从三维多孔支架回收培养细胞的方法与流程

本发明涉及一种从三维多孔支架回收培养细胞的方法，更详细而言，涉及从培养面积较大的三维多孔支架高效地回收大量的培养细胞的培养细胞回收方法。

背景技术：

多能干细胞(胚胎干细胞、人工多能干(ips)细胞)因具有无限增殖能力和多分化能力而被认为是再生医疗的重要细胞源。ips细胞技术通过药物毒性试验、疾病模型的确立而能够应用于病理解析中，因此近年来世界各国都对此进行研究开发。利用多能干细胞来从事再生医疗、进行药物研发时，供给大量且稳定的未分化细胞和分化细胞是必不可少的。

与在平板上对细胞进行单层培养的二维培养相比，对细胞进行培养而使细胞在纵向上具有厚度的方法被称为三维培养。与二维培养相比，三维培养更接近生物内细胞的状态，因此三维培养不仅更适于确立模拟生物内环境的实验模型，三维培养还能够进行大量的细胞培养。

专利文献1中记载了三维多孔支架(three-dimensionalporousscaffold)(需要说明的是，在本说明书中，有时用基质(matrix)表述支架)，还记载了用该三维多孔支架进行的细胞培养方法。其中，该三维多孔支架由具有规定直径和视密度的生物相容性聚合性纤维的集合体构成。

专利文献2中，记载了以下细胞培养方法：将种植有细胞的三维多孔支架放入密封细胞培养容器内，通过用活塞对该三维多孔支架加压而进行三维多孔支架的压缩变形。

专利文献3中记载了种植有细胞的三维多孔支架，并且记载了让微流体从该三维多孔支架的表面通过微流体通道进行流动的细胞培养方法。

在先技术文献

专利文献

专利文献1：日本再表2007/102606号公报

专利文献2：日本特开2009－125068号公报

专利文献3：日本特表2010－505393号公报

技术实现要素：

－发明要解决的技术问题－

但虽然能够用上述三维多孔支架培养大量细胞，却难以从支架高效地回收所培养的细胞。尤其是，在不损伤埋到三维多孔支架的深处的培养细胞的情况下高效地回收该培养细胞更是极其困难的。

本发明正是鉴于上述问题而完成的。其目的在于：提供一种从三维多孔支架回收培养细胞的方法，在不损伤利用三维多孔支架培养出的细胞的情况下，高效地回收该细胞。

－用以解决技术问题的技术方案－

本发明所涉及的培养细胞回收方法的特征在于，包括：培养步骤，用封入在培养容器内的三维多孔支架培养细胞；酶处理步骤，向所述培养容器添加具有胰蛋白酶-edta和酪蛋白酶的酶溶液，对所述培养容器内的培养细胞进行酶处理；以及振动处理步骤，让在水平面内做圆周运动的台座与所述培养容器进行接触，对进行过酶处理的培养细胞施加铅直方向的振动来进行振动处理。

－发明的效果－

根据本发明，在不损伤细胞的情况下，即能够从三维多孔支架上高效地回收培养细胞。

附图说明

图1是用实施例1所涉及的培养细胞回收方法回收了细胞的基质的照片图，酶溶液中，胰蛋白酶(trypsin)-edta：酪蛋白酶＝2：1。

图2是用比较例所涉及的培养细胞回收方法回收了细胞的基质的照片图。

图3是用实施例2所涉及的培养细胞回收方法回收了细胞的基质的照片图，其中，图3的(a)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶(collagenase)：酪蛋白酶(caseinase)＝2：1：1，图3的(b)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶＝2：1，图3的(c)中，胶原酶：酪蛋白酶＝1：1，图3的(d)为比较例。

图4是示出在成分不同的酶溶液的情况下的细胞回收率的比较情况的图。

图5是用实施例3所涉及的培养细胞回收方法回收了细胞的基质的照片图，其中，图5的(a)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：2：2，图5的(b)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：1，图5的(c)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝0.5：2：2，图5的(d)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝1：1：1。

