优良种事件油菜NS-B50027-4的制作方法
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领域
本发明实施方案涉及油菜育种和农产品领域，具体涉及优良种(elite)事件ns-b50027-4。
背景
油菜是在世界上许多地区种植的重要油料作物。菜子油的脂肪酸组成富含单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸二者，包括短链ω-3脂肪酸，但缺乏长链ω-3脂肪酸。长链ω-3脂肪酸(lc-ω3)脂肪酸具有已确定的健康益处，但目前lc-ω3脂肪酸主要从藻类直接获得或从食用藻类的海洋鱼类获得。对膳食lc-ω3脂肪酸，特别是二十二碳六烯酸(22:6n-3；dha)和二十碳五烯酸(20:5n-3；epa)的认识导致对可食用鱼油的需求急剧增加。因此，存在对于供人类消耗的lc-ω3脂肪酸的可替代的、直接来源的需求。此外，由于养殖鱼类诸如大西洋鲑鱼以与膳食脂肪酸成正比地积累脂肪酸，因此需要维持鱼饲料中lc多不饱和脂肪酸(lc-pufa)的量，并继而确保养殖鱼类中这些脂肪酸的存在。因此，需要可以在水产养殖中使用的富含lc-pufa的来源。例如，需要能够产生lc-pufa，特别是lc-ω3脂肪酸诸如dha的油菜，用于在水产养殖中使用以及用于直接人体消耗。尽管植物育种和分子遗传操作(manipulation)方面取得了成就，但是还没有具有接近在野生鱼类中产生的lc-pufa含量的那些lc-pufa含量的菜子油的商业来源。此外，油菜栽培种(cultivar)(不是f1杂交种)应是同系的(homogenous)、纯合的(homozygous)和可繁殖的，以用于经济作物在可靠的基础上的生产。因此，仍然需要可以作为可持续作物种植、其种子提供具有商业可行的量的lc-ω3脂肪酸诸如dha的油菜品系。
技术实现要素：
本文描述的实施方案提供了一种近交重组油菜品系，命名为ns-b50027-4，其种子包含有益水平的ω3和lc-ω3脂肪酸，因此提供生产这些有价值的油类的可再生的基于陆地的系统。近交油菜品系ns-b50027-4的种子的代表性样品根据布达佩斯条约于2016年6月9日保藏在美国典型培养物保藏中心
本发明实施方案的一个方面提供了一种油菜(欧洲油菜(brassicanapusl.))品系ns-b50027-4的种子，ns-b50027-4是被选择和育种成稳定、均一的育种品系的栽培种avjade的经遗传改良的油菜，并且在其种子中积累了相对总脂肪酸含量而言高比例(百分比)的ω3脂肪酸和lc-ω3脂肪酸。开发近交品系ns-b50027-4以提供以接近一些野生鱼油中发现的水平的那些水平产生包含lc-ω3脂肪酸，特别是dha的种子的油菜植物。源自ns-b50027-4的食用油具有比其他欧洲油菜植物显著更高的dha含量。通过遗传转化、然后是对稳定、高产、形态适合的油菜品系的严格的选择和育种来开发新颖的、均一的育种品系ns-b50027-4。
因此，本文描述的至少一个实施方案涉及近交油菜品系ns-b50027-4的种子；从近交油菜品系ns-b50027-4的种子培育的植物及其部分诸如花粉、胚珠或种子；以及通过培育近交油菜品系ns-b50027-4，或通过将近交油菜品系ns-b50027-4与其自身或与另一个油菜品系或芸薹属(brassica)品系杂交并从培育的子代(progeny)获得种子而从油菜植物生产种子的方法。
至少一个实施方案提供了来自通过本文描述的方法产生的油菜植物群体的种子，平均而言，所述群体的10％至100％的等位基因来源于油菜品系ns-b50027-4。类似地，本发明实施方案提供了油菜品系ns-b50027-4、ns-b50027-4的亚系、ns-b50027-4或亚系的子代、或通过将ns-b50027-4与第二油菜或芸薹属植物杂交而产生的植物，用于育种或培育用于种子、油、粗粉(meal)或蛋白生产的植物。
至少一个实施方案提供了油菜植物(诸如欧洲油菜植物)的种子，所述种子在其基因组中包含近交品系ns-b50027-4的至少一部分基因组。至少一个实施方案提供了一种植物诸如欧洲油菜植物，所述植物在其基因组中包含近交品系ns-b50027-4的至少一部分基因组。至少一个实施方案提供了油菜植物(诸如欧洲油菜植物)的细胞，所述细胞在其基因组中包含近交品系ns-b50027-4的至少一部分基因组。另一个实施方案提供了油菜植物(诸如欧洲油菜植物)的基因组dna，所述基因组dna包含品系ns-b50027-4的至少一部分基因组。至少一个实施方案还涉及来自植物的种子、细胞、组织、组织培养物、子代和后代(descendant)，所述植物包含ns-b50027-4的至少一部分基因组，ns-b50027-4由保藏在
至少一个实施方案提供了油菜植物(诸如欧洲油菜植物)的种子，所述种子在其基因组中包含品系ns-b50027-4的优良种事件。至少一个实施方案提供了一种植物，诸如欧洲油菜植物，所述植物在其基因组中包含近交品系ns-b50027-4的优良种事件。另一个实施方案提供了油菜植物(诸如欧洲油菜植物)的基因组dna，该基因组dna包含品系ns-b50027-4的优良种事件。至少一个实施方案还涉及来自植物的种子、细胞、组织、组织培养物、子代和后代，所述植物包含由保藏于
本发明实施方案的近交品系ns-b50027-4的参考种子已经以登陆号pta-123186保藏于
在至少一个实施方案中，
在另一个实施方案中，可以播种从保藏的种子可获得的或已获得的种子或子代种子(例如，在与具有相同或不同遗传背景的油菜或芸薹属植物杂交后)，并且生长的植物可以具有和ns-b50027-4的表型基本上相同的表型。在至少一个实施方案中，在常规收获时，ns-b50027-4子代种子的脂肪酸含量包含以种子的总脂肪酸的重量％计至少5％的dha、约6％、约7％的dha、约8％的dha、约9％的dha、约10％的dha、约11％的dha、约12％的dha、约13％的dha、约14％的dha、约15％的dha、约17％的dha、约18％的dha、约19％的dha、约20％的dha、约21％的dha、约22％的dha、约23％的dha、约24％的dha(包含端点)，或更多的dha。在至少一个实施方案中，在常规收获时，ns-b50027-4子代种子的脂肪酸含量包含作为epa、dpa和dha之和的为种子的总脂肪酸的重量％计至少5％的lc-pufa、约6％的lc-pufa、约7％的lc-pufa、约8％的lc-pufa、约9％的lc-pufa、约10％的lc-pufa、约11％的lc-pufa、约12％的lc-pufa、约13％的lc-pufa、约14％的lc-pufa、约15％的lc-ufa、约16％的lc-pufa、约17％的lc-pufa、约18％的lc-pufa、约19％的lc-pufa、约20％的lc-pufa、约21％的lc-pufa、约22％的lc-pufa、约23％的lc-pufa、约24％的lc-pufa、约25％的lc-pufa(包含端点)，或更多的lc-pufa。
ns-b50027-4的种子还含有比常规油菜品种实质上更多的ω3ala。在至少一个实施方案中，在常规收获时，ns-b50027-4子代种子的脂肪酸含量包含以种子的总脂肪酸的重量％计至少15％的ala、约16％的ala、约17％的ala、约18％的ala、约19％的ala、约20％的ala、约21％的ala、约22％的ala、约23％的ala、约24％的ala(包含端点)，或更多的ala。
本发明实施方案的另一方面提供了含有有益的ω3脂肪酸和lc-ω3脂肪酸水平的油，其中脂肪酸内容物含有比普通菜子油的比率更高的ω3:ω6脂肪酸比率。例如，avjade不含有epa/dpa/dha(ω3)来与la(ω6)比较，在一个实施方案中，来自ns-b50027-4的种子油具有约1至约7的epa/dpa/dha(ω3):la(ω6)比率，诸如约1.25。来自ns-b50027-4的ω3:ω6脂肪酸的比率对于棕榈酸而言是特别有益的。来自亲本品系avjade的油不具有dha，因此不存在dha:棕榈酸酯比率；来自ns-b50027-4的油具有例如约2.12的dha:棕榈酸酯比率；相比之下，来自养殖鲑鱼的油具有0.59的报道的dha:棕榈酸酯比率；并且来自野生鲑鱼的油具有1.02的报道的dha:棕榈酸酯比率。在至少一个实施方案中，ns-b50027-4的种子油中的ω3:ω6脂肪酸的比率为约3至约7，诸如约6的比率。
在本发明实施方案的另一个方面，来自近交品系ns-b50027-4种子的油、脂质、ω3-fa、lc-pufa或dha用作人类或动物的食料(食品或食用材料，包括饮料)或者用于在人类或动物的食料(食品或可食用材料，包括饮料)中使用，或用作人类或动物的营养补充剂(食品添加剂)。在至少一个实施方案中，来自事件ns-b50027-4种子的油、脂质、ω3-fa、lc-pufa或dha用于补充饲料或用作水产养殖中的饲料添加剂。在至少一个实施方案中，来自事件ns-b50027-4种子的油、脂质、ω3-fa、lc-pufa或dha用作药物组合物或用于在药物组合物中使用。在至少一个其他实施方案中，从ns-b50027-4或其子代的种子浓缩获得的种子粗粉或蛋白用作食料(食品或可食用材料)或用于在食料(食品或可食用材料)中使用，或用作人类或动物的营养补充剂(食品添加剂)。在具体的实施方案中，来自ns-b50027-4或其子代的种子的油、脂质、粗粉或蛋白用作水产养殖的饲料。
本发明实施方案的一个方面提供了通过向植物提供(例如，通过遗传转化或育种)多于一个(multiple)拷贝的基因构建体来增加植物中lc-pufa的方法，所述基因构建体表达lc-pufa生物合成途径的“前端(frontend)”的一些酶。例如，虽然并非所有的酶δ6-去饱和酶、δ5-去饱和酶、δ5-延长酶和ω3/δ15-去饱和酶都可以被排他地(exclusively)认为是前端酶，但在特定的实施方案中，这些基因在产生lc-pufa的植物中被组装成增加lc-pufa诸如dha生产的人工基因座。在特定的实施方案中，包含一些前端基因的人工基因座包括细小微胞藻(micromonaspusilla)来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、盐生巴夫藻(pavlovasalina)来源的δ5-去饱和酶和巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)来源的δ15/ω3-去饱和酶。
所描述的实施方案的一个方面提供了一种新的油菜育种品系，命名为ns-b50027-4，和在其核基因组中包含nsb50027的优良种事件的油菜植物，诸如欧洲油菜。包含品系ns-b50027-4的遗传事件的芸薹属植物能够产生种子特异性的脂肪酸，所述脂肪酸包含比常规油菜植物中产生的脂肪酸更不饱和的、更长的链。近交油菜品系ns-b50027-4植物表现出与非转基因的等基因的(isogenic)油菜植物品系基本等同的其他农艺性状；但是这样的性状与其他品系不同，以提供独立的品系或栽培种。近交油菜品系ns-b50027-4种子的代表性样品已保藏在
至少一个实施方案涉及转基因油菜种子、其植物或植物部分、组织或细胞，具有稳定地整合到基因组的至少一个转基因插入片段，所述转基因插入片段包含含有16个异源基因的表达盒，所述转基因经密码子优化用于植物表达并且编码pavlovasalina来源的δ4-去饱和酶、pavlovasalina来源的δ5-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ6-延长酶、lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶，和至少一个红花烟草(nicotianatobacum)来源的基质结合区(mar)和可选择标记基因；以及至少一个包含四个异源基因的表达盒的转基因插入片段，该转基因经密码子优化用于植物表达并且编码细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、pavlovasalina来源的δ5-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶转基因，以及至少一个红花烟草来源的mar。近交转基因系ns-b50027-4举例说明了该实施方案，并且具有这些异源基因的种子的代表性样品已经保藏在
本发明实施方案的另一个方面提供了从近交油菜品系ns-b50027-4或包含品系ns-b50027-4的优良种事件的油菜植物获得的分离的或纯化的基因组dna，其种子已经保藏于atcc，登录号为pta123186。这样的基因组dna可以用作，例如，本文描述的鉴定测定中的参考对照材料。至少一个实施方案提供了欧洲油菜的基因组，所述基因组具有在位于欧洲油菜参考基因组(2n＝aacc；darmor变种)chrun_random上的118589903-118591677位处的hpp基因的3'utr中的缺失，和在芸薹(b.rapa)参考基因组(2n＝aa，chiifu变种)的染色体a02处的18569298-18571066位处的缺失，其中该缺失是gtagcacgacaagtt(seqidno:38)。15-bp缺失位于欧洲油菜参考基因组的chrun_random的118589927-118589941位处和芸薹参考基因组的染色体a02的18569316-18569330位处。至少一个实施方案提供了欧洲油菜植物，该欧洲油菜植物在位于欧洲油菜参考(darmor变种)基因组的染色体a05上的17267746-17270700位处的编码pto相互作用蛋白(pti)的基因的第二外显子中具有缺失，该缺失破坏pti的表达，其中该缺失是cacggtggaggtcaccatgt(seqidno:39)。这些缺失是近交油菜品系ns-b50027-4的基因组特征，并且可以用于鉴定品系ns-b50027-4和来源于品系ns-b50027-4的子代。
因此，本发明实施方案还提供了鉴定包括近交油菜品系ns-b50027-4的转基因方面(优良种事件)的转基因植物或其细胞或组织的方法，该方法基于鉴定具有特定的核苷酸序列或编码特定的氨基酸的表征dna分子的存在。例如，这样的表征dna分子包含含有该事件的插入片段连接位点的15个碱基对(bp)、至少15bp、20bp、至少20bp、至少24bp、至少30bp或多于30bp的序列(即，包含含有lc-ω3脂肪酸合成基因或(包括用于表达等的调控序列的“基因”)的插入的外源dna的一部分和与其相接的油菜或芸薹属基因组的一部分(每个插入的5'侧翼区域或3'侧翼区域)二者)，允许特异性地识别优良种事件。例如，ns-b50027-4的染色体a02中的四基因插入片段的5'末端的连接序列包含seqidno:43；染色体a02中四基因插入片段的3'末端的连接序列包含seqidno:44；ns-b50027-4的染色体a05中的16基因插入片段的5'末端的连接序列包含seqidno:45；并且染色体a05中的16基因插入片段的3'末端的连接序列包含seqidno:46。实施方案还涉及包含通过这样的方法鉴定的近交油菜品系ns-b50027-4的优良种事件的植物。
本发明实施方案的另一个方面提供了核酸分子(例如，多核苷酸或dna)，所述核酸分子包含ns-b50027-4优良种事件的插入位点和足够长度的油菜基因组dna和转基因dna二者的多核苷酸，以便可用于检测近交品系ns-b50027-4的优良种事件，以及表征包含ns-b50027-4优良种事件的植物或与近交品系ns-b50027-4相关的植物。这样的分子可以包含，例如，在连接位点的每一侧处分别包含油菜基因组dna的至少9个核苷酸和转基因dna的类似数量的核苷酸。例如，这样的dna分子包含油菜基因组dna的至少9个核苷酸和转基因(外源)dna的类似数量的核苷酸，所述转基因(外源)dna的类似数量的核苷酸包含与seqidno:40中的插入位点相接的基因区域(例如，核苷酸2081至2098和核苷酸14193至14210)、与seqidno:41中的插入位点相接的基因区域(例如，核苷酸1151至1168和核苷酸47765至47782)。在本发明的一个方面中，提供了包含这样的特定核酸分子的油菜植物。
至少一个实施方案涉及转基因芸薹属或油菜种子，或其植物细胞、植物、植物部分或组织，所述转基因芸薹属或油菜种子，或其植物细胞、植物、植物部分或组织具有稳定地整合到基因组的至少一个转基因插入片段，所述转基因插入片段包含含有16个异源基因的表达盒，所述转基因是植物密码子优化的细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、δ6-延长酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶、盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶和lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶，至少一个红花烟草来源的基质结合区(mar)和可选择标记基因；16转基因插入片段，其特征为seqidno:41的核苷酸1268至47773；和至少一个转基因插入片段，所述转基因插入片段包含四个异源基因的表达盒，所述基因经密码子优化用于植物表达并且编码细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶转基因，以及至少一个红花烟草来源的mar；四基因插入片段，其特征为seqidno:40的核苷酸2090至14201。在至少一个实施方案中，两个表达盒位于植物基因组中的两个不同染色体中。
另一实施方案提供了具有seqidno:40、seqidno:41的核酸序列或其互补序列的重组核酸分子。另一实施方案提供了具有seqidno:40的2090至14201位的核酸序列或其互补序列的重组核酸分子。另一实施方案提供了具有seqidno:41的1160至47773位的核酸序列，或其互补序列的重组核酸分子。本发明实施方案还提供了转基因芸薹属或油菜种子，所述种子包含具有seqidno:40的核苷酸2090至14201的核酸序列或其互补序列的核酸分子；和芸薹属或油菜种子，所述种子包含具有seqidno:41的核苷酸1160至47773的核酸序列或其互序列的核酸分子。另一实施方案提供了包含这样的核酸分子的种子或细胞。
另一个实施方案提供了包含人工基因座的dna分子，所述人工基因座依次包括以下核苷酸序列：(a)seqidno:40的从核苷酸2747至核苷酸6250的核苷酸序列；(b)seqidno:40的从核苷酸6257至核苷酸8414的核苷酸序列；(c)seqidno:40的从核苷酸8415至核苷酸10374的核苷酸序列；(d)seqidno:40的从核苷酸10375至核苷酸11544的核苷酸序列；(e)seqidno:40的从核苷酸11545至核苷酸14049的核苷酸序列；(f)与核苷酸序列(a)至(e)具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子；或(g)其互补序列。相关的实施方案提供了包含该人工基因座的植物细胞、植物材料或植物种子。
另一个实施方案提供了包含人工基因座的dna分子，所述人工基因座依次包括以下核苷酸序列：(a)seqidno:41的从核苷酸1268至核苷酸5317的核苷酸序列；(b)seqidno:41的从核苷酸5324至核苷酸7481的核苷酸序列；(c)seqidno:41的从核苷酸7482至核苷酸9443的核苷酸序列；(d)seqidno:41的从核苷酸9444至核苷酸10611的核苷酸序列；(e)seqidno:41的从核苷酸10612至核苷酸13116的核苷酸序列；(f)seqidno:41的从核苷酸13117至核苷酸17000的核苷酸序列；(g)seqidno:41的从核苷酸17001至核苷酸19606的核苷酸序列；(h)seqidno:41的从核苷酸19607至核苷酸29773的核苷酸序列；(i)seqidno:41的从核苷酸20783至核苷酸22987的核苷酸序列；(j)seqidno:41的从核苷酸23011至24370的核苷酸序列；(k)seqidno:41的从核苷酸42561至核苷酸25920的核苷酸序列；(l)seqidno:41的从核苷酸25943至核苷酸29324的核苷酸序列；(m)seqidno:41的从核苷酸28157至核苷酸29324的核苷酸序列；(n)seqidno:41的从核苷酸29324至核苷酸31830的核苷酸序列；(p)seqidno:41的从核苷酸31831至核苷酸35816的核苷酸序列；(q)seqidno:41的从核苷酸35817至核苷酸38319的核苷酸序列；(r)seqidno:41的从核苷酸38320至核苷酸39488的核苷酸序列；(s)seqidno:41的从核苷酸39489至核苷酸41449的核苷酸序列；(t)seqidno:41的从核苷酸41450至核苷酸43607的核苷酸序列；(u)seqidno:41的从核苷酸43614至核苷酸47662的核苷酸序列；(v)与核苷酸序列(a)至(u)、(a)至(j)、(k)至(u)具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的分子，或(w)其互补序列。相关实施方案提供了包含该人工基因座的植物细胞、材料或种子。
另一个实施方案提供了包含人工基因座的dna分子，所述人工基因座依次包括以下核苷酸序列：(a)seqidno:40的从核苷酸2747至核苷酸4141的核苷酸序列；(b)seqidno:40的从核苷酸7259至核苷酸8065的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列；(c)seqidno:40的从核苷酸8841至核苷酸10121的核苷酸序列；(d)seqidno:40的从核苷酸12281至核苷酸13531的核苷酸序列；(e)与核苷酸序列(a)至(d)具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子；或(f)其互补序列；其中人工基因座包括调节区(例如启动子、前导序列、终止子)以提供(a)至(d)或(e)或(f)的表达。相关实施方案提供了包含该人工基因座的植物细胞、植物材料或植物种子。
另一个实施方案提供了包含人工基因座的dna分子，所述人工基因座依次包括以下核苷酸序列：(a)seqidno:41的从核苷酸1820至核苷酸3208的核苷酸序列；(b)seqidno:41的从核苷酸6326至核苷酸7126的核苷酸序列；(c)seqidno:41的从核苷酸7908至核苷酸9192的核苷酸序列；(d)seqidno:41的从核苷酸11352至核苷酸12596的核苷酸序列；(e)seqidno:41的从核苷酸15216至核苷酸16556的核苷酸序列；(f)seqidno:41的从核苷酸17619至核苷酸18866的核苷酸序列；(g)seqidno:41的从核苷酸21895至核苷酸22647的核苷酸序列；(h)seqidno:41的从核苷酸25943至核苷酸26283的核苷酸序列；(i)seqidno:41的从核苷酸30066至核苷酸31313的核苷酸序列；(j)seqidno:41的从核苷酸31831至核苷酸35816的核苷酸序列；(k)seqidno:41的从核苷酸36335至核苷酸38319的核苷酸序列；(1)seqidno:41的从核苷酸39749至核苷酸41023的核苷酸序列；(m)seqidno:41的从核苷酸41805至核苷酸42605的核苷酸序列；(n)seqidno:41的从核苷酸45724至核苷酸47111的核苷酸序列；(o)与核苷酸序列(a)至(u)、(a)至(j)、(k)至(u)具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的分子；或(p)其互补序列；其中人工基因座包括调节区(例如启动子、前导序列、终止子)以提供(a)至(n)或(o)或(p)的表达。相关实施方案提供了包含该人工基因座的植物细胞、植物材料或植物种子。
