。seqidno:34列出了pyb66载体核苷酸序列。seqidno:35列出了pyb73载体核苷酸序列。seqidno:36列出了pcl310载体核苷酸序列。seqidno:37列出了pcl122载体核苷酸序列。seqidno:38列出了pyb66bambglf载体核苷酸序列。seqidno:39列出了pyb66nder引物核苷酸序列。seqidno:40列出了pyb66ef1seqf引物核苷酸序列。seqidno:41列出了pcl122orfcr引物核苷酸序列。seqidno:42列出了pyb73grnapstkpniff引物核苷酸序列。seqidno:43列出了pyb73grnaxhopstifr引物核苷酸序列。seqidno:44列出了pyb73seqf引物核苷酸序列。seqidno:45列出了pyb73seqr引物核苷酸序列。seqidno:46列出了pyb13pyb1seqf引物核苷酸序列。seqidno:47列出了ttpyb73hdvr引物核苷酸序列。发明详述再进一步描述本主题公开之前，应理解，本公开不限于下面描述的本公开的特定实施方案，因为可以进行特定实施方案的变化并且仍落入所附权利要求的范围内。还应理解，所采用的术语是出于描述特定实施方案的目的，并不是限制性的。相反，本公开的范围将由所附权利要求确定。在第一方面中，本发明提供包含crispr-cas系统的来源的非天然存在或工程化的组合物，所述系统包含引导多核苷酸和cas蛋白，其中所述引导多核苷酸包含基本上为宿主细胞中靶多核苷酸的反向互补物的引导序列，且所述引导多核苷酸可指导cas蛋白在宿主细胞中靶多核苷酸处的结合以形成crispr-cas复合物，其中所述引导序列基本上为宿主细胞的基因组中的5′-(n)ypam-3′多核苷酸序列靶物的(n)y部分的反向互补物，其中y是8-30的整数，更优选10-30，更优选15-30，更优选17-27，更优选17-20，更优选17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27，其中pam是前间区序列邻近基序，其中所述宿主细胞是网粘菌纲(labyrinthulomycete)的，优选破囊壶菌目(thraustochytriales)的，更优选破囊壶菌科(thraustochytriaceae)的，更优选选自下组的菌属的成员：aurantiochytrium、oblongichytrium、裂殖壶菌属(schizochytrium)、破囊壶菌属(thraustochytrium)和吾肯氏壶菌属(ulkenia)，甚至更优选裂殖壶菌属菌种atcc#20888，且其中pam优选选自下列的序列：5′-xgg-3′、5′-xggxg-3′、5′-xxagaaw-3′、5′-xxxxgatt-3′、5′-xxagaa-3′、5′-xaaaac-3′，其中x可为任何核苷酸或其类似物，优选地，x可为任何核苷酸；且w为a或t。所述组合物、来源、crispr-cas系统、引导多核苷酸、cas蛋白、靶多核苷酸、宿主细胞和crispr-cas复合物在本文中称为根据本发明的组合物、来源、crispr-cas系统、引导多核苷酸、cas蛋白、靶多核苷酸、宿主细胞和crispr-cas复合物。为了完整起见，由于“一个(a)”在本文别处定义为“至少一个”，则根据本发明的组合物包含至少一个(即一个、两个、三个或多个)引导多核苷酸来源和/或至少一个(即一个、两个、三个或多个)cas蛋白。因此，本发明方便地提供多重crispr-cas系统。这种多重crispr-cas系统可方便地用于导入供体多核苷酸、缺失多核苷酸以及将多核苷酸库插入宿主细胞的基因组中。本文中，多重crispr-cas系统可指使用一个或多个cas蛋白、一个或多个引导多核苷酸和/或一个或多个供体多核苷酸。术语“crispr系统”、“crispr-cas系统”和“crispr酶系统”在本文中可互换使用，且在本发明的所有实施方案的上下文中指需要而与靶多核苷酸一起形成crispr-cas复合物的要素的集合；这些元件包含但不限于cas蛋白和引导多核苷酸。在本发明的所有实施方案的上下文中，术语“crispr-cas复合物”指包含与靶多核苷酸杂交的引导多核苷酸且与cas蛋白复合的复合物。在最直接的形式中，在使用非突变的cas蛋白(例如，但不限于酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)的cas9蛋白)的情况下，crispr-cas复合物的形成导致靶多核苷酸中或附近(例如距靶多核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对)的一个或两个多核苷酸链的切割。通常，根据本发明的靶多核苷酸(下文定义)与pam序列(下文定义)相关，并且pam序列优选紧邻靶多核苷酸的下游(3')；crispr-cas复合物的形成通常导致pam序列上游(5')3个碱基对的一条或两条多核苷酸链切割。在本发明的所有实施方案的上下文中，术语“非天然存在的组合物”是指组合物，其在本发明中使用的形式不在自然界中存在。各个元件可(例如)本身天然存在或与自然界中的其他元件组合存在，但非天然存在的组合物包括(例如)至少一种元件，其多于或少于天然组合物。在本发明的所有实施方案的上下文中，术语“工程化的组合物”是指组合物，其中至少一种元件已经被改造，即由人修饰的，使得所得元件不存在于自然界中。因此，由于包含至少一种工程化元件，工程化组合物不存在于自然界中。术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”在本文中可互换使用，并且在本发明的所有实施方案的上下文中是指任何长度的核苷酸的聚合形式(即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)，或其混合物或类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可实施已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区，由连锁分析定义的基因座，外显子，内含子，信使rna(mrna)，转运rna(trna)，核糖体rna(rrna)，短干扰rna(sirna)，短发夹rna(shrna)，微rna(mirna)，核酶，cdna，重组多核苷酸，支链多核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离的dna，任何序列的分离的rna序列，核酸探针，寡核苷酸和引物。多核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物或核苷酸等同物，其中核苷酸类似物或等同物定义为具有修饰的碱基、和/或修饰的骨架、和/或非天然核苷间键合、或这些修饰的组合的残基。优选的核苷酸类似物和等同物描述于“一般定义”部分。根据需要，可在组装多核苷酸之前或之后引入对核苷酸结构的修饰。聚合后可进一步修饰多核苷酸，例如通过与标记化合物缀合。如本文所用，“多核苷酸”可包含常见的磷酸二酯键或非常见的键(例如，酰胺键，如其在肽核酸(pna)中发现)。多核苷酸可含有全长cdna序列的核苷酸序列，其包括非翻译的5'和3'序列、编码序列以及核酸序列的片段、表位、域和变体。多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可为未修饰的rna或dna或修饰的rna或dna。例如，多核苷酸可由单链和双链dna，作为单链和双链区的混合物的dna，单链和双链rna以及作为单链和双链区的混合物的rna，包含dna和rna的杂交分子(其可为单链的，或更通常是双链的或单链和双链区的混合物)组成。另外，多核苷酸可由包含rna或dna或rna和dna两者的三链区组成。多核苷酸可含有核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“rna分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“dna分子”)，或其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯。多核苷酸还可含有一个或多个修饰的碱基或为稳定性或其他原因而修饰的dna或rna骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(如肌苷)。可对dna和rna进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包含化学、酶促或代谢修饰的形式。术语核酸分子仅指分子的一级和二级结构，并不限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括(尤其)在线性或环状dna分子(例如限制性片段)、质粒和染色体中发现的双链dna。在讨论特定双链dna分子的结构时，本文可根据仅沿着dna的非转录链的5'至3'方向给出序列的常规惯例来描述序列(即具有与mrna同源的序列的链)。术语“分离的”核酸分子是指已从其天然环境中除去的核酸分子、dna或rna。分离的核酸分子的进一步实例包括核酸分子，其包含维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的rna分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外rna转录物。根据本发明的分离的核酸分子进一步包括合成产生的这种分子。另外，核酸分子或多核苷酸可包括调控元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。“基因”是指编码多肽的核苷酸集合，且包括cdna和基因组dna核酸。“基因”还指表达特定蛋白质的核酸片段，其包括各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)以及编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指在自然界中发现的具有其自身调控序列的基因。在一些实施方案中，核酸分子包含与本文报道的多核苷酸序列至少约80％、85％或90％相同的多核苷酸序列，或与本文报道的多核苷酸序列至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的多核苷酸序列。如本领域已知的，术语“百分比同一性”是两个或更多个氨基酸序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在本领域中，“同一性”还表示氨基酸或多核苷酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，如通过这些序列的字串之间的匹配所确定的。依据具有至少(例如)与本发明的参考多核苷酸序列95％“相同”的多核苷酸序列的核酸分子，除了多核苷酸序列可包含参考多核苷酸序列的每100个核苷酸多达五个核苷酸差异外，其意图是核酸分子的多核苷酸序列与参考序列相同。换言之，为了获得具有与参考多核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸序列的核酸分子，参考序列中多达5％的核苷酸可被缺失或由另一核苷酸或多个核苷酸取代。参考序列中高达5％的总核苷酸可插入参考序列中。实际上，可使用已知的计算机程序常规地确定任何特定的多核苷酸序列或氨基酸序列是否与本发明的多核苷酸序列或氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的相同。可使用序列的比对和计算同一性得分来确定用于确定查询序列(本发明的序列)与主题序列之间的最佳总体匹配的方法。使用具有参考算法和geneious参考汇编程序的图谱的计算机程序geneious(www.geneious.com)完成比对。根据本发明的引导多核苷酸至少包含能够与靶多核苷酸杂交且能够指导crispr-cas系统序列特异性地结合至靶多核苷酸以形成crispr-cas复合物的引导序列。为了能够形成活性crispr-cas复合物，引导多核苷酸还优选地包含具有特定二级结构的序列且允许cas蛋白结合至引导多核苷酸。这些序列在本领域中已知为tracrrna、tracr序列、tracr支架或引导多核苷酸结构组分，这些术语在本文中可互换地施用；其中所述tracr是反式激活crispr的缩写；因此，tracrrna意指反式激活crisprrna。原始crispr-cas系统中的tracrrna是将crrna(引导序列)与cas核酸酶(其能够结合任何crrna)连接的内源细菌rna。引导多核苷酸结构组分可由单个多核苷酸分子组成或由两个或更多个彼此杂交的分子；或与cas蛋白或相似功能的其他核酸酶相关联的两个或更多个分子组成。引导多核苷酸的这些组分可指tracr序列和tracr配对序列。因此，引导多核苷酸还优选地包含tracr序列和/或tracr配对序列。引导多核苷酸是根据上文列出的多核苷酸的常规定义的多核苷酸；优选的引导多核苷酸包含核糖多核苷酸，更优选的引导多核苷酸是rna(引导rna)。引导多核苷酸结构的两个实例在图1中描述。在本发明的上下文中，如果主题序列能够与靶序列或靶核酸序列杂交(优选在生理条件下如在宿主细胞中杂交)，则序列称之为基本上为靶序列或靶核酸序列的反向互补物。当使用合适的比对算法最佳比对时，引导序列和其相应的靶序列之间的互补性程度优选高于50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％序列同一性。当靶多核苷酸是双链多核苷酸时，主题序列(如引导序列)可能够与靶多核苷酸的任一链(例如编码链或非编码链)杂交。任选地，根据本发明的引导序列靶向靶物中唯一的靶序列。优选地，根据本发明的引导序列与紧邻pam序列的靶多核苷酸中的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个(更优选8、9、10、11或12个)核苷酸具有100％序列同一性。根据本发明的引导序列优选为8-30个核苷酸长度，更优选10-30个，更优选15-30个，更优选17-27个，更优选17-20个，更优选17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个。引导序列指导crispr-cas序列特异性结合至靶核酸以形成crispr-cas复合物的能力可由任何适合的测定法评估。例如，可将足以形成crispr-cas复合物的crispr系统的组分(包括待测的引导序列)提供至具有相应靶序列的宿主细胞中，如通过用编码crispr-cas系统的组分的载体转染，随后评估优先剪切和/或由靶序列内的细胞修复机制诱导的所得突变(如通过标准序列分析测定)。还可通过提供靶多核苷酸、crispr-cas系统组分(包括待测的引导序列和不同于检测引导序列的对照引导序列)，并且比较测试和对照引导序列反应之间的靶序列处的结合和剪切速率而在试管中评价靶多核酸序列的剪切。其他测定是可能的，并且是本领域技术人员已知的。据信引导多核苷酸结构组分对于形成活性crispr-cas复合物是必需的。不认为所述引导多核苷酸结构组分对于可操作连接至引导序列是必需的；然而，引导多核苷酸结构组分可操作地连接至引导多核苷酸内的引导序列中。根据本发明的引导多核苷酸结构组分(其可包含全部或部分野生型引导多核苷酸结构组分或由其组成(如野生型tracr序列的约或多于约20,26,32,45,48,54,63,67,85或更多个核苷酸))形成部分crispr-cas复合物；如通过使根据本发明的trace序列的至少一部分与根据本发明的tracr配对序列的全部或一部分杂交，且优选可操作地连接至根据本发明的引导序列。