图6是示出通过吹吸(pipetting)进行了振动处理步骤的情况下的细胞回收率的比较情况的图，其中，图6的(a)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：2：2，图6的(b)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：1，图6的(c)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝0.5：2：2，图6的(d)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝1：1：1。

图7是示出成分不同的酶溶液的情况下的细胞回收率的比较情况的图。

图8是用实施例4所涉及的培养细胞回收方法回收了细胞的基质的照片图，其中，图8的(a)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：4：4，图8的(b)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：4，图8的(c)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：4：1，图8的(d)中，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：1，图8的(e)是不进行酶处理的比较例。

图9是示出用实施例4所涉及的培养细胞回收方法回收的细胞个数的图。

具体实施方式

下面根据附图对本发明的实施方式进行具体说明。该实施方式是为了便于理解本发明原理的实施方式，本发明的范围并不限于下述实施方式，所属技术领域的技术人员适当地置换了以下实施方式的结构而构成的其它实施方式也包含在本发明的范围内。

本实施方式所涉及的培养细胞回收方法具有培养细胞的培养步骤、对培养细胞进行酶处理的酶处理步骤以及对培养细胞施加振动进行振动处理的振动处理步骤。

在培养步骤中，用已被封入在培养容器内的三维多孔支架培养细胞。成为培养对象的细胞没有特别限定，难以损伤的细胞和容易损伤的细胞都可以，但是优选为容易损伤的细胞。具体而言，能够列举出的细胞有：人体胚胎干(es)细胞、ips细胞、成体干细胞(adultstemcell)(脂肪、骨髓由来间充质干细胞等)等。

培养细胞的培养容器是培养出的细胞难以附着在容器内壁上的细胞非粘着性容器，例如是聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯等附着性低的塑料容器或者经过了氟加工、硅加工这样的疏水性表面加工的塑料容器或玻璃容器。

培养容器的大小、形状没有特别限定，例如可以是瓶(bottle)状、烧瓶(frasco)状、包(bag)状、井格(well)状、碟(dish)状等，能够根据培养的细胞选择任意的形状和大小，优选为瓶状。例如是底部的底面为平面的瓶状培养容器。此外，例如整体外观呈近似圆柱状、底部的底面为平面的培养容器。作为整体外观呈近似圆柱状、底部的底面为平面的培养容器，例如能够使用容积为250ml(口径39mm、高度117mm、底部直径72mm)的培养容器、容积为500ml(口径39mm、高度137mm、底部直径92mm)的培养容器或者容积为1000ml(口径39mm、高度156mm、底部直径107mm)培养容器等。

三维多孔支架既可以是多个支架的集合体，也可以是单个支架。三维多孔支架的培养面积没有特别限定，例如为800～900000cm²，优选为800～45000cm²。此外，三维多孔支架的平均孔隙率例如为50～90％，优选为80～90％，三维多孔支架的平均气孔尺寸例如为10～800μm，优选为200～400μm。

三维多孔支架例如既可以是由热塑性树脂制纤维形成的纤维集合体(无纺布、针织物、梭织物等)，也可以是先将热塑性树脂混炼然后成形而得到的片材(例如薄膜、平板、板材等)。热塑性树脂例如能够列举聚乙醇酸(polyglycolicacid)、聚乳酸(polylacticacid)、聚乳酸－聚乙醇酸共聚物(polyglycolicacidcopolymer)、聚已酸内酯(polycaprolactone)、聚二氧六环酮(polydioxanone)、聚碳酸三甲烯(poly(trimethylenecarbonate))、聚丁二酸丁二醇酯(polybutylenesuccinate)、聚丁二酸乙二酯(polyethylenesuccinate)等。

培养期没有特别限定，能够根据细胞的种类、细胞的种植个数等而适当选择培养期，例如是，种植细胞后5天～30天。正常培养期例如可以为5天～14天，优选为7天～10天。长期的培养期例如可以为15天～30天，优选为22天～26天。