在一个实施方案中，如本文描述的近交品系ns-b50027-4的转基因具有seqidno:40的从核苷酸位置2090至14201的核苷酸序列或其互补序列，或包含与seqidno:40的从核苷酸位置2090至核苷酸位置14201的核苷酸序列具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子或其互补序列。在一个实施方案中，如本文描述的近交品系ns-b50027-4的转基因具有seqidno:41的从核苷酸位置1268至47662的核苷酸序列或其互补序列，或包含与seqidno:41的从核苷酸位置1268至核苷酸位置47662的核苷酸序列具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子或其互补序列。
本文还提供了芸薹属或油菜植物、植物细胞、组织或种子，在其基因组中包含核酸分子，所述核酸分子包含seqidno:40的从核苷酸位置2090至14201的核苷酸序列或其互补序列，或包含与seqidno:40的从核苷酸位置2090至核苷酸位置14201的核苷酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子或其互补序列。另一个实施方案提供了芸薹属或油菜植物、植物细胞、组织或种子，在其基因组中包含核酸分子，所述核酸分子包含seqidno:41的从核苷酸位置1268至47662的核苷酸序列或其互补序列，或包含与seqidno:41的从核苷酸位置1268至核苷酸位置47662的核苷酸序列具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子或其互补序列。
本发明实施方案的另一个方面提供了用于确定油菜植物是否是近交品系ns-b50027-4或与近交品系ns-b50027-4有关，或者是否是包含品系ns-b50027-4的遗传优良种事件的至少一部分的油菜植物的试剂盒和方法。本文描述了用于鉴定生物样品中的优良种事件ns-b50027-4的简单且明确的技术的组合物和方法。例如，试剂盒包括至少一组对芸薹属染色体dna和插入的转基因的连接特异性的有义(正向)引物和反义(反向)引物。例如，包含序列seqidno:43(tggaggtgttcaaacact)、seqidno:44(atagtattagtatacaga)、seqidno:45(ggctaaggtaacactgat)和seqidno:46(cagtgtttgaaggacaga)的dna连接是优良种事件ns-b50027-4的新的dna序列，并且可以用于诊断油菜植物ns-b50027-4及其子代。更具体地，seqidno:43和seqidno:44中的连接序列代表在转基因序列片段的插入位点的每一侧且在油菜基因组染色体a02dna上的9个多核苷酸；并且seqidno:45和seqidno:46中的连接序列代表在转基因序列片段的插入位点的每一侧且在油菜基因组染色体a05dna上的9个多核苷酸。可以从本文描述的侧翼区选择更长或更短的多核苷酸。
本发明实施方案还提供了用于基于特异性识别外源dna插入片段的5'侧翼区或3'侧翼区的引物或探针来鉴定生物样品中近交油菜品系ns-b50027-4的优良种事件的方法，所述外源dna插入片段包含优良种事件ns-b50027-4的遗传事件。更具体地，实例方法包括通过聚合酶链式反应用至少两个引物扩增生物样品中存在的核酸，其中一个引物识别优良种事件ns-b50027-4的插入的外源dna(异源dna或转基因dna)的5'芸薹属侧翼区或3'芸薹属侧翼区，其中另一个引物识别外源dna内的包括例如外源去饱和酶或延长酶基因的序列，以获得100bp和800bp之间的dna片段。引物或探针可以通过识别以下序列来鉴定ns-b50027-4：seqidno:40的从1至2089位的插入片段(或其互补物)侧翼的染色体a02的5'区内的序列、或seqidno:40的从14202至15006位的插入片段(或其互补物)侧翼的染色体a02的3'区内的序列；seqidno:41的从1至1159位的插入片段(或其互补物)侧翼的染色体a05的5'区内的序列、或seqidno:41的从47774至49789位的插入片段(或其互补物)侧翼的染色体a05的3'区内的序列；和包含例如seqidno:40的从2090至14201位(或其互补序列)或seqidno:41的从1160至47773位(或其互补序列)的外源dna中的至少一个序列。
至少一个实施方案还提供了可用于竞争性等位基因特异性pcr(kasp)测定(两个等位基因特异性正向引物识别snp)、液滴数字pcr(ddpcr)测定、定量pcr(qpcr)测定、旁系同源物特异性测定、或用于偶然存在(ap)测试测定的组合物。可用于进行kasp测定以检测ns-b50027-4遗传性状，特别适用于基因渗入研究和杂交体开发的引物的具体实施方案包括seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:35、seqidno:36、seqidno:37的引物的至少10个连续核苷酸，或其互补序列。前述引物或其互补序列可以包括在用于鉴定ns-b50027-4、ns-b50027-4的子代，或包含ns-b50027-4的至少一部分基因组的其他植物或植物材料的试剂盒中。相关实施方案提供了通过这样的引物鉴定的植物材料。
例如，至少一个实施方案提供了dna分子的分离的引物对，其中第一引物包含来自seqidno:47的5'油菜侧翼基因组区域的核苷酸1至235的至少11个连续核苷酸或其完全互补序列，并且第二引物包含来自seqidno:47的核苷酸236至470的转基因区域的至少11个连续核苷酸或其完全互补序列，其中dna分子的引物对当在dna扩增反应中一起使用时，产生包含seqidno:43的用于油菜事件ns-b50027-4或其子代的诊断扩增子。
至少一个实施方案提供了包含dna分子的分离的引物对的组合物，其中第一引物包含seqidno:48的转基因区域的从核苷酸1至235的至少11个连续核苷酸或其完全互补序列，并且第二引物包含seqidno:48的从核苷酸236至470的3'油菜侧翼基因组dna区域的至少11个连续核苷酸或其完全互补序列，其中dna分子的引物对当在dna扩增反应中一起使用时，产生包含seqidno:44的用于油菜事件ns-b50027-4或其子代的诊断扩增子。
至少一个实施方案中提供了dna分子的分离的引物对，其中第一引物包含seqidno:49的5'油菜侧翼基因组区域的从核苷酸1至235的至少11个连续核苷酸或其完全互补序列，并且第二引物包含seqidno:49的从核苷酸236至470的转基因区域的至少11个连续核苷酸或其完全互补序列，其中dna分子的引物对当在dna扩增反应中一起使用时，产生包含seqidno:45的用于油菜事件ns-b50027-4或其子代的诊断扩增子。
至少一个实施方案中提供了dna分子的分离的引物对，其中第一引物包含seqidno:50的转基因组区域的从核苷酸1至235的至少11个连续核苷酸或其完全互补序列，并且第二引物包含seqidno:50的从核苷酸236至470的3'油菜侧翼基因组dna区域的至少11个连续核苷酸或其完全互补序列，其中，dna分子的引物对当在dna扩增反应中一起使用时产生包含seqidno:46的用于油菜事件ns-b50027-4或其子代的诊断扩增子。
此外，dna事件引物对也可以用于产生诊断ns-b50027-4事件的扩增子。这些事件引物对包括，例如，aattgttggaggtgttcaaacact(seqidno:51)和cggaatcacaatccctgaatgatt(seqidno:52)或其互补序列。由seqidno:51和seqidno:52产生的扩增子为约250个多核苷酸。除了这些引物对之外，当在dna扩增反应中使用时产生诊断ns-b50027-4事件的扩增子的来源于seqidno:47、seqidno:48、seqidno:49或seqidno:50或其互补序列的任何引物对是本发明实施方案的一个方面。
另一实施方案提供了针对盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶、盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ6-延长酶、lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶中的一个的至少一组引物；和对在插入片段和天然芸薹属染色体a02dna之间的5'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:40的从核苷酸2033至2132的连接，包含43bp插入片段和57bp的芸薹属染色体a02dna的100bp区域，或对在插入片段和天然芸薹属染色体a02dna之间的3'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:40的从核苷酸14156至14255的连接，包含46bp的插入片段和54bp的芸薹属染色体a02dna的100bp区域；对在插入片段和天然芸薹属染色体a05dna之间的5'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:41的从核苷酸47724至47823的连接，包含50bp插入片段和50bp的芸薹属染色体a05dna的100bp区域，或对在插入片段和天然芸薹属染色体a05dna之间的3'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:41的从核苷酸47724至47823的连接，包含50bp的插入片段和50bp的芸薹属染色体a05dna的100bp区域。
另一个实施方案提供了识别ns-b50027-4的外源dna内的序列的引物，所述外源dna包括例如具有seqidno:57、seqidno:58的序列的细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶dna或其互补序列；具有seqidno:63、seqidno:64的序列的pyramimonascordata来源的δ5-延长酶或其互补序列；具有seqidno:61、seqidno:62的序列的盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶或其互补序列；具有seqidno:55、seqidno:56的序列的巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶或其互补序列；具有seqidno:65、seqidno:66的序列的盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶或其互补序列；具有seqidno:53、seqidno:54的核苷酸序列的lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶或其互补序列；或具有seqidno:59、seqidno:60的序列的pyramimonascordata来源的δ6-延长酶或其互补序列的至少一种引物。因此，本发明实施方案提供了特异性引物和使用这样的引物扩增的特异性dna，以及可以来源于本文提供的序列信息的引物。
根据用于鉴定ns-b50027-4及其子代的方法，除了特异性识别优良种事件ns-b50027-4的5'或3'侧翼区的引物之外，试剂盒还可以包含特异性识别外源dna内的序列的第二引物，用于在pcr鉴定方案中使用，所述外源dna包含细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶、盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ6-延长酶或lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶中的至少一种。试剂盒可以包含至少两种特异性引物，一种识别优良种事件ns-b50027-4的5'侧翼区内的序列，且另一种识别外源dna内的序列，所述外源dna包含细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶、盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶或lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶中的至少一种。
本发明还涉及用于鉴定生物样品中优良种事件ns-b50027-4的试剂盒，所述试剂盒包含pcr引物，所述pcr引物包含seqidno:1至seqidno:37的核苷酸序列或其互补序列或基本上由seqidno:1至seqidno:37的核苷酸序列或其互补序列组成，用于在本文描述的优良种事件ns-b50027-4鉴定方案中使用。
至少一个实施方案涉及转基因油菜种子、其植物或植物部分、组织或细胞，所述转基因油菜种子、其植物或植物部分、组织或细胞具有稳定地整合到基因组的至少一个转基因插入片段，所述转基因插入片段包含含有16个异源基因的表达盒，所述转基因是植物密码子优化的细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶、盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ6-延长酶和lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶，至少一个红花烟草来源的基质结合区(mar)和可选择标记基因；以及至少一个包含四个异源基因的表达盒的转基因插入片段，该基因经密码子优化用于植物表达并且编码细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶转基因，和至少一个红花烟草来源的mar，该四基因表达盒的特征为seqidno:40的核苷酸2090至14201。在至少一个实施方案中，两个表达盒位于植物基因组的两个不同染色体中。
另一实施方案提供了具有图5的核酸序列(seqidno:40)或其互补序列的重组核酸分子。另一实施方案提供了具有图6的核酸序列(seqidno:41)或其互补序列的重组核酸分子。在一个实施方案中，如本文描述的近交品系ns-b50027-4的转基因具有seqidno:40的从核苷酸位置2090至14201的核苷酸序列或其互补序列，或包含与seqidno:40的从核苷酸位置2090至核苷酸位置14201的核苷酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子或其互补序列。本文还提供了油菜植物、植物细胞、组织或种子，在其基因组中包含核酸分子，所述核酸分子包含seqidno:40的从核苷酸位置2090至14201的核苷酸序列或其互补序列，或包含与seqidno:40的从核苷酸位置2090至核苷酸位置14201的核苷酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的分子或其互补序列。在另一个实施方案中，如本文描述的近交品系ns-b50027-4的转基因具有seqidno:41的从核苷酸位置1268至47662的核苷酸序列或其互补序列，或包含与seqidno:41的从核苷酸位置1268至核苷酸位置47662的核苷酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子或其互补序列。本文还提供了一种油菜植物、植物细胞、组织或种子，在其基因组中包含核酸分子，所述核酸分子包含seqidno:41的从核苷酸位置1268至47662的核苷酸序列或其互补序列，或包含与seqidno:41的从核苷酸位置1268至核苷酸位置47662的核苷酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或99.5％的序列同一性的分子或其互补序列。
本发明实施方案的另一方面提供了用于确定油菜植物是否是近交品系ns-b50027-4或是否与近交品系ns-b50027-4有关，或者是否是包含品系ns-b50027-4的遗传优良种事件的至少一部分的油菜植物。本文描述了用于鉴定生物样品中优良种事件ns-b50027-4的简单且明确的技术的组合物和方法。例如，试剂盒包括至少一组对芸薹属染色体dna和插入的转基因的连接特异性的有义(正向)引物和反义(反向)引物。例如，包含序列seqidno:43(tggaggtgttcaaacact)、seqidno:44(atagtattagtatacaga)、seqidno:45(ggctaaggtaacactgat)和seqidno:46(cagtgtttgaaggacaga)的dna连接是ns-b50027-4事件的新的dna序列，并且可以用于诊断油菜植物ns-b50027-4及其子代。seqidno:43和seqidno:44中的连接序列代表在转基因序列片段的插入位点的每一侧且油菜基因组染色体a02dna的9个多核苷酸；并且seqidno:45和seqidno:46中的连接序列代表在转基因序列片段的插入位点的每一侧且在油菜基因组染色体a05dna9个多核苷酸。可以从本文描述的侧翼区选择更长或更短的多核苷酸。
此外，dna事件引物对也可用于产生诊断ns-b50027-4事件的扩增子。这些事件引物对包括例如aattgttggaggtgttcaaacact(seqidno:51)和cggaatcacaatccctgaatgatt(seqidno:52)，或其互补序列。由seqidno:51和seqidno:52产生的扩增子为约250个多核苷酸。除了这些引物对之外，当在dna扩增反应中使用时产生诊断ns-b50027-4事件的扩增子的来源于seqidno:43、seqidno:44、seqidno:45或seqidno:46或其互补序列的任何引物对是本发明实施方案的一个方面。
另一个实施方案提供了针对微藻细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、微藻pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、pyramimonascordata来源的δ6-延长酶、海洋微藻盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、酵母巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶、盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶、和酵母lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶中的一个的至少一组引物；和对在插入片段和天然芸薹属染色体a02dna之间的5'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:40的从核苷酸2033至2132的连接，包含43bp插入片段和57bp的芸薹属染色体a02dna的100bp区域，或对在插入片段和天然芸薹属染色体a02dna之间的3'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:40的从核苷酸14156至14255的连接，包含46bp的插入片段和54bp的芸薹属染色体a02dna的100bp区域；对在插入片段和天然芸薹属染色体a05dna之间的5'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:41的从核苷酸11109至11209的连接，包含50bp插入片段和50bp的芸薹属染色体a05dna的100bp区域，或对在插入片段和天然芸薹属染色体a05dna之间的3'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:41的从核苷酸47724至47823的连接，包含50bp插入片段和50bp的芸薹属染色体a05dna的100bp区域。
本文描述的实施方案的另一方面提供了用于鉴定生物样品中ns-b50027-4优良种事件的试剂盒，所述试剂盒包含特异性识别侧接外源dna的5'或3'芸薹属区域的至少一个引物或探针，以及特异性识别以下中的至少一个插入dna的至少一个引物或探针：细小微胞藻来源的δ6去饱和酶，其可以包含核苷酸序列gagcaccttgtagttgagtcc(seqidno:57)、agtctgaggatgctcctatgc(seqidno:58)或其互补序列；pyramimonascordata来源的δ5-延长酶，其可以包含核苷酸序列tgctggaactcttggatacg(seqidno:63)、ctgggtgatgtacttcttcc(seqidno:64)或其互补序列；盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶，其可以包含核苷酸序列gctaccgatgcttacaagca(seqidno:61)、tagtgaagtccgtgcttctc(seqidno:62)或其互补序列；巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶，其可以包含核苷酸序列gacgctatccctaagcactgt(seqidno:55)、gtccactcttgagcatcgta(seqidno:56)或其互补序列；盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶，其可以包含核苷酸序列ggctttcagatctgagcatc(seqidno:65)、ctcagccttaacaagaggag(seqidno:66)或其互补序列；lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶，其可以包含核苷酸序列tggagctatccctcatgagt(seqidno:53)、gatcctagaacagtagtggtg(seqidno:54)或其互补序列；塔胞藻(pyramimonas)cs0140来源的δ6-延长酶，其可以包含核苷酸序列tgttgctatggctcaagagc(seqidno:59)、ctagcgtggtgcttcatgta(seqidno:60)或其互补序列。