根据本发明的tracr序列具有与根据本发明的tracr配对序列的足够的互补性以杂交(优选在生理条件下，如在宿主细胞中)并促进形成crispr-cas复合物。与根据本发明的靶序列一样，认为不需要完全互补，只要有足够的互补性以起作用。优选地，当最佳比对时，根据本发明的tracr序列沿着根据本发明的trace配对序列的长度具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％序列同一性。如上所讨论的，可使用任何适合的算法以对齐序列来确定最佳比对。通常，根据本发明的tracr配对序列包括与根据本发明的tracr序列具有足够互补性的任何序列，以促进在靶序列上形成crispr-cas复合物，其中crispr-cas复合物包含与根据本发明的tracr序列杂交的根据本发明的tracr配对序列。根据本发明的tracr序列和根据本发明的tracr配对序列的互补程度优选地相对于tracr配对序列和tracr序列沿着两个序列中较短的序列的长度的最佳比对来定义。如上所讨论的，可使用任何比对序列的合适的算法来确定最佳比对。优选地，对于根据本发明的tracr配对序列和根据本发明的tracr序列，考虑二级结构，如tracr序列或tracr配对序列内的自身互补性。优选地，在最佳比对时，根据本发明的tracr序列与根据本发明的tracr配对序列之间沿着两个序列中较短的序列的长度的互补程度高于50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％序列同一性。优选地，根据本发明的tracr配对序列长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多个核苷酸。优选地，根据本发明的tracr序列长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或更多个核苷酸。优选地，根据本发明的tracr序列和tracr配对序列，即根据本发明的引导多核苷酸结构组分包含在单个转录物内，使得两者之间的杂交产生包含二级结构的杂交复合物，例如发夹。当tracr序列和tracr配对序列不包含在单个转录物中时，也可形成这种杂交复合物。根据本发明的tracr序列中的优选的形成环的序列和/或根据本发明的tracr配对序列和/或根据本发明的用于形成发夹结构的引导多核苷酸结构组分的长度为4个核苷酸，并且最优选具有序列gaaa；可使用更长或更短的环序列，也可使用替代序列。环序列优选包括核苷酸三联体(例如aaa)和另外的核苷酸(例如c或g)。环成形序列的实例包括caaa和aaag。优选地，根据本发明的tracr序列和/或根据本发明的tracr配对序列或其杂交复合物和/或根据本发明的引导多核苷酸结构组分包含或能够形成至少两个或更多个发夹。更优选地，根据本发明的tracr序列和/或根据本发明的tracr配对序列或其杂交复合物和/或根据本发明的引导多核苷酸结构组分包含或能够形成两个、三个、四个或五个发夹。优选地，根据本发明的tracr序列和/或根据本发明的tracr配对序列或其杂交复合物和/或根据本发明的指导多核苷酸结构成分包含或能够形成至多五个发夹。优选地，根据本发明的tracr序列的单个转录物和根据本发明的tracr-mate序列或根据本发明的tracr序列的杂交复合物和根据本发明的tracr配对序列和/或根据本发明的引导多核苷酸结构组分进一步包含转录终止序列；优选地，这是polyt序列，例如6个t核苷酸。如上所述，引导多核苷酸结构组分是本领域技术人员已知的；背景信息可在(例如)gaj等,2013中发现。在根据本发明的所有实施方案的上下文中，术语“靶多核苷酸”是指根据本发明的靶序列，其中根据本发明的引导序列被设计成与该序列具有互补性，其中根据本发明的靶序列与根据本发明的引导序列之间的杂交促进形成crispr-cas复合物。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进crispr-cas复合物的形成，则不一定需要完全互补。优选地，根据本发明的引导序列靶向靶物中唯一的靶序列。优选地，根据本发明的引导序列与紧邻pam序列的靶多核苷酸中的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸(更优选8、9、10、11或12个)具有100％的序列同一性。根据本发明的靶多核苷酸可包含任何多核苷酸(例如dna或rna多核苷酸)，并且可为单链或双链的。当靶多核苷酸是双链多核苷酸时，根据本发明的引导序列可能够与靶多核苷酸的任一链杂交，例如编码链或非编码链。根据本发明的靶多核苷酸可位于细胞的细胞核或细胞质中。根据本发明的靶多核苷酸可以位于宿主细胞的细胞器中，例如位于线粒体或质体中。根据本发明的靶多核苷酸可以包含在基因组中，可包含在染色体中或可为染色体外的，可包含在人工染色体中，可存在于任何染色体实体或染色体外实体中例如常染色体复制实体(例如附加型质粒或载体)。根据本发明的靶多核苷酸对宿主细胞而言可为天然的或外来的。根据本发明的靶多核苷酸优选与前间区序列邻近基序(pam)关联，所述pam是由crispr-cas复合物识别的短多核苷酸。优选地，靶多核苷酸和pam连接，其中pam优选紧邻靶多核苷酸的下游(3')。pam的精确序列序和长度可变化，例如具有相似功能的不同cas蛋白和核酸酶可需要不同的pam序列。根据本发明的优选的pam是长度为2-8个核苷酸的多核苷酸。优选的pam选自下组：5′-xgg-3′、5′-xggxg-3′、5′-xxagaaw-3′、5′-xxxxgatt-3′、5′-xxagaa-3′、5′-xaaaac-3′，其中x可为任何核苷酸或其类似物，优选任何核苷酸；而w是a或t。更优选的pam是5'-xgg-3'。pam优选与cas蛋白匹配。最广泛使用的cas/crispr系统源自酿脓链球菌(s.pyogenes)，且匹配的pam序列5'-xgg-3'位于靶序列的紧邻下游(3')。脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)cas蛋白的优选pam是5'-xxxxgatt-3'；嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)cas蛋白的优选pam是5'-xxagaa-3'；齿垢密螺旋体(treponemadenticola)的优选pam是5'-xaaaac-3'。优选的pam与所用的cas蛋白匹配。可改造根据本发明的cas蛋白以匹配与匹配野生型cas蛋白的天然pam不同的pam。因此，根据本发明的crispr-cas系统可用于定制的特异性靶向。术语“杂交”是指其中一种或多种多核苷酸反应形成复合物的反应，所述复合物经由核苷酸残基的碱基之间的氢键合。所述氢键合可通过watsoncrick碱基配对、hoogstein结合或以任何其他序列特异性方式发生。所述复合物可包含形成双链结构的两条链，形成多链复合物的三条或更多条链，单一自杂交链或这些的任何组合。杂交反应可构成更广泛过程中的步骤，例如通过酶剪切多核苷酸。优选的杂交条件是根据本发明的宿主细胞内的生理条件。在本发明所有实施方案的上下文中，术语“来源”是指包含引导多核苷酸和cas蛋白的crispr-cas系统的任何来源。所述引导多核苷酸和cas蛋白可存在于不同的来源。在这种情况下，根据本发明的组合物包含crispr-cas系统，其包含引导多核苷酸的来源和cas蛋白的来源。任何来源意指引导多核苷酸和cas蛋白可以它们可在crispr-cas系统内起作用的形式存在。引导多核苷酸和/或cas蛋白可以其活性形式提供，并且可(例如)由非活性形式或由另一种实体提供。引导多核苷酸可(例如)存在于另一多核苷酸上或可由多核苷酸编码，所述多核苷酸被转录以提供实际的引导多核苷酸。cas蛋白可由多核苷酸(例如dna或mrna)编码，所述多核苷酸被转录和/或翻译以提供实际的cas蛋白。编码的多核苷酸可存在于如本文定义的核酸构建体中和/或如本文定义的载体中。此类核酸构建体和载体在本文中称为根据本发明的核酸构建体和根据本发明的载体。优选地，在根据本发明的组合物中，相关功能的cas蛋白或核酸酶由多核苷酸编码和/或所述引导多核苷酸由多核苷酸编码或存在于多核苷酸上。优选地，在根据本发明的组合物中，相关功能的cas蛋白或核酸酶由多核苷酸编码和/或所述引导多核苷酸由另一多核苷酸编码或存在于另一多核苷酸上，且所述多核苷酸包含在载体中。优选地，在根据本发明的组合物中，所述引导多核苷酸由多核苷酸编码，所述多核苷酸被转录以提供实际的引导多核苷酸。因此，在一个实施方案中，在根据本发明的组合物中，优选地，所述引导多核苷酸以编码所述引导多核苷酸的多核苷酸的形式存在，并且引导多核苷酸是在宿主细胞中转录所述多核苷酸时获得的。优选地，在根据本发明的组合物中，所述cas蛋白由多核苷酸编码，并且所述引导多核苷酸由另一多核苷酸编码或存在于另一多核苷酸上，并且所述多核苷酸包含在一个载体中。优选地，在根据本发明的组合物中，所述cas蛋白由包含在载体中的多核苷酸编码，并且引导多核苷酸由包含在另一载体中的另一多核苷酸编码或存在于包含在另一载体中的另一多核苷酸上。优选地，编码cas蛋白的载体是低拷贝载体和/或驱动cas转录物表达的启动子是低强度启动子，且编码引导多核苷酸的载体是高拷贝载体和/或驱动grna转录物表达的启动子是高强度启动子。这允许cas蛋白和引导多核苷酸的差异表达；cas蛋白可(例如)以低于引导多核苷酸的水平表达。可通过任何方法估计启动子强度，例如通过rna测序。rna测序(rnaseq)是一种高灵敏度和精准的用于测量不同条件下的转录组的表达的工具。它允许在转录水平上定量基因表达的近似值，其被报道为rpkm值(每百万映射读段的转录物的每千碱基读段)。来自裂殖壶菌属(schizochytrium)的代表性基因的rpkm值和相对启动子强度在表1中提供。表1低强度(即弱)裂殖壶菌属启动子的实例包括但不限于那些驱动类胡萝卜素合酶表达的启动子。中等强度(即中等)裂殖壶菌属启动子的实例包括但不限于那些驱动α微管蛋白表达的启动子。高强度(即强)裂殖壶菌属启动子的实例包括但不限于那些驱动延长因子-1(ef-1)表达的启动子。尽管认为rpkm值通常指示相对启动子强度，但本领域技术人员已知在其天然基因组环境中的启动子在表达载体的上下文中可不具有完全相同的强度。因此，本领域技术人员会理解，表1中提供的相对启动子强度可在本发明的上下文中变化。因此，本发明提供同样供给引导多核苷酸和cas蛋白的可能性，或它们在载体上编码或存在于载体上的可能性。在后者，编码的多核苷酸可各自在分开的载体上或可同时在单个载体上。因此，在实施方案中，本发明提供根据本发明的组合物，其中编码根据本发明的cas蛋白的多核苷酸、引导多核苷酸或编码根据本发明的引导多核苷酸的多核苷酸存在于单个载体上，所述载体可进一步包含表达编码产物所必需的任何元件，例如启动子和终止子元件。这种单个(一体化)载体具有crispr-cas系统所必需的所有组分一起存在的优势，此外，单个转化事件(任选与供体多核苷酸组合)足以将所有组分导入宿主细胞中。载体在本发明的所有实施方案的上下文中，载体可为任何载体(如质粒或病毒)，其可便利地进行重组dna过程且可介导根据本发明的多核苷酸的表达。载体的选择将通常取决于载体与宿主细胞的相容性，其中所述载体导入该细胞中。优选的载体是用于本文实施例中的载体。载体可为线性多核苷酸或线性或闭环的质粒。载体可为整合的或自主复制的载体(即以染色体或染色体外实体存在的载体，其复制取决于或独立于染色体复制，如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体)。优选地，载体可为当引入宿主细胞时整合到基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。整合载体可随机地或在宿主细胞的染色体中的预定靶基因座处整合。优选的整合载体包含dna片段，其与宿主细胞基因组中预定靶基因座中的dna序列同源，用于靶向载体整合至该预定基因座。为了促进靶向整合，优选在转化细胞之前将载体线性化。优选进行线性化，使得载体的至少一个但优选任一末端侧翼有靶基因座同源的序列。靶基因座侧翼的同源序列的长度优选为至少30bp、优选至少50bp、优选至少0.1kb、甚至优选至少0.2kb、更优选至少0.5kb、甚至更优选至少1kb、最优选至少2kb。优选地，通过增强的宿主细胞的同源重组能力，增加靶向整合到宿主细胞基因组中的效率，即在预定靶基因座中的整合。载体中的同源侧翼dna序列(其与靶基因座同源)可源自表达的基因座，意味着它们源自基因，其能够在宿主细胞中表达。侧翼dna序列可与选择标记基因连接，从而当向培养基补充合适的选择试剂时，转化的细胞会生长。侧翼dna序列可通过本领域技术人员已知的任何方法设计；一种优选的设计将同源重组引导至编码饱和和/或多不饱和脂肪酸合酶(pufa合酶)的基因，使得这些合酶的突变或破坏产生针对饱和和/或多不饱和脂肪酸的营养缺陷型。对饱和和/或不饱和脂肪酸营养缺陷的细胞需要饱和和/或多不饱和脂肪作为生长补充剂。另一种优选的设计能够表达显性选择标记基因，使得所述选择标记基因的转化子能够在适当的显性选择试剂存在下生长。可将根据本发明的一个以上拷贝的多核苷酸插入微生物宿主细胞中以介导由所述多核苷酸编码的产物的产生。这可优选地通过将多个拷贝的多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中，或通过在可操作的构型中靶向多核苷酸在高度表达的基因座处的整合来完成。或者，通过将可扩增的选择标记基因与根据本发明的多核苷酸包括在一起，可实现多拷贝的整合，从而可通过在适当的选择试剂存在下培养该细胞来选择含有扩增拷贝的选择标记基因(以及由此含有附加拷贝的核酸序列)的细胞。为了进一步增加根据本发明的多核苷酸拷贝数，可使用wo98/46772中所述的基因转换技术。当编码根据本发明的的cas蛋白的根据本发明的多核苷酸和/或根据本发明的引导多核苷酸整合至宿主细胞的基因组中，可为合意的是从基因组切除多核苷酸，如当所需的基因组编辑已经发生时。多核苷酸的切除可通过本领域技术人员已知的任何方法进行；一个优选的方法是通过用修复基因突变或破坏的核苷酸的二级转化，所述基因突变或破坏诱导营养缺陷型，使得已经治愈营养缺陷型的细胞反而可通过在其中营养缺陷型所需的营养已经被省略的培养基中生长来选择。另一种切除方法是使用根据本发明的crispr-cas系统。根据本发明的载体可为单个载体或质粒或包含两个或更多个载体或质粒的载体系统，其一起含有待导入宿主细胞中的根据本发明的多核苷酸。根据本发明的载体可含有一个或多个选择标记，其允许简单选择转化的细胞。在实施方案中，在根据本发明的组合物中，一个或多个或所有载体包含选择标记，优选各载体包含不同选择标记。选择标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性，对重金属的抗性，针对营养缺陷型的原养性等。可将选择标记作为表达盒引入细胞中的载体上或可引入单独的载体上。用于网粘菌纲(labyrinthulomycete)细胞中的选择标记可选自下组，其包括但不限于nptii(新霉素磷酸转移酶ii，赋予巴龙霉素抗性)、als(乙酰乳酸合酶，赋予甲嘧磺隆(sulfometuronmethyl)抗性)、bsd(杀稻瘟菌素-s-脱氨酶，赋予杀稻瘟菌素抗性)和shble(结合腐草霉素，赋予博来霉素(zeocin)抗性)。或者，可使用特异性选择标记，如营养缺陷型标记，其需要携带如前所述的菌株的饱和或多不饱和脂肪酸合酶基因的失活突变的相应突变的宿主细胞。在优选的实施方案中，在引入表达构建体后，从转化的宿主细胞中缺失选择标记，以获得能够产生无选择标记基因的多核苷酸的转化的宿主细胞。