接下来，在酶处理步骤中，向培养容器添加具有胰蛋白酶-edta(以下，有时记为“t”。)、酪蛋白酶(以下，有时记为“d”。)和/或胶原酶(以下，有时记为“c”。)的酶溶液，对培养容器内的培养细胞进行酶处理。胰蛋白酶-edta中的edta的含量没有特别限定，例如在1.0w/v％的胰蛋白酶中edta为4.0～12.0mmol/l，例如有0.05w/v％胰蛋白酶-0.53mmol/ledta、0.25w/v％胰蛋白酶-1.0mmol/ledta、或者0.5w/v％胰蛋白酶-5.3mmol/ledta等。

胶原酶没有特别限定，例如有mmp(matrixmetalloproteinase，基质金属蛋白酶)1、2、3、9、13、14等mmp家族等。

在酶溶液中含有胰蛋白酶-edta和酪蛋白酶的情况下，其混合比没有特别限定，只要能够进行酶处理即可。例如，胰蛋白酶-edta：酪蛋白酶＝0.5～4：1～2，优选为2：1。在此，胰蛋白酶-edta的1×为0.5mg/ml，酪蛋白酶的1×为1000units(1mg/ml＝300units)。因此，胰蛋白酶-edta:酪蛋白酶＝2：1，意味着1.0mg/ml的胰蛋白酶-edta与3.334mg/ml的酪蛋白酶的混合液。

在酶溶液中含有胰蛋白酶-edta和胶原酶的情况下，其混合比没有特别限定，只要能够进行酶处理即可。例如，胰蛋白酶-edta：胶原酶＝0.5～4：1～4，优选为2：1。在此，胰蛋白酶-edta的1×为0.5mg/ml，胶原酶的1×为300units(1mg/ml＝300units)。

在酶溶液中含有胰蛋白酶-edta、胶原酶以及酪蛋白酶的情况下，其混合比没有特别限定，只要能够进行酶处理即可。例如胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝0.5～4：1～6：1～6。在正常培养期的情况下，t：c：d例如为0.5～2：1～2：1～2，优选为2：1：1。在较长的培养期的情况下，t：c：d例如为2～4：1～6：2～6，优选为2：4：4。在较长的培养期的情况下，由于细胞增殖，因此有时会在细胞周围生成新的细胞外基质。因生成的该细胞外基质而难以对细胞进行回收。但是，如后述的实施例所示，本申请发明人对酶处理步骤中的酶溶液的混合比做了研究探讨，而做到了即使在较长的培养期的情况下也能够很容易地对细胞进行回收。在此，胰蛋白酶-edta的1×为0.5mg/ml；胶原酶的1×为300units(1mg/ml＝300units)；酪蛋白酶的1×为1000units(1mg/ml＝300units)。

需要说明的是，在三维多孔支架为多个支架的集合体的情况下，能够将培养容器内的每十个支架的溶液量设为1ml。

酶处理的条件没有特别限定，例如10～30分钟，36～38℃，优选为15分钟，37℃。

需要说明的是，也能够使酶溶液中进一步含有脱氧核糖核酸酶(dnase)、木瓜蛋白酶(papain)、弹性蛋白酶(elastase)、透明质酸酶(hyaluronidase)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)或链丝菌蛋白酶(pronase)等蛋白质分解酶。

接下来，在振动处理步骤中，使在水平面内做圆周运动的台座(platform)与添加有酶溶液的培养容器的底面保持面接触，对进行过酶处理的培养细胞施加铅直方向的振动来进行振动处理。

圆周运动优选为等速圆周运动，其频率例如为20～100hz，优选为40～70hz。台座的形状没有特别限定，例如能够列举出的形状有板状、碗状等。例如在水平面内做圆周运动的台座可以是设置在涡旋混合器(以下，有时记为“v”)上部的橡胶台座。在台座呈板状的情况下，能够在台座的上部设置凸部。而且，能够在底部为平面的瓶状培养容器的底面上设置与该凸部紧密嵌合的凹部。如果在台座上部的凸部紧密嵌合、插入瓶状培养容器底部的凹部内而使台座的上表面与培养容器的底面保持面接触的状态下，台座在水平面内做圆周运动，台座的圆周运动便会可靠地传递给培养容器。此外，在台座呈碗状的情况下，也能够在台座的上部设置凸部，在培养容器的底面上设置与该凸部紧密嵌合的凹部。需要说明的是，涡旋混合器是让容器的底部高速旋转来搅拌内部液体的实验器具，橡胶台座设在朝着上方设置的电动机的偏离驱动轴中心的位置处。