该实施方案的试剂盒可以包含：特异性识别优良种事件ns-b50027-4的5'或3'侧翼区中的至少一个的引物，；以及除此之外的特异性识别外源dna内的序列的引物，用于在pcr鉴定中使用，所述外源dna包含细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶、盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ6-延长酶或lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶中的至少一种。试剂盒可以包含至少两种特异性引物，一种引物识别优良种事件ns-b50027-4的5'侧翼区内的序列，并且另一种引物识别外源dna内的序列，所述外源dna包含细小微胞藻来源的δ6-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶、盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶、pyramimonascordata来源的δ6-延长酶或lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶中的至少一种。
相关方面提供了从植物获得的或来源于植物的基因组dna，所述基因组dna包含品系ns-b50027-4的优良种事件的至少一部分。这样的基因组dna可用作本文描述的鉴定测定中的参考对照材料。
附图简述
图1提供了ga7-modb转化盒的示意图(图谱(map))。
图2为二元载体pjp3416的质粒图谱。
图3描绘了在8个栽培地点上针对预测的dha(以kg/ha计)绘制的产量图。◆为dhakg/ha；--为线性dhakg/ha；y＝29.296x+2.8315；r2＝0.8567。
图4描绘了在8个地点上针对预测的lc-pufa(epa、dpa和dha)(以kg/ha计)绘制的产量图。◆为lc-pfukg/ha；--为线性lc-pufkg/ha；y＝34.043x+3.4049；r2＝0.8636。
图5示出了四基因转基因插入片段的dna序列及其侧翼欧洲油菜序列(粗体)(seqidno:40)。
图6示出了16基因插入片段的dna序列及其侧翼欧洲油菜序列(粗体)(seqidno:41)。
详细描述
应当理解，本发明不限于本文描述的特定方法、方案和试剂等，并因此可以变化。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求界定。
指出的所有专利和其他出版物为了描述和公开例如可以与本发明关联使用的在这样的出版物中描述的方法，但不提供与本文呈现的那些术语不一致的术语的定义的目的通过引用并入本文。这些出版物仅以其先于本申请的申请日期的公开内容被单独地提供。就这一点而言，任何内容不应该被解释为发明人没有资格借助在先发明或出于任何其他原因先于这样的公开内容的承认。所有关于日期的叙述或关于这些文献内容的陈述是基于申请人可获得的信息，而并不构成对这些文献的日期或内容的正确性的承认。
如在本文和在权利要求中所使用的，单数形式的“一(a)”、“一(an)”及“该(the)”包括复数的指示物，除非上下文另外清楚地指明。除非另有说明，否则在整个说明书中“包含(comprise)”，“包含(comprises)”和“包含(comprising)”包含性地而非排除性地使用，使得所述整数或整数组可包括一个或多个其他未说明的整数或整数组。除非例如被“任一(either)”修饰，否则术语“或”是包含性的。因此，除非上下文另外指明，否则单词“或”表示特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
所有的值都是近似值，因为脂肪酸组成由于环境条件存在一些波动。值通常表示为总脂肪酸的重量的百分比，或总种子的重量的百分比。因此，除了在操作实例中之外，或在另外指示的情况下，表示本文中使用的量或反应条件的所有数字应当被理解为在所有情况中被术语“约”修饰。
重组dna技术可以根据本领域已知的标准方案进行。参见：sambrook等人,molecularcloning:lab.manual(第2版,coldspringharborlab.press,ny(1989)；ausubel等人,currentprotocolsmolec.biol.(1994及更新)；dnacloning:practicalapproach,第1-4卷(glover&hames编辑,irlpress1995,1996)，croy,plantmolec.biol.labfax(biossci.pub.ltd.&blackwellsci.pub.,uk,1993)；wo2015089587。
标题仅为方便起见而提供并且不应解释为以任何方式限制本发明。除非另外定义，本文使用的所有技术术语和科学术语具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的那些含义。本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书界定。为使本公开内容可更容易地理解，首先定义某些术语。另外的定义贯穿详细说明而阐述。
“品系”是在共享该名称的个体之间显示非常小的整体变异的一组植物。“品系”还指携带基本上相同的遗传物质的植物的同质组合，所述基本上相同的遗传物质的至少一种性状在个体之间显示很小的遗传变异或没有遗传变异。“变种(variety)”或“栽培种”可以与“品系”互换使用，但通常前两个术语是指适用于商业生产的品系。例如在短语“遗传衍生自亲本系”中使用的“遗传衍生”是指所讨论的特征完全或部分地由所讨论的植物的遗传组成的一个方面决定。
如本文所用的，“芸薹属”植物是指十字花科(brassicaceae)的植物。芸薹属植物可以属于物种欧洲油菜、芸薹(或芸苔(b.campestris))或芥菜(b.juncea)中的一种。或者，该植物可以属于源自使这些芸薹属物种相互杂交的物种，诸如b.napocampestris，或者源自使这些芸薹属物种中的一种与十字花科(cruciferacea)的另一个物种人工杂交的物种。倍性是指栽培种表现出的染色体数目是二倍体还是四倍体。因为欧洲油菜是由芸薹(以前的芸苔)和甘蓝(b.oleracea)的两种基因组的交叉和保留产生的异源四倍体(双二倍体)，包含转基因事件ns-b50027-4的欧洲油菜可以用于引入ns-b50027-4事件，并因此将本文描述的产生lc-ω3脂肪酸的“性状”引入到芸薹属的其他成员中的育种方法。因此，可用于实施本发明实施方案的芸薹属的成员的实例包括但不限于芥菜、b.napobrassica、甘蓝、埃塞俄比亚芥(b.carinata)、欧洲油菜、芸薹和芸苔以及允许在芸薹属物种之间育种的属于芸薹属的任何其他植物。通常，“油料种子植物”是指物种欧洲油菜、芸薹(或芸苔)或芥菜中的任一种。
欧洲油菜通常被称为油菜籽(rapeseed)或油菜(oilseedrape)，并且特定的栽培种可以被称为油菜(canola)。如本文中使用的，术语“油菜”或“油菜植物”是指能够用于生产菜子油的芸薹属植物(即满足含有少于2％芥酸的特定质量指标的油)并且包括以下品种：欧洲油菜、b.napobrassica、芸薹、芥菜和芸苔。油菜是一种双二倍体(也称为异源四倍体)，是一种种间杂交种，具有来自每个亲本形式的完整二倍体染色体组，具有基因组aacc。
“油菜”和“油菜植物”通常指欧洲油菜，但包括可以与油菜杂交(bred)的所有植物品种。“油菜”和“油菜植物”还包括植物部分。“菜子油”必须含有少于2％芥酸；并且1克风干的、无油固体油菜种子必须含有少于30微摩尔的3-丁烯基葡萄糖异硫氰酸酯、4-戊烯基葡萄糖异硫氰酸酯、2-羟基-3丁烯基葡萄糖异硫氰酸酯、2-羟基-4-戊烯基葡萄糖异硫氰酸酯或其混合物。参见例如codexalimentarius:fats,oils&relatedproducts,第8卷(第2版,food&agricultureorg.unitednations,rome,italy,2001)。
“植物部分”包括植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从其再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和在植物或植物部分中完整的植物细胞，诸如胚胎、花粉、胚珠、种子、荚、叶、花、枝、果实、茎、根、根尖、花药、子叶、下胚轴、胚根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物等。子叶是一种类型的种子叶片；植物胚胎上包含的一个小叶片。子叶含有种子的食物储存组织。胚胎是包含在成熟种子中的小植物。“植物细胞”还包括不可再生的植物细胞。再生植物的子代、衍生物、变体和突变体也包括在本发明实施方案的范围内，条件是这些部分包含事件ns-b50027-4核酸分子。本发明实施方案还涉及优良种事件ns-b50027-4转基因在植物细胞培养和组织培养中的用途。实施方案包括来自优良种事件ns-b50027-4品系的植物和植物部分，以及通过本文描述的方法产生的其他植物。
“等位基因”是与一种性状或特征相关的基因的一种或更多种替代形式中的任何一种。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上对应的基因座。
“基因座”赋予一种或更多种性状，例如修饰的脂肪酸新陈代谢、修饰的植酸新陈代谢、修饰的碳水化合物新陈代谢、雄性不育、除草剂耐受性、昆虫抗性、抗病性或修饰的蛋白新陈代谢。性状可以由例如，通过回交引入到品系的基因组中的天然存在的基因、天然或诱导的突变、或通过遗传转化技术引入的转基因赋予。基因座可包含整合在单个染色体位置的一个或更多个等位基因。数量性状基因座(qtl)是指至少在某种程度上控制通常连续分布的可用数字表示的性状的遗传基因座。
“事件”是作为遗传操作的结果，携带包含至少一个拷贝的感兴趣的基因的外源dna人工基因座。事件的典型等位基因状态是存在或不存在外源dna。事件可以通过一种或更多种转基因的表达来通过表型表征。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于限制性图谱(例如通过dna印迹确定)或转基因的上游或下游侧翼序列，或转基因的分子构型。通常用转化dna转化植物细胞或植物部分导致多个事件，每个事件是独特的。
术语“基因”是指通常包含几个可操作地连接的dna区域的dna分子，诸如启动子和5'非翻译区(5'utr或5'非编码序列)，它们一起形成启动子区；编码区(可以编码或可以不编码蛋白)；和包含多腺苷酸化位点的非翻译3'区(3'utr或3'非编码序列)。通常在植物细胞中，5'utr、编码区和3'utr区被转录成rna分子，在编码蛋白的基因的情况中，该rna分子被翻译成蛋白。因此，“编码序列”是指dna分子中提供翻译特定氨基酸序列的密码子的核苷酸序列。基因可以包括另外的dna区，诸如例如内含子。“基因型”是指细胞或生物体的遗传构成。“基因座”通常是给定基因在植物基因组中的位置。
术语“转基因”是指整合到植物的基因组中的感兴趣的基因。因此，“转基因植物”在其所有细胞的基因组中包含至少一个转基因。本发明实施方案的转基因包含至少一个拷贝的感兴趣的基因，更具体地，至少一个拷贝的来源于pavlovasalina的δ4-去饱和酶、来源于海洋微藻pavlovasalina的δ5-去饱和酶、来源于微藻pyramimonascordata的δ5-延长酶、来源于微藻细小微胞藻的δ6-去饱和酶、来源于pyramimonascordata的δ6-延长酶、来源于酵母lachanceakluyveri的δ12-去饱和酶和来源于酵母巴斯德毕赤酵母的δ15/ω3-去饱和酶；以及至少一个另外的拷贝的来源于微藻细小微胞藻的δ6-去饱和酶、来源于pyramimonascordata的δ5-延长酶、来源于海洋微藻pavlovasalina的δ5-去饱和酶、和来源于酵母巴斯德毕赤酵母的δ15/ω3-去饱和酶。转基因在包括适当的调节区的表达盒中以二元方式布置。上文描述的转基因是人工的，因为它们是使用密码子优化策略设计的，并且因此该转基因原本在自然界中不存在。转基因表达盒可包括来自红花烟草的至少一个基质结合区(mar)。转基因盒还可包括可选择标记基因。参见美国专利第8,816,111号。
当关于植物物种提及基因或dna分子时，“外源的”或“异源的”表示基因或dna分子或其部分(例如特定区域)不能天然地在该植物物种中找到，或者不能天然地在该植物物种的基因座中找到。术语“外源dna”还指由于转化而将被整合或已经整合到植物的基因组中的dna分子。在本公开内容的上下文中，转基因、转基因盒或转基因表达盒包含至少一种外源dna或异源dna。
当提及基因或dna分子时，术语“嵌合的”用于表示该基因或dna分子包含至少两个功能上相关的dna区域(诸如启动子、5'utr、编码区、3'utr、内含子)，它们天然地彼此不缔合，并且源自不同的来源，使得至少一个dna区域对于嵌合分子中的另一个dna区域是外源的。
术语“质粒”、“载体”是指通常携带不是细胞的中心代谢(centralmetabolism)的一部分的基因的染色体外元件，并且通常是环状双链dna片段的形式。这样的元件可以是源自任何来源的线型的或环状的单链或双链dna或rna的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体序列或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经连接或重组成独特的构建体，该构建体能够将选择的基因产物的启动子片段和dna序列以及合适的3'非翻译序列引入到细胞中。关于转基因植物，这样的质粒或载体可以含有t-dna区域，以便于将转基因插入植物基因组中。
“表达盒”是指含有转基因并且具有除了外源基因以外的允许该基因在外源宿主中表达的元件的遗传构建体；并且可以指在插入植物的基因组之前和之后的盒。换句话说，转基因插入片段构成表达盒。
“转化dna”是指用于转化的重组dna分子，例如表达载体。转化dna通常包含能够赋予转化植物一种或更多种特定特征的至少一个“感兴趣的基因”(例如，嵌合基因)。
“转化”是指核酸分子到宿主生物体的转移，导致遗传上稳定的遗传。例如，核酸分子可以是自主复制的质粒，或者核酸分子可以整合到宿主生物体的基因组中。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物体。
术语“重组dna分子”用于举例说明，并因此可以包括分离的核酸分子，所述分离的核酸分子可以是dna并且可以通过重组或其他过程诸如合成dna合成或pcr获得。pcr(聚合酶链式反应)是其中使用由“上游”引物和“下游”引物组成的引物和聚合催化剂(诸如dna聚合酶)，并且通常为热稳定的聚合酶，制备靶多核苷酸的复制拷贝的反应。用于pcr的方法是本领域已知的。参见，例如pcr(mcpherson&moller编辑,biossci.publ.ltd.,oxford,2000)。pcr可以在基因组dna或cdna上进行。
“插入dna”是指通过转化方法引入植物材料的异源dna，并且包括与用于本文说明的这样的转化的原始dna不同的dna。插入dna通常是转基因表达盒。“优良种事件ns-b50027-4间插核酸”和“事件ns-b50027-4插入dna”是指特征为由seqidno:1的核苷酸2090至14201的序列或其互补序列组成的核酸分子；和特征为包含seqidno:2的核苷酸位置987至1894、或seqidno:3的1至910的序列或其互补序列的核酸分子。
“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(例如5'utr)、内部或下游(3'utr)的核苷酸序列；所述核苷酸序列影响转录、rna加工或稳定性、或相关编码序列的翻译。调控序列可包括启动子、增强子元件、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、rna加工位点、效应物结合位点和茎环结构。
“启动子”是指能够控制编码序列或功能性rna的表达的dna序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以整体源自天然基因，或包括源自自然界中发现的不同启动子的不同元件，或甚至包括合成的dna区段。本领域技术人员理解，不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中表达，或在发育的不同阶段、或响应不同的环境条件或生理条件表达。引起基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。还认识到，由于在大多数情况中调控序列的确切边界尚未完全确定，不同长度的dna片段可以具有相同的启动子活性。
术语“3'非编码序列”和“转录终止子”是指位于编码序列下游的dna序列。这包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mrna加工或基因表达的调控信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常通过影响聚腺苷酸串(polyadenylicacidtracts)添加至mrna前体的3'末端表征。3'区可以影响转录、rna加工或稳定性、或相关编码序列的翻译。
术语“可操作地连接”指核酸序列在单个核酸片段上的缔合，使得一个核酸序列的功能被另一个核酸序列影响。例如，当启动子能够调节编码序列的表达时，该启动子与该编码序列可操作地连接(即，该编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以以有义方向或反义方向可操作地连接至调控序列。
如本文中使用的，术语“表达”是指源自本发明核酸的有义(mrna)的转录和稳定积累。表达还可以指mrna翻译成多肽。
除非另外陈述或从上下文中清楚的，否则提及细胞包括植物细胞，无论是分离的、在组织培养物中、还是整合到植物或植物部分中。
“子代”是指所有后代，包括植物的后裔(offspring)或衍生物或植物，并且包括第一代、第二代、第三代和后续各代；并且可以通过自花授粉或与具有相同或不同基因型的植物杂交产生，并且可以通过一系列合适的基因工程技术修饰。栽培种(cultigen)通常涉及已经被人类有意改变和选择的植物。“t0”是指第一代转化植物材料，“t1”是指在t0植物上产生的种子，t1种子产生产生t2种子的植物，以及后续的tx代。
“育种”包括使植物发育或繁殖的所有方法，并且包括种内杂交和种间杂交、和品系内杂交和品系间杂交以及所有合适的常规育种和人工育种技术。所需的性状(例如ns-b50027-4dha性状)可以转移到其他油菜或欧洲油菜品系、栽培种(cultivar)或栽培种(cultigen)；或者通过常规的育种方法并且也可以通过种间杂交转移到其他芸薹属物种诸如芥菜和芸薹。常规育种方法和种间杂交方法以及在植物之间转移遗传物质的其他方法在本领域中是周知的。
“回交”是其中育种者反复将杂交子代杂交回亲本品系的方法，例如，将第一代杂交体f1与f1杂交体的一个亲本基因型杂交。
“脂肪酸组成”或“脂肪酸含量”通常是指存在于成熟、完整、部分干燥的种子的内源形成的油中的各种脂肪酸的重量百分比。常见的行业惯例是将脂肪酸组成报告为面积百分比(面积归一化)，而不是绝对量。面积百分比易于计算，并且容易与行业中以同样方式报告的许多其他人的结果进行比较。面积百分比与绝对重量百分比不同，但近似。绝对结果可以使用已知浓度的单独的参考标准品和内标来基于mg/kg计算。但也可以使用校正因子来计算脂肪酸的质量而不使用单独的脂肪酸标准品，然而仍可能需要内标。通常，脂肪酸含量通过压碎种子并提取脂肪作为脂肪酸甲酯(fame)来确定，脂肪酸甲酯(fame)可以通过生成面积百分比或可以从中得到面积百分比的数据的各种技术来分析脂肪酸含量。分析方法的实例包括气相色谱法(gc)、gc-质谱法(gc-ms)、液相色谱-质谱法(lc-ms)、核磁共振法(nmr)或近红外反射光谱法。总脂质可以通过本领域已知的技术分离以纯化级分，例如诸如tag级分。用于表征脂肪酸组成的其他方法是本领域技术人员已知的。参见例如，tinoco等人,3anal.biochem.514(1962)；canola:chemistry,production,processing&utilization(daun等人编辑,aocspress,urbana,il,2011)(daun等人,2011)；us2015/0166928；us20160002566。
类似地，“油含量”是存在于成熟、完整、部分干燥的种子(通常含有约6％或7％的水分)中的油的典型重量百分比。油的百分比被计算为油的重量除以0％水分的种子重量。油含量可以是不同品种的特征。它可以使用各种分析技术确定，诸如nmr(mqc，oxfordinstruments)、nir和soxhlet提取。例如，油菜油含量可以通过核磁共振技术(rossell&pritchar,analysisofoilseeds,fats&fattyfoods48-53(elseviersci.pub.ltd,london,1991)、通过脉冲波nms100minispec(balkerptyltdscientificinstruments,germany)测量，同时测量水分含量。种子油含量也可以通过近红外反射(nir)光谱法测量。li等人67phytochem.904(2006)。
短语“提取的植物脂质”、“分离的植物脂质”、“提取的脂质”等是指包含从例如压碎的植物或植物部分(诸如种子)提取的脂质的组合物。提取的脂质可以是通过例如压碎植物材料(诸如种子)而获得的相对粗制的组合物；或更纯化的组合物，其中来源于植物材料的大部分(如果不是全部的话)水、核酸、蛋白或碳水化合物已从油中去除。纯化的方法的实例是本领域已知的。在一些实施方案中，提取的或分离的植物脂质包含按组合物重量计至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％(w/w)的脂质。提取的脂质在室温可以是固体或液体，后者被认为是“油”。在一些实施方案中，提取的脂质未与另一种来源产生的另一种脂质诸如dha(例如，来自鱼油的dha)混合。在一些实施方案中，与完整种子或细胞中的比率相比，在提取后，油酸与dha、棕榈酸与dha、亚油酸与dha或总ω6脂肪酸与总ω3脂肪酸的比率没有显著改变(例如，不大于10％或5％改变)。换句话说，提取的脂质没有富集特定的脂肪酸，例如dha。在其他实施方案中，提取的植物脂质尚未暴露于诸如氢化或分馏程序，当与完整种子或细胞中的比率相比，氢化或分馏改变油酸与dha、棕榈酸与dha、亚油酸与dha或总ω6脂肪酸与总ω3脂肪酸的比率。也就是说，提取的脂质没有富集特定的脂肪酸，例如dha。当本发明的实施方案的提取的植物脂质是油时，油还包含非脂肪酸分子诸如甾醇。
如上所述，短语“提取的植物油”和“分离的植物油”是指包含在室温是液体的提取的植物脂质或分离的植物脂质的组合物。油从植物或其部分诸如种子获得。提取或分离的油可以是通过例如压碎植物种子获得的相对粗制的组合物；或更纯化的组合物，其中来源于植物材料的大部分(如果不是全部的话)水、核酸、蛋白或碳水化合物已从油中去除。组合物可以包含可以为脂质或非脂质的其他组分，例如非脂肪酸分子诸如甾醇。在实施方案中，油组合物包含至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％(w/w)的提取的植物脂质。在实施方案中，本发明提取的油未与另一种来源产生的的另一种油或脂肪酸诸如dha(例如来自鱼油的dha)混合。在一个实施方案中，与完整种子或细胞中的比率相比，在提取后，脂肪酸的比率没有显著改变(例如不大于10％或5％改变)；提取的植物油也尚未暴露于诸如氢化或分馏程序，与完整种子或细胞中的比率相比，氢化或分馏显著改变提取物中脂肪酸的比率。也就是说，提取的油没有富集特定的脂肪酸，例如dha。
如本文中使用的，“油”是主要包含脂质并且在室温为液体的组合物。例如，本发明的油优选包含以重量计至少75％、至少80％、至少85％或至少90％脂质。通常，纯化的植物油包含以油中的脂质的重量计至少90％三酰甘油酯(tag)。油的微量组分诸如二酰甘油酯(dag)、游离脂肪酸(ffa)、磷脂或甾醇可以存在于油中。