用于连接上述元件以构建根据本发明的载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如sambrook和russell,molecularcloning:alaboratorymanual,第3版,cshlpress,coldspringharbor,ny,2001；和ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,wileyinterscience,ny,1995)。在本发明所有实施方案的上下文中，cas蛋白是指适用于本发明目的的任何cas蛋白。cas蛋白可包含酶活性或者可不包含酶活性。cas蛋白的非限制性实例包括cas1、cas1b、cas2、cas3、cas4、cas5、cas6、cas7、cas8、cas9(也称为csn1和csx12)、cas10、csy1、csy2、csy3、cse1、cse2、csc1、csc2、csa5、csn2、csm2、csm3、csm4、csm5、csm6、cmr1、cmr3、cmr4、cmr5、cmr6、csb1、csb2、csb3、csx17、csx14、csx10、csx16、csax、csx3、csx1、csx1s、csf1、csf2、csf3、csf4、其同源物或其修饰形式。这些cas蛋白质是本领域技术人员已知的；例如，酿脓链球菌(s.pyogenes)cas9蛋白的氨基酸序列可在swissprot数据库中以登录号q99zw2找到。优选地，根据本发明的未修饰的cas蛋白具有dna切割活性，例如cas9。优选地，相应的cas蛋白质是cas9，并且可为来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(s.pneumoniae)的cas9。优选地，根据本发明的cas蛋白指导靶多核苷酸位点处的一条或两条多核苷酸链的剪切，如在靶多核苷酸内和/或靶多核苷酸的反向互补物内。靶多核苷酸的位点处在本文中定义为在距靶多核苷酸的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多个核苷酸内；更优选地，在距靶多核苷酸的第一个或最后一个核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多个核苷酸内；甚至更优选地，在距靶多核苷酸的第一个或最后一个核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50个核苷酸内。因此，根据本发明的cas蛋白质优选地指导在距靶多核苷酸的第一个或最后一个核苷酸约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500个核苷酸内的一条或两条多核苷酸链的剪切；更优选地，在距靶多核苷酸的第一个或最后一个核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多个核苷酸内的一条或两条多核苷酸链的剪切；甚至更优选地，在距靶多核苷酸的第一个或最后一个核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50个核苷酸内的一条或两条多核苷酸链的剪切。通常，根据本发明的靶多核苷酸与pam序列相关联(在本文别处定义)且pam序列优选紧邻靶序列的下游(3')；通常，crispr-cas复合物的形成通常导致pam序列上游(5')3个碱基对的一条或两条多核苷酸链的切割。优选地，根据本发明的组合物中的cas蛋白质具有指导剪切靶多核苷酸的位点处的两个多核苷酸链的活性。通常，cas核酸酶活性通过两个单独的催化域进行，即ruvc和hnh。每个域切割一条多核苷酸链，每个域可通过单个点突变失活。因此，可相对于相应的野生型cas蛋白方便地突变根据本发明的cas蛋白，使得突变的cas蛋白具有改变的核酸酶活性且缺乏剪切靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自酿脓链球菌的cas9的ruvci催化域中的天冬氨酸至丙氨酸取代(d10a)将cas9从将剪切两条链的核酸酶转换为切口酶，该切口酶在本文中定义为切割靶多核苷酸的单个链的cas蛋白。使cas9成为切口酶的突变的其他实例包括但不限于h840a、n854a和n863a。在本发明的上下文中，具有切口酶活性的cas蛋白可通过同源重组用于基因组编辑，优选根据ran等,2013的双切口技术。因此，根据本发明优选的cas蛋白包含至少一个突变，使得该蛋白相较于相应的野生型cas蛋白，具有已经改变的核酸酶活性，优选具有在靶序列的位点处直接剪切单个多核苷酸链的活性。这种所谓的切口酶突变体可方便地用于双链体装配，即在根据本发明的组合物中，其包含具有ruvc突变的cas蛋白切口酶突变体和其中nhn突变的cas蛋白切口酶突变体，使得一个cas蛋白质突变体使多核苷酸靶物的一条链断口，且另一个cas蛋白质突变体使多核苷酸靶物的另一条链断口。取决于所用的两种引导多核苷酸，两种不同的crispr-cas复合物将有效地在多核苷酸靶物中产生两个单链切口；这些切口可为几个核苷酸，相隔多至5、10、20、30或更多。这种双切口方法极大地增强了非同源末端连接(nejh)的特异性。关于双切口的背景知识可在例如ran等,2013中发现。根据本发明的cas蛋白可包含两个或更多个cas9的突变的催化域(例如ruvci、ruvcii和/或ruvciii)，以导致基本上缺乏所有dna切割活性的突变的cas9。在一些实施方案中，d10a突变与h840a、n854a或n863a突变中的一个或多个组合，以产生基本上缺乏所有dna切割活性的cas9酶。优选地，相对于其非突变形式，当突变酶的dna剪切活性小于约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更低时，认为cas蛋白基本上缺乏所有dna剪切活性。基本上缺乏所有酶活性的cas蛋白可方便地用于基因沉默或表达的下调，因为crispr-cas复合物将阻碍靶多核苷酸的转录。其他突变可能是有用的；其中cas9或其他cas蛋白来自除酿脓链球菌外的物种，可进行相应的氨基酸中的突变以实现类似的效果；本领域技术人员知道如何鉴定这些相应的氨基酸。根据本发明的cas蛋白可为融合蛋白并且包含至少一个异源功能域，这种域优选是包含foki活性的域，如由aggarwal等(aggarwal,a.k.；wah,d.a.；hirsch,j.a.；dorner,l.f.；schildkraut,i.(1997)“structureofthemultimodularendonucleasefokiboundtodna”.nature388(6637):97-100)所述。foki酶天然存在于海床黄杆菌(flavobacteriumokeanokoites)中且是一种细菌iis型限制性内切核酸酶，其由n-末端dna结合域和c末端处的非特异性dna切割域组成(durai等,2005)。当foki蛋白通过其在5'-ggatg-3':3'-catcc-5'识别位点处的dna结合域与双链dna结合时，dna剪切域被激活并剪切(而无进一步的序列特异性)识别位点的最近核苷酸的第一条链下游9个核苷酸和第二条链上游13个核苷酸(wah等,1998)。cas9-foki融合已经在(尤其是)guilinger等,2014中；和在tsai等,2014中进行了描述。除cas蛋白外，根据本发明的cas融合蛋白可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个域。可与cas蛋白融合的蛋白域的实例包括但不限于表位标签、报告基因序列和具有以下一种或多种活性的蛋白结构域：甲基化酶活性、去甲基化酶活性、转录激活活性、转录抑制活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、rna切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(his)标签、v5标签、flag标签、流感血凝素(ha)标签、myc标签、vsv-g标签和硫氧还蛋白(trx)标签。报告基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-s-转移酶(gst)、辣根过氧化物酶(hrp)、氯霉素乙酰转移酶(cat)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白(gfp)、hcred、dsred、青色荧光蛋白(cfp)、黄色荧光蛋白(yfp)和自发荧光蛋白(包括蓝色荧光蛋白(bfp))。cas蛋白可融合至编码蛋白或结合dna分子或结合其他细胞分子的蛋白的片段(包括但不限于麦芽糖结合蛋白(mbp)、s标签、lexadna结合域(dbd)融合物，gal4dna结合域融合物和单纯疱疹病毒(hsv)bp16蛋白融合物)的基因序列。可形成包含crispr酶的融合蛋白的一部分的其他域描述于us20110059502中。标记的cas蛋白可用于鉴定靶多核苷酸的位点。根据本发明优选的cas融合蛋白包含如上文所定义的foki域。根据本发明优选的cas蛋白包含核定位序列，优选异源核定位序列。这种核定位序列也称为核定位信号。优选地，这种核定位信号赋予crispr-cas复合物足够的强度以在宿主细胞的细胞核中以可检测的量驱动所述crispr-cas复合物的积累。不希望受理论束缚，认为在宿主细胞中核定位序列对于crispr-cas活性不是必需的，但包括此类序列的核定位序列增强了所述系统的活性，尤其是将核酸分子靶向细胞核中的活性。这种核定位序列优选存在于cas蛋白中，但也可存在于其他任何地方使得促进crispr-cas系统靶向细胞核。优选的核定位序列是sv40核定位序列。在根据本发明的组合物和任何其他实施方案中，cas蛋白编码多核苷酸优选地是其待在宿主细胞中表达的密码子优化的，更优选地，cas蛋白编码多核苷酸是密码子对优化的。通常，密码子优化是指通过用保持天然氨基酸序列的宿主细胞基因中更频繁或最常用的密码子替换天然序列的至少一个密码子(例如超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)来修饰核酸序列以增强目的宿主细胞中的表达的方法。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特别的偏好。密码子偏好(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使rna(mrna)的翻译效率相关，而认为信使rna(mrna)的翻译效率取决于(除了其它方面)被翻译的密码子的特性和特定转运rna(trna)分子的可用性。所选择的trna在细胞中的优势通常是肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，可基于密码子优化来定制在给定生物中最佳基因表达的基因。密码子使用表是容易获得的，例如在“密码子使用数据库”中，并且这些表可以多种方式进行调整。参见，例如nakamura,y.,等,2000。还可得到用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法，如geneforge(aptagen；jacobus,pa)。优选地，编码cas蛋白的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个或所有密码子)对应于特定的氨基酸的最常用的密码子。用于密码子优化的优选方法描述于wo2006/077258和wo2008/000632中。wo2008/000632解决了密码子对优化。密码子对优化是一种方法，其中编码多肽的核苷酸序列已经就其密码子使用方面进行修饰，特别是使用的密码子对，以获得编码多肽的核苷酸序列的改善的表达和/或改进的产生编码的多肽。密码子对被定义为编码序列中的两个后续三联体(密码子)的集合。根据本发明的组合物中的来源中cas蛋白的量可变化，并且可针对最佳性能进行优化。在宿主细胞中避免过高水平的cas蛋白可能是方便的，因为高水平的cas蛋白可能对宿主细胞有毒，即使没有引导多核苷酸存在(参见，例如ryan等,2014和jacobs等,2014)。本领域技术人员知道如何调控表达水平，如通过选择较弱的启动子、阻抑性启动子或诱导型启动子来表达cas蛋白。适用于表达蛋白的启动子的实例在本文别处描述。在根据本发明的组合物中，其中根据本发明的引导多核苷酸由多核苷酸编码，可通过与编码多核苷酸可操作地连接的启动子促进引导多核苷酸的表达。这种启动子可为本领域技术人员已知的任何合适的启动子。可使用几种类型的启动子。使用rna聚合酶iii启动子或rna聚合酶ii启动子可为方便的。可在marck等,2006中找到关于rna聚合酶iii及其启动子的背景知识。因此，使用rna聚合酶ii启动子可为便利的；这些是本领域技术人员已知的，且在(例如)kornberg,1999中进行了综述。然而，来自rnaii聚合酶的转录物通常具有复杂的转录终止子，转录物是多腺苷酸化的；这可能妨碍引导多核苷酸的要求，因为需要精确定义其5'和3'末端以实现产生功能性crispr-cas系统所需的二级结构。然而，可避免这些缺点。在使用rna聚合酶ii启动子的情况下，编码引导多核苷酸的多核苷酸也可编码自处理核酶，并且可以与rna聚合酶ii启动子可操作地连接；如此，多核苷酸编码包含引导多核苷酸和自处理核酶的前引导多核苷酸，其中，当转录时，引导多核苷酸由来自前引导多核苷酸转录物的自处理核酶释放。包含编码与rna聚合酶ii启动子可操作地连接的根据本发明的前引导多核苷酸的多核苷酸的优选构建体是本文实施例1-4中描述的那些。关于这种构建体的背景知识可在(例如)gao等,2014中发现。优选地，在根据本发明的组合物中，所述引导多核苷酸由多核苷酸编码。优选地，在根据本发明的组合物中，其中所述引导多核苷酸由多核苷酸编码，所述多核苷酸与rna聚合酶ii启动子可操作地连接，并编码包含引导多核苷酸和自处理核酶的前引导多核苷酸，其中，当转录时，引导多核苷酸由来自前引导多核苷酸转录物的自处理核酶释放。包含与rna聚合酶ii启动子可操作地连接的编码本发明的前引导多核苷酸的多核苷酸的优选构建体是本文实施例1-4中描述的那些。方便地，多个前引导多核苷酸和多个自处理核酶可由单个多核苷酸编码，所述多核苷酸与一个或多个rna聚合酶ii启动子可操作地连接。根据本发明第一方面的组合物可方便地用于调节宿主细胞中多核苷酸的表达。因此，在第二方面，本发明提供了调节宿主细胞中多核苷酸表达的方法，其包含使宿主细胞与根据本发明第一方面的组合物接触，其中所述引导多核苷酸指导cas蛋白在宿主细胞中的靶多核苷酸处的结合以形成crispr-cas复合物。本发明上下文中的术语“表达”在本文中定义为多核苷酸模板转录多核苷酸的过程(例如将dna模板多核苷酸转录成mrna多核苷酸转录物或其他rna转录物)和/或随后将mrna转录物翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果所述多核苷酸转录物源自基因组模板dna，则表达可包括在宿主细胞中mrna转录物的剪接。术语“调节表达”在本文中是指与亲本宿主细胞相比增加或减少的表达，所述亲本宿主中当使用相同条件测定时表达未被调节。减少的表达可为转录物(如mrna)的减少量和/或翻译产物(如多肽)的减少量。由此可见，增加的表达可为转录物的增加量(如mrna)和/或翻译产物(如多肽)的增加量。优选地，所述crispr-cas复合物在靶多核苷酸的位点处剪切一条或两条多核苷酸链，其形成基因产物的调节表达。所述crispr-cas复合物也可具有改变的核酸酶活性，并且基本上缺乏剪切靶多核苷酸的一条或两条链的能力；在这种情况下，通过复合物与靶多核苷酸的结合来调节表达。