能够让培养容器的底部与台座紧密接触，并以该状态将培养容器的底部设置在台座上；还能够将培养容器倒过来，让培养容器上部的盖部与台座紧密接触，以该状态将培养容器设置在台座上；也能够既将培养容器倒过来而让底部接触在水平面内做圆周运动的台座，又让固定部件接触盖部来用该固定部件和台座夹住培养容器。

在与在水平面内做圆周运动的台座接触的培养容器内对培养细胞施加铅直方向的振动，其理由如下。例如，底部的底面为平面的圆柱形状的培养容器放置在涡旋混合器的台座上而对培养容器施加了振动的情况下，涡旋混合器的台座进行等速圆周运动，在容器下部，水平方向的振动传递给容器内部的酶溶液。容器内部的酶溶液由于容器底部在水平方向上振动而碰撞容器内壁后，而变成朝着铅直方向的上方移动，然后因重力作用而朝着铅直方向的下方落下来。重复该过程，容器内部的酶溶液反复朝着铅直方向的上方以及朝着铅直方向的下方移动。容器内部的酶溶液的运动传递给容器内部的三维多孔支架。其结果是，铅直方向的振动施加给培养细胞。需要说明的是，在底部的底面呈圆锥状的情况下，内部液体被搅拌成涡旋状，基质也同样伴随着内部液体的涡流而工作，因此不会发生沿铅直方向的移动。此外，如果在容器内部产生涡流，容器内部的三维多孔支架就会朝着酶溶液的上方浮上来并停留在涡流中心附近，振动难以传递给三维多孔支架。因此，在振动处理步骤中，优选尽可能地抑制涡流的产生。

振动处理的时间没有特别限定，例如为10秒～30分钟。

需要说明的是，在振动处理步骤中，还能够通过吹吸(以下，有时记为“p”)进行向培养细胞施加振动的振动处理，其中，上述吹吸通过喷嘴反复地吸入、喷出含有培养细胞的酶溶液。

根据本实施方式所涉及的培养细胞回收方法，例如能够用500ml的瓶子作培养容器用，向该培养容器内封入例如总培养面积为34000cm²的三维多孔支架，例如放入人体脂肪组织由来间充质细胞1×10⁷个。培养后，再经过酶处理和振动处理。这样一来，即使是位于三维多孔支架深处的细胞，也能够从三维多孔支架高效地对它们进行回收。而且，根据本实施方式所涉及的发明，能够以如下述实施例所示的高生存率高效地回收细胞。通过设置多个培养容器或者增大培养容器的内部容积，还能够实现更大量的细胞培养以及细胞回收，通过本发明可得到的收益无法估算。

实施例

(1)实施例1

在实施例1中，对本实施例所涉及的培养细胞回收方法和既未实施酶处理也未实施振动处理的比较例所涉及的培养细胞回收方法进行比较。

以无菌方式从获得了许可的实验对象的腹部取下了皮下脂肪组织。用胶原酶对脂肪组织进行处理让细胞分散以进行离心处理，然后将svf(stromalvascularfraction，基质血管部分)回收起来。用pbs(-)清洗svf后，让经过离心处理的细胞悬浮于向dmem/f12添加了20μg/ml的还原型谷胱甘肽、5μg/ml的纤维连接蛋白以及100nm的大肠杆菌素而成的原始培养用无血清培养基中，将经过离心处理的细胞种植到t烧瓶内，在此基础上，在37℃/5％co2条件下进行培养，一直培养到铺满(confluent)率达到95％为止。

然后，用剥离剂将细胞剥离下来并回收起来，用pbs(-)清洗后，让细胞悬浮于向dmem/f12添加了20μg/ml的还原型谷胱甘肽而成的下一代培养用无血清培养基中，将细胞种植到t烧瓶内，在37℃/5％co2条件下进行了培养。反复进行该下一代作业，得到人体脂肪组织由来间充质细胞1×10⁸个。