如本文中使用的，术语“脂肪酸”是指通常具有饱和或不饱和的长脂族尾部的羧酸。通常，脂肪酸具有长度为至少8个碳原子、例如长度为至少12个碳、16个碳、18个碳、20个碳或22个碳的碳-碳键合链。大多数天然存在的脂肪酸具有偶数个碳原子，因为它们的生物合成涉及具有两个碳原子的乙酸酯。脂肪酸可以处于游离状态(非酯化)；处于酯化形式诸如甘油三酯(tag)、二酰甘油酯(dag)、单酰甘油酯的一部分；或者是酰基-coa(硫代酯)结合或另一种结合形式。脂肪酸可以酯化为磷脂，诸如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇或二磷脂酰甘油。
“饱和脂肪酸”沿链不含有碳-碳双键(烯烃)或其他官能团。“饱和的”是指在所有可能的碳处(除了羧酸[-cooh]基团)存在氢。换句话说，在饱和脂肪酸中，脂肪酸的omega(ω末)端(也称为n末端)含有三个氢(-ch3)，并且链内的每个碳含有两个氢(-ch2-)。
“不饱和脂肪酸”与饱和脂肪酸共享相似的骨架，除了它们在碳链中包含至少一个烯烃基团(-ch＝ch-)。两个侧接碳原子(与烯烃基团的任一侧结合)可以以顺式或反式构型存在。“单不饱和脂肪酸”是指在碳链中具有至少12个碳原子但仅具有一个烯烃基团的脂肪酸。“多不饱和脂肪酸”或“pufa”是指在碳链中具有至少12个碳原子和至少两个烯烃基团的脂肪酸。“长链多不饱和脂肪酸”和“lc-pufa”是指在碳链中具有至少20个碳原子并且具有至少两个烯烃基团的脂肪酸。“超长链多不饱和脂肪酸”和“vlc-pufa”是指在碳链中具有至少二十二个碳原子和至少三个烯烃基团的脂肪酸。提及lc-pufa包括vlc-pufa。通常，脂肪酸的碳链中的碳原子数是指未支化的碳链。如果碳链是支链的，则碳原子数不包括侧基中的那些碳原子数。
在一个实施方案中，lc-pufa是ω3脂肪酸：它在脂肪酸的从甲基末端计的第三个碳-碳键处具有去饱和(烯烃基团)。在另一个实施方案中，lc-pufa是ω6脂肪酸：它在脂肪酸从甲基末端计的第六个碳-碳键中具有去饱和(烯烃基团)。烯烃(双键)在脂肪酸链中的位置也使用δ(或δ)注释，其中烯烃的位置参照脂肪酸的羧基末端编号。例如，亚油酸也可以称为“顺式-δ9,顺式-δ12十八碳二烯酸”或δ9,12十八碳二烯酸。“脂肪酸也可以参考“c:d”脂质数来鉴定，其中c是碳的数目且d是碳主链中双键的数目。例如，花生四烯酸可以标注为20:4δ5,8,11,14，意指具有位于脂肪酸的羧基末端的碳5、8、11和14上的四个烯烃基团的二十碳链。该名称还表明花生四烯酸是ω6脂肪酸，因为如果存在二十个碳并且在从羧基末端的c14处存在一个烯烃，则来自甲基末端的第一个烯烃必须在c6处。
在另一实施方案中，lc-pufa选自由以下组成的组：花生四烯酸(ara，20:4δ5,8,11,14；ω6)、二十碳四烯酸(eta，20:4δ8,11,14,17；ω3)、二十碳五烯酸(epa，20:5δ5,8,11,14,17；ω3)、二十二碳五烯酸(dpa，22:5δ7,10,13,16,19；ω3)、或二十二碳六烯酸(dha，22:6δ4,7,10,13,16,19，ω3)。lc-pufa也可以是双高-γ高亚油酸(dgla)或二十碳三烯酸(etra，20:3δ11,14,17；ω3)。根据本发明实施方案制备的lc-pufa可以是上述任何或全部的混合物，并且可以包括其他lc-pufa或这些lc-pufa中的任一种的衍生物。然而，在优良种事件油菜中产生的lc-pufa通常比来源于鱼油的lc-pufa更纯。在至少一个实施方案中，ω3脂肪酸是dha；dpa和dha；或epa、dpa、和dha中的至少一种。
此外，如上所述，lc-pufa和vlc-pufa可以是游离脂肪酸(非酯化的)、酯化的或另一种结合形式。因此，本发明实施方案的lc-pufa可以在细胞的脂质、提取的脂质或纯化油中以混合物的形式存在。在至少一个实施方案中，所述油包含至少75％或至少85％三酰甘油酯，其余部分以其他形式的脂质存在，诸如所提及的那些，其中三酰甘油酯包含至少一种lc-pufa。随后油可以被进一步纯化或处理，例如通过用强碱水解以释放游离脂肪酸，或通过蒸馏或类似方式。
因此，“总ω3脂肪酸”、“总ω3脂肪酸含量”等是指提取的脂质、油、重组细胞、植物部分或种子(根据上下文确定)中酯化的和非酯化的所有ω3脂肪酸的总和，通常表示为总脂肪酸含量的百分比。这些ω3脂肪酸包括ala、sda、etra、eta、epa、dpa或dha，并且不包括任何ω6脂肪酸或单不饱和脂肪酸。“新ω3脂肪酸”、“新ω3脂肪酸含量”等是指提取的脂质、油、重组细胞、植物部分或种子(根据上下文确定)中除了ala的酯化和非酯化的所有ω3脂肪酸的总和，表示为总脂肪酸含量的百分比。这些新ω3脂肪酸是通过优良种事件转基因构建体的表达在本发明实施方案的细胞、植物、植物部分和种子中产生的脂肪酸，并且如果存在则包括sda、etra、eta、epa、dpa或dha，但不包括ala、任何ω6脂肪酸或单不饱和脂肪酸。示例性的总ω3脂肪酸含量和新ω3脂肪酸含量可以通过将样品中的脂肪酸转化为fame并使用本领域已知的方法通过gc分析来确定。参见例如，americanoilseedchemists’society(aocs)方法celd-91。
类似地，“总ω6脂肪酸”、“总ω6脂肪酸含量”等是指提取的脂质、油、重组细胞、植物部分或种子(根据上下文确定)中酯化和非酯化的所有ω6脂肪酸的总和，表示为总脂肪酸含量的百分比。“总ω6脂肪酸”，如果存在的话，可以包括la、gla、dgla、ara、eda或ω6-dpa，并且不包括任何ω3脂肪酸或单不饱和脂肪酸。“新ω6脂肪酸”、“新ω6脂肪酸含量”等是指在提取的脂质、油、重组细胞、植物部分或种子(根据上下文确定)中的除了la以外的所有酯化和非酯化的ω6脂肪酸的总和，表示为总脂肪酸含量的百分比。这些新ω6脂肪酸是通过优良种事件转基因的表达在如本文描述的细胞、植物、植物部分或种子中产生的脂肪酸，并且可以包括gla、dgla、ara、eda或ω6-dpa，但不包括la、ω3脂肪酸或单不饱和脂肪酸。
“半种子分析”是对两片子叶中的一片(半粒种子)进行的脂肪酸分析的过程，并且携带第二子叶的剩余幼苗形成植物。
“蛋白含量”是通过本领域已知的方法确定的成熟的、完全干燥的种子的无油粗粉中蛋白的典型重量百分比。参见例如，daun等人,2011；aocsofficialmeth.ba4e-93combustionmeth.determinationcrudeprotein。
商业种植者为生长或繁殖物种以外的目的而生产的成熟种子有时被称为“籽粒”。
遗传事件
转基因在油菜中的表型表达由转基因盒本身的结构及其在植物基因组中的插入位置二者决定：转基因在植物基因组中特定位置的存在可能影响转基因的表达和植物的整体表型。通过遗传操作将商业上感兴趣的性状农业上或工业上成功地引入植物中可能是依赖不同因素的漫长过程。遗传转化植物的实际转化和再生只是包括广泛的遗传表征、育种和田间试验评估，最终导致选择优良种事件的一系列选择步骤中的第一步。
本发明实施方案的方面涉及植物基因组中惊人的拷贝数的可表达转基因。“可表达”是指dna分子的一级结构，即转基因的编码序列，表明该基因编码活性蛋白。然而，可表达的编码序列可能无法表达，因为“基因沉默”在体内通过同源转基因失活的各种机制发生。同源转基因失活已经在植物中被描述，其中转基因以有义方向插入，意外的结果是基因和转基因二者都被下调。napoli等人,2plantcell279(1990)。同源基因序列的失活的可能机制包括通过甲基化的转录失活，其中复制的dna区发出用于基因沉默以及转录后沉默的内源机制的信号，其中来自内源基因和转基因二者的mrna的组合水平触发阈值诱导的两种信号的降解。vanbokland等人,6plantj.861(1994)。然而，令人惊讶的是，尽管在ns-b50027-4中存在至少三个拷贝的几种转基因，其中一些以相同的方向放置，但ns-b50027-4显示出协同dha表达。
优良种事件可以通过重组dna分子在植物基因组中掺入的位点的位置和构型来表征。植物基因组中被插入重组dna盒的位点也称为“插入位点”或“靶位点”。“侧翼区”或“侧翼序列”是位于紧邻转基因盒的上游并与转基因盒连续的或紧邻转基因盒的下游并与转基因盒连续的植物基因组的dna区域，例如，至少20个碱基对、至少50个碱基对、或至多5,000个碱基对。导致外源dna随机整合的转化产生具有不同侧翼区的转化子，该不同侧翼区对于每个转化子是特征性的和独特的(优良种事件)。
通常，当转基因通过传统杂交引入植物时，它在植物基因组中的插入位点及其侧翼区不改变。“插入区”是指对应于至少40个碱基对，诸如至少100个碱基对，或多达超过10,000个碱基对的区域，其被(未转化的)植物基因组的转基因的上游和下游侧翼区包围，并包括插入位点(和可能的靶位点缺失)。考虑到由于物种内的突变引起的微小差异，插入区域可以与该物种的给定植物中的外源dna的上游和下游侧翼区保持至少85％、诸如90％、95％或100％的序列同一性。然而，将转基因盒插入植物基因组中有时可伴随植物dna的缺失(称为“靶位点缺失”)。
感兴趣的基因的表达是指这样的事实：转基因赋予植物一种或更多种表型性状(例如，产生lc-ω3脂肪酸)，所述表型性状意图由转化dna的导入赋予(基于一些或全部感兴趣的基因的结构和功能)。在本发明实施方案中，若干转基因提供了在转化的植物中产生lc-ω3脂肪酸的生物合成途径。
如本文中使用的，“优良种事件”是选自一组事件的事件，通过用相同的转化dna转化获得或通过与这样的转化获得的植物回交，基于转基因构建体的表达和稳定性、转基因构建体与包含它的植物的最佳农艺特征的相容性、以及所期望的表型性状的实现来获得。因此，优良种事件选择的标准是以下中的至少之一个，并且最好是全部：
(a)转基因的存在不会过度损害植物的其他期望特性，诸如与农艺性能或商业价值有关的那些特性；
(b)事件以明确定义的分子构型为特征，该分子构型是稳定遗传的并且可以针对其开发身份控制的适当诊断工具；
(c)转基因盒中的感兴趣的基因示出了在事件的杂合条件(或半合子条件)和纯合条件下、在其中携带该事件的植物可能暴露于于正常的农艺使用的一系列环境条件中的商业上可接受的水平上正确的、适当的和稳定的空间和时间表型表达。外源dna还可以与允许基因渗入到进一步期望的商业遗传背景的植物基因组中的位置相关。
作为优良种事件的事件的状态可以通过优良种事件在不同的相关遗传背景中基因渗入来确认，并且以至少一个标准，例如上述(a)、(b)和(c)观察依从性(compliance)。另外，优良种事件的选择也可以根据相容性来确定，更具体地说，由携带优良种事件ns-b50027-4的植物与携带至少一个其他事件的植物之间的杂交产生的子代，使得子代携带2个事件。因此，“优良种事件”是指包含符合上述标准的转基因盒的基因座。植物、种子、植物材料或子代可在其基因组中包含一个或更多个优良种事件。
优良种事件ns-b50027-4在油菜的开发中被选为优良种事件，其产生lc-pufa、特别是lc-ω3脂肪酸、更特别是dha。在植物基因组中掺入重组dna分子通常是由细胞或组织的转化(或另一种遗传操作)引起的。掺入的特定位点可以是随机的(amatterofchance)或预定的(如果使用靶向整合方法)。如本文描述的，油菜品系ns-b50027-4是稳定且均一的育种品系。它是在注意植物类型的均一性的情况下培育的。该品系随着对均一性的持续观察而增加。在对品系ns-b50027-4提交专利时，油菜品系ns-b50027-4不是任何其他商业化油菜栽培种的亲本。
新的分子生物学技术的出现已经允许分离和表征具有特定功能诸如编码特定的蛋白质产物的遗传元件。植物生物学领域的科学家对工程化植物基因组以包含和表达外源遗传元件、或另外的版本的或修饰版本的天然或内源遗传元件，从而以特定方式改变植物的性状产生了浓厚的兴趣。使用转化插入物种基因组中的任何dna分子，无论是来自不同物种还是来自相同物种，在本文中统称为“转基因”。“转化”的过程是将dna插入基因组中。已经开发了用于生产转基因植物的几种方法，并且在特定实施方案中，本发明还涉及所要求保护的油菜品系ns-b50027-4的转化版本。
已开发了用于植物转化的许多方法，包括生物和物理的植物转化方案。此外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达载体和体外培养方法是可获得的。参见例如miki等人,proceduresforintroducingforeigndnaintoplants,meth.plantmolec.biol.&biotechnol.中，63页(glick&thompson编辑,crcpress,bocaraton,1993)；gruber等人,vectorsforplanttransformation,同上，r89页；genetictransformationfortheimprovementofcanola,proc.worldconf.biotechnol.fats&oilsindus.43-46页(am.oil.chem.soc.,champaign,il,1988)。
最普遍的植物转化的类型涉及表达载体的构建。这样的载体包含含有在调控区(例如启动子)的控制下的编码区或者与调控区(例如启动子)可操作地连接的编码区的dna分子。载体可含有一种或更多种基因和一种或更多种调控元件。至少一个编码区和它们各自的调控元件可以在载体内以相反的方向布置，提供二元载体。理论上，将对基因沉默敏感的基因以二元方式布置可以使基因沉默最小化。
例如，初始转化盒，pjp3416_ga7-modb包括能够促进油菜种子中ω-3脂肪酸积累的7个基因，以及一个可选择标记基因，以便于在体外选择推定的转基因植物。参见wo2013/185184；美国专利公布第2015/0374654号；美国专利第8,816,111号和第8,946,460号；petrie等人,6plantmeth.8(2010)。
表达的基因都是合成的——经密码子优化并合成的——因此在任何自然生物体中都未发现转基因dna分子。描述了用作密码子优化的模板的原始序列。参见petrie等人,12metab.eng’g233(2010a)；petrie等人,11plantmethods6(2010b)；petrie等人,21transgenicres.139(2012)。
如本领域周知的，功能基因启动子是对基因转录重要的dna区域，但不编码功能性产物诸如肽。例如，用于组成型表达的共同启动子来源于花椰菜花叶病毒(cauliflowermosaicvirus)。kay等人,236science1299(1987)；coutu等人,16transgenicres.771(2007)。包括多腺苷酸化信号的终止子区对于产生完整且稳定的mrna分子是必需的。例如，根癌农杆菌(a.tumefaciens)胭脂碱合酶(nos)终止子提供了有用的终止子。bevan,12nucl.acidres.8711(1984)；rogers等人,在biotechnol.plantsci.中219页(acad.press,inc.,newyork,ny,1985)；sanders等人,15nucl.acidsres.1543(1987)。组合使用一系列调控序列以驱动和终止各种表达盒的转录。先前已经描述了ga7-modb中使用的种子特异性启动子：拟南芥(a.thaliana)fae1(rossack等人,46plantmolec.biol.717(2001))；亚麻(l.usitatissimum)cnl1和cnl2(chaudhary等人,wo2001/016340)；和截短的欧洲油菜油菜籽蛋白启动子(stalberg等人,23plantmolec.biol.671(1993))。还参见美国专利第8,816,111号。
用于将lc-pufa途径引入油菜中的包含开放阅读框5'和3'调控区和转基因表达盒的其他非编码区的转基因的更详细的描述在表1中示出。
因此，为了确定生物样品是否包含如存在于ns-b50027-4中的lc-pufa途径的至少一部分，可以使用引物和探针来检测转基因。对于检测转基因有用的特定引物在表2中示出，其中每种引物具有62的退火温度，并且大小(bp)是指pcr产物中碱基对的数目。
从欧洲油菜(变种avjade)种系培养的初始转化体在脂肪酸产生水平，特别是在epa和dha水平上表现出很大变化。对于第二代和第三代，选择主要基于转基因种子的dha和epa含量。在一些情况中，特别是t2代或t3代，分离模式(通过将来自一株植物的二十至四十个单独的种子生长成二十至四十个后代，并然后测量那些后代的单独的种子的dha和epa含量来确定)也显示出分散的结果，表示发生了复合的或多拷贝的插入。因此丢弃了许多初始t2或t3代植物。最初，得出转基因插入片段的多个拷贝将产生不稳定的转化体，并且还表现出在纯合基因型中所看到的经典基因沉默的结论。因此，如果转化植物的pcr分析表明拷贝数>1，则经常丢弃那些转化体。
出人意料的是，发现优良种事件ns-b50027-4含有多拷贝事件：16个基因插入，包括以二元(倒置)左边界到左边界方式布置(类似于大型回文结构)的两个八基因-t-dna边界的盒；和单独的、较小的四基因盒；并且转基因插入片段的这种组合在近交品系ns-b50027-4的dha产生中协同地作用。更具体地，杂交、回交和自交的组合将16个基因的插入片段分离到染色体a05(也称为n05)，且将四基因插入片段分离到染色体a02(也称为n02)。通过培育每个分离子(segregant)以获得每个事件的纯的纯合品系来确定每个转基因染色体的贡献。例如，在一个实验中，包含16个基因插入片段的分离子产生约4％dha；并且包含四基因插入片段的分离子不产生dha；但是当分离子被培育以组合转基因染色体a02基因座和转基因染色体a05基因座时，两种转基因插入片段的组合提供在其种子中产生至少约7％dha至至少约14％dha(包括端点)的植物。这个结果出人意料。如所述的，尽管优良种事件ns-b50027-4具有不寻常的基因组成，但品系已证明在脂肪酸生产方面稳定且一致。
关于位于a02上的较小的四基因插入片段，该插入片段取代了未知功能的基因(hpp基因)的3'utr区的约15bp。部分插入片段及其侧翼欧洲油菜序列在本文中被充分表征。四基因插入片段包括δ6-去饱和酶、δ5-延长酶、δ5-去饱和酶和δ15/ω3-去饱和酶转基因；但不包括δ4-去饱和酶、δ12-去饱和酶、δ6-延长酶基因，也不包括遗传选择标记pat。因为在植物种子细胞中产生dha需要δ4-去饱和酶，所以出乎意料并且令人惊讶的是，四基因插入片段协同地贡献于转基因品系ns-b50027-4中dha的产生。a02上的四基因插入片段及其侧翼欧洲油菜区域在图5中示出(seqidno:40)。特别地，seqidno:40的核苷酸1至2089是小插入片段的插入位点的5'(上游)侧翼区；seqidno:40的核苷酸2090至14201提供了来自转基因盒的异源核酸；seqidno:40的核苷酸14202至15006是插入位点的808bp3'(下游)区。seqidno:40的核苷酸1至2089和14202至15006对于欧洲油菜染色体a02是天然的。比较天然欧洲油菜序列和插入位点的遗传分析显示出以下插入缺失：转基因插入片段取代了原本位于欧洲油菜栽培种darmor参考(2n＝aacc)的chrun_random的118589927-118589941位以及芸薹栽培种chiifu(2n＝aa)的参考基因组的染色体a02的18569316-18569330位的15-bp片段(gtagcacgacaagtt；seqidno:38)。参见chalhoub等人,345sci.950(2014)；ncbiref.seq.nc_024796.1；wang等人,43nat.genet.1035(2011)；ncbiref.seq.xm_009130638。
已证实16个基因的插入片段位于编码pto-相互作用蛋白(pti)的芸薹属基因中，pto-相互作用蛋白(pti)是原本参与超敏应答介导的信号传导的丝氨酸-苏氨酸激酶。pti基因位于参考基因组欧洲油菜(栽培种darmor)的染色体a05的17267746-17270700位。这个较大的插入片段伴有插入缺失，其取代了pti蛋白的第二个外显子中的dna的20-bp链段(stretch)(cacggtggaggtcaccatgt；seqidno:39)；并且从而破坏了pti的表达。该20-bp缺失位于参考基因组的染色体a05的17269790-17269809。a05上的16个基因插入片段及其侧翼欧洲油菜区的dna序列在图6中示出(seqidno:41)。特别地，seqidno:41的核苷酸1至1159是大插入片段的插入位点的5'(上游)侧翼区；seqidno:41的核苷酸47774至49789是插入位点的3'(下游)侧翼区。seqidno:41的核苷酸1至1159和seqidno:41的47774至49789对于欧洲油菜染色体a05是天然的。
因此，另一个实施方案提供了包含人工二元基因座的dna分子，所述基因座按顺序包含以下核苷酸序列(箭头指示关于参考的5'至3'dna序列的转录方向)：
(a)seqidno:40的从核苷酸2747至核苷酸6250的核苷酸序列(micpu-d6d←包括pro、前导序列、ter)；
(b)seqidno:40的从核苷酸6257至核苷酸8414的核苷酸序列(→pyrco-d5e，包括pro、前导序列、ter)；
(c)seqidno:40的从核苷酸8415至核苷酸10374的核苷酸序列(→pavsa-d5d，包括pro、前导序列、ter)；
(d)seqidno:40的从核苷酸10375至核苷酸11544的核苷酸序列(→mar)；和
(e)seqidno:40的从核苷酸11545至核苷酸14049的核苷酸序列(picpa-w3/d15d←，包括pro、前导序列、ter)；
(f)与核苷酸序列(a)至(e)具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子；或
(g)其互补序列。
相关实施方案提供了包含该人工二元基因座的植物细胞、植物材料或植物种子。
另一个实施方案提供了包含人工二元基因座的dna分子，所述基因座分子依次包括以下核苷酸序列：
(a)seqidno:41的从核苷酸1268至核苷酸5317的核苷酸序列(cn12pro通过前导序列通过micpu-d6d的编码区←通过ter)；
(b)seqidno:41的从核苷酸5324至核苷酸7481的核苷酸序列(pro通过→pyrco-d5e通过ter)；
(c)seqidno:41的从核苷酸7482至核苷酸9443的核苷酸序列(pro通过前导序列和→pavsa-d5d通过ter)；
(d)seqidno:41的从核苷酸9444至核苷酸10611的核苷酸序列(→mar)；
(e)seqidno:41的从核苷酸10612至核苷酸13116的核苷酸序列(pro通过前导序列和picpa-w3/d15d←通过ter)；
(f)seqidno:41的从核苷酸13117至核苷酸17000的核苷酸序列(pro通过→pavsad4d通过ter)；
(g)seqidno:41的从核苷酸17001至核苷酸19606的核苷酸序列(pro通过→lack-d12d通过ter)；
(h)seqidno:41的从核苷酸19607至核苷酸29773的核苷酸序列(→mar)；
(i)seqidno:41的从核苷酸20783至核苷酸22987的核苷酸序列，(pro通过→pyrco-d6e通过ter)；
(j)seqidno:41的从核苷酸23011至24370的核苷酸序列(pro通过→pat通过ter)；