基本上缺乏所有酶活性的cas蛋白可方便地用于基因沉默或表达的下调，因为所述crispr-cas复合物会阻碍从靶多核苷酸的转录。或者，可将cas蛋白修饰成转录因子以用于感兴趣的基因的可编程的转录激活或沉默(larson等,2013)。根据本发明第一方面的组合物可方便地用于多核苷酸的缺失。在实施方案中，当根据本发明第一方面的组合物包含至少一种或两种引导多核苷酸的来源和/或至少一种cas蛋白的来源，形成至少一个crispr-cas复合物或两种不同的crispr-cas复合物，其在靶多核苷酸的一个位点或不同位点处剪切一条或两条多核苷酸链，其导致来自靶多核苷酸中多核苷酸片段的缺失。优选地，根据本发明的包含至少一种或两种引导多核苷酸和/或至少一种cas蛋白的来源的这类组合物额外地包含如下文定义的外源多核苷酸，其与由引导多核苷酸靶向的至少一个或两个靶多核苷酸部分地互补。这种待缺失的多核苷酸片段或缺失的片段可为几个核苷酸长度，多至几千个核苷酸长度，可以缺失整个基因或缺失一簇基因。因此，本发明提供了调节宿主细胞中多核苷酸表达的方法，其中从靶多核苷酸中缺失多核苷酸片段。在一个实施方案中，调节表达的方法包括在靶多核苷酸的至少一个位点处剪切一条或两条多核苷酸链，然后通过具有外源多核苷酸的同源重组修饰靶多核苷酸。在这种情况下，优选地，根据本发明第一方面的组合物进一步包含这种外源多核苷酸。这种修饰可导致靶多核苷酸中至少一个核苷酸的插入、缺失或取代，其中插入或取代核苷酸可源自外源多核苷酸。当外源多核苷酸是非整合实体时，也可进行修饰，如dong等和beetham等所述；在这种情况下，所述靶多核苷酸被修饰，但外源多核苷酸的核苷酸不被引入靶多核苷酸中。因此，当将根据本发明的cas蛋白质作为蛋白质引入宿主细胞中时，所得宿主是非重组宿主细胞。外源多核苷酸可为任何感兴趣的多核苷酸，如编码如下文定义的感兴趣的化合物的多核苷酸，或这种多核苷酸的一部分或其变体。此类外源多核苷酸在本文中称为根据本发明的外源多核苷酸，且可为单链或双链的。本领域技术人员可考虑用于根据本发明的组合物和方法的各种应用。可使用根据本发明的组合物和方法修饰、编辑或断裂基因组中的多核苷酸(或基因)。例如，当使用完全活性的cas蛋白剪切靶多核苷酸的两条链时，且当没有外源多核苷酸作为合适的修复模板存在时，通过非同源末端连接修复(nhej)修复双链断裂。在nhej期间，可能发生一个或几个核苷酸的插入和/或缺失(可能在某些情况下其被解释为取代)，这些在修复位点处随机插入或缺失；这是nhej的特点。这种插入和/或缺失可能影响编码序列的阅读框，其导致基因产物中的氨基酸变化或甚至在(过早)终止密码子的发生或剪接位点的改变的情况下截短的蛋白质。当外源多核苷酸作为修复模板存在时，可使用同源末端连接修复(hej，也称为同源定向修复(hdr))，使用根据本发明的组合物和方法修饰、编辑或断裂基因组中的多核苷酸(或基因)。例如，当具有与靶多核苷酸序列同一性的外源多核苷酸(即断裂的双链上游(5')和下游(3'))与根据本发明的crispr-cas系统一起存在时，hdr会在靶多核苷酸中的双链断裂处引入(或者实际上是复制)外源多核苷酸的相应核苷酸。优选地，根据本发明的外源多核苷酸不含其后是功能性pam序列的靶序列本身，以避免外源多核苷酸本身或修饰的靶多核苷酸被crispr-cas系统(再)切割的风险。在本发明的实施方案中，当根据本发明的crispr-cas系统包含外源多核苷酸(供体多核苷酸、供体dna、修复模板)时，根据本发明的crispr-cas系统优选地包含由一个或多个单独的多核苷酸或载体编码或存在于一个或多个单独的多核苷酸或载体上的两个或更多个引导多核苷酸，且两个或更多个外源多核苷酸与所述crispr-cas系统一起提供，其使得能够形成两个或更多个crispr-cas复合物。在根据本发明的方法中，根据本发明的这种crispr-cas系统可方便地用于调节两个或多个靶多核苷酸处的表达，即靶向多个靶位点的方法。根据本发明的这种crispr-cas系统会偶然地在一个或多个靶多核苷酸处形成一个、两个或更多个crispr-cas复合物。此类方法可用于在宿主细胞的基因组中产生一个或多个插入、缺失、取代(任选地与一个或多个外源多核苷酸组合)，或通过形成的crispr-cas复合物调节基因的表达。宿主细胞在根据本发明此方面的方法中，优选的宿主细胞包含编码如本文其他地方所定义的感兴趣的化合物的多核苷酸。在根据本发明此方面的方法中，所述宿主细胞可为重组宿主细胞或者可为非重组宿主细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是网粘菌纲(labyrinthulomycete)，优选是破囊壶菌目的成员，优选是破囊壶菌科的成员，更优选是选自下组的菌属的成员：aurantiochytrium、oblongichytrium、裂殖壶菌属(schizochytrium)、破囊壶菌属(thraustochytrium)和吾肯氏壶菌属(ulkenia)，甚至更优选裂殖壶菌属菌种atcc#20888。根据本发明的此方面的调控宿主细胞中多核苷酸表达的方法得到修饰的宿主细胞，其优选包含根据本发明的第一方面的组合物的组分。因此，在第三方面，本发明提供了包含根据本发明第一方面的组合物的宿主细胞。此类宿主细胞可为如本文所定义的任何宿主细胞，并且可进一步包含编码本文其他地方所定义的感兴趣的化合物的多核苷酸。在第四方面，本发明提供了一种产生宿主细胞的方法，其包括使宿主细胞与根据本发明第一方面的组合物接触，其中所述引导多核苷酸指导cas蛋白在宿主细胞中的靶多核苷酸处的结合以形成crispr-cas复合物。在一个实施方案中，与根据本发明第一方面的组合物的接触可以分两步进行，其中首先使所述宿主细胞与根据本发明的cas蛋白来源接触，然后使所述宿主细胞与根据本发明的引导多核苷酸来源和任选的根据本发明的外源多核苷酸接触。本发明该实施方案中的宿主细胞可为如本文所定义的任何类型的宿主细胞，并且可包含编码如本文其他地方所定义的感兴趣的化合物的多核苷酸。产生根据本发明的宿主细胞的优选方法包含产生后代宿主细胞的步骤，其中在所述后代宿主细胞中，不再存在根据本发明的crispr-cas系统的组分。根据本发明第一方面的组合物可为本文定义的任何此类组合物。使宿主细胞与根据本发明的组合物接触可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。可简单地将根据本发明的宿主细胞置于包含根据本发明的组合物的溶液中。可使用将根据本发明的组合物递送到宿主细胞中的具体方法。本领域技术人员知道这些方法(参见例如sambrook和russell；ausubel,同上)，其包括但不限于电穿孔方法、粒子轰击或微粒轰击、原生质体方法和土壤杆菌介导的转化(amt)。可使用本领域已知的任何方法转化网粘菌纲。破囊壶菌的遗传转化的一般技术在美国专利号7,001,772和8,637,651中以及由cheng等(2012)详细描述，其所有通过提述以其整体并入本文。优选地，所述crispr-cas复合物在靶多核苷酸的位点处剪切一条或两条多核苷酸链，其得到基因产物的调控表达。所述crispr-cas复合物也可能具有改变的核酸酶活性，并且缺乏剪切靶多核苷酸的一条或两条链的能力；在这种情况下，通过所述复合物与靶多核苷酸的结合来调控表达。在一个实施方案中，当根据本发明第一方面的组合物包含至少一个或两个引导多核苷酸来源和/或至少一个cas蛋白来源时，形成至少一个crispr-cas复合物或两个不同的crispr-cas复合物，其在靶多核苷酸的一个位点或不同位点处剪切一条或两条多核苷酸链，导致多核苷酸片段从靶多核苷酸中缺失。优选地，根据本发明的这种组合物包含至少一个或两个引导多核苷酸和/或至少一个cas蛋白的来源，额外地包含如下文所定义的外源多核苷酸，其与由引导多核苷酸靶向的至少一个或两个靶多核苷酸至少部分地互补。待缺失的这种多核苷酸片段或缺失的片段长度可为从几个核苷酸多至几千个核苷酸，可缺失整个基因或缺失一簇基因。因此，本发明提供了调控宿主细胞中多核苷酸表达的方法，其中从靶多核苷酸中缺失多核苷酸片段。在一个实施方案中，调节宿主细胞中多核苷酸表达的方法(其中从靶多核苷酸中缺失多核苷酸片段)包含使宿主细胞与本文所述的组合物接触，其中所述引导多核苷酸指导cas蛋白在宿主细胞中靶多核苷酸处结合以形成crispr-cas复合物。优选地，调节宿主细胞中多核苷酸表达的方法(其中从靶多核苷酸中缺失多核苷酸片段)包含使宿主细胞与本文所述的组合物接触，其中所述引导多核苷酸指导cas蛋白在宿主细胞中的靶多核苷酸处结合以形成crispr-cas复合物。在另一个优选的实施方案中，调节宿主细胞中多核苷酸表达的方法(其中多核苷酸片段从靶多核苷酸中缺失)包含使宿主细胞与本文所述的组合物接触，其中所述引导多核苷酸指导cas蛋白在宿主细胞中靶多核苷酸处结合以形成crispr-cas复合物，其中如本文所述的组合物不包含外源或供体多核苷酸。在调节宿主细胞中多核苷酸表达的方法的另一个实施方案中，该组合物包含在自主复制载体中。因此，在一个实施方案中，本发明涉及调节细胞中多核苷酸表达的方法(其中从靶多核苷酸中缺失多核苷酸片段)包括使宿主细胞与本文所述的但优选不包含如本文所定义的供体多核苷酸组合物接触，其中所述引导多核苷酸指导cas蛋白在宿主细胞中靶多核苷酸处的结合以形成crispr-cas复合物。在一个优选的实施方案中，所述cas蛋白具有指导靶序列的位点处的两条多核苷酸链的剪切活性，且其中所述剪切发生在包含在两个同源区之间的基因组区域中，所述两个同源区由cas蛋白剪切后彼此重组以得到包含在所述区域之间的多核苷酸的缺失。优选地，所述两个同源区之间的同源性程度是允许同源重组的。优选地，所述两个同源区在同源区的整个长度上具有至少60％、70％、80％、90％、99％或100％的序列同一性。令人惊讶地发现，即使在网粘菌纲中同源区的长度也可非常短，其中通常需要至少1个或几个kbp的长度以允许同源重组。因此，在优选的实施方案中，所述同源区的长度优选为至多1kb、至多0.5kb、至多100bp、至多50bp、至多40bp、至多30bp、至多20bp、至多10bp。优选地，所述两个同源区之间的距离为至多10kb、至多9kb、至多8kb、至多7kb、至多6kb、至多5kb、至多4kb、至多3kb、至多2kb、最多1kb、至多0.5kb、至多100bp、至多50bp、至多40bp、至多30bp、至多20bp、至多10bp。在一个方面，本发明涉及能够识别基因组中pam位点的软件算法以设计靶向一个或多个pam位点的方法和在不使用供体dna的情况下产生多核苷酸的缺失，所述基因组包含在pam位点附近约7-20bp的同源区之间。上述方法可用于以设计的方式有效去除多核苷酸序列。例如，在将cas9表达盒引入基因组dna中并且在由crispr/cas9系统介导的几轮修饰后，可通过引入靶向cas9表达中的位点的grna从所述基因组中去除cas9表达盒，且其中cas9表达盒包含在如上定义的两个同源区之间，优选100-bp长，更优选20-bp、15-bp长或更短，并切除cas9开放阅读框或大部分表达盒。上述方法也可用于基因的瞬时失活。例如，可以通过在类胡萝卜素合成酶或饱和脂肪酸合酶或多不饱和脂肪酸合酶的orf中插入多核苷酸序列来使基因(例如，类胡萝卜素合成酶或饱和脂肪酸合酶或多不饱和脂肪酸合酶)无功能，其包含分别在5'-末端和3'-末端处包含两个同源区，其中优选同源区是100bp，更优选20bp、15bp长或更短。如上所述，可使用不含供体dna的crispr-cas9系统再次使上述合酶基因发挥功能。在一个实施方案中，调节表达的方法包含在靶多核苷酸的至少一个位点处剪切一条或两条多核苷酸链，然后通过用外源多核苷酸的同源重组修饰靶多核苷酸。在这种情况下，根据本发明第一方面的组合物优选地进一步包含这种外源多核苷酸。这种修饰可导致靶多核苷酸中至少一个核苷酸的插入、缺失或取代，其中所述插入或取代核苷酸可以或可以不源自外源多核苷酸。在一个实施方案中，所述外源多核苷酸包含与靶多核苷酸同源的区域。优选地，这些同源区之间的同源性程度是如此允许同源重组的。优选地，同源区在同源区的整个长度上具有至少60％、70％、80％、90％、99％或100％的序列同一性。当外源多核苷酸是非整合实体时，也可进行修饰；在这种情况下，靶多核苷酸被修饰，但不将外源多核苷酸的核苷酸引入靶多核苷酸。因此，当将根据本发明的cas蛋白质引入宿主细胞中时，所得宿主是非重组宿主。在根据本发明该方面的方法中，所述宿主细胞可因此是重组宿主细胞或可为非重组宿主细胞。外源多核苷酸可为任何感兴趣的多核苷酸，如如本文所定义的编码感兴趣的化合物的多核苷酸，或这种多核苷酸的一部分或其变体。在另一方面，本发明提供了产生感兴趣的化合物的方法，其包括在有益于感兴趣的化合物的条件下培养根据本发明第三或第四方面的宿主细胞或通过根据本发明第二方面的方法获得的宿主细胞，或通过根据本发明第四方面的方法可获得的宿主细胞，以及任选地纯化或分离感兴趣的化合物。在本发明所有实施方案的上下文中的感兴趣的化合物可为任何生物化合物。该生物化合物可为生物质或生物聚合物或代谢物。该生物化合物可由构成生物合成或代谢途径的单个多核苷酸或一系列多核苷酸编码，或者可为单个多核苷酸的产物或一系列多核苷酸的产物的直接结果，所述多核苷酸可为基因，所述一系列多核苷酸可为基因簇。在本发明的所有实施方案中，编码感兴趣的生物化合物的单个多核苷酸或一系列多核苷酸或与感兴趣的生物化合物相关的生物合成或代谢途径是根据本发明的组合物和方法的优选靶物。生物化合物对于宿主细胞可为天然的，或者对于宿主细胞可为异源的。术语“异源生物化合物”在本文中定义为对于所述细胞不是天然的生物化合物；或其中已经进行结构修饰以改变天然生物化合物的天然生物化合物。术语“生物聚合物”在本文中定义为相同、相似或不相的亚单元(单体)的链(或聚合物)。生物聚合物可为任何生物聚合物。生物聚合物可例如为但不限于核酸、多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖。生物聚合物可为多肽。所述多肽可为具有感兴趣的生物活性的任何多肽。术语“多肽”在本文中并不是指特定长度的编码产物，且因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语多肽是指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可为直链或支链的，它可包含修饰的氨基酸，并且它可由非氨基酸中断。该术语还包括已经修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作(如与标记组分的缀合)。如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，其包括甘氨酸和d或l两种光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。多肽进一步包括上述多肽的天然存在的等位的和工程化变体以及杂合多肽。所述多肽对于宿主细胞可为天然的或可为异源的。所述多肽可为胶原蛋白或明胶，或其变体或杂合体。所述多肽可为抗体或其部分、抗原、凝血因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调控蛋白、结构蛋白、报道分子或转运蛋白、参与分泌过程的蛋白质、参与折叠过程的蛋白质、分子伴侣、肽氨基酸转运蛋白、糖基化因子、转录因子、合成肽或寡肽、细胞内蛋白质。细胞内蛋白可为酶，如蛋白酶、神经酰胺酶、环氧化物水解酶、氨肽酶、酰化酶、醛缩酶、羟化酶、氨肽酶、脂肪酶。所述多肽也可为细胞外分泌的酶。这些酶可以属于下组：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、右旋糖酐酶、酯酶。