进行细胞培养时使用了cesco公司的高密度培养系统bellocell。一瓶bellocell-500一次性培养瓶中装有900个bionocii基质。瓶的容量为500ml(口径39mm、高度137mm、底部直径92mm)。一瓶内的基质的总表面积为15600cm²。瓶内装有人体脂肪组织由来间充质细胞1×10⁷个。bellocell瓶内的培养基的水位由于bellocell系统的升降设备升降而上升、下降，由此而将空气供给细胞，将营养供给细胞，将代谢产物(co2)排出，将细胞种植在瓶内以后又进行了7天的细胞培养。然后，加入pbs(-)进行了清洗。

将pbs(-)回收起来备用。添加基质全部位于水面下所需要的最少量的酶溶液，并在37℃下进行了15分钟的酶处理。酶溶液是胰蛋白酶-edta以及酪蛋白酶的混合液。混合比为胰蛋白酶-edta：酪蛋白酶＝2：1(t2d1)。瓶内的液量为90ml。

然后，用涡旋混合器(2800～3200rpm、接触底面10秒)进行了振动处理。即，将装有进行过酶处理的细胞的bellocell瓶放置在涡旋混合器的橡胶台座上，对进行过酶处理的培养细胞施加铅直方向的振动进行了振动处理。然后通过手动让瓶子沿铅直方向轻轻地振动，再次用涡旋混合器(2800～3200rpm、接触底面10秒)进行了振动处理。

接下来，用pbs(-)清洗瓶内的基质，然后回收了从基质上剥离下来的人体脂肪组织由来间充质细胞1×10⁸个。

将人体脂肪组织由来间充质细胞已被剥离下来的基质染色，然后拍摄了照片。染色就是用4wt％的多聚甲醛固定细胞，用5mg/ml结晶紫进行染色，清洗多出来的结晶紫以后，将基质干燥，再用2％的sds溶液溶析结晶紫，然后拍摄了照片。将结果示于图1中。需要说明的是，细胞生存率为97.6％。

让剥离下来的大量的人体脂肪组织由来间充质细胞以悬浮于细胞悬浮液的状态通过20μm(比细胞直径大且比异物碎片小)的过滤器，并将细胞悬浮液回收到四个50ml的离心管中。

添加与离心管内的细胞悬浮液等量的培养基，在离心力400g、时间5min、温度4℃的条件下进行离心处理，为实现细胞块(cellpellet)而去掉了上清液。

让人体脂肪组织由来间充质细胞悬浮、漂浮于20ml的培养基上。

将细胞悬浮液轻轻地、缓慢地添加到50ml的离心管内比重为1.20(需要说明的是，人体脂肪组织由来间充质细胞的比重为1.075、异物碎片的比重为1.36)的蔗糖溶液上，由此实现了叠层化。

在该状态下，在离心力400g、时间10min、温度4℃的条件下进行离心处理，比重较大的异物碎片在蔗糖溶液内朝着离心管的最下部沉淀，人体脂肪组织由来间充质细胞就在蔗糖溶液的上层形成了细胞层。

只将细胞层回收到50ml的离心管内，添加其量在细胞层以上的培养基，在离心力400g、时间5min、温度4℃的条件下进行离心处理，使其成为细胞块状态后，再让该细胞块悬浮于所需量的培养基、生理食盐水中，由此制备出细胞悬浮液。

接下来，作为比较例，与上述一样，用cesco公司的高密度培养系统bellocell在瓶内进行细胞培养，然后添加pbs(-)进行了清洗。既不进行上述酶处理也不进行振动处理，而用结晶紫对基质进行染色，然后拍摄了照片。将结果示于图2中。结果显示，根据本实施例所涉及的培养细胞回收方法，能够高效地回收细胞。