(k)seqidno:41的从核苷酸42561至核苷酸25920的核苷酸序列(pro通过pat←通过ter)；
(1)seqidno:41的从核苷酸25943至核苷酸29324的核苷酸序列(pro通过pyrco-d6e←通过ter)；
(m)seqidno:41的从核苷酸28157至核苷酸29324的核苷酸序列(mar←)；
(n)seqidno:41的从核苷酸29324至核苷酸31830的核苷酸序列(pro通过lack-d12d←通过ter)；
(p)seqidno:41的从核苷酸31831至核苷酸35816的核苷酸序列(pro通过pavsad4d←通过ter)；
(q)seqidno:41的从核苷酸35817至核苷酸38319的核苷酸序列(pro通过前导序列和→picpa-w3/d15d通过ter)；
(r)seqidno:41的从核苷酸38320至核苷酸39488的核苷酸序列(mar←)；
(s)seqidno:41的从核苷酸39489至核苷酸41449的核苷酸序列(pro通过pavsa-d5d←通过ter)；
(t)seqidno:41的从核苷酸41450至核苷酸43607的核苷酸序列(pro通过pyrco-d5e←通过ter)；
(u)seqidno:41的从核苷酸43614至核苷酸47662的核苷酸序列(pro→micpu-d6d通过ter)；
(v)与核苷酸序列(a)至(u)、(a)至(j)、(k)到(u)具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子；或
(w)其互补序列。
相关实施方案提供了包含该人工二元基因座的植物细胞、材料或种子。
另一个实施方案提供了包含人工二元基因座的dna分子，所述基因座依次包括以下核苷酸序列：
(a)seqidno:40的从核苷酸2747至核苷酸4141的核苷酸序列(micpu-d6d←)；
(b)seqidno:40的从核苷酸7259至核苷酸8065的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列(→pyrco-d5e)；
(c)seqidno:40的从核苷酸8841至核苷酸10121的核苷酸序列(→pavsa-d5d)；
(d)seqidno:40的从核苷酸12281至核苷酸13531的核苷酸序列(picpa-w3/d15d←)；
(e)与核苷酸序列(a)至(d)具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子；或
(f)其互补序列；
其中人工基因座包括调控区(例如启动子、前导序列、终止子)，以提供(a)至(d)或(e)或(f)的表达。相关实施方案提供了包含该人工二元基因座的植物细胞、植物材料或植物种子。
另一个实施方案提供了包含人工二元基因座的dna分子，所述基因座依次包括以下核苷酸序列：
(a)seqidno:41的从核苷酸1820至核苷酸3208的核苷酸序列(micpu-d6d←)；
(b)seqidno:41的从核苷酸6326至核苷酸7126的核苷酸序列(→pyrco-d5e)；
(c)seqidno:41的从核苷酸7908至核苷酸9192的核苷酸序列(→pavsa-d5d)；
(d)seqidno:41的从核苷酸11352至核苷酸12596的核苷酸序列(picpa-w3/d15d←)；
(e)seqidno:41的从核苷酸15216至核苷酸16556的核苷酸序列(→pavsad4d)；
(f)seqidno:41的从核苷酸17619至核苷酸18866的核苷酸序列(→lack-d12d)；
(g)seqidno:41的从核苷酸21895至核苷酸22647的核苷酸序列(→pyrco-d6e)；
(h)seqidno:41的从核苷酸25943至核苷酸26283的核苷酸序列(pyrco-d6e←)；
(i)seqidno:41的从核苷酸30066至核苷酸31313的核苷酸序列(lack-d12d←)；
(j)seqidno:41的从核苷酸31831至核苷酸35816的核苷酸序列(pavsa-d4d←)；
(k)seqidno:41的从核苷酸36335至核苷酸38319的核苷酸序列(→picpa-w3/d15d)；
(l)seqidno:41的从核苷酸39749至核苷酸41023的核苷酸序列(pavsa-d5d←)；
(m)seqidno:41的从核苷酸41805至核苷酸42605的核苷酸序列(pyrco-d5e←)；
(n)seqidno:41的从核苷酸45724至核苷酸47111的核苷酸序列(→micpu-d6d)；
(o)与核苷酸序列(a)至(u)、(a)至(j)、(k)至(u)具有至少80％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的分子，或
(p)其互补序列；
其中人工基因座包括调控区(例如启动子、前导序列、终止子)，以提供(a)至(n)或(o)或(p)的表达。相关实施方案提供了包含该人工二元基因座的植物细胞、植物材料或植物种子。
使用诸如本文描述的转化技术被工程化到特定的油菜植物中的遗传性状可以使用植物育种领域中周知的传统育种技术移入另一种油菜或芸薹属品系中。例如，具有优良种事件ns-b50027-4的植物可以例如从保藏在atcc的种子获得。这样的植物可以进一步繁殖和/或按照常规育种方案使用，以将优良种事件ns-b50027-4引入到相同植物物种的其他栽培种中。保藏的种子属于物种欧洲油菜。然而，将位于a基因组或c基因组上的等位基因或转基因从欧洲油菜引入到芥菜的方法是本领域周知的并且包括重复的回交。回交方法可用于将转基因从转化的油菜植物转移到优良种近交品系，并且得到的子代包括转基因。此外，如果将近交品系用于转化，那么转基因植物可以与不同的品系杂交以产生转基因杂交体油菜植物。如本文使用的，“杂交”可以指简单的x与y杂交，或指回交的过程，根据上下文而定。使用转化可以进一步将各种遗传元件引入植物基因组中。这些元件包括但不限于基因；编码序列；可诱导的启动子、组成型的启动子和组织特异性启动子；增强序列；以及信号序列和靶向序列。
近交油菜品系ns-b50027-4
如本文描述的，油菜品系ns-b50027-4是一种稳定且均一的育种品系。它是在非常注重植物类型的均一性的情况下培育出来的，并且品系已经随着对一致性的观察而增加。ns-b50027-4特别通过其种子生产lc-pufa，特别是lc-ω3脂肪酸，更特别是dha来区分。在对品系ns-b50027-4提交专利时，油菜品系ns-b50027-4不是任何其他商业化油菜栽培种的亲本。
近交转基因油菜品系ns-b50027-4具有以下形态和生理特征(主要基于2015年在澳大利亚八个不同地点收集的数据和平均值)：
另一个方面提供了生产ns-b50027-4来源的欧洲油菜植物或其部分诸如种子的方法，包括和上述欧洲油菜植物或其部分杂交，包括获得上述芸薹属植物和在芸薹属植物生长条件下使该植物生长。另一个方面提供了使欧洲油菜品系ns-b50027-4(所述品系的代表性种子已经以atcc登陆号pta-123186保藏)、ns-b50027-4的亚系、ns-b50027-4或亚系的子代、或通过将ns-b50027-4与第二种油菜或芸薹属植物杂交而产生的植物生长的方法，所述方法包括：获得上述芸薹属种子并使该植物在芸薹属植物生长条件下生长。另一个方面提供了生产ns-b50027-4来源的欧洲油菜植物或其部分诸如种子的方法，包括使欧洲油菜植物或其部分杂交。
lc-ω3脂肪酸
使用根据本发明实施方案的油菜品系ns-b50027-4植物，lc-ω3脂肪酸可以从ns-b50027-4油菜种子中以商业化的量生产。因此，转化植物的选择和繁殖技术产生了具有ns-b50027-4的有利性状的多种(apluralityof)植物，这些植物以常规方式收获并且脂肪酸从感兴趣的组织诸如种子中提取。
如上所述，“脂肪酸含量”或“脂肪酸组成”通常是指成熟、完整、部分干燥的种子(通常含有约6％或7％的水分)的内源形成的油脂中存在的各种脂肪酸的重量百分比，所述重量百分比以面积归一化的特定脂肪酸的百分比；或相对于已知标准品；或作为每克种子的脂肪酸重量比(例如，mgdha/g种子)计算。
通常工业实践以面积百分比(面积归一化)，而不是绝对量报告脂肪酸组成。例如，色谱法通常以峰生成数据，每个峰下的面积被积分，并以色谱图中所有脂肪酸峰下总面积的百分比表示。面积百分比易于计算以及与业内也报告面积百分比的其他人报告的结果进行比较。面积百分比不是绝对的，但提供了可接受的近似值。例如，通过包括已知浓度的参考标准品和内标，可以计算绝对mg/kg结果。校正因子也可用于计算脂肪酸的质量
例如，在确定脂肪酸含量时，可以将种子压碎、提取油三酰基甘油酯(tag)，然后用甲醇和甲醇钠皂化和甲基化，或者通过与1.25％在甲醇中的3-(三氟甲基)苯基-三甲基氢氧化铵(methprepiitm，fischerscientificcat#at18007)反应，形成脂肪酸甲酯。得到的脂肪酸甲酯(fame)可以使用基于不饱和度和脂肪酸链长度分离fame的毛细管柱通过气液色谱法(glc)分析。fame还可以通过例如gc、lc-ms、gc-ms、nmr或近红外反射光谱法分析。脂肪酸组成也可以从整个种子中确定，例如通过破碎种皮并使破碎的种子经受直接甲基化。总脂质可以通过本领域已知的技术分离以纯化级分，诸如tag级分。例如，薄层色谱法(tlc)可以在分析规模上进行，以将tag与其它脂质级分诸如dag、酰基-coa或磷脂分离，以确定脂肪酸组成，特别是tag。如本领域技术人员已知的，可以使用许多其他分析技术。参见例如tinoco等人,3anal.biochem.514(1962)；canola:chemistry,production,processing&utilization(daun等人编辑,aocspress,urbana,il,2011)(daun等人,2011)；us2015/0166928；us20160002566。
在又一实施方案中，提取的植物脂质可以被处理以增加作为总脂肪酸含量的百分比的dha的水平。例如，处理包括水解酯化的脂肪酸以产生游离脂肪酸，或酯交换。例如，可以处理菜子油以将油中的脂肪酸转化为烷基酯诸如甲基酯或乙基酯，然后将烷基酯纯化或分馏以针对dha富集脂质或油。在实施方案中，这样的处理后的脂质的脂肪酸组成包含至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％dha。
本发明实施方案还包括来自品系ns-b5002-4的这些新型欧洲油菜品系的子代和后代。子代或后代可以通过本领域技术人员已知的育种或组织培养方法开发。例如，子代或后代可以包含在这些品系中开发的油菜脂肪酸谱。因此，后代或子代可以具有来自所开发的品系的任何数量的基因。后代或子代仅包括提供本文提供的油菜脂肪酸表型的那些基因，或另外的基因。这可以通过本领域技术人员已知的分子分析方法来确定。
一个方面提供了用于开发具有与ns-b50027-4的表型相同的表型的欧洲油菜种子的方法。例如，ns-b50027-4种子的dha脂肪酸含量包含至少约7％、至少约8％、至少约8％、至少约10％dha、至少约11％dha、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％或更多dha(％脂肪酸)。例如，ns-b50027-4种子的lc-pufa脂肪酸含量包含至少约10％lc-pufa、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％或更多的lc-pufa(作为％脂肪酸的epa、dpa、dha的总和)。
另一个方面提供了由本文描述的植物产生的压碎的欧洲油菜种子的均一的集合物(assemblage)，其中压碎的欧洲油菜种子具有以重量计总脂肪酸的至少约30％、至少约35％、诸如约36％至约40％(包括端点)(％种子重量)。在特定的实施方案中，例如，在压碎的欧洲油菜种子的均一的集合物中脂肪酸含量包含至少约7％的dha、至少约8％的dha、至少约9％的dha、至少约10％的dha、至少约11％的dha、至少约12％的dha、至少约13％的dha、至少约14％的dha、至少约15％的dha、或更多的dha(％脂肪酸)。在特定的实施方案中，例如，压碎的欧洲油菜种子的均一的集合物的脂肪酸含量包含至少约8％的lc-pufa、至少约9％的lc-pufa、至少约10％的lc-pufa、至少约11％的lc-pufa、至少约12％的lc-pufa、至少约13％、至少约14％的lc-pufa、至少约15％的lc-pufa、至少约16％、至少约17％、至少约18％或更多的lc-pufa(作为％脂肪酸的epa、dpa、dha的总和)。还提供了来自这种压碎的种子的油和粗粉。
还提供了压碎的品系ns-b50027-4种子的均一的集合物，或来自ns-b50027-4的子代或后代的压碎的欧洲油菜种子的均一的集合物，其中压碎的种子具有至少约7％的dha、至少约8％的dha、至少约9％的dha、至少约10％的dha、至少约11％的dha、至少约12％的dha、至少约13％的dha、至少约14％的dha、至少约15％或更多的dha(％脂肪酸)的dha含量。例如，压碎的欧洲油菜ns-b50027-4种子的均一的集合物，或来自ns-b50027-4的子代或后代的压碎的欧洲油菜种子的均一的集合物，其中压碎的种子的均一的集合物包含至少约8％的lc-pufa、至少约9％的lc-pufa、至少约10％的lc-pufa、至少约11％的lc-pufa、至少约12％的lc-pufa、至少约13％、至少约14％的lc-pufa、至少约15％的lc-pufa、至少约16％、至少约17％、至少约18％或更多的lc-pufa(作为％脂肪酸的epa、dpa、dha的总和)。还提供了来自这种压碎的种子的油和粗粉。
本文描述的另一方面提供了一种从欧洲油菜品系ns-b50027-4(所述品系的代表性种子已经以atcc登录号pta-123186保藏)、ns-b50027-4的亚系、ns-b50027-4或亚系的子代、或通过将ns-b50027-4与第二种油菜或芸薹属植物杂交产生的植物产生油或粗粉的方法，所述方法包括：使上述作物在芸薹属植物生长条件下生长；收获种子；和提取油或粗粉。
本文描述的另一个方面提供了一种从欧洲油菜品系ns-b50027-4(所述品系的代表性种子已经以atcc登录号pta-123186保藏)、ns-b50027-4的亚系、ns-b50027-4或亚系的子代、或通过将ns-b50027-4与第二种芸薹属植物杂交产生的植物产生油的方法，所述方法包括：压碎品系ns-b50027-4(所述品系的代表性种子已经以atcc登录号pta-123186保藏)、ns-b50027-4的亚系、ns-b50027-4或亚系的子代、或通过将ns-b50027-4与第二种油菜或芸薹属植物杂交产生的植物的种子；和从所述种子提取油。
另一个方面提供了来自ns-b50027-4种子或ns-b50027-4来源的子代种子的粗粉和蛋白以及油。从植物生物质提取蛋白可以通过已知方法完成。参见例如heney&orr,114anal.biochem.92(1981)。来自ns-b50027-4的粗粉可以证明是特别有益的，因为它含有至少一些dha和其他ω3脂肪酸。类似地，来自ns-b50027-4的蛋白级分包含至少一些有益dha和其他ω3脂肪酸。
尽管比声称通过高油酸含量给予dha和其他lc-pufa稳定性的油更低的油酸含量，但来自ns-b50027-4的种子的lc-pufaω3脂肪酸油表现出令人惊讶的稳定性。更具体地，lc-pufaω3脂肪酸众所周知的不稳定并且特别易于氧化。在本领域中理解，为了延长lc-pufa和含有lc-pufa的食品的货架期，需要封装、与其他油特别是高油酸油混合或添加抗氧化剂。然而，尽管缺乏这样的处理，一些证据表明从压碎的ns-b50027-4种子提取的粗制油在室温会保持新鲜数月。
本发明实施方案的另一个方面提供了用于在人类和非人类动物的营养补充剂和食物中使用的dha和lc-pufa的来源。特别是，来自ns-b50027-4种子的油提供了用于在水产养殖中使用的dha和lc-pufa的可持续来源。由于对鱼类的高全球需求以及由此造成的海洋过度捕捞，海水和淡水养殖的重要性日益增加。betancor等人,4sci.rep.8104(2014)。例如，在过去的20年中，鲑科鱼类(salmonid)的养殖和消耗急剧增加。然而，野生鱼类的饮食与水产养殖中的同类物种的饮食非常不同。事实上，水产养殖仍然高度依赖海洋捕捞渔业来提供关键的膳食营养，诸如鱼粉和鱼油。实际上，鱼粉和鱼油是水产养殖中ω3-lcpufa的主要来源。由于海洋鱼油是鱼类养殖工业强劲增长(每年5％至10％)的限制因素，水产养殖饮食包含很多替代性的基于植物的成分诸如豆类种子、油籽饼、叶粉和增加比例的植物油。用传统上低lc-pufa的植物油代替鱼油意味着鱼类饮食中可获得的lc-pufa较少，即使一些油类诸如亚麻籽油包含一定量的可以在鱼中(虽然仅以有限程度)转化为的lc代谢物的ala。一般来说，目前鱼饲料中的植物油可能对鱼中的fa分布具有有害影响，并且它们可以改变ω3/ω6比率。
例如，典型的植物油包含高含量的ω6pufa，主要是亚油酸(c18:2ω6；la)。来自亲本品系avjade的油不具有dha，因此没有dha:la比率；来自ns-b50027-4的油具有1.048的dha:la比率；相比之下，具有0.908的dha:la比率的来自养殖鲑鱼的油。strobel等人,11lipidshealthdis.144(2012)。有趣的是，来自ns-b50027-4的ω3fa的比率在棕榈酸(一种与心血管疾病和血脂异常相关的饱和脂肪酸)方面更有益。diet,nutrition&preventionofchronicdis.,whotech.rep.series916,reportofajointwho/faoexpertconsultation,88(worldhealthorganization,geneva,2003)。来自亲本品系avjade的油不具有dha，并且因此没有dha:棕榈酸比率；来自ns-b50027-4的油具有2.122的dha:棕榈酸比率；相比之下，来自养殖鲑鱼的油具有0.591的dha:棕榈酸比率为；并且来自野生鲑鱼的油具有1.018的dha:棕榈酸比率。strobel等人,2012。包括lc-pufa的水产养殖饲料的制备原本在本领域中是已知的。参见betancor等人,2014；petrie等人,9plosone1,2014；tocher,aquaculture(2015)。因此，本发明实施方案的范围包括使用来自ns-b50027-4的油作为水产养殖饲料和包含从ns-b50027-4及其子代获得的油的水产养殖饲料的ω3脂肪酸的来源。
ns-b50027-4及其子代的鉴定
优良种遗传事件可以通过重组dna分子在植物基因组中掺入的位置和位点的构型来表征。植物基因组中被插入重组dna盒的位点也被称为“插入位点”或“靶位点”。“侧翼区”或“侧翼序列”是位于紧邻转基因盒的上游并与转基因盒连续的或紧邻转基因盒的下游并与转基因盒连续的植物基因组的dna区，例如，至少20个碱基对、至少50个碱基对、或至多5,000个碱基对。导致外源dna随机整合的转化产生具有不同侧翼区的转化子，该不同侧翼区对于每个转化子是特征性的和独特的(优良种事件)。
另一方面提供了产生ns-b50027-4来源的欧洲油菜植物或其部分的方法，所述方法包括将上述欧洲油菜植物或其部分与第二种植物杂交以产生第一代子代种子；使所述第一代子代种子生长以生产f1代植物；任选地，重复杂交和生长的步骤以获得所述种子的连续杂交代，以获得育种品系ns-b50027-4来源的欧洲油菜种子、植物或其部分。还提供了通过此方法产生的植物或植物部分(包括任何杂交体)。在实施方案中，已被工程化到特定油菜植物的基因组的遗传性状可以使用植物育种领域周知的传统育种技术转移到另一个栽培种的基因组中。例如，回交方法可以用于将转基因从转化的油菜栽培种转移到已经开发的油菜栽培种中，并且然后所得的回交转化植物将包含转基因。
因此，本发明实施方案的另一方面提供了用于检测ns-b50027-4的组合物、方法和试剂盒。能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的子代是否包含感兴趣的转基因将是有利的。另外，用于检测特定事件的方法将更有助于遵守例如需要对来源于重组作物植物的食品进行上市前审批和标记的法规。可以通过任何周知的核酸检测方法检测转基因的存在，诸如聚合酶链式反应(pcr)或使用核酸探针的dna杂交。这些检测方法通常关注常用的遗传元件诸如例如启动子、终止子、标记基因等。因此，这样的方法可能无法用于区分不同的事件，特别是那些使用相同dna构建体产生的那些，除非与插入的dna相邻的染色体dna的序列(“侧翼dna”)是已知的。已经描述了事件特异性pcr测定。参见例如windels等人,(med.fac.landbouww,univ.gent64/5b:459-462,1999)(通过使用跨插入片段和侧翼dna之间的连接的引物组的pcr来鉴定大豆耐草甘膦事件，具体地，所述引物组包括来自插入片段的序列的一个引物和包括来自侧翼dna的序列的第二个引物)。此外，ns-b50027-4的16基因插入片段破坏了编码pto-相互作用蛋白(pti)的芸薹属基因的表达，pto-相互作用蛋白(pti)是参与位于染色体a05上的超敏应答介导的信号传导的丝氨酸-苏氨酸激酶。虽然没有观察到表型变化，但这为鉴定ns-b50027-4或ns-b50027-4来源的子代提供了另一种标记。
本文中的方法和试剂盒可用于鉴定生物样品中具体地包含ns-b50027-4中的转基因的植物材料、以及转基因油菜植物、植物材料和含有这样的事件的种子的存在。本文描述的优良种事件ns-b50027-4可以通过基因型来鉴定，基因型可以通过可以鉴定相同栽培种或相关栽培种的植物或者用于确定或验证谱系(pedigree)的遗传标记谱来表征。遗传标记谱可以通过技术诸如限制性片段长度多态性(rflp)、随机扩增多态性dna(rapd)、任意引物聚合酶链式反应(ap-pcr)、dna扩增指纹(daf)、序列特征扩增区域(scar)、扩增片段长度多态性(aflp)、简单序列重复(ssr)(也称为微卫星)、和单核苷酸多态性(snp)获得。
例如，本文描述的优良种事件ns-b50027-4可以通过从植物材料的样品生成遗传图谱(geneticmap)来鉴定。遗传图谱可以通过常规rflp、聚合酶链式反应(pcr)分析或鉴定编码外源蛋白的整合的dna分子的大致染色体位置的ssr生成。参见glick&thompson,methodsinplantmolec.biol.&biotechnol.269(crcpress,bocaraton,fl,1993)。关于染色体位置的图谱信息对于受试转基因植物的专有保护是有用的。例如，可以将整合区域的图谱与可疑植物的类似图谱进行比较，以确定后者是否与受试植物具有共有的亲缘关系(parentage)。图谱比较可以涉及杂交、rflp、pcr、ssr和测序，所有这些都是常规技术。
本发明实施方案的另一方面提供了用于确定油菜植物是否是近交品系ns-b50027-4或是否与近交品系ns-b50027-4有关、或者是否是包含品系ns-b50027-4的遗传优良种事件的至少一部分的油菜植物的试剂盒和方法。本文描述了用于鉴定生物样品中优良种事件ns-b50027-4的简单且明确的技术的组合物和方法。
例如，试剂盒可包括用于鉴定ns-b50027-4的一种或更多种遗传标记至少一组引物，诸如一组有义(正向)引物和反义(反向)引物。参见表2。引物的具体实施方案包括可用于进行kasp测定以检测ns-b50027-4遗传性状、特别适用于基因渗入研究和杂交体发育的试剂盒中的以下引物。参见实施例2。这些引物可以由包含如下序列的至少10个连续核酸的核酸分子组成：