所述酶可为糖酶，例如纤维素酶(如内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶)、半纤维素酶或果胶分解酶如木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶甲基酯酶、果胶裂合酶、果胶酸裂合酶、内多聚半乳糖醛酸酶、外多聚半乳糖醛酸酶鼠李糖基半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯木聚糖水解酶、半乳糖醛酸酶、裂合酶或淀粉分解酶；水解酶、异构酶或连接酶、磷酸酶(如肌醇六磷酸酶)、酯酶(如脂肪酶)、蛋白水解酶、氧化还原酶(如氧化酶)、转移酶或异构酶。所述酶可为肌醇六磷酸酶。所述酶可为氨肽酶、天冬酰胺酶、淀粉酶、产麦芽糖淀粉酶、糖酶、羧肽酶、内切蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、卤过氧化物酶、蛋白质脱氨酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、半乳糖脂肪酶、叶绿素酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化酶、单加氧酶。根据本发明，感兴趣的化合物可为如wo2010/102982中所述的具有改进的分泌特征的多肽或酶。根据本发明，感兴趣的化合物可为融合或杂合多肽，其中另一多肽在所述多肽或其片段的n-末端或c-末端融合。通过将编码一种多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)融合来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列使得它们在框内并且融合多肽的表达在相同的启动子和终止子的控制下。所述杂合多肽可包含从至少两种不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合物，其中一种或多种多肽对于宿主细胞可为异源的。融合多肽和信号序列融合的实例是(例如)如wo2010/121933中所述。生物聚合物可为多糖。所述多糖可为任何多糖，其包括但不限于粘多糖(例如肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如几丁质)。在优选的选择中，所述多糖是透明质酸。编码感兴趣的化合物或编码参与本发明的感兴趣的化合物产生的化合物的多核苷酸可编码参与初级或次级代谢产物，如有机酸、类胡萝卜素、(β-内酰胺)抗生素和维生素的合成的酶。这种代谢物可被认为是根据本发明的生物化合物。术语“代谢物”包括初级和次级代谢物；所述代谢物可为任何代谢物。优选的代谢物是不饱和脂肪和脂质(其包括但不限于脂肪酸二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、芥酸、二十烯酸，十八碳烯酸(顺式或反式)、二十碳五烯酸、二十碳四烯酸(n-3)、花生四烯酸(n-6)、十八碳五烯酸、十八碳四烯酸、亚麻酸(n6或n3)、亚油酸、油酸、棕榈油酸、二十八碳八烯酸(octacosaoctaenoicacid)及其包含的脂质)、饱和脂肪和脂质(其包括但不限于脂肪酸：己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸/二十二烷酸及其包含的脂质)、硫酸化脂质、槐糖脂、内酯、神经酰胺、磷脂、脂肪醇、脂肪酸酯、脂肪酸醚、脂肪酸醛、甾醇、类胡萝卜素、脂氧化物(oxylipins)、消退素(resolvins)、白三烯、前列腺素、有机酸(其包括但不限于乙酸、丁酸、柠檬酸、葡萄糖酸、己二酸、富马酸、衣康酸、苹果酸、甲羟戊酸和琥珀酸)、糖醇和糖酸。代谢物可由(例如)生物合成途径或代谢途径中一种或多种基因编码。初级代谢产物是细胞的初级或一般代谢产物，其涉及能量代谢、生长和结构。次级代谢产物是次级代谢产物(参见，例如r.b.herbert,thebiosynthesisofsecondarymetabolites,chapman和hall,newyork,1981)。初级代谢物可为但不限于氨基酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯或维生素。次级代谢产物可为但不限于生物碱、香豆素、类黄酮、聚酮化合物、奎宁、类固醇、肽或萜烯。次级代谢产物可为抗生素、拒食剂、引诱剂、杀菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂或杀啮齿类剂。生物化合物也可为选择标记的产物。选择标记是感兴趣的多核苷酸的产物，该产物提供抗生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、针对营养缺陷型的原养型等。选择标记包括但不限于nptii(新霉素磷酸转移酶ii)、als(乙酰乳酸合酶)、bsd(杀稻瘟素-s-脱氨酶)和shble(腐草霉素结合)以及其等同物。根据本发明，感兴趣的化合物优选是感兴趣的化合物列表中描述的多肽。根据本发明的另一个实施方案，感兴趣的化合物优选是代谢物。根据本发明的宿主细胞可已经能够产生所述感兴趣的化合物。所述宿主细胞还可以具有编码多肽的同源或异源核酸构建体，其中所述多肽可为感兴趣的化合物或参与感兴趣的化合物产生的多肽。本领域技术人员知道如何修饰藻类宿主细胞，使其能够产生感兴趣的化合物。一般定义在整个说明书和所附权利要求书中，词语“包含(comprise)”、“包括(include)”和“具有(having)”以及变型如“包含(comprises,comprising)”、“包括(includes,including)”为包含性解释的。也就是说，这些词语旨在传达可能包含上下文允许的未具体叙述的其他元素或整数。术语“a,an”在本文中用于指代文中的语法对象中的一个或一个以上(即一个或至少一个)。举例来说，“元件”可表示一个元件或一个以上的元件。词语“约”或“大约”当与数值结合使用(如约10)时，优选地表示该值可为给定值(10)多或少1％的值。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。优选的核苷酸类似物或等同物包含修饰的骨架。这种骨架的实例由吗啉代骨架、氨基甲酸酯骨架、硅氧烷骨架、硫化物、亚砜和砜骨架、甲酰基和硫代甲酰基骨架、亚甲基甲酰基骨架、核乙酰基(riboacetyl)骨架、含烯烃的骨架、氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺骨架、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架，以及酰胺骨干。进一步优选骨架中残基之间的键不包括磷原子，如由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的键。优选的核苷酸类似物或等同物包含具有修饰的聚酰胺骨架的肽核酸(pna)(nielsen,等(1991)science254,1497-1500)。基于pna的分子在碱基对识别方面是dna分子的真实模拟物。pna的骨架由通过肽键连接的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成，其中核碱基通过亚甲基羰基键与骨架连接。另一种骨架包含一碳延伸的吡咯烷pna单体(govindaraju和kumar(2005)chem.commun,495-497)。由于pna分子的骨架不含有带电荷的磷酸基团，因此pna-rna杂合体通常分别比rna-rna或rna-dna杂合体更稳定(egholm等(1993)nature365,566-568)。进一步优选的骨架包含吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖由6元吗啉代环替代。最优选的核苷酸类似物或等同物包含二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(phosphorodiamidatemorpholinooligomer)(pmo)，其中核糖或脱氧核糖由6元吗啉代环替代，且相邻吗啉代环之间的阴离子磷酸二酯键由非离子二氨基磷酸酯键取代。进一步优选的核苷酸类似物或等同物包含磷酸二酯键中至少一个非桥接氧的取代。这种修饰使碱基配对轻微不稳定，但增加了对核酸酶降解的显著抗性。优选的核苷酸类似物或等同物包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、h-膦酸酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒磷酸酯或硼烷磷酸酯))。进一步优选的核苷酸类似物或等同物包含一个或多个在2'、3'和/或5'位置单或双取代的糖部分；所述取代例如-oh；-f；取代或未取代的，直链或支链的低级(c1-c10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基、芳基或芳烷基，其可由一个或多个杂原子中断；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；o-、s-或n-烯丙基；o-烷基-o-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；氨氧基、甲氧基乙氧基；-二甲基氨基氧基乙氧基；和-二甲基氨基乙氧基乙氧基。所述糖部分可为吡喃糖或其衍生物，或脱氧吡喃糖或其衍生物，优选核糖或其衍生物，或脱氧核糖或其衍生物。这种优选的衍生糖部分包括锁核酸(lna)，其中2'-碳原子与糖环的3'或4'碳原子连接，由此形成双环糖部分。优选的lna包含2'-o,4'-c-亚乙基桥连的核酸(morita等,2001.nucleicacidressupplementno.1:241-242)。这些取代使得核苷酸类似物或等同的rna酶h和核酸酶具有抗性并增加对靶物的亲和力。本发明上下文中氨基酸-或核酸-序列的“序列同一性”或“同一性”在本文中定义为通过比较序列确定的两个或更多个氨基酸(肽、多肽或蛋白质)序列或两种或更多种核酸(核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还表示氨基酸或核苷酸序列之间的序列相关程度，视情况而定，如通过这些序列的字符串之间的匹配所确定的。在本发明中，特定序列的序列同一性优选是指在所述特定多肽或多核苷酸序列的整个长度上的序列同一性。通过比较一种肽或多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸替代物与第二种肽或多肽的序列来确定两个氨基酸序列之间的“相似性”。在优选的实施方案中，在如本文鉴定的整个序列(seqidno:)上计算同一性或相似性。可容易地通过已知方法计算“同一性”和“相似性”，其包括但不限于computationalmolecularbiology,lesk,a.m.,等,oxforduniversitypress,newyork,1988；biocomputing:informaticsandgenomeprojects,smith,d.w.,等,academicpress,newyork,1993；computeranalysisofsequencedata,parti,griffin,a.m.,和griffin,h.g.编,humanapress,newjersey,1994；sequenceanalysisinmolecularbiology,vonheine,g.,academicpress,1987；和sequenceanalysisprimer,gribskov,m.和devereux,j.编,mstocktonpress,newyork,1991；和carillo,h.,和lipman,d.,siamj.appliedmath.,48:1073(1988)中描述的那些。设计确定同一性的优选的方法以给出测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法在公开可用的计算机程序中编码。用于确定两个序列之间的同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括(如)gcg程序包(devereux,j.,等,nucleicacidsresearch12(1):387(1984))、bestfit、blastp、blastn和fasta(altschul,s.f.等,j.mol.biol.215:403-410(1990)。blastx程序可从ncbi和其他资源公开获得(blastmanual,altschul,s.,等,ncbinlmnihbethesda,md20894；altschul,s.等,j.mol.biol.215:403-410(1990)。已知的smithwaterman算法也可用于确定同一性。用于多肽序列比较的优选参数如下：算法：needleman和wunsch，j.mol,j.mol.biol.48:443-453(1970)；比较矩阵:blossum62，其来自hentikoff和hentikoff,proc.natl.acad.sci.usa.89:10915-10919(1992)；缺口罚分:12；和缺口长度罚分：4。用于这些参数的程序可根据位于威斯康星州麦迪逊市的geneticscomputergroup的“ogap”程序公开获得。上述参数是氨基酸比较的默认参数(连同没有对末端缺口的罚分)。用于核酸比较的优选参数如下：算法：needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443-453(1970)；比较矩阵:匹配＝+10，不匹配＝0；缺口罚分:50；缺口长度罚分:3。可从位于威斯康星州麦迪逊市的geneticscomputergroup获得gap程序。以上是核酸比较的默认参数。任选地，在确定氨基酸相似性程度时，技术人员还可考虑所谓的“保守”氨基酸取代，这是本领域技术人员清楚的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中已除去所公开序列中的至少一个残基并在其位点插入不同残基的那些变体。优选地，氨基酸变化是保守的。每种天然存在的氨基酸的优选保守取代如下：ala变为ser；arg变为lys；asn变为gln或his；asp变为glu；cys变为ser或ala；gln变为asn；glu变为asp；gly到pro；his变为asn或gln；ile变为leu或val；leu变为ile或val；lys变为arg；gln或glu；met变为leu或ile；phe变为met、leu或tyr；ser变为thr；thr变为ser；trp变为tyr；tyr变为trp或phe；以及val变为ile或leu。根据本发明的多核苷酸由核苷酸序列表示。根据本发明的多肽由氨基酸序列表示。根据本发明的核酸构建体定义为从天然存在的基因中分离的多核苷酸，或者已被修饰为含有多核苷酸区段的多核苷酸，所述多核苷酸区段以自然界中不存在的方式组合或并置。任选地，存在于根据本发明的核酸构建体中的多核苷酸与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列指导编码产物在宿主细胞或无细胞系统中的产生或表达。本文提供的序列信息不应如此狭窄地解释为需要包含错误识别的碱基。技术人员能够识别这种错误识别的基础并且知道如何校正这种错误。本发明的所有实施方案(即根据本发明的组合物、调节表达的方法、包含根据本发明的组合物的宿主细胞、产生根据本发明的宿主细胞的方法、根据本发明的宿主细胞和产生根据本发明感兴趣的合物的方法)优选是指宿主细胞，而非指无细胞的体外系统；换言之，根据本发明的crispr-cas系统优选是宿主细胞系统，而非无细胞的体外系统。