(2)实施例2

在实施例2中，对在酶处理步骤中使用的酶溶液做了研究。

与实施例1一样，用cesco公司的高密度培养系统bellocell将细胞种植在瓶内以后又进行了7天的细胞培养，然后添加pbs(-)进行了清洗。

将pbs(-)回收起来备用。添加了基质全部位于水面下时所需要的最少量的酶溶液，37℃下进行了15分钟的酶处理。酶溶液为胰蛋白酶-edta、胶原酶以及酪蛋白酶的混合液。混合比为，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：1(t2c1d1)。

然后，与实施例1一样，使用涡旋混合器(2800～3200rpm、接触底面10秒)进行了振动处理。

接下来，用pbs(-)对瓶内的基质进行了清洗以后，对从基质剥离下来的人体脂肪组织由来间充质细胞进行回收，与实施例1一样用结晶紫进行染色，拍摄了照片(图3的(a))。需要说明的是，细胞生存率为98.5％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶＝2：1(t2c1)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，然后拍摄了照片(图3的(b))。需要说明的是，细胞生存率为96.9％。

在酶处理步骤，使用了混合比为胶原酶：酪蛋白酶＝1：1(c1d1)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，然后拍摄了照片(图3的(c))。需要说明的是，细胞生存率为93.2％。

作为比较例，与实施例1一样，使用cesco公司的高密度培养系统bellocell在瓶内进行细胞培养，然后添加pbs(-)进行了清洗，既不进行酶处理也不进行振动处理，用结晶紫对基质进行染色，然后拍摄了照片(图3的(d))。

接下来，在图4中示出对在成分不同的酶溶液的情况下的细胞回收率的比较情况。在图4中，示出在酶溶液t2c1d1的情况下的细胞回收设为100时的相对值。

实施例1以及实施例2的结果表明：进行酶处理时使用的酶溶液中需要含有胰蛋白酶-edta、酪蛋白酶和/或胶原酶，即酶溶液中含有胰蛋白酶-edta、胶原酶以及酪蛋白酶的情况下，能够更加高效地进行回收。

(3)实施例3

在实施例3中，研究了在正常培养期的情况下回收效率最佳的胰蛋白酶-edta、胶原酶以及酪蛋白酶的混合液即酶溶液的混合比。

与实施例1一样，用cesco公司的高密度培养系统bellocell将细胞种植在瓶内以后又进行了7天的细胞培养，然后添加pbs(-)进行了清洗。

将pbs(-)回收起来备用。添加了基质全部位于水面下时所需要的最少量的酶溶液，并在37℃下进行了15分钟的酶处理。酶溶液的混合比为，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：2：2(t2c2d2)。

然后，与实施例1一样，使用涡旋混合器(2800～3200rpm、接触底面10秒)进行了振动处理。

接下来，用pbs(-)清洗瓶内的基质，然后回收了从基质上剥离下来的人体脂肪组织由来间充质细胞，与实施例1一样地用结晶紫进行染色，拍摄了照片(图5的(a))。细胞生存率为95.4％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：1(t2c1d1)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，然后拍摄了照片(图5的(b))。需要说明的是，该混合比与在实施例2的图3的(a)中示出的相同。细胞生存率为94.8％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝0.5：2：2(t0.5c2d2)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，然后拍摄了照片(图5的(c))。细胞生存率为96.2％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝1：1：1(t1c1d1)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，然后拍摄了照片(图5的(d))。细胞生存率为93.1％。

需要说明的是，作为参考例，通过吹吸进行了振动处理步骤。即，与实施例1一样，用cesco公司的高密度培养系统bellocell在瓶内进行细胞培养，然后添加pbs(-)进行了清洗。回收pbs(-)以备用。添加了基质全部位于水面下时所需要的最少量的酶溶液，在37℃下进行了15分钟的酶处理。酶溶液的混合比为，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：2：2(t2c2d2)。然后，用巴氏吸管通过吹吸进行了振动处理。用pbs(-)清洗瓶内的基质后，回收从基质剥离下来的人体脂肪组织由来间充质细胞，与实施例1一样，用结晶紫进行染色，拍摄了照片(图6的(a))。细胞生存率为99.1％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：1(t2c1d1)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，通过吹吸进行了振动处理(图6的(b))。细胞生存率为95.3％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝0.5：2：2(t0.5c2d2)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，然后通过吹吸进行了振动处理(图6的(c))。细胞生存率为85.5％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝1：1：1(t1c1d1)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，然后通过吹吸进行了振动处理(图6的(d))。细胞生存率为90.5％。