本发明还提供了用于鉴定优良种事件ns-b50027-4油菜植物的方法，所述方法包括：(a)形成包含含有油菜植物dna的生物样品和能够扩增事件ns-b50027-4的特异性核酸分子的第一核酸引物和第二核酸引物的混合物；(b)使混合物在允许第一核酸引物和第二核酸引物扩增事件ns-b50027-4的特异性核酸分子的条件下反应；和(c)检测扩增的片段核酸分子的存在，其中油菜优良种事件ns-b50027-4特异性核酸分子的存在表明油菜植物是ns-b50027-4油菜植物。
另一个实施方案提供了用于检测生物样品中优良种事件ns-b50027-4核酸分子的方法，所述方法包括：(a)形成包含含有dna的生物样品和能够与事件ns-b50027-4的特异性核酸分子杂交的核酸探针的混合物；(b)使混合物在允许探针与事件ns-b50027-4的特异性核酸分子杂交的条件下反应；和(c)检测杂交的核酸分子的存在，其中事件ns-b50027-4的特异性核酸分子的存在表明该样品包含事件ns-b50027-4核酸分子。
又另一个实施方案提供了用于检测生物样品中事件ns-b50027-4核酸分子的存在的方法，所述方法包括：(a)形成包含含有dna的生物样品和能够退火至事件ns-b50027-4插入片段核酸分子的区域的第一引物以及能够退火到宿主细胞基因组中的侧翼核酸分子的第二引物的混合物；(b)使混合物在允许第一核酸引物和第二核酸引物产生包含事件ns-b50027-4插入片段核酸分子的片段的扩增的核酸分子的条件下反应；和(c)检测扩增的核酸分子的存在，其中事件ns-b50027-4插入片段核酸分子的片段的存在表明该样品含有事件ns-b50027-4插入dna。
合适的测试应当检测任何主要的缺陷并建立优势水平或相对于当前栽培种的改进。除了表现出优异的性能外，必须要求与工业标准相容或创造新的市场的新的栽培种。新栽培种的引入将给种子生产者、种植者、加工者和消费者带来用于特殊广告和营销、改变的种子和商业化生产实践以及新产品利用的额外的成本。新的栽培种在发布之前的测试应考虑研究和开发成本，以及最终的栽培种的技术优势。对于种子繁殖的栽培种，容易且经济地产生种子必须是可行的。
例如，试剂盒可以包括对以下特异性的至少一组有义(正向)引物和反义(反向)引物：微藻细小微胞藻来源的的δ6-去饱和酶、微藻pyramimonascordata来源的δ5-延长酶、海洋微藻盐生巴夫藻来源的δ5-去饱和酶、酵母巴斯德毕赤酵母来源的δ15/ω3-去饱和酶、盐生巴夫藻来源的δ4-去饱和酶、或酵母lachanceakluyveri来源的δ12-去饱和酶(参见例如表2)；以及对插入片段和天然芸薹属染色体a02dna之间的5'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:40的从核苷酸2033至2132的连接，包含43bp的插入片段和57bp的芸薹属染色体a02dna的100bp区域，或对插入片段和天然芸薹属染色体a02dna之间的3'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:40的从核苷酸14156至14255的连接，包含46bp的插入片段和54bp的芸薹属染色体a02dna的100bp区域；对插入片段和天然芸薹属染色体a05dna之间的5'连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:41的从核苷酸1110至1209，的连接，包含50bp的插入片段和50bp的芸薹属染色体a05dna的100bp区域，或对插入片段和天然芸薹属染色体a05dna之间的3’连接特异性的至少一组引物，所述连接诸如seqidno:42的从核苷酸47724至47823的连接，包含50bp的插入片段和50bp的芸薹属染色体a05dna的100bp区域。
对于使用dna引物来产生诊断ns-b50027-4事件的扩增子的方法的扩增条件在本领域的普通技术范围内。另外，包括用于扩增内源性油菜基因的对照引物对作为反应条件的内标并且其产生约100-5000个核苷酸的扩增子。ns-b50027-4事件植物组织样品的分析应包括来自ns-b50027-4事件的阳性组织对照、来自不为ns-b50027-4事件的油菜植物的阴性对照、和不包含模板油菜dna的阴性对照。另外的引物可以由dna扩增方法领域的技术人员从seqidno:47、seqidno:48、seqidno:49和seqidno:50中示出的连接中选择，并且优化可能得到诊断ns-b50027-4的任何扩增子的扩增子产生条件。使用具有修饰的这些dna引物序列在本文描述的实施方案的范围内。通过使用当在pcr方法中使用时产生诊断ns-b50027-4事件的扩增子的衍生自seqidno:47的至少一个引物序列、或衍生自seqidno:48的至少一个引物序列、或衍生自seqidno:49的至少一个引物序列、或衍生自seqidno:50的至少一个引物序列产生的扩增子可以在所描述的方法中使用，并且是本发明实施方案的一个方面。ns-b50027-4事件扩增子的产生可以通过使用热循环仪或通过本领域技术人员已知的方法和装置进行。
本发明还提供了用于鉴定优良种事件ns-b50027-4油菜植物的方法，所述方法包括：(a)形成包含含有油菜植物dna的生物样品和能够扩增事件ns-b50027-4特异性核酸分子的第一核酸引物和第二核酸引物的混合物；(b)使混合物在允许第一核酸引物和第二核酸引物扩增事件ns-b50027-4特异性核酸分子的条件下反应；和(c)检测扩增的片段核酸分子的存在，其中油菜优良种事件ns-b50027-4特异性核酸分子的存在表明油菜植物是ns-b50027-4油菜植物。
另一个实施方案提供了用于检测生物样品中优良种事件ns-b50027-4核酸分子的方法，所述方法包括：(a)形成包含含有dna的生物样品和能够与事件ns-b50027-4特异性核酸分子杂交的核酸探针的混合物；(b)使混合物在允许探针与事件ns-b50027-4特异性核酸分子杂交的条件下反应；和(c)检测杂交的核酸分子的存在，其中事件ns-b50027-4特异性核酸分子的存在表明该样品含有事件ns-b50027-4核酸分子。
又另一个实施方案提供了用于检测生物样品中事件ns-b50027-4核酸分子的存在的方法，所述方法包括：(a)形成包含含有dna的生物样品和能够退火至事件ns-b50027-4插入片段核酸分子的第一引物以及能够退火到宿主细胞基因组侧翼核酸分子的第二引物；(b)使混合物在允许第一核酸引物和第二核酸引物产生包含事件ns-b50027-4插入片段核酸分子的片段的扩增的核酸分子的条件下反应；和(c)检测扩增的核酸分子的存在，其中事件ns-b50027-4插入片段核酸分子的片段的存在表明样品含有事件ns-b50027-4插入dna。
子代
本文描述的品系ns-b50027-4也可用于育种其他品系。例如，源材料可以自花授粉(self-pollinated)、异型杂交、回交、用于产生双单倍体、用作遗传转化的源材料、经受遗传转化、进一步诱变、并用于对于本领域技术人员已知的其他形式的育种。使用源材料来育种其他品系的方法和结果也在这些实施方案的范围内。
随着允许分离和表征编码特定蛋白产物的基因的分子生物学技术的出现，植物生物学领域的科学家们对工程化植物基因组以包含和表达外源基因，或另外的版本的或修饰版本的天然基因或内源性基因(可能由不同启动子驱动)，以便以特定方式改变植物的性状产生了浓厚的兴趣。使用转化或各种育种方法引入基因组的任何dna序列，无论是来自不同物种还是来自相同物种，在本文中统称为“转基因”。在过去的十五到二十年中，已经开发了用于产生转基因植物的几种方法，并且本发明在具体实施方案中也涉及所要求保护的品系的转化版本。
核酸、寡核苷酸或多核苷酸是指线性或分支的、单链或双链的rna或dna分子，或其杂交体——包括rna/dna杂交体。这些术语还包括3'utr和5'utr，通常为基因编码区的5'端上游至少约1000个核苷酸的序列和基因编码区的3'端下游至少约200个核苷酸的序列。不太常见的碱基，诸如肌苷、5-甲基胞嘧啶、6-甲基腺嘌呤、次黄嘌呤及其他也可用于反义、dsrna和核酶配对。例如，包含尿嘧啶和胞嘧啶的c-5丙炔类似物的多核苷酸已被示出以高亲和力结合rna并且是基因表达的有效反义抑制剂。还可以进行其他修饰，诸如对磷酸二酯主链的修饰，或对rna的核糖基团的2'-羟基的修饰。反义多核苷酸和核酶可完全由核糖核苷酸组成，或可以包含混合的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。本发明的多核苷酸可以通过任何手段产生，包括基因组制备、cdna制备、体外合成、rt-pcr以及体外转录或体内转录。
植物转化包括构建将在植物细胞中起作用的表达载体。这样的载体包含含有在调控元件(例如启动子)的控制下的基因或可操作地连接于调控元件(例如启动子)的基因。表达载体可以包含一种或更多种这样的可操作连接的基因/调控元件组合。载体可以是质粒的形式，并且可以单独使用或与其它质粒组合使用，以提供使用本领域已知的将转基因掺入油菜植物(包括ns-b50027-4油菜植物)的遗传物质中的转化方法转化的油菜植物。
已经使用转化技术被工程化到特定油菜植物中的遗传性状可以使用植物育种领域周知的传统育种技术转移到另一个品系中。例如，携带优良种事件ns-b50027-4的植物可以从保藏在atcc的种子获得。这样的植物可以进一步繁殖或在常规育种方案中使用，以将优良种事件ns-b50027-4引入到相同植物物种的其他栽培种中。保藏的种子属于物种欧洲油菜。然而，将位于a基因组或c基因组上的等位基因或转基因从欧洲油菜引入芥菜的方法是本领域周知的，并且包括重复回交。回交方法可用于将转基因从转化的油菜植物转移到优良种近交品系，并且所得的子代包含转基因。并且，如果将近交品系用于转化，那么转基因植物可以与不同的品系杂交以产生转基因杂合油菜植物。如本文中使用的，根据上下文，“杂交”可以指简单的x与y杂交，或回交的过程。
各种遗传原件可以使用转化进一步引入植物基因组中。这些元件包括但不限于基因；编码序列；诱导型启动子、组成型启动子和组织特异性启动子；增强序列；以及信号序列和靶向序列。新的分子生物学技术的出现已经允许分离和表征具有特定功能诸如编码特定蛋白产物的遗传元件。植物生物学领域的科学家对工程化植物基因组以包含和表达外源基因元件，或另外版本的或修饰版本的天然基因或内源性基因，以便以特定方式改变植物的性状产生了浓厚的兴趣。使用转化插入到基因组中的任何dna分子，无论是来自不同物种还是来自相同物种，在本文中统称为“转基因”。“转化”的过程是dna插入到基因组中。已经开发了用于产生转基因植物的几种方法，并且本发明在具体实施方案中也涉及所要求保护的油菜品系ns-b50027-4的转化版本。
已经开发了用于植物转化的许多方法，包括生物和物理的植物转化方案。此外，表达载体和用于植物细胞或组织转化和植物再生的体外培养方法是可用的。参见，例如miki等人,proceduresforintroducingforeigndnaintoplants,meth.plantmolec.biol.&biotechnol.中63页(glick&thompson编辑,crcpress,bocaraton,1993)；gruber等人,vectorsforplanttransformation,同上.r89页；genetictransformationfortheimprovementofcanola,proc.worldconf.biotechnol.fats&oilsindus.43-46页(am.oil.chem.soc.,champaign,il,1988)。
最普遍类型的植物转化涉及表达载体的构建。这样的载体包含含有在调控区(例如启动子)的控制下的编码区或者与调控区(例如启动子)可操作地连接的编码区的dna分子。表达载体可含有一种或更多种基因和一种或更多种调控元件。至少一个编码区和它们各自的调控元件可以在载体内以相反的方向布置，提供二元载体。理论上，将对基因沉默敏感的基因以二元方式布置可以使基因沉默最小化。载体可以是质粒的形式，并且可以单独使用或与其它质粒组合使用，以使用本领域已知的转化方法将转基因掺入ns-b50027-4植物或ns-b50027-4来源的植物的遗传物质中，以提供转化的油菜植物。
例如，初始转化盒pjp3416_ga7-modb包括能够促进油菜种子中ω-3脂肪酸积累的7个基因以及促进体外指定转基因植物的选择的1个可选择标记基因。参见wo2013185184；美国专利公布第2015/0374654号；petrie等人,6plantmeth.8(2010)。表达的基因都是合成的——密码子优化和合成的——因此在任何天然生物中都没有发现转基因dna分子。已经描述了用作密码子优化的模板的原始序列。参见petrie等人,12metab.eng’g233(2010a)；petrie等人,11plantmethods6(2010b)；petri等人,21transgenicres.139(2012)。
如本领域周知的，功能基因启动子是对于基因转录重要但不编码功能产物诸如肽的dna区域。例如，用于组成型表达的常见启动子来源于花椰菜花叶病毒。kay等人,236sci.1299(1987)；coutu等人,16transgenicres.771(2007)。在发育控制下的启动子包括优先在某些组织例如种子、叶、根、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中启动转录的启动子。特别相关的启动子是主要或仅在种子中起始转录的“种子优选的”启动子。“种子优选的”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间是活跃的那些启动子，诸如种子贮藏蛋白的启动子)，以及“种子萌发”启动子二者(在种子发芽期间活跃的那些启动子)。参见thompson等人,10bioessays108(1989)。这样的种子优选的启动子包括但不限于cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cz19b1(玉米19kda玉米醇溶蛋白)；milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见wo2000/11177和美国专利第6,225,529号)。对于双子叶作物，种子特异性启动子包括但不限于大豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、cruciferin、conlinin等。先前已经描述了ga7-modb中使用的种子特异性启动子：拟南芥fae1(rossack等人,46plantmolec.biol.717(2001))；亚麻cnl1和cnl2(chaudhary等人,wo2001016340)；被截短的欧洲油菜油菜籽蛋白启动子(stalberg等人,23plantmolec.biol.671(1993)。也参见wo2013185184。
“诱导型”启动子是在环境控制下的启动子。可能影响诱导型启动子的环境条件的实例包括化学控制(在某些化学品存在下诱导)、厌氧条件或光的存在。组织特异性启动子、组织优选的(例如种子特异性的)启动子和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类。参见ward等人,22plantmol.biol.361(1993)；meft等人,90pnas4567(1993)(铜-可诱导的)；gatz等人,243mol.gen.genet.32(1994)(由除草剂安全剂诱导)；gatz等人,227mol.gen.genet.229(1991)(四环素-可诱导的)；schena等人,88pnas10421(1991)(糖皮质类固醇可诱导的)。也参见wo2001016340以及其中讨论的启动子。
“组成型”启动子是在大多数环境条件下都活跃的启动子。示例性组成型启动子包括来自植物病毒的启动子，诸如来自花椰菜花叶病毒(cmv)的35s启动子(odell等人,313nature810(1985))和来自以下基因的启动子：水稻肌动蛋白(mcelroy等人,2plantcell163(1990))；泛素(christensen等人,12plantmol.biol.619(1989)；christensen等人,18plantmol.biol.6759(1992))；pemu(last等人,81theor.appl.genet.581(1991))；mas(velten等人,3emboj.2723(1984))和玉米h3组蛋白(lepetit等人,231mol.gen.genet.276(1992)；atanassova等人,2plantj.291(1992))。als启动子，欧洲油菜als3结构基因5'的xbai/ncoi片段(或与所述xbai/ncoi片段相似的核苷酸序列)提供了另一种组成型启动子。还参见wo1996/30530和其中讨论的启动子。cmv启动子也与有用的增强子区相关。参见wo1996/30530和wo2013185184以及其中讨论的启动子。
包括多腺苷酸化信号的终止子区是产生完整且稳定的mrna分子所需的。例如，根癌农杆菌胭脂碱合酶终止子(nos)终止子提供了有用的终止子。bevan,12nucl.acidres.8711(1984)；rogers等人,biotechnol.plantsci.中219页(acad.press,inc.,newyork,ny,1985)；sanders等人,15nucl.acidsres.1543(1987)。一系列调控序列被组合使用以驱动和终止各种表达盒的转录。
转基因产生的蛋白向亚细胞区室诸如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸酶体、细胞壁或线粒体的转运，或分泌到质外体中，通过将编码信号序列的核苷酸序列可操作地连接到编码感兴趣的蛋白的基因的5'或3'区的手段来完成。在蛋白合成和加工期间，结构基因的5'或3'末端的靶向序列可以确定所编码的蛋白最终被区室化的位置。
信号序列的存在指导多肽至细胞内细胞器或亚细胞区室或分泌至质外体。许多信号序列是本领域中已知的。参见例如becker等人,20plantmol.biol.49(1992)；knox等人,9plantmol.biol.3(1987)；lerner等人,91plantphysiol.124(1989)；fontes等人,3plantcell483(1991)；matsuoka等人,88pnas834(1991)；creissen等人,2plantj.129(1991)；kalderon等人,39cell499(1984)；steifel等人,2plantcell785(1990)。
表达载体通常包括可操作地连接到调控元件(例如启动子)的至少一个遗传标记，所述遗传标记允许包含标记的转化细胞通过阴性选择(即抑制不包含可选择标记基因的细胞的生长)，或通过阳性选择(即筛选由遗传标记编码的产物)被回收。许多常用的用于植物转化的可选择标记基因是转化领域周知的，并且包括例如编码代谢地解毒选择性化学剂(可以是抗生素或除草剂)的酶的基因，或编码对抑制剂不敏感的改变的靶的基因。阳性选择方法是本领域已知的。
用于植物转化的一种常用的可选择标记基因是从转座子tn5分离的新霉素磷酸转移酶ii(nptii)基因，该基因在置于植物调控信号的控制下时赋予卡那霉素抗性。fraley等人,80pnas4803(1983)。另一种常用的可选择标记基因是赋予对抗生素潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶基因。vandenelzen等人,5plantmol.biol.299(1985)。赋予对抗生素的抗性的细菌来源的另外的可选择标记基因包括庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3'-腺苷转移酶、博来霉素抗性决定子。hayford等人,86plantphysiol.1216(1988)；jones等人,210mol.gen.genet.,86(1987)；svab等人,14plantmol.biol.197(1990)；hille等人,7plantmol.biol.171(1986)。其他可选择标记基因赋予对除草剂诸如草甘膦、草铵膦或溴苯腈的抗性。comai等人,317nature741(1985)；gordon-kamm等人,2plantcell603(1990)；stalker等人,242sci.419(1988)。用于植物转化的非细菌来源的可选择标记基因包括例如小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶。eichholtz等人,13somaticcellmol.genet.67(1987)；shah等人,233sci.478(1986)；charest等人,8plantcellrep.643(1990)。
用于植物转化的另一类标记基因需要筛选推定转化的植物细胞，而不是直接遗传选择对有毒物质诸如抗生素抗性的转化的细胞。这些基因对于量化或可视化特定组织中基因表达的空间模式特别有用，并且经常被称为报告基因，因为它们可以与基因或基因调控序列融合，用于研究基因表达。用于筛选推定转化的细胞的常用基因包括α-葡糖苷酸酶(gus)、α-半乳糖苷酶、荧光素酶和氯霉素、乙酰基转移酶。jefferson,r.a.,plantmol.biol.,5:387(1987)；teeri等人,emboj.,8:343(1989)；koncz等人,pnas,84:131(1987)；和deblock等人,emboj.,3:1681(1984)。用于可视化gus活性的一些体内方法不需要破坏植物组织。molecularprobes,publication2908,imagenegreen,1-4(1993)；naleway等人,115j.cellbiol.151a(1991)。然而，用于可视化gus活性的体内方法存在问题，表现出低灵敏度、高荧光背景和与使用荧光素酶基因作为可选择标记相关的限制。绿色荧光蛋白(gfp)可用作原核细胞和真核细胞中基因表达的标记。chalfie等人,263sci.802(1994)。gfp和gfp的突变体可用作可筛选标记。
ns-b50027-4和ns-b50027-4子代可以进一步被转化以赋予疾病或害虫抗性。例如，植物品系可以用克隆的抗性基因转化，以工程化对特定病原体菌株具有抗性的植物。参见例如jones等人,266sci.789(1994)(克隆抗黄枝孢霉(cladosporiumfulvum)的番茄cf-9基因)；martin等人,262sci.1432(1993)(抗丁香假单胞菌(pseudomonassyringae)pv番茄的番茄pto基因，一种蛋白激酶)；mindrinos等人,78cell1089(1994)(抗丁香假单胞菌的拟南芥(arabidopsis)rsp2基因)；geiser等人.48gene109(1986)(苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)δ-内毒素基因)；vandamme等人,24plantmol.biol.25(1994)，(大花君子兰(cliviaminiata)甘露糖结合凝集素)；sumitani等人,57biosci.biotech.biochem.1243(1993)(淀粉酶抑制剂)；abe等人,262j.biol.chem.16793(1987)(半胱氨酸蛋白酶抑制剂)；huub等人,21plantmol.biol.985(1993)(烟草蛋白酶抑制剂i)；regan,269j.biol.chem.9(1994)(昆虫利尿激素受体)；pratt等人,163biochem.biophys.res.comm.1243(1989)(allostatin)；tomalski等人,美国专利第5,266,317号(昆虫特异性麻痹性神经毒素)；scott等人,wo1993/02197(胼胝酶(callase)基因)；kramer等人,23insectbiochem.mol.biol.691(1993)(烟草天蛾几丁质酶)；kawalleck等人,21plantmol.biol.673(1993)(欧芹ubi4-2聚泛素基因)；wo1995/16776(鲎素的衍生物抑制真菌)；wo1995/18855(合成的抗微生物肽)；jaynes等人,89plantsci.43(1993)(天蚕抗菌肽-β，裂解肽使转基因烟草植物对青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearum)具有抗性)；botella等人,24plantmol.biol.,24:757(1994)(绿豆钙调蛋白)；griess等人,104plantphysiol.1467(1994)(玉米钙调蛋白)；taylor等人,摘要#497,7thint'lsymp.molec.plant-microbeinteractions(edinburgh,scotland(1994)(通过转基因单链抗体在烟草中酶促失活)；tavladoraki等人,366nature469(1993)(通过转基因抗体的病毒抗性)；lamb等人,10biotechnol.1436(1992)(真菌内切-α-1,4-d-多聚半乳糖醛酸酶片段促进真菌定植和通过溶解植物细胞壁同型-α-1,4-d-半乳糖醛酸酶释放的植物营养；toubart等人,2plantj.367(1992)(大豆多聚半乳糖醛酸内切酶抑制蛋白)；logemann等人,10bio/technology305(1992)(表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌疾病的抗性)。
如上所述，除草剂抗性是可以通过遗传修饰引入的另一种有用的性状。例如，对抑制生长点或分生组织的除草剂(诸如咪唑啉酮或磺酰脲类)的抗性可以通过突变体als和ahas酶赋予。参见例如lee等人,7emboj.1241(1988)；miki等人,80theor.appl.genet.449(1990)；草甘膦抗性由aroa和突变体5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(epsps)基因赋予；草铵膦抗性由草丁膦-乙酰基转移酶基因赋予；并且对吡啶氧基丙酸或苯氧基丙酸和环己酮的抗性由acc酶抑制剂编码基因赋予。参见例如美国专利第4,940,835号(epsps赋予草甘膦抗性)；突变体aroa基因，atcc登录号39256，参见comai,美国专利第4,769,061号；还参见umaballava-mobapathie,8transgenicresearch33(1999)(莴苣(lactucasativa)对草铵膦的抗性)；kumada等人,ep0333033；goodman等人,美国专利第4,975,374号(epsps赋予对除草剂诸如l-草丁膦的抗性)；leemans等人,ep0242246(草丁膦-乙酰基转移酶)；degreef等人,7bio/technol.61(1989)(编码草丁膦乙酰剂转移酶的嵌合bar基因)；marshall等人,83theor.appl.genet.435(1992)(acc1-s1、acc1-s2和acc1-s3基因赋予对苯氧基丙酸和环己酮诸如例如稀禾定和氟吡禾灵的抗性)；przibilla等人,3plantcell169(1991)(psba和gs+基因赋予三嗪抗性)；stalker,美国专利第4,810,648号(腈水解酶基因赋予苯基腈抗性)；hayes等人,285biochem.j.173(1992)(谷胱甘肽s-转移酶)；hattori等人,246mol.gen.genet.419(1995)(乙酰羟酸合酶赋予对多种除草剂的抗性)；shiota等人,106plantphysiol.17(1994)(酵母nadph-细胞色素p450氧化还原酶)；aono等人,36plantcellphysiol.1687(1995)(谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶)；datta,等人,20plantmol.biol.619(1992)(各种磷酸转移酶)；wo2001/12825；美国专利第6,288,306号；第6,282,837号；第5,767,373号；(具有改变的原卟啉原氧化酶活性的植物对靶向原卟啉原氧化酶的除草剂具有抗性)。
ns-b50027-4和ns-b50027-4来源的子代可以被进一步修饰以赋予任何数量的本领域已知的增值性状。参见例如goto等人,521actahorticulturae101(2000)(大豆铁蛋白基因)；curtis等人,18plantcellrep.889(1999)(硝酸还原酶)；knultzon等人,89pnas2625(1992)(硬脂酰-acp去饱和酶)；shiroza等人,170j.bacteriol.810(1988)(变异链球菌(streptococcusmutans)果糖基转移酶基因的核苷酸序列)；steinmetz等人,20mol.gen.genet.220(1985)(枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)左旋蔗糖酶基因)；pen等人,10bio/technol.292(1992)(转基因植物表达地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)α-淀粉酶)；elliot等人,21plantmol.biol.515(1993)(番茄转化酶基因)；
油菜品系ns-b50027-4也可以通过本领域已知的多种方法中的任何一种操作为雄性不育，包括通过使用机械方法、化学方法、自交不亲和性(si)、细胞质雄性不育(cms、ogura或另一种系统)或细胞核雄性不育(nms)。术语“被操作为雄性不育”是指使用任何可用的技术来产生油菜品系ns-b50027-4的雄性不育版本。雄性不育可以是部分雄性不育或完全雄性不育。参见例如wo2001/29237(引入在绒毡层特异性启动子的控制下的脱乙酰酶基因并应用化学物质n-ac-ppt)；wo1992/13956、wo1992/13957(雄蕊特异性启动子)；paul等人,19plantmol.biol.611(1992)(引入芽孢杆菌rna酶(barnase)和芽孢杆菌rna酶抑制剂(barstar)基因)；还参见美国专利第5,859,341号；第6,297,426号；第5,478,369号；第5,824,524号；第5,850,014号；第6,265,640号；hanson等人,16plantcells154(2004)。
已经开发了用于植物转化的许多方法，包括生物和物理植物转化方案。参见例如wo2013185184；miki等人,meths.plantmolec.biol.biotechnol.中67-88页(glick&thompson编辑,crcpress,inc.,bocaraton,fl,1993)。此外，表达载体和植物细胞或组织转化和植物再生的体外培养方法是可用的。参见例如wo2013185184；gruber等人,meths.plantmolec.biol.biotechnol.89-119页(glick&thompson编辑,crcpress,inc.,bocaraton,fl,1993)。将表达载体引入植物的一种方法是使用农杆菌属的天然转化系统，参见horsch等人,227sci.1229(1985)；curtis等人,45j.exper.botany1441(1994)；torres等人,34plantcelltissueorganculture279(1993)；dinant等人,3molec.breeding75(1997)；kado,10crit.rev.plantsci.1(1991)(根癌农杆菌和发根农杆菌(a.rhizogene)的ti质粒和ri质粒分别携带负责植物的遗传转化的基因)；gruber等人；miki等人；moloney等人,8plantcellrep.238(1989)(农杆菌属载体系统，用于农杆菌属介导的基因转移的方法)；美国专利第5,591,616号。
已经开发了统称为直接基因转移的几种植物转化方法，作为农杆菌属介导的转化的替代。通常可应用的植物转化方法是微粒介导的转化，其中dna被携带在1μm至4μm的微粒的表面上。表达载体通过基因枪(biolistic)装置引入植物组织中，该基因枪装置将微粒加速至足以穿透植物细胞壁和膜的300m/s至600m/s的速度。russell等人,12plantcellrep.165(1993)；aragao等人,20plantmol.biol.357(1992)；aragao等人,12plantcellrep.483(1993)；aragao,93theor.appl.genet.142(1996)；kim&minamikawa117plantsci.131(1996)；sanford等人,5part.sci.technol.27(1987)；sanford6trendsbiotech.299(1988)；klein等人,6bio/technol.559(1988)；sanford,7physiol.plant206(1990)；klein等人,10bio/technol.268(1992)。
将dna物理递送至植物的方法也是本领域已知的。参见例如zhang等人,9bio/technol.996(1991)(超声)；deshayes等人,4emboj.,2731(1985)(脂质体)；christou等人,84pnas3962(1987)(原生质体nhw11915)；hain等人,199mol.gen.genet.161(1985)(cac12沉淀)；draper等人,23plantcellphysiol.451(1982)(聚乙烯醇或聚l-鸟氨酸)；saker等人,40biologiaplantarum,507(1997/98)(原生质体电穿孔)。另外的方法包括但不限于使用直接基因转移法将表达载体引入植物组织中，诸如用鸟枪法装置的微粒介导的递送、dna注射、电穿孔等。转化后，使用本领域周知的再生和选择方法，上文描述的可选择标记基因的表达可以允许优先选择转化细胞、组织和/或植物。参见例如wo2013185184。
上述转化方法将通常用于产生转基因品系。然后可以将转基因品系与另一个(未转化的或转化的)品系杂交，以产生新的转基因油菜品系。可选择的，使用周知的转化技术被工程化到特定油菜或芸薹属中的遗传性状可以使用也在植物育种领域周知的传统回交技术引入到另一个品系中。例如，回交方法可用于将工程化性状从公共的非优良种近交品系转移到优良种近交品系中，或从在其基因组中含有外源基因的近交品系转移到不含有那个基因的近交品系或品系中。如本文中使用的，取决于上下文，“杂交”可以指简单的x与y杂交或回交的过程。
当在本发明实施方案的上下文中使用术语“ns-b50027-4植物”时，还包括该品系的任何基因转换。术语“基因转换植物”是指通过回交、基因工程或突变开发的那些ns-b50027-4植物，其中除了通过回交技术、基因工程或突变转移到ns-b50027-4来源的品系中的一个或更多个基因以外，基本上所有期望的形态和生理特征都被获得。回交方法可以与发明本实施方案一起使用，以改善品种或向品种引入特征。如本文中使用的，术语“回交”是指将杂交子代重复杂交回到轮回亲本(recurrentparent)，即，与轮回亲本回交1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多次。为期望的特征贡献基因的亲本芸薹属植物被称为“非轮回亲本”或“供体亲本”。这个术语指的是非轮回亲本在回交方案中使用一次，因此不再轮回(recur)的事实。来自非轮回亲本的一个或更多个基因被转移到其中的亲本芸薹属植物被称为轮回亲本，因为它在回交方案中使用几个轮次。poehlman&sleper,1994；fehr,1993。在典型的回交方案中，原始的感兴趣的品种(轮回亲本)与携带待转移的感兴趣的基因的第二个品种(非轮回亲本)杂交。然后将来自该杂交的所得的子代再次杂交至轮回亲本并重复该过程直至获得油菜植物，其中除了来自非轮回亲本的转移的基因以外，轮回亲本的基本上所有期望的形态学和生理特征都在转换植物中获得。
选择合适的轮回亲本是成功的回交程序的重要步骤。回交方案的目标是改变或替代原始品系中的性状或特征。为了实现这一点，轮回栽培种的基因被修饰或用来自非轮回亲本的期望的基因取代，同时保留基本上所有其余期望的基因型，并因此保持原始品系的期望的生理和形态特征。特定非轮回亲本的选择将取决于回交的目的。主要目的之一是为植物添加一些商业上期望的、农学上重要的性状。确切的回交方案将取决于被改变的特征或性状以确定适当的测试方案。尽管当被转移的特征是显性等位基因时，回交方法被简化，但是也可以转移隐性等位基因。在这种情况中，可能需要引入子代的测试以确定是否已经成功转移所期望的特征。
可以鉴定在新品系的开发中不经常选择但可以通过回交技术改进的基因性状。基因性状可以是转基因的或可以不是转基因的。这些性状的实例包括但不限于雄性不育、改变的碳水化合物代谢、除草剂抗性、对细菌、真菌或病毒疾病的抗性、昆虫抗性、增强的营养质量、工业用途、产量稳定性和产量提高。这些基因通常通过细胞核遗传。参见例如美国专利第5,969,212号；第7,164,059号。
近交品系ns-b50027-4的进一步繁殖可以通过组织培养和再生发生。术语“组织培养物”表示包含相同或不同类型的分离的细胞的组合物或组成植物部分的这样的细胞的集合。示例性组织培养物的类型是原生质体、愈伤组织、分生组织细胞和可以生成在植物或植物部分诸如叶、花粉、胚、根、根尖、花药、雌蕊、花、种子、叶柄、吸盘等中完整的组织培养物的植物细胞。用于制备和保持植物组织培养物的手段是本领域周知的。油菜的各种组织的组织培养物和从其再生植物是周知的。参见例如teng等人,27hortsci.1030(1992)；teng等人,28hortsci.669(1993)；zhang等人,46j.genet.breeding287(1992)；webb等人,38plantcelltissueorgancult.77(1994)；curtis等人,45j.exp.bot.1441(1994)；nagata等人,125j.am.soc’yhort.sci.669(2000)；ibrahim等人,28plantcelltissueorgancult.139(1992)；美国专利第5,959,185号；第5,973,234号；第5,977,445号。用于油菜植物再生的组织培养以及小孢子培养可以成功完成。参见chuong等人,4plantcellrep.4(1985)；barsby等人,5plantcellrep.101(1986)；kartha等人,31physiol.plant217(1974)；narasimhulu等人,7plantcellrep.104(1988)；swanson,6meth.molec.biol.159(1990)；cellculturetech.&canolaimprovement,66j.am.oilchem.soc.455(1989)。从文献中清楚的是，现有技术状态使得获得植物的这些方法按常规使用，具有高成功率。因此，本发明实施方案的另一个方面提供了细胞，其在生长和分化时产生具有近交转基因品系ns-b50027-4的生理和形态特征的油菜植物。
通常，当转基因通过传统杂交引入植物时，它在植物基因组中的插入位点及其侧翼区不会改变。“插入区”是指对应于至少40个碱基对，诸如至少100个碱基对或多达超过10,000个碱基对的区域，其被(未转化的)植物基因组中的转基因的上游和下游侧翼区包围并且包括插入位点(以及可能的靶位点缺失)。考虑到由于物种内的突变引起的微小差异，插入区可以与该物种的给定植物中的外源dna的上游和下游侧翼区保持至少85％、诸如90％、95％或100％序列同一性。然而，转基因盒插入植物基因组有时可伴随被称为“靶位点缺失”的植物dna的缺失。然而，另外的转基因或其他遗传操作可以在ns-b50027-4中进行，不需要过多实验；并且ns-b50027-4来源的植物可以如本文描述地被鉴定。
如果源材料ns-b50027-4与细胞质雄性不育来源或用于使近交品系的雌性不育的一些其它来源回交，源材料ns-b50027-4可以用于产生用于杂交种子生产的品系。可选择地，品系可以直接使用。例如，欧洲油菜品系ns-b50027-4可以与另一种油菜植物杂交，形成第一代f1植物的群体。通过这种方法产生的第一代f1植物的群体也是一个实施方案。该第一代f1植物的群体包含油菜品系ns-b50027-4的基本完整的等位基因组。通常，f1杂交体被认为具有每个亲本的所有等位基因。本领域普通技术人员可以利用育种手册或分子方法来鉴定使用油菜品系ns-b50027-4产生的特定f1植物，并且任何这样的单独植物也包括在本发明中。这些实施方案还涵盖了这些方法用于品系ns-b50027-4的转基因或单基因转换的用途。
本发明的另一个实施方案是在育种中使用油菜品系ns-b50027-4的方法，包括与油菜品系ns-b50027-4反复回交任意次数。使用本文描述的转基因方法、回交方法或本领域普通技术人员已知的其他育种方法，可以开发保留油菜品系ns-b50027-4的遗传谱的至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的单个植物和植物群体。保留在子代中的遗传物质百分比可以通过谱系分析或通过使用遗传技术(例如分子标记或电泳)来测量。在谱系分析中，平均50％的初始种质在与另一个品系杂交一次后将被传递到子代品系，25％在另一次杂交后传递到不同的品系，依此类推。分子标记也可用于确认和/或确定子代品系的谱系。
用于制备源自油菜品系ns-b50027-4的品系的具体方法如下。本领域普通技术人员将油菜品系ns-b50027-4与另一种油菜植物(例如优良种事件)杂交。使来自该杂交的f1种子生长以形成同系群体。f1种子含有来自油菜品系ns-b50027-4的50％的等位基因和另一种植物的50％的等位基因。使f1种子生长并使其自交，从而形成f2种子。平均而言，f2种子已从品系ns-b50027-4中获得50％的等位基因，并且从另一种油菜植物获得50％，但来自群体的各种个体植物的等位基因具有更大百分比的来源于事件ns-b50027-4的其等位基因。wang等人,40cropsci.659(2000)；bernardo等人,102theor.appl.genet.986(2001)。如本文中使用的，术语群体指的是具有统计学代表性样本。使f2种子生长，并且基于目视观察或性状测量来选择植物。用于选择的性状可以是油菜种子中高dha产量的油菜品系ns-b50027-4性状。选择表现出期望的ns-b50027-4来源的性状的事件ns-b50027-4来源的子代，并分别收获每株植物。来自每株植物的f3种子在单独的行间生长并允许其自交。选择的行或来自行的植物被单独收获和脱粒。选择同样基于对植物表型的目视观察，或对植物的期望的性状诸如期望的ns-b50027-4来源的性状的检测。生长和选择的过程重复任何次数，直到获得近交ns-b50027-4来源的油菜植物。
ns-b50027-4来源的油菜植物包含来源于油菜品系ns-b50027-4的期望的性状，其中一些可能不由油菜品系ns-b50027-4与其杂交的另一油菜植物表达并且其中一些可能由两个油菜品系表达但目前处于等于或大于在ns-b50027-4中表达水平的水平。
ns-b50027-4来源的f1油菜或芸薹属植物平均具有50％的基因来自ns-b50027-4，但来自该群体的各种单株植物具有更高百分比的来自ns-b50027-4的等位基因。重复杂交、自花授粉和选择的育种过程以产生ns-b50027-4来源的油菜植物的另一个群体，该群体平均具有25％的来源于油菜品系ns-b50027-4的其基因，但是来自该群体的各种单株植物具有更大百分比的来源于ns-b50027-4其等位基因。本发明的另一个实施方案是近交ns-b50027-4来源的油菜植物，所述油菜植物已经获得了高dha的期望的ns-b50027-4来源的性状。
先前的实施例可以以多种方式修改，例如选择可以在或可以不在在每一自花授粉的代发生或不发生，可以在实际的自花授粉过程发生之前或之后发生，或者单独的选择可以通过所描述的育种过程期间的任何时间点收获单个荚、植物、行或点来进行。此外，双单倍体育种方法可以在该过程的任何步骤中使用。在每一代和任何一代自花授粉中产生的植物群体也是本发明实施方案的实施方案，并且每个这样的群体将由以下植物组成：含有其约50％的基因来自油菜品系ns-b50027-4的植物，在第二轮杂交和选择中其25％的基因来自油菜品系ns-b50027-4的植物，在第三轮杂交和选择中其12.5％的基因来自油菜品系ns-b50027-4的植物，依此类推。
另一个实施方案是获得纯合的ns-b50027-4来源的油菜植物的方法，该方法通过将油菜品系ns-b50027-4与另一种油菜植物杂交并将双单倍体方法应用于f1种子或f1植物或通过将该杂交进行自交获得的油菜品系ns-b50027-4的任何代进行。谱系育种通常用于改进自花授粉作物或交叉授粉作物的近交品系。具有有利、互补性状的两个亲本被杂交以产生f1。f2群体通过一个或几个f1自交或通过两个f1相互杂交(同胞交配)产生。最佳个体的选择通常在f2群体中开始。然后，从f3开始，选择最好的家系中的最好的个体。家系的重复测试或涉及这些家系的个体的杂交体组合通常在f4代中进行，以提高对具有低遗传性的性状的选择的有效性。在近交繁殖的进展阶段(即f6和f7)，检测最好的品系或表型相似的品系的混合物作为新栽培种的潜在释放。
更进一步地，本发明实施方案涉及产生ns-b50027-4来源的油菜植物的方法，该方法通过以下进行：通过将油菜品系ns-b50027-4与油菜植物杂交并使子代种子生长，并用ns-b50027-4-来源的油菜植物重复杂交和生长步骤1至2次、1至3次、1至4次、或1至5次，并在第一次、第二次、第三次、第四次或第五次杂交后自交任何次数。质量和轮回选择可以用于改进自花授粉或交叉授粉作物的群体。杂合个体的遗传变异群体通过使几个不同的亲本相互杂交来鉴定或产生。最佳的植物基于个体优势、突出的子代或优异的组合能力来选择。选择的植物被相互杂交以产生新的群体，在新的群体中继续进一步的选择循环。
回交育种已被用于将简单遗传的、高度遗传的性状的基因转移到为轮回亲本的期望的纯合栽培种或品系中。待转移的性状来源被称为供体亲本。预期所得的植物具有轮回亲本(例如，栽培种)的属性和从供体亲本转移的期望的性状。在初始杂交后，选择具有供体亲本表型的个体并重复杂交(回交)至轮回亲本。预期所得的植物具有轮回亲本(例如，栽培种)的属性和从供体亲本转移的期望的性状。
严格意义上的单粒传法(single-seeddescentprocedure)是指种植分离群体，收获每株植物一粒种子的样品，并使用单粒种子样品种植下一代。当群体从f2推进到期望的育种水平时，从中衍生品系的植物将各自追踪到不同的f2个体。由于一些种子未能萌发或一些植物未产生至少一粒种子，群体中的植物的数量随着每一代下降。结果，当继代完成时，并非所有在群体中最初采样的f2植物都在子代中显示。
另一个实施方案提供了ns-b50027-4的单基因转换。当通过传统(非转化)育种技术(诸如回交)引入dna序列时发生基因转换。dna序列，无论是天然存在的还是转基因的，可以使用这些传统的育种技术引入。通过该方法转移的期望的性状包括但不限于生育力改变、脂肪酸谱修饰、其他营养增强、工业增强、抗病性、昆虫抗性、除草剂抗性和产量提高。感兴趣的性状从供体亲本转移到轮回亲本，在这种情况中，本文公开的油菜植物。单基因性状可能由显性等位基因或隐性等位基因的转移所致。包含感兴趣的性状的子代的选择通过直接选择与显性等位基因相关的性状来进行。通过隐性等位基因转移的性状的子代的选择需要使第一次回交物生长和自交，以确定哪些植物携带隐性等位基因。隐性性状可能需要在连续的回交世代中进行另外的子代测试，以确定感兴趣的基因的存在。随着对感兴趣的性状的选择，选择子代的轮回亲本的表型。应当理解，另外的多核苷酸序列或基因偶尔与感兴趣的单基因转化性状一起转移。包含来自轮回亲本(本文公开的油菜植物)的至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的基因，加上包含基因转化性状的子代被认为是基因转换的ns-b50027-4。当性状由两个基因控制时(例如一些抗病性)，选择可以同时对两个基因进行，等等。
突变育种是将新性状引入油菜品种的另一种方法。对于植物育种者而言，自发发生的或人工诱导的突变对于植物育种者可能是变异的有用来源。人工诱变的目标是增加期望的特征的突变率。通过许多不同手段可以提高突变率，包括温度、长期种子储存、组织培养条件、辐射(诸如x射线、γ射线、中子、β辐射或紫外线辐射)、化学诱变剂(诸如碱基类似物如5-溴-尿嘧啶)、抗生素、烷化剂(诸如硫芥、氮芥、环氧化物、亚乙基胺、硫酸盐、磺酸盐、砜或内酯)、叠氮化物、羟基胺、亚硝酸或吖啶。通过诱变观察到期望的性状后，性状可以通过传统的育种技术掺入现有的种质中。参见例如fehr,principlescultivardevel.(macmillanpub’lco.,1993)。
应当理解，本发明实施方案的油菜品系可以通过细胞质基因、核基因、或其他因子的常规操作以雄性不育形式产生，如前面讨论的参考文献中描述的。这样的实施方案也在本权利要求书的范围内。本发明实施方案因此提供了通过使用油菜品系ns-b50027-4产生的f1杂交种子和植株。
许多实验室技术可用于植物基因型的分析、比较和表征；其中有同工酶电泳、限制性片段长度多态性(rflp)、随机扩增多态性dna(rapd)、任意引物聚合酶链式反应(ap-pcr)、dna扩增指纹图谱(daf)、序列特征扩增区域(scar)、扩增片段长度多态性(aflp)、简单序列重复(ssr，也称为微卫星)和单核苷酸多态性(snp)。
同工酶电泳和rflp已被广泛用于确定基因组成。shoemaker&olsen(molecularlinkagemapofsoybean(glycinemax),s.j.o'brien(编辑)geneticmaps:locusmapsofcomplexgenomes,6.131-6.138页,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1993)开发了由25个连锁群组成的分子遗传连锁图谱，具有约365个rflp、11个rapd、3个经典标记和4个同工酶基因座。还参见shoemaker,r.c.,rflpmapofsoybean,299-309页，phillips,r.l.和vasil,i.k.(编辑),dna-basedmarkersinplants,kluweracademicpress,dordrecht,thenetherlands(1994)。
ssr技术是目前有效且实用的标记技术；更多的标记基因座可以常规使用，并且与rflp相比，使用ssr可以找到每个标记基因座更多的等位基因。参见例如diwan&cregan,95theor.appl.genet.22(1997)。snp也可用于鉴定本发明的独特基因组成和保留该独特基因组成的子代品种。各种分子标记技术可以组合使用以增强整体分辨率。可以在植物育种中使用分子标记，包括通过使用技术诸如同工酶电泳、rflp、rapd、ap-pcr、daf、scar、aflp、ssr和snp鉴定的标记。分子标记的一个用途是数量性状基因座(qtl)图谱。qtl图谱是使用已知与对数量性状具有可测量的影响的等位基因紧密连锁的标记。育种过程中的选择基于与来自植物基因组的阳性效应等位基因连锁的标记的积累或与来自植物基因组的阴性效应等位基因连锁的标记的消除。
分子标记也可以在育种过程期间使用用于选择定性性状。例如，与等位基因紧密连锁的标记或含有感兴趣的实际等位基因内的序列的标记可以用于在回交育种程序期间选择含有感兴趣的等位基因的植物。这些标记还可用于朝向轮回亲本的基因组选择并弃去供体亲本的标记。该过程试图使保留在所选植物中的来自供体亲本的基因组的量最小化。它还可以用于减少回交程序中所需的回交到轮回亲本的数量。在选择过程中使用分子标记通常称为遗传标记增强选择或标记辅助选择。通过提供追踪通过杂交的遗传谱的手段，分子标记也可用于鉴定和排除某些种质的来源作为亲本品种或植物的祖先。
因此，清楚的是获得植物的这些方法的技术状态是“常规的”，因为它们常规地使用并且具有高成功率。油菜品系ns-b50027-4的实用性还延伸至与其他物种杂交。通常，合适的物种属于十字花科。因此，本发明实施方案包括在育种中使用油菜优良种事件ns-b50027-4的任何和所有的方法，包括自交、谱系育种、回交、杂交体产生和与群体杂交。使用油菜品系优良种事件ns-b50027-4作为亲本产生的所有植物和植物群体都在这些实施方案的范围内，包括由来源于油菜品系ns-b50027-4的品种开发的那些。本领域普通技术人员可以使用独特的分子标记谱或育种记录来鉴定来源于油菜品系ns-b50027-4的子代品系或子代的群体。
实施例
实施例1.品系ns-b50027-4在田间试验中的表征和选择
植物育种的一项艰巨任务是鉴定具有遗传优势的单株植物，因为对于大多数性状而言，真正的基因型价值可能被其他混杂的植物性状或环境因素所掩盖。鉴定优势植物的一种方法是观察其相对于其他实验植物和一种或更多种广泛种植的标准栽培种的性能。如果单个观察结果不确定，则重复观察提供对遗传价值的更好的估算。
最初鉴定为b0050-027-18的植物基于单粒传法通过收获每株植物一粒种子的样品和使用单粒种子样品种植下一代来选择。通常，由于一些种子未能萌发或一些植物未产生至少一粒种子，群体中的植物的数量随着每一代下降。结果，当继代完成时，并非所有在群体中最初采样的植物都在子代中显示。而且，原始的转基因事件增加了遗传的复杂性，使得无法对子代的基因型或表型做出预测。因此，植物自花授粉并连续几代选择类型，直到特定的品系变为纯合的，表现出具有优良农艺特性的选择性状，并产生真正的育种子代的均一群体。更具体地，测试品系在horsham(victoria，australia)的nuseedinnovationcenter(nic)按照育种重选程序选择。候选品系的选择和开发基于：
(a)t-dna插入片段的拷贝数；
(b)dha表达的分离模式；
(c)纯合性；(基于脂肪酸表型和基因型)；
(d)lc-ω3-dha的产生；和
(e)基于冬季和夏季不同地点的子代测试的适合作物生产的农艺性状。
在澳大利亚，油菜在南部旱地种植区并且主要是在冬季降雨环境中生长。澳大利亚生产主要来自具有较低的春化(vernalization)要求的春季型油菜栽培种。一般而言，澳大利亚栽培种的开花期开始通常具有些许延迟，并且在冬季月份具有相对高的植物活力或生物质产量。澳大利亚的油菜作物通常在第一次大降雨后事件后的4月至5月播种，并且在10月至12月收获。产量主要受生长季节期间的水量和栽培种的水分利用效率的影响。对斑点小球腔菌(leptosphaeriamaculans)引起的黑胫病的主要病变型基因的抗性可以在幼苗存活和茎溃疡方面区分栽培种，但澳大利亚栽培种在推荐的农艺措施下生长时，通常被认为具有高抗性。在五至七个月的生长季节之后，并发生在春末或初夏种子发育。除水的可利用度外，产量可以明显地受到极端温度(<0℃至>35℃)的影响，这可能导致种子和种荚的败育。
如本文所述，油菜种质的转化是用八基因构建体进行的，所述八基因构建体引起了lc-ω3脂肪酸，特别是dha的种子特异性积累。广义地说，尽管植物携带标记基因(mg)，表型用产品质量(pq)(产生的ω-3脂肪酸)表征。再选择转化材料的基因座纯合性、dha在种子中的表达、以及适合于商业化生产的农艺性状和产量潜能。
比较在八个试验地点(地点)来自转基因事件的三个t2代来源的姐妹株(sib)与八个其他油菜栽培种(品系)的一系列重要的农艺学性状和种子性状。2015年在维多利亚州，生长季降雨量低于长期平均值，并且缩短了生长季节。八个澳大利亚试验地点代表了宽范围的环境产量潜力，如地点平均地点产量的范围所指示的(即，avgarnet：0.7至2.4t/ha)。转基因品系b0050-027-18-x由三个转基因品系代表：b0050-027-18-20(t3)、b0050-027-18-36-13(t4)和b0050-027-18-105-13(t4)。测试品系的农艺性状变化与在所有测试环境中评估的商业栽培种的农艺性状的变化相当。该结论得到以下发现的支持：基于跨地点分析(met-reml)，最高产量测试品系的籽粒产量与最高产量的商业栽培种是统计学上相当的。此外，对于每个地点，最高产量的测试品系比至少一个栽培种具有显著更高的产量，除了在一个地点没有显著差异。测试品系产生具有略低百分比种子油且具有改变的脂肪酸组成的种子；但这并不影响产量或农艺性状。lcω3dha脂肪酸的表达在测试环境中是高度稳定的。
测试品系来源于转化的小植株(avjade变种)。通过允许隔离的植物自花授粉(即，防虫篷)使种子积累(bulked)。
用于比较的对照栽培种(商用育种品系)提供了在种植区广泛生长的良好适应的(即高产但变化的产量潜力和油含量)栽培种的农艺学多样性(例如植物习性、物候学)范围。这些栽培种都是开放授粉的，并在例如澳大利亚国家品种测试计划和区域年度作物报告中描述和广泛评估。参见“nvtonline”网站。此外，对于澳大利亚的黑胫病，植物疾病抗性的变异被详细描述。vandewouw等人,67crop&pasturesci.273(2015)。在澳大利亚，黑胫病可以引起高达90％的产量损失。marcroft&bluett,agricul.notes,ag1352,victoria,dept.primaryindus.(2008)。已经随时间记录了商业栽培种对特定种子脂肪酸组成和种子油含量的遗传变异。参见seberry等人,qualityofaustraliancanola2011(australianoilseedsfed.,2012)。来自栽培种avjade的植物被转化以产生转基因t0，并且因此avjade可被认为是本文描述的转基因事件的未转化的等值线(isoline)。
测试品系的表型变异以植物萌发、植物活力、开花时间、开花持续时间、株高、落籽、抗倒伏性、黑胫病严重程度、植物收获计数、籽粒产量、籽粒水分、种子油百分比和脂肪酸含量特别是种子lc-ω3多不饱和脂肪酸(lc-pufa)含量(具体涉及epa、dpa和dha的产量)为特征。对于所有测量的性状，使用统计软件genstat中的asreml进行有限估计似然分析。gilmour等人,asreml用户指南,release3.0,biometricbulletin(3)(vsvint’l,waterhousestmhemelhempstead,uk,2009)。线性混合模型统计方法用于解释野外空间变异，如广泛描述的，并且用于野外植物育种和遗传研究。cullis&gleeson,47biometrics1449(1991)；smith等人,57biometrics1138(2001)；welham等人,analysisoflinearmixedmodelsbyasreml-rwithapplicationsinplantbreeding:coursenotes(vsvint’l,waterhousestmhemelhempstead,uk,2013)。进一步对籽粒产量(t/ha)进行meta-reml跨地点分析，以确定所测试的品系的跨地点最佳线性无偏预测(blup)。
关于植物萌发，此计数是通过在播种后大约12天，在所有八个地点每块样地中两个1平方米(1m2)象限中对萌发植物的数量进行计数来估计的。两个象限的平均值用于估计每平方米萌发的植物数量，并作为性状变量进行分析。对所有地点的每块样地记录基于对每块样地的平均植物密度的目视估计的植物出苗得分，并且将其作为性状变量进行分析(例如，1＝低＝0-5株植物/m2；5＝中等＝25-30株植物/m2；9＝高＝45-50株植物/m2)。基于每平方米的数量的植物萌发和植物萌发得分在所有八个地点的品系处理之间显著变化。转基因品系的植物萌发的统计学变异显著在所有实验的栽培种表示的范围内。使用在所有地点的每块样地的植物包心期(cabbagestage)(即从六叶期开始)的营养生物质(vegetativebiomass)的1至9分的观察结果预测生长季节早期的植物活力，并将其作为性状变量进行分析。
将开花时间记录为从播种到该块样地中50％的植物具有至少一朵开放的花的天数。对于所有试验中的每块样地均记录了这一点，并将其作为性状变量进行分析。基于50％的植物开花的开花开始(从播种开始的天数)在所有地点的品系处理之间显著变化。地点平均开花时间从99天至110天变化，并且指示该性状在试验地点之间的环境差异。转基因品系的开花时间的统计学变异显著地在所有实验的栽培种表示的范围内。
开花持续时间是开花时间和结束开花时之间的计算差异(表示为天数)。这是针对所有试验每块样地计算的，并且作为性状变量进行分析：开花持续时间＝开花结束日-开花时间(50％)。基于50％的植物开花的开花开始(从播种开始的天数)在所有地点的品系品系之间显著变化。地点平均开花时间从99天至110天变化，反应该性状在试验地点之间的环境差异。在统计学上，转基因品系的开花时间的变异显著地在所有实验的栽培种表示的范围内。基于90％的植物没有花的开花结束(从播种开始的天数)在所有八个地点的品系之间显著变化。地点平均开花结束时间为128天至139天，反映该性状在实验地点之间的环境差异。统计学上，转基因品系的开花结束的变异显著地在所有地点的栽培种表示的范围内。
基于每平方米植物的收获时的植物在所有八个地点的品系之间显著变化。统计学上，转基因品系的收获时间时的植物数量的变异显著地在所有种植和位置的栽培种表示的范围内。萌发时的植物数量与收获时记录的植物数量显著相关。一些计算的存活百分比超过100％，这反映了两种栽培种(atrwahoo和avjade)的缓慢幼苗萌发：不是所有萌发的幼苗在植物萌发计数时都被记录。
在干燥种子成熟阶段的株高是从样地中心的基部到生长尖端测量的。使用样地中心以避免与地间空间区域可能相关的混杂的效应(边缘效应)。记录所有试验中每个样地的性状，并作为性状变量进行分析。成熟时的株高(cm)在所有地点的品系处理之间显著变化。地点平均株高从63cm到105cm变化，并且指示该性状在试验地点之间的环境差异。统计学上，转基因品系的成熟株高的变异显著地在所有实验的栽培种表示的范围内。
使用在两周时间段内记录的每1/8平方米的落籽计数分析成熟时的落籽(有时称为落荚)。这是通过在所有位置的每块样地的播种行之间在冠层下面放置两个托盘来进行的，并作为性状变量进行分析。落籽得分(基于1(零)至9级(高：+40)级)也在每个地点基于邻收获前在地面上观察到的种子数量记录并将其作为性状变量进行分析。基于收获时地面上的种子数量的落籽在八个地点中的四个的品系处理之间显著变化。地点平均落籽数从3到15(每1/8平方米)变化，并且指示所有地点的落籽的低水平。一个地点的落籽得分在品系之间也显著变化，并且与跨地点平均落籽计数密切相关。这表明将落籽记录为得分是落籽的良好预测物。统计学上，基于种子计数的落籽和转基因品系的得分的变异显著地在有所有实验的栽培种表示的范围内。
基于成熟时从植物基部倾斜的植物角度进行评分，将抗倒伏性记录为1(抗性)至9(易感的)。植物倒伏没有统计学上的显著变异。缺乏这种性状的变异可能与豆荚灌浆后期低于平均的降雨量有关。
五个地点中，代表斑点小球腔菌和油菜黑胫病菌(leptosphaeriabiglobosa)的黑胫病严重程度症状记录为1(低<5％)至9(高>40％)得分。由于缺乏可观察的变异，并非所有样地都被评分。没有观察到与溃疡和断茎相关的症状。黑胫病叶片症状在所有八个地点都被观察到处于非常低水平。一个地点使用裸种子(未经杀真菌剂处理的种子)播种。在该地点与用种子杀真菌剂处理的其他地点之间测试的品系中，植物萌发没有相对差异。叶片症状并不总是预测由斑点小球腔菌引起的茎溃疡的程度(澳大利亚产量损失的主要原因和抗性评级基础，参见sosnowski等人,33australianplantpathol.401(2004))。几项研究已经基于子叶、叶、茎(溃疡病)上的病原体感染和田间条件下的植物存活来评估黑胫病抗性。由于缺少溃疡和断茎，油菜品系可以被认为出于本文描述的目的对存在的疾病压力具有抗性。
植物收获计数通过在所有八个地点的每个样地的两个一平方米的象限中对植物进行计数来估算。然后使用两个象限的平均值来估算每平方米的植物数量，并将其作为性状变量进行分析。通过将植物计数的地点平均值表示为植物萌发计数的地点平均值的％来计算植物存活率(％)：植物存活率％＝(植物收获计数×100)/植物萌发计数。
当种子在生理上成熟时收获籽粒，并使用样地收割机干燥(～7％)。对于每次试验，保持收获方向一致(即，每行的前后范围)以避免收获方向错误。确定每个样地的干籽粒重量并基于样地面积转化为t/ha的单位，并作为性状变量分析。
收获时和在实验室样品中的籽粒水分被记录并作为性状变量分析。使用手持式水分计在田间收获时直接分析大量样品。还使用基于澳大利亚油籽联合(aof)方法4-1.5的烘箱干燥方法测定水分百分比。该方法包括将在敞口罐中的5克样品在130℃用烘箱干燥持续1小时。将样品在干燥器中冷却40分钟并称重，并将水分百分比确定为质量损失百分比。收获时的籽粒水分(％)在所有八个地点的品系处理之间显著变化。收获时的地点平均籽粒水分从9％至12％变化，这表明种子在相似的籽粒阶段收获。统计学上，对于转基因的品系，收获时籽粒水分的变异显著地在所有实验的栽培种表示的范围内。收获时的籽粒水分％也与开花时间相关，这样晚期开花品系(即atrwahoo和monola515tt)的种子在所有地点在收获时间具有显著更高的籽粒水分％。实验室种子水分在所有地点的品系之间显著变化。但是，品系和跨位点之间的差异非常低，并且平均约7％。这表明不存在种子储存的混淆效应。实验室中，转基因品系的种子水分的变异显著地在非转基因品系表示的范围内(p<0.05)。
使用自旋锁核磁共振(nmr)光谱法对调节至6％水分的种子分析种子油含量(％)。简而言之，将5克至10克种子的样品称重到nmr管中并通过nmr光谱仪分析。通过使用已知油含量百分比的20个参考样品初始创建的软件校准来确定种子油结果，如通过所提取的油的重量确定的。种子油含量在所有八个地点的品系之间显著变化(p<0.05)。地点平均种子油％从37.0％到41.5％变化，通常低于种植地点的平均值，并且可能是在籽粒灌浆期间经历的低于平均值的降雨量和高于平均温度的结果。相对品系差异在各个地点非常一致。所有地点的转基因品系的种子油含量的变异与非转基因品系相比略低——平均约2％，这可能提供遗传改进的靶。较低的油含量可能在遗传学上不和转基因事件连锁，但可能是转化较低油含量栽培种即avjade的结果。
与非转基因栽培种的农艺性状相比的事件ns-b50027-4的农艺性状的表征的总结在表4中示出(分析型reml；对于所有性状，fpr<0.001sig)。
脂肪酸使用溶剂萃取、然后同时进行皂化和甲基化并通过gc-fid分析来确定。简而言之，这涉及压碎种子样品，并将油从压碎的种子子样品中提取到溶剂中。溶剂在氮气下蒸发掉，并将油子样品在新溶剂中稀释。将等分试样与methprepii(皂化/甲基化试剂)反应。将样品在40℃加热以加速反应，并且然后注射到使用bpx-70柱的gc-fid上，用于脂肪酸确定。脂肪酸被计算为油的组成％，其中每个脂肪酸峰的面积被确定为色谱图中所有脂肪酸峰的总和的百分比。这些估计值作为性状变量单独分析。评估以下的特定脂肪酸％：棕榈酸；硬脂酸；油酸和顺式异油酸(cis-vaccenic)；亚油酸；α亚麻酸(ala)；花生四烯酸(也称为二十烷酸)和十八碳四烯酸(sda)；二十碳烯酸、二十碳-11-烯酸和二十碳-9-烯酸；芥酸和二十碳四烯酸(eta)；二十碳五烯酸(epa)；二十二碳五烯酸(dpa)；和二十二碳六烯酸(dha)。表5显示了种子脂肪酸含量的跨地点分析(所有值为百分比；分析型reml；对于所有性状，fpr<0.001sig)：
如通过gc-fid分析的种子中作为硬脂酸存在的脂肪酸的百分比在所有八个地点的品系之间显著变化。地点平均％硬脂酸显示出非常小的变异，并且范围从1.6％至2.2％。统计学上，对于转基因品系的％硬脂酸的变异显著地在所有地点的非转基因品系表示的范围内。
如通过gc-fid分析的种子中作为油酸和顺式-异油酸的脂肪酸％在所有八个地点的品系之间显著变化。地点平均％油酸和顺式-异油酸从51％至58％变化。统计学上，对于转基因品系的％油酸和顺式-异油酸的变异显著地低于由所有地点的非转基因品系表示的范围。该结果与转基因插入片段有关，并且不影响商业农艺性状或籽粒生产。
如使用gc-fid分析的种子中作为亚油酸存在的脂肪酸％在所有八个地点的品系之间显著变化。每个地点的平均％亚油酸范围为从13.4％至14.7％。来源于一个t2事件(植物b0050-027-18)的转基因姐妹品系(sibline)的亚油酸％的变异显著地(p<0.05)低于所有地点的栽培种和来源于其他事件姐妹株来源的姐妹株表示的范围。亚油酸％的显著差异可能与转基因的表达相关。亚油酸％的减少可能与转基因插入片段相关，但不影响农艺性状或商业规模的籽粒生产。
作为ala、花生酸和sda存在的的脂肪酸％在所有八个地点的品系之间显著变化。ala、花生酸和sda％的地点平均值在从5％至11％之间变化。转基因品系的ala、花生酸和sda％的变异显著地(p<0.05)高于全部实验的非转基因栽培种表示的变异。在某些地点观察到的这种性状的显著差异与转基因的表达相关。该结果与转基因插入片段相关，并且不影响商业农艺性状或籽粒生产。由于fad基因中的snp，与其他栽培种相比，特种高油酸栽培种(monola515tt)产生显著(p<0.05)较低的ala％。
作为二十碳烯酸、二十碳-11-烯酸和二十碳-9-烯酸存在的脂肪酸的％在所有八个地点的品系之间显著变化。二十碳烯酸、二十碳-11-烯酸和二十碳-9-烯酸％的地点平均值的范围从2.0％至2.5％。转基因品系的二十碳烯酸、二十碳-11-烯酸和二十碳-9-烯酸％的变异显著地(p<0.05)高于所有实验的非转基因栽培种表示的变异。该结果与转基因插入片段相关，并且不影响商业农艺性状或籽粒生产。
作为芥酸和eta存在的脂肪酸的％在五个地点记录，并且变化通常接近0％。与转基因插入片段相关的结果不在商业上影响农艺性状或籽粒生产。
种子lc-ω3多不饱和脂肪酸(lc-pufa)，特别是epa、dpa和dha被计算为每个样地样品的百分比，并作为性状变异分析，其中lc-pufa＝epa％+dpa％+dha％。针对每个样地计算预测的dha，以kg/ha为单位，并将其作为性状变量进行分析：dhakg/ha＝(油％x0.01)x(dha％x0.01)x籽粒产量(t/ha)x1000。对于每块样地计算预测的lc-pufa，单位为kg/ha，并将其作为性状变量分析：dhakg/ha＝(