在本发明的所有实施方案中(例如根据本发明的组合物，调节表达的方法、包含根据本发明的组合物的宿主细胞、产生根据本发明的宿主细胞的方法，根据本发明的宿主细胞和产生根据本发明的感兴趣的化合物的方法)，所述宿主细胞可为单倍体、二倍体或多倍体宿主细胞。根据本发明的宿主细胞是网粘菌纲宿主细胞，优选为破囊壶菌目，更优选为破囊壶菌科，更优选为选自下组的菌属：aurantiochytrium、oblongichytrium、裂殖壶菌属、破囊壶菌属和吾肯氏壶菌属(ulkenia)，甚至更优选裂殖壶菌菌种atcc#20888。优选在基因组中的修饰在本文中解释为一种或多种修饰。优选在根据本发明的宿主细胞的基因组中的修饰可通过下列实现a)对亲本宿主细胞进行重组遗传操作技术；和/或b)对亲本宿主细胞进行(传统的)诱变；和/或c)对亲本宿主细胞施用抑制性化合物或组合物。宿主细胞基因组的修饰在本文中定义为导致该宿主细胞基因组中多核苷酸序列变化的任何事件。优选地，根据本发明的宿主细胞具有修饰(优选在其基因组中)，当在相同条件下分时，与未经修饰的亲本宿主细胞相比，所述修饰导致如本文所定义的不合意的化合物的减少或不产生。可通过本领域技术人员已知的任何方法引入修饰，例如但不限于传统的菌株改良，随机诱变后选择。也可通过定点诱变引入修饰。可通过引入(插入)、取代(置换)或去除(缺失)多核苷酸序列中一个或多个核苷酸来完成修饰。可实现编码不合意的化合物(如多肽)的多核苷酸的完全或部分缺失。不合意的化合物可为本文其他地方列出的任何不合意的化合物；它也可为合成不需要的化合物(如代谢物)的生物途径中的蛋白质和/或酶。或者，编码所述不合意的化合物的多核苷酸可部分地或完全地由不编码所述不合意的化合物或编码部分或完全失活形式的所述不合意的化合物的多核苷酸序列取代。在另一个替代中，可将一个或多个核苷酸插入编码所述不合意的化合物的多核苷酸中，其导致所述多核苷酸的断裂以及随后使由断裂的多核苷酸编码的所述不合意的化合物部分或完全失活。在一个实施方案中，根据本发明的突变的微生物宿主细胞包含选自下列的其基因组中的修饰a)完全或部分缺失编码不合意的化合物的多核苷酸，b)用不编码所述不合意的化合物或编码部分或完全失活形式的所述不合意的化合物的多核苷酸序列完全或部分置换编码不合意的化合物的多核苷酸，c)通过在多核苷酸序列中插入一个或多个核苷酸来破坏编码不合意的化合物的多核苷酸，且随后通过破坏的多核苷酸部分或完全失活所述不合意的化合物。例如，该修饰可在编码序列或所述不合意的化合物的转录或翻译所需的调控元件中。例如，可插入或去除核苷酸，以导致终止密码子的引入，起始密码子的去除或编码序列的开放阅读框的改变或移码。编码序列或其调控元件的修饰可通过定点或随机诱变、dna改组方法、dna组装方法、基因合成(参见如young和dong(2004),nucleicacidsresearch32(7)电子版于nar.oupjournals.org/cgi/reprint/32/7/e59或gupta等(1968),proc.natl.acad.sciusa,60:1338-1344；scarpulla等(1982),anal.biochem.121:356-365；stemmer等(1995),gene164:49-53)或依照本领域熟知的pcr产生的诱变来完成。随机诱变方法的实例是本领域熟知的，例如化学诱变(例如ntg)或物理诱变(例如uv)。定点诱变步骤的实例是quickchangetm定点诱变试剂盒(stratagenecloningsystems,lajolla,ca)，alteredii体外诱变系统(promegacorporation)或通过使用如ho等(“site-directedmutagenesisbyoverlapextensionusingthepolymerasechainreaction”,gene,1989apr15,77(1):51-9)所述的pcr或使用如molecularbiology:currentinnovationsandfuturetrends.(eds.a.m.griffin和h.g.griffin.isbn1-898486-01-8；1995horizonscientificpress,pobox1,wymondham,norfolk,u.k.)中所述的pcr的重叠延伸。优选的修饰方法基于重组遗传操作技术，如部分或完全基因置换或部分或完全基因缺失。例如，在置换多核苷酸、核酸构建体或表达盒的情况下，可在待置换的靶基因座处引入合适的dna序列。所述合适的dna序列优选存在于克隆载体上。优选的整合克隆载体包含dna片段，其与多核苷酸同源和/或与待替换基因座侧翼的多核苷酸具有同源性，用于靶向将克隆载体整合至此预定的基因座。为了促进靶向整合，优选在转化细胞之前将所述克隆载体线性化。优选地，进行线性化，使得所述克隆载体的至少一端但优选任一端侧翼为与待置换的dna序列(或侧翼序列)同源的序列。该过程称为同源重组，并且该技术也可用于实现(部分)基因缺失。例如，对应于内源多核苷酸的多核苷酸可由缺陷的多核苷酸取代，所述缺陷的多核苷酸是不能产生(完全功能)多肽的多核苷酸。通过同源重组，所述缺陷的多核苷酸取代内源多核苷酸。可能需要缺陷的多核苷酸也编码标记，所述标记可用于选择其中已修饰了核酸序列的转化子。可通过不同方法获得导致减少或不产生不合意的化合物的修饰，例如通过针对这种不合意的化合物或化学抑制剂或蛋白质抑制剂或物理抑制剂的抗体(touro.等,“geneticallytargetedchromophore-assistedlightinactivation”,(2003)nat.biotech)。或者，或与上述技术组合，也可减少或不产生不合意的化合物，例如，通过uv或化学诱变(lian等,“increaseofdocosahexaenoicacidproductionbyschizochytriumsp.throughmutagenesisandenzymeassay”(2010)applbiochembiotechnol162(4):935-941)或通过使用抑制剂抑制如本文所述的非合意的多肽的酶活性(例如，作为β-葡糖苷酶的抑制剂的野尻霉素(ren等,“effectofbiotinandceruleninadditionondhaproductionbyschizochytriumsp.”(2012-01)chinesejbioprocessengineering)。在本发明的一个实施方案中，根据本发明的宿主细胞的基因组中的修饰是编码不合意的化合物的多核苷酸的至少一个位置的修饰。细胞在产生化合物(例如不合意的化合物，如非期望的多肽和/或酶)方面的缺陷在本文中定义为已被修饰(优选在其基因组中)以产生表型特征的突变微生物宿主细胞，其中所述细胞：当在相同条件下分析时，与未修饰的亲本宿主细胞相比，a)产生较少的不合意的化合物或基本上不产生任何不合意的化合物和/或b)产生具有降低的活性或降低的比活性的不合意的化合物或不具有活性或无比活性的不合意的化合物以及这些可能性中的一种或多种组合。优选地，如果与在相同条件下未经修饰和测定的亲本宿主细胞相比，根据本发明的经修饰的宿主细胞产生少于1％的不合意的化合物、至少少于5％的不合意的化合物、至少少于10％的不合意的化合物、至少少于20％的不合意的化合物、至少少于30％的不合意的化合物、至少少于40％的不合意的化合物、至少少于50％的不合意的化合物、至少60％的不合意的化合物、至少70％的不合意的化合物、至少80％的不合意的化合物，至少90％的非期望化合物、至少91％的不合意的化合物、至少92％的不合意的化合物、至少93％的不合意的化合物、至少94％的不合意的化合物、至少95％的不合意的化合物、至少96％的不合意的化合物、至少97％的不合意的化合物、至少98％的不合意的化合物、至少99％的不合意的化合物、至少99.9％的不合意的化合物或最优选少于100％的不合意的化合物。本文提供的序列信息不应如此狭窄地解释为需要包含错误识别的碱基。技术人员能够识别这种错误识别的基础并且知道如何校正这种错误。本文所述的每篇参考文献的公开内容通过提述以其整体并入本文。通过以下实施例进一步说明本发明：实施例实施例1设计和构建用于转化的cas9载体酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)mgas5005cas9序列经密码子优化以在裂殖壶菌属中表达。所用的基本的cas9肽序列与jinek等,2013所用的序列基本上相同，但其不具有描述的ha标签或gfp融合物(参见下文)。合成cas9(dna2.0,newark,ca)后，将其克隆到包含巴龙霉素选择盒的pcl122载体中，其产生命名为pcl122-cas9(seqid)的载体。合成orfa/pfa1侧翼，并克隆(genscriptusa,piscataway,nj)到pcl121(其具有博来霉素选择盒)中，且将最终的载体命名为pyb31(seqidno:2)；参见例如us8,940,88。经由使用bamhi和ndei限制性酶切位点和酶(newenglandbiolabs,ipswich,ma)(图3)以及快速dna连接试剂盒(罗氏,risch-rotkreuz,瑞士)的消化和连接将cas9基因从pcl122-cas9载体亚克隆至pyb31载体。转化neb10β化学感受态细胞(newenglandbiolabs)，且使用选择的菌落、带有引物121tubseqf(seqidno:13)和pyb32/3cr1(seqidno:14)(表2)以及5％dmso(v:v)的gotaqgreen主混合物(promega,chicago,il)通过菌落pcr筛选得到的菌落，并将下列循环条件应用于所述反应：95℃5分钟，(95℃30秒，59℃30秒，72℃1分钟)x35循环，72℃5分钟(图4)。从pcr为阳性的菌落分离质粒，测序，并将一个所得的载体命名为pyb32(seqidno:3)。表2引物名称seqidno引物序列，5′→3′121tubseqf13ggatctcatgctggagttcttcpyb32/3cr114gtacttctcgtggtaggcaacc如先前所述，其他研究已经表明cas9表达水平对于优化转化子活力或核酸酶活性是重要的。在pyb32质粒中，cas9基因在α微管蛋白启动(中等强度启动子)的控制下。选择来自胡萝卜素合成酶(cs)基因的弱启动子同时进行测试，并通过infusionpcr克隆(clontech/takarabiousa,inc.,mountainview,ca)将其克隆到pyb31中。用kpni和ndei酶(newenglandbiolabs)消化pyb31质粒以准备infusion克隆。用csprokpniiff1(seqidno:15)和csprobamhiifr1引物(seqidno:16)(表3)，用5％dmso(v:v)、kodhotstartmaster混合物(emdmillipore,billerica,ma)和具有cs启动子的pth043质粒(用作模板)扩增cs启动子。反应循环条件如下：95℃2分钟，(95℃20秒，66℃10秒，70℃20秒)x35循环，70℃2分钟。用csprobamhiiff2(seqidno:17)和csprondeiifr2(seqidno:18)引物(表3)，用5％dmso(v:v)、kodhotstart主混合物和用作模板的pcl122-cas9扩增cas9。反应循环条件如下：95℃2分钟，(95℃20秒，65℃10秒，70℃1分45秒)x35循环，70℃2分钟。表3pcr产物在1％琼脂糖凝胶(lonza，巴塞尔，瑞士)上电泳，切下预期大小的条带，并使用qia快速凝胶提取试剂盒(qiagen，希尔登，德国)纯化凝胶(图3)。按照制造商的infusion克隆方案，连接cas9pcr片段、cs启动pcr片段和线性化的pyb31片段，转化neb10β化学感受态细胞，并通过上述的菌落pcr(图4)(72℃处1分钟30秒的延伸时间)筛选得到的菌落。序列验证后，将得到的含有与cs启动子可操作连接的cas9的载体之一命名为pyb33(seqidno:4)。通过消化、连接和infusionpcr克隆的组合进行pyb32和pyb33的克隆。如图3所示，在柱纯化后产生所有片段并具有预期大小的条带。消化的质粒和pcr扩增的片段在1％琼脂糖凝胶上运行。在所有泳道中观察到预期的片段大小如下：pyb31-bamhi+ndei＝838bp+6555bp、pyb31-kpni+ndei＝1289bp+6104bp、cas9-bamhi+ndei＝4157bp+5773bp、cspcr片段＝1046bp、cas9pcr片段＝4189bp。在该凝胶和所有后续凝胶中使用的分子量标记是dnaquanti梯度(origene，rockville，md)-片段大小在图3右侧的图面中指示。通过菌落pcr分析由pyb32和pyb33细菌转化得到的菌落，且具有预期大小的扩增子的菌落在图4中以粗体字标记。这些菌落是：pyb32-2、-4、-9、-14、-15、-24、-25、-28和pyb33-16和pyb33d-1、-14。pyb32-2和pyb33-16属于经验证具有正确序列的那些，并用于后续工作。对于克隆pbb32和pyb33的菌落pcr结果，预期的扩增子大小如下：pyb32＝1028bp、pyb33＝1584bp。实施例2转化和选择cas9转化子使用粒子轰击法和如下所述的基因枪仪器(bio-rad,raleigh,nc)，将裂殖壶菌属菌种atcc20888的野生型菌株用于pyb32和pyb33的转化。简言之，将20888在250ml光滑底部锥形瓶中的25ml的m50-20培养基(参见如us8,003,772)中于27℃生长，以200rpm振荡过夜。然后，将培养物以1/100稀释到250ml带挡板的烧瓶中的50mlm2b培养基(参见如us8,003,772)中，并在相同条件下过夜生长。当裂殖壶菌属培养物处于早期对数期(0.6-2od单位/ml)时，通过以3,220xg离心10分钟收获培养物。倾析上清液，将沉淀重悬浮于m2b中至终浓度为20od单位/ml，并将100μl的所得细胞悬浮物在约三分之一的非选择性m2b琼脂平板(直径约4cm)上以圆周运动涂布。用swai在25℃过夜消化质粒pyb32和pyb33，并使用qia快速pcr纯化试剂盒(qiagen,希尔登,德国)纯化。然后将5μg的每种纯化的质粒与50μl的2.5mcacl2、20μl的0.1m亚精胺和50μl制备的m10钨珠混合(依照制造商的方案，bio-rad)，涡旋1分钟，然后在室温温育10分钟以使珠子沉降。用250μl100％乙醇洗涤dna包被的珠子一次，然后将珠子重悬于60μl100％乙醇中。每个制备的大载体(依照制造商的大载体组装制备方案)具有出现在大载体盘的中心的10μl的在乙醇中包被的珠子，并使乙醇干燥。在70％异丙醇中短暂灭菌后，破裂盘支架具有置于内部的1,100psi级破裂盘，且组装好的大载体安装在顶部搁架位置的基因枪平台上，并将具有裂殖壶菌属的细胞碎片的m2b琼脂平板细胞侧面向上(cell-side-up)置于从顶部开始的第三个架子上。当基因枪室内的真空达到～27psi时，射出氦气直至破裂盘失效，将氦气流关闭，将该腔室减压至大气，从腔室中移出轰击的板。对所有样品和对照重复所述轰击过程，将用pyb32轰击的裂殖壶菌属菌种20888命名为t188，将用pyb33轰击的裂殖壶菌属培养物命名为t189。将轰击的板在27℃温育4小时，然后用～1ml的m2b从板上洗掉细胞，并在含有0.4％随机甲基化β-环糊精(ctd股份有限公司，普林斯顿，fl)中的0.5mmdha(nu-chekprep,沃特维尔,mn)和50μg/ml博来霉素(thermofisherscientific,沃尔瑟姆,ma)的4个m2b琼脂平板之间平均分配。用3mm无菌玻璃珠涂布细胞，取出珠子并包裹平板并在27℃温育约7-10天。当菌落大小达到2-4毫米时，将每个菌落在具有或不具有dha(如上所述与随机甲基化的β-环糊精复合)的含有100μg/ml博来霉素的m2b琼脂平板上复制修复，以选择通过破坏orfa/pfa1基因诱导的营养缺陷型。挑选确认为对于dha营养缺陷的菌落，并将其接种到250ml光滑底部锥形瓶中的补充有500μl的40％β-环糊精和50mmdha溶液的50mlm50-20中并置于27℃的振荡器以200rpm进行48小时。培养48小时后，通过以5,000xg离心10分钟收集2ml培养物，倾析上清液，依照改良的苯酚-氯仿提取，将沉淀用于基因组dna分离。提取基因组dna并用作gotaqgreen主混合物(promega，达拉谟，nc)的pcr模板，以使用引物、gotaqgreen主混合物和如用于菌落pcr筛选pyb32和pyb33所述的循环条件来验证博来霉素盒和cas9基因的存在(图5)。通过pcr验证t188和t189转化子中orfa/pfa1基因的破坏。具体地，用oa1-kof(seqidno:19)和pyb32/3sv40r1(seqidno:20)引物(表4)、gotaqgreen主混合物、5％dmso(v:v)和作为模板的t188/t189gdna通过pcr考察5'侧翼区，且循环条件如下：95℃保持2分钟，(95℃保持30秒，60℃保持30秒，72℃保持2分15秒)×35循环，72℃保持5分钟。此外，用oa1-kor(seqidno:21)和pyb32/2cf1(seqidno:22)引物(表4)、gotaqgreen主混合物、5％dmso(v:v)和作为模板的t188/t189gdna通过pcr考察3'侧翼区，循环条件如下：95℃2分钟，(95℃30秒，59℃30秒，72℃2分钟)×35循环，72℃5分钟(图6)。表4引物名称seqidno引物序列，5′→3′oa1-kof19ccaagttcgccaaggcttcpyb32/3sv40r120gtggaatcgaaatctcgtagcacoa1-kor21gctgttgcaactttgctccacpyb32/3cf122gttaagaagaccgaggtccagac将经由pcr确定的cas9基因整合和orfa/pfa1处破坏的阳性培养物接种到补充有随机甲基化β-环糊精和dha的25ml的m50-20中，并如前所述生长24小时。测量该培养物的od600，并将2个od单位的各培养物接种到250ml带挡板的锥形瓶中的补充有随机甲基化的β-环糊精和dha的50mlspfm,ph6.75中，并在27℃的振荡器中以200rpm生长48小时然后加入5％甘油(v:v)用于冷冻保存。选择两个克隆t188-1-20和t189-1-20用于进一步的工作，每个克隆来自各个转化组。通过轰击用pyb32和pyb33质粒转化野生型裂殖壶菌属菌种20888，导致由于在多不饱和脂肪酸(pufa)合酶的orfa/pfa1基因座处插入cas9所致20888中的dha营养缺陷型。将菌落计数并在有或没有dha的选择性平板上进行修复。从两个转化组中随机挑选对于dha营养缺陷的菌落，并用于进一步表征。如下表5中所示，用pyb33质粒的转化效率低于用pyb32质粒的情况，并且也观察到与发现的营养缺陷型菌落的分数类似的趋势。表5转化每5μgdna总克隆营养缺陷型克隆％敲除t188:pyb32—tubpro-cas91608050％t189:pyb33—cspro-cas9963738.5％考察t188和t189转化子是否存在与cas9连接的启动子以及cas9基因的上游区域。对于t188克隆，预期的扩增子大小为1028bp，对于t189-1584bp。如图5所示，除了克隆t189-1-30之外的所有产生预期的扩增子大小并用于进一步测试。通过pcr验证了cas9在orfa/pfa1基因座中的整合，用野生型特异性外部引物和cas9特异性内部引物的组合扩增了5'和3'二者侧翼区，使得只有在发生整合时才可得到扩增子(图6)。cas9整合位点5'侧翼的预期扩增子大小为2229bp，3'侧翼的预期扩增子大小为1973bp。所有测试的菌株均对于cas9在orfa/pfa1基因座上整合是阳性的。实施例3设计和建立grna载体设计所有指导rna(grna)盒以由来自裂殖壶菌属的延伸因子1α(ef-1α)启动子表达。在每种情况下，grna序列侧翼为两个核酶序列，锤头状(hammerhead)和hdv(gaoy和zhaoy“self-processingofribozyme-flankedrnasintoguidernasinvitroandinvivoforcrispr-mediatedgenomeediting”jintegrplantbiol.56(4):343-349(2014))。在胡萝卜素合酶基因内鉴定出含有“ngg”原型间隔区相邻基序的4个靶序列，并选择每个上游紧邻的20bp作为靶序列。合成包括两种核酶、靶序列和引导rna的一个盒，并使用bglii和ndei位点(dna2.0)将其克隆到pcl122载体中，得到命名为pcl401的载体-用于额外克隆的前体质粒(seqidno:7)。为了制备最终grna盒载体，用ndei和hpai消化质粒psp73(promega)，并将得到的较大片段进行凝胶纯化。从裂殖壶菌属菌种20888基因组dna用5'faspmende(seqidno:23)和3'faspmehpa(seqidno:24)引物(表6)，kodhotstart主混合物和5％dmso通过pcr扩增裂殖壶菌属脂肪酸合酶片段(fas)的片段，使用以下循环条件：95℃2分钟，(95℃20秒，62℃10秒，70℃51秒)×40循环，70℃5分钟(图7)。将得到的片段用hpai和ndei限制酶消化并纯化。表6引物名称seqidno引物序列，5′→3′5′faspmende23tagcatatgtttaaactcgcggcgtctttcgc3′faspmehpa24agttaacgtttaaacagaggaggtggctggc使用快速dna连接试剂盒(roche)连接合适的纯化和消化的psp73和fas片段，并转化到neb10β细胞(newenglandbiolabs)中，得到载体pcl399(seqidno:5)。然后单独用ndei内切核酸酶消化pcl399载体，用绿豆核酸酶(newenglandbiolabs)使末端平端化，并用快速dna连接试剂盒重新连接载体，由此除去ndei位点。将所得载体命名为pcl400(seqidno:6)。通过infusionpcr克隆使用作为模板的pcl401(seqidno:7)扩增巴龙霉素表达盒和grna盒以将其插入到用xhoi预消化的pcl400中以产生载体pcl402(seqidno:8)。简言之，使用pcl402iff(seqidno:25)和pcl402ifr(seqidno:26)引物(表7)、5％dmso(v:v)、kodhotstart主混合物、pcl401质粒模板使用以下循环条件从pcl401扩增所需片段：95℃2分钟(95℃20秒，60℃10秒，70℃1分25秒)×35循环，70℃5分钟(图8)。将得到的载体命名为pcl402。表7合成了具有bglii和ndei侧翼位点的四种基因组胡萝卜素合酶靶序列(eurofins，mebane，nc)。将这些片段命名为grna3cs1、cs2、cs3和cs4。用bglii和ndei消化全部4个片段和载体pcl0402。将所有合适的片段进行凝胶或柱纯化，然后使用快速dna连接试剂盒(roche)连接在一起，并将所得载体命名为pyb36(grna3cs1；seqidno:9)、pyb37(grna3cs2；seqidno:10)、pyb38(grna3cs3；seqidno:11)和pyb39(grna3cs4；seqidno:12)。为了从裂殖壶菌属去除基因编辑组分，设计cas9和引导rna盒以破坏(“敲除”)基因从而诱导营养缺陷型。虽然具有cas9选择的营养缺陷型是针对dha的，但由于脂肪酸合酶基因座(fas)的破坏，用于grna插入的诱导的营养缺陷型是针对棕榈酸的。从裂殖壶菌属菌种20888基因组dna扩增fas基因的部分，然后在1％琼脂糖凝胶上运行(图8)。扩增子的预期大小为2530bp。制备两个样品并加载到凝胶上，预期的大小条带是pcr的主要产物，但是存在其他较小尺寸的条带，该条带指示pcr条件可能不太理想并且可能需要在将来进行优化。切出2.5kbp条带，凝胶纯化并用于克隆载体pcl399。建立pcr以用于将巴龙霉素和grna盒克隆到载体pcl400中的fas基因座中。扩增子的预期大小为3376bp，且它是凝胶上出现的主要条带(图8)。然后将该片段克隆到pcl400中以产生pcl402。实施例4转化和选择grna构建体将t188-1-20和t189-1-20菌株(二者均通过pcr验证含有分别在不同启动子(α微管蛋白和cs)的调节下的cas9表达盒，所述cas9表达盒在pufa合酶的orfa/pfa1基因座处插入)接种到含有25ml的补充有0.4％随机甲基化β-环糊精及0.5mmdha的m50-20光滑底部的锥形瓶中，并在27℃，200rpm过夜生长。将两种菌株以1/50稀释到含有如上所述补充有β-环糊精和dha的50ml的m2b的带挡板的烧瓶中，并在27℃过夜生长。如上所述，在第二天收获t188和t189培养物，并如上所述进行轰击制备。在轰击之前用pmei消化pyb36-39质粒并纯化柱，将所有四种消化的质粒用于转化两种菌株，产生命名为t202-209的转化(分别为具有pyb36-39的t188，具有pyb36-39的t189)。将得到的转化子铺板于含有0.4％的β-环糊精及0.5mmdha、0.5mmc16:0(棕榈酸,sigma-aldrich,st.louis,mo)和50μg/ml巴龙霉素的m2b平板上4小时，然后从轰击中恢复。包裹平板并在27℃温育7-10天。一旦直径为2-4mm，将菌落复制修复到m2b+0.4％β-环糊精+0.5mmdha+50μg/ml巴龙霉素(具有或不具有0.5mm棕榈酸)上，以验证由于在fas基因座处插入grna盒而产生的对于棕榈酸的营养缺陷型。挑选来自证实是dha和棕榈酸的营养缺陷型的8个转化的每个转化中的10个菌落，并将其接种到含有补充有0.4％β-环糊精、0.5mmdha和0.5mm棕榈酸的25ml的m50-20的平滑底部锥形瓶中，培养物在27℃、200rpm生长48小时，此时收集2ml每种培养物以用于基因组dna制备。在用苯酚:氯仿提取基因组dna后，进行pcr以扩增含有grna盒靶向的区域的胡萝卜素合酶基因座。使用pyb36cs1f(seqidno:27)和pyb36cs3r(seqidno:29)引物(表8)、5％dmso(v:v)、kodhotstart主混合物、作为模板的各gdna使用以下循环条件通过pcr扩增来自t202、203、204、207、208的选择的转化子的gdna：95℃2分钟，(95℃20秒，61℃10秒，70℃21秒)x35循环，70℃5分钟(图9)。用pyb36cs1f和pyb36cs1r(seqidno:28)引物(表8)，5％dmso(v:v)，kodhotstart主混合物使用以下循环条件扩增来自t206的gdna：95℃2分钟，(95℃20秒，61℃10秒，70℃11秒)x35循环，70℃5分钟(图10)。使用pyb36cs4f(seqidno:30)和pyb36cs4r(seqidno:31)引物(表8)，5％dmso(v:v)、kodhotstart主混合物使用以下扩增循环扩增来自t205和t209的gdna：95℃2分钟，(95℃20秒，61℃10秒，70℃21秒)x35循环，70℃5分钟(图9)。表8将得到的pcr扩增子柱纯化，克隆到pjet1.2载体中(thermofisher,沃尔瑟姆,ma)中，微量制备所得的细菌转化子，并用试剂盒中提供的引物对插入物测序。使用geneious软件比对序列。成功进行了用编码grna的载体转化两个cas9背景(t188和t189)，并产生许多双重营养缺陷型菌株，如下表9中所示(称为t202-209)。随后在遗传水平上分析选择的菌株以检测类胡萝卜素合酶基因座的任何突变，其指示非同源末端连接(nhej)事件。表9从显示为营养缺陷型的grna+cas9转化子(需要补充dha和棕榈酸)中分离gdna后，分别使用一个pcr以扩增包含前3个csgrna靶物的整个区域作为一个扩增子以及另一个pcr以扩增grna3cs4靶物(图9)。来自grna3cs1-3转化子dna的扩增子的预期大小为1040bp，来自grna3cs4转化子的预期大小为715bp。在grnacs1-3靶物的扩增子的情况下，来自t188谱系的样品具有正确大小的单一条带。然而，来自t189的样品(包括来自t189亲本菌株本身的gdna)具有多个条带，其中～1kbp条带最突出，～1.5kbp条带是第二最突出的。将1.5kbp条带被判断为非特异性扩增的产物。为了减少非特异性条带的存在，没有进行pcr的优化，并且对于所有转化子从凝胶中切出～1kbp带并用于pjet1.2克隆。所有cs4扩增子都是正确大小的单一条带。将携带来自每个cas9/grna转化子的几个所得的pjet转化子菌落送去测序以确定cas9/grna是否对cs序列具有任何影响。此外，对克隆的t206谱系进行分析，如图9中所描述，t206转化子提取gdna并用作仅扩增grna3cs1靶序列的pcr的模板，且预期的扩增子大小为689bp。在凝胶上观察到这种大小的条带，这是在其他更高分子量的条带中的主要条带，类似于上图中观察到的那些。切割并纯化并纯化预期～700bp大小的凝胶片段，并用于pjet1.2克隆和片段测序，以确定cas9-gdna是否诱导了cs基因中的任何序列变化(图10)。对含有来自cas9和grna编码载体二者转化的克隆的cs基因座的扩增子的多个pjet载体测序后，观察到发生的几种变化(表10)。先前的工作表明cas9切割dna并在pam序列上游三个碱基对的位点处产生双链断裂(jinek等,“aprogrammabledual-rna-guideddnaendonucleaseinadaptivebacterialimmunity”science337(6096):816-821,2012)。已知在双链断裂位点处突变可形成不精确的非同源末端连接(nhej)介导的修复，其可产生可变长度的插入和/或缺失突变(sander和joung,“crispr-cassystemsforediting,regulatingandtargetinggenomes”natbiotechnol.32(4):347-355,2014)。观察到的所有变化均发生在相对于pam(在此情况中为agg)的-3位置中。在cas9+grna转化子中检测到的裂殖壶菌属菌种20888的类胡萝卜素合酶的例示性突变显示在表10中，缺失显示为破折号，插入显示为下划线文本。表10野生型核苷酸位置#151617181920pam/ngg野生型acgcgcaggcs1靶物-变体#1acgc--aggcs1靶物-变体#2ac-cgcaggcs1靶物-变体#3acgccgcaggcs1靶物-变体#4acgtcgcagg本说明书中引用的所有参考文献均通过提述并入本文，如同每个参考文献被具体和单独地指出通过提述并入。任何参考文献的引用均为其在申请日之前的公开内容，且不应被解释为承认本公开内容无权凭借在先发明而先于此类参考文献。应当理解，上述元件中的每一个、或者两个或更多个元件一起也可以在与上述类型不同的其他类型的方法中找到有用的应用。在没有进一步分析的情况下，上述内容将如此充分地揭示本公开的主旨，即其他人可以(通过应用当前知识)容易地将其适用于各种应用而不会遗漏(从现有技术的角度来看)完全构成所附权利要求中阐述的本发明的一般或特定方面的基因特征的特征。上述实施方案仅以实施例呈现；本公开的范围仅由以上权利要求限制。实施例5设计和构建cas9载体(pyb61)先前，设计cas9质粒用于在pufa合酶基因(orfa亚基；参见pyb32和pyb33)处的靶向整合。以这种方式设计的cas9盒的整合导致orfa基因敲除和dha营养缺陷型。营养缺陷型的诱导使得能够更容易地筛选转化子以便随后在orfa基因座处整合，但使得crispr介导的胡萝卜素合成酶敲除的区别更加困难。构建具有cas9表达盒而不靶向任何染色体基因座的质粒，以测试异位、随机整合的作用。用bamhi-hf(neb)和ndei(neb)消化质粒pcl122-cas9(seqidno:1)，得到两个片段，大小为4140bp和5780bp。将4140bp片段在1％琼脂糖凝胶上分离，切下，并使用qia快速凝胶提取试剂盒(qiagen)纯化(图11)。质粒pyb30(seqidno:32)包含α-微管蛋白启动子的部分片段，该启动子驱动gfp和博来霉素抗性的表达。用bamhi-hf(neb)和ndei(neb)消化此质粒，得到两个片段，838bp和4724bp。将4724bp片段在1％琼脂糖凝胶上分离，切下，并使用qia快速凝胶提取试剂盒(qiagen)纯化(图11)。使用快速dna连接试剂盒(roche)连接所述两个感兴趣的片段。然后用一些连接反应转化neb10β化学感受态细胞(neb)。得到的菌落用作模板用于通过使用如下的pcr进行筛选：2xgotaqgreen主混合物(promega)、引物121tubseqf和pyb32/3cr1和5％终dmso。应用下列循环条件：95℃5分钟，[95℃30秒，59℃30秒,72℃1分钟]35循环和72℃5分钟(如先前所述)(图12)。从通过pcr确认为阳性转化子的菌落中提取质粒，测序，并将得到的载体命名为pyb61(seqidno:33)。表11引物名称seqidno引物序列，5’→3’121tubseqf13ggatctcatgctggagttcttcpyb32/3cr114gtacttctcgtggtaggcaacc实施例6设计和构建非靶向grna载体(pyb66)先前，grna质粒靶向脂肪酸合酶(fas)基因座，由此产生对棕榈酸的营养缺陷型需求。此营养缺陷型掩盖了由crispr介导的胡萝卜素合成酶失活引起的表型。为了更好地辨别参与类胡萝卜素生物合成的基因座上的crispr介导的表型变化，制备了非靶向grna载体。用bamhi-hf(neb)和ndei(neb)消化质粒pcl122(seqidno:37)以除去编码gfp的阅读框，产生两个片段，大小为838bp和5773bp。在1％琼脂糖凝胶上分离5773bp片段，切下，并使用qia快速凝胶提取试剂盒(qiagen)纯化(图13)。通过使用质粒pyb36(seqidno:9)作为模板及如下的pcr扩增编码grna3cs1的盒：2xkodhotstart主混合物(emdmillipore)、引物pyb66bambglf和pyb66nder和5％终dmso。应用下列循环条件：95℃2分钟，[95℃20秒，59℃10秒，70℃5秒]35个循环，72℃2分钟(图14)。使用qia快速pcr纯化试剂盒(qiagen)对得到的pcr片段柱纯化，并用bamhi-hf(neb)和ndei(neb)消化。消化后，再次使用qia快速pcr纯化试剂盒纯化得到的dna片段(图15)。使用快速dna连接试剂盒(roche)连接消化的pcl122和grna片段。然后用连接反应的部分转化neb10β化学感受态细胞，并使用2xgotaqgreen主混合物(promega)、引物pyb66ef1seqf和pcl122orfcr以及5％终体积的dmso及下列循环条件通过菌落pcr筛选得到的细菌菌落：95℃10分钟，[95℃30秒，60℃30秒，72℃45秒]35循环，72℃5分钟(图16)。从通过pcr确定为阳性的菌落中提取质粒，测序，并将得到的载体命名为pyb66(seqidno:34)。表12引物名称seqidno引物序列，5’→3’pyb66bambglf38caagggatccagatcttccgcactgatgagtcpyb66nder39aactcatatggtcccattcgccapyb66ef1seqf40gagaggatagtatcttgcgtgcttgpcl122orfcr41gcaaggttggaacattacgatcaag实施例7设计和构建cas9和grna载体(pyb73)建立含有在相同载体上具有单一显性选择标记的cas9和grna盒二者载体，以测试这种构型对基因组编辑的效率。用psti(neb)消化质粒pyb61，并通过qia快速pcr纯化试剂盒(qiagen)纯化(图17)。使用pcr及如下从pyb36扩增grna表达盒：2xkod热启动主混合物(novagen)、引物pyb73grnapstkpniff和pyb73grnaxhopstifr和5％终dmso。使用如下循环条件：95℃2分钟，[95℃20秒,58℃10秒,70℃38秒]35循环，70℃2分钟(图18)。使用qia快速pcr纯化试剂盒(qiagen)对得到的pcr片段柱纯化。使用infusion试剂盒(clontech)按照制造商的方案将纯化的、消化的pyb61片段连接到纯化的消化的grnapcr片段上。用infusion反应的部分转化neb10β化学感受态细胞，并通过使用如下的pcr筛选得到的细菌菌落：2xgotaqgreen主混合物(promega)，引物pyb73seqf和pyb73seqr和5％终dmso。应用以下循环条件：95℃10分钟，[95℃30秒，60℃30秒，72℃2分钟]35循环和72℃5分钟(图19)。从通过pcr确定为阳性的菌落中提取质粒，测序，并将得到的载体命名为pyb73(seqidno:35)。质粒pyb73不是用于靶向任何特定基因而设计的。表13实施例8设计、构建和转化carg菌株为了改善具有cripsr介导的胡萝卜素合成酶基因失活(白色菌落表型)和没有cripsr介导的胡萝卜素合成酶基因失活(黄橙色菌落表型)的转化子之间的区别，将来自卷枝毛霉(mucorcircinelloides)的carg基因(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶)密码子优化用于裂殖壶菌属中表达。通过dna2.0合成carg基因(其可增加产生的类胡萝卜素的总量并使转化子更加橙色)并克隆到含有杀稻瘟素选择盒的裂殖壶菌属表达载体中。将得到的载体命名为pcl310(seqidno:36)。裂殖壶菌属菌种atcc20888的野生型菌株用于通过粒子轰击方法(bio-rad)用pcl310的转化。atcc20888在250ml光滑底部锥形瓶中的25ml的m50-20培养基中在+27℃、以200rpm振荡过夜生长。然后，将该20888培养物以1/100稀释到250ml带挡板的烧瓶中的50ml的m2b培养基中，并在先前使用的条件下过夜生长。当该20888培养物处于早期对数期(0.6-2od单位/ml)时，通过在3,220×g离心10分钟收获。倾析上清液，将沉淀重悬于m2b中至终浓度为20od单位/ml。将100μl所得细胞悬浮液涂布在约三分之一的非选择性m2b琼脂平板(直径约2英寸)上。将5μg质粒dna和5μgpcl310与50μl的2.5mcacl2、20μl的0.1m亚精胺和50μl制备的m10钨珠(依照制造商的方案)混合，涡旋1分钟，然后在室温温育10分钟以使珠子沉降。用250μl的100％乙醇洗涤dna包被的珠子一次，然后将珠子重悬于60μl的100％乙醇中。每个制备的大载体(依照制造商的用于大载体组装制备的方案)具有在导致来自罩的最小振动的条件下位置在中心的10μl的乙醇中包被的珠子，并使乙醇干燥。将两者在70％异丙醇中短暂灭菌后，破裂盘支架内固定在1,100psi破裂盘上。组装好的大载体平台置于顶部搁架位置，并将具有裂殖壶菌属菌种20888的细胞碎片的m2b琼脂平板细胞侧面向上(cell-side-up)置于从顶部开始的第三个架子上。当轰击机械内的真空达到27英寸汞柱时，射出氦气直至破裂盘失效。然后，将氦气流关闭，将该腔室通风至大气。从腔室中移出轰击的板。对所有样品和对照重复所述轰击过程。将用pcl310轰击的20888菌株命名为t212。将轰击的板在+27℃温育器温育4小时，然后用～1mlm2b从板上洗掉细胞，并在含有100μg/ml杀稻瘟菌素(thermofisher)的4个m2b琼脂平板之间平均分配。用3mm无菌玻璃珠涂布细胞。移出珠子后，包裹平板并在+27℃温育约5至8天。当菌落大小达到2-4毫米时，将菌落在含有100μg/ml杀稻瘟菌素的m2b琼脂平板上修复。挑选确认为对杀稻瘟菌素有抗性的菌落，并将其接种到250ml光滑底部锥形瓶中的50mlm50-20中，并置于+27℃和200rpm的振荡器中48小时。48小时温育时间后，通过以4,000×g离心10分钟收集2毫升培养物。倾析上清，并依照改良的苯酚-氯仿提取，将沉淀用于基因组dna分离。提取基因组dna并用作使用gotaqgreen主混合物(promega)的pcr模板，使用引物pyb13pyb1seqf和pcl122orfcr和5％终浓度dmso以验证cas9盒的存在。应用下列循环条件：95℃2分钟，[95℃3秒,63℃30秒，72℃1分45秒]35循环，和72℃5分钟(图20)。如通过pcr测定的pcl130转化dna的存在呈阳性并且与野生型对照相比呈现更深橙色的几个转化子通过uv-vis方法分析总类胡萝卜素。在该分析中，鉴定出两个菌株具有较高的总类胡萝卜素，即t212-3-1和t212-3-2。选择t212-3-2用于随后的基因组编辑元件的工作。表14引物名称seqidno引物序列，5’→3’pyb13pyb1seqf46gagaggatagtatcttgcgtgcttggpcl122orfcr41gcaaggttggaacattacgatcaag实施例9用pyb61、pyb66和pyb73转化t212和20888为了测试非靶向载体对裂殖壶菌中编辑效率的影响，使用上述粒子轰击方法进行了几次转化。转化设置如下：t280—用pyb61转化t280-t212-3-2菌株，和t285—用pyb61转化atcc20888野生型菌株。进行两种转化以产生预表达cas9的受体菌株用于grna测试工作。后续转化设置如下：t281—用pyb61和pyb66共转化t212-3-2菌株，和t286—用pyb61和pyb66共转化atcc20888野生型菌株。进行t281和t286转化以评估未设计成用于靶向基因组中任何特定基因座的质粒的编辑效率。完成t282—用pyb73转化t212-3-2菌株和t287—用pyb73转化atcc20888野生型菌株以评估用携带用于基因组编辑的两个元件的单个质粒的编辑效率。在补充有50μg/ml的博来霉素(thermofisher)的m2b平板上选择t280、t282、t285、t287转化。在补充有50μg/ml的博来霉素和100μg/ml的巴龙霉素(sigma)的m2b平板上选择t281和t286转化。将由所有这些转化产生的菌落在仅含有100μg/ml单独的博来霉素或同时含有100μg/ml博来霉素和100μg/ml巴龙霉素的选择性m2b平板上进行修复。选择在修复平板上稳固生长且在适用时显示白色菌落表型的修复物用于进一步分析。将这些菌株从修复平板上取下并接种到250ml锥形光滑底部烧瓶中25ml的m50-20培养基中。烧瓶在+27℃、200rpm生长约24小时。取2ml等分试样的每份接种物并置于微量离心管中，以7,500×g离心10分钟。倾析上清液，使用改良的酚-氯仿提取法将沉淀物用于制备基因组dna。通过pcr对得到的gdna进行分析，以确定选择盒和感兴趣的基因的存在。对于t280、t281、t285、t286，使用以下扩增选择盒终止子和cas9基因起点之间的连接：2xgotaqgreen主混合物、引物121tubseqf和pyb32/3cr1、5％终浓度的dmso和gdna。应用下列循环条件：95℃2分钟，[95℃30秒，28℃30秒，72℃1分2秒]35循环和72℃5分钟(图21)。对于t281和t286，通过如下pcr扩增整个grna盒来评估grna盒的存在：2xgotaqgreen主混合物、引物pyb66ef1seqf和pcl122orfcr、5％终浓度的dmso和gdna。应用下列循环条件：95℃2分钟，[95℃30秒，60℃30秒，72℃47秒]35循环和72℃5分钟(图22)。对于t282和t287，通过如下pcr评估grna盒的存在：2xgotaqgreen主混合物、引物pyb66ef1seqf和ttpyb73hdvr、5％终浓度的dmso和gdna。应用下列循环条件：95℃2分钟[95℃30秒，60.9℃30秒，72℃16秒]35循环和72℃5分钟(图23)。对通过pcr测试对于cas9和grna呈阳性的t281、t282、t286和t287转化子进行pcr以扩增grna影响变化的部分cs基因的部分，以对pcr扩增子测序并观察由此引起基因编辑实验的插入或缺失(indels)的类型。用下列准备用于扩增cs基因的相关部分的pcr：2xkodhotstar主混合物、引物pyb36cs1f和pyb36cs1r、5％终浓度的dmso和gdna。应用下列循环条件：95℃2分钟，[95℃20秒，61℃10秒，70℃11秒)]35个循环和70℃5分钟(图24)。使用qia快速pcr纯化试剂盒(qiagen)对pcr片段柱纯化，并用pyb36cs1f和pyb36cs1r进行序列验证。表15引物名称seqidno引物序列，5’→3’pyb66ef1seqf40gagaggatagtatcttgcgtgcttgpcl122orfcr41gcaaggttggaacattacgatcaagttpyb73hdvr47gaagcatgttgcccagccpyb36cs1f27gagtcgaaggagacgttgtcgpyb36cs1r28gtcattgcgaatgatgcgatatg序列表<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司(dsmipassetsb.v.)<120>用于海藻宿主细胞的crispr-cas系统<130>32176-wo-pct<140>tbd<141>2017-07-13<150>us62/361,741<151>2016-07-13<160>47<170>patentin版本3.5<210>1<211>9920<212>dna<213>人工序列<220><223>pcl122-cas9载体<220><221>misc_特征<222>(1)..(1064)<223>ef-1α启动子<220><221>misc_特征<222>(1070)..(5209)<223>cas9<220><221>misc_特征<222>(5229)..(5868)<223>orfc_终止子<220><221>misc_特征<222>(7153)..(8013)<223>ampr_基因<220><221>misc_特征<222>(8403)..(8851)<223>α_微管蛋白_启动子<220><221>misc_特征<222>(8852)..(9646)<223>巴龙霉素_抗性_基因<220><221>misc_特征<222>(9647)..(9920)<223>sv40_终止子<400>1ctcttatctgcctcgcgccgttgaccgccgcttgactcttggcgcttgccgctcgcatcc60tgcctcgctcgcgcaggcgggcgggcgagtgggtgggtccgcagccttccgcgctcgccc120gctagctcgctcgcgccgtgctgcagccagc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