接下来，在图7中示出用涡旋混合器进行振动处理步骤的情况和通过吹吸进行振动处理步骤的情况下的细胞回收率的比较情况。在图7中，示出的是，设酶溶液为t2c1d1且混合器为涡旋混合器的情况下的细胞回收率为100时的相对值。

实施例3的结果表明：在正常培养期的情况下，使用胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：1的酶溶液时，细胞回收率最佳。

(4)实施例4

在实施例4中，对在培养期较长的情况下回收效率最佳的胰蛋白酶-edta、胶原酶以及酪蛋白酶的混合液即酶溶液的混合比进行了研究。

细胞使用了从lonza公司买来的人体脂肪组织由来间充质细胞。培养是在瓶状的培养瓶内进行的。瓶的容量为1500ml(口径100mm、高度210mm、底部直径110mm)。在培养瓶内填充有培养液和由高分子材料制成的无纺布形成的基质，将人体脂肪组织由来间充质细胞种植在该基质上。将空气供给细胞，将营养供给细胞，将代谢产物(co2)排出，将细胞种植在瓶内以后又进行了25天的细胞培养。然后，添加pbs(-)进行了清洗。

将pbs(-)回收起来备用。添加酶溶液，在37℃下进行了15分钟的酶处理。酶溶液的混合比为，胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：4：4(t2c4d4)。

然后，用涡旋混合器(2800～3200rpm、接触底面30秒)进行了振动处理。即，将装有进行过酶处理的细胞的培养瓶放置在涡旋混合器的橡胶台座上，对进行过酶处理的培养细胞施加铅直方向的振动，进行了振动处理。然后，通过手动让瓶子沿铅直方向轻轻地振动，再次使用涡旋混合器(2800～3200rpm、接触底面30秒)进行了振动处理。

接下来，用pbs(-)清洗瓶内的基质后，回收从基质剥离下来的人体脂肪组织由来间充质细胞，在结晶紫染色后，拍摄了照片(图8的(a))。细胞生存率为96.3％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：4(t2c1d4)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，用结晶紫进行染色后，拍摄了照片(图8的(b))。细胞生存率为97.2％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：4：1(t2c4d1)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，用结晶紫进行染色后，拍摄了照片(图8的(c))。细胞生存率为97.7％。

在酶处理步骤中，使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：1：1(t2c1d1)的酶溶液，除此之外，其它方面都与以上所述一样，用结晶紫进行染色，然后拍摄了照片(图8的(d))。细胞生存率为96.0％。

需要说明的是，将人体脂肪组织由来间充质细胞种植在填充有培养液和由高分子材料的无纺布形成的基质的培养瓶内，种植后进行了25天的细胞培养，然后添加pbs(-)进行清洗，不进行酶处理，在该状态下，拍摄了照片(图8的(e))，定为比较例。参考图8的(e)可知，基质上附着有大量的人体脂肪组织由来间充质细胞。参考图8的(a)可知，基质上几乎未附着有人体脂肪组织由来间充质细胞。附着在基质上的人体脂肪组织由来间充质细胞的个数按照图8的(a)、图8的(b)、图8的(c)、图8的(d)的顺序逐渐增多。图9示出在酶溶液的混合比为t2c4d4、t2c1d4、t2c4d1、t2c1d1的情况下所回收的细胞个数。如图9所示，所回收的细胞个数按照t2c4d4、t2c1d4、t2c4d1、t2c1d1的顺序逐渐增多。由该实验结果可以看出，在细胞培养期较长的情况下，在酶处理步骤中使用混合比为胰蛋白酶-edta：胶原酶：酪蛋白酶＝2：4：4(t2c4d4)的酶溶液时，细胞的回收率最佳。

－产业实用性－

能够将培养出的大量细胞从支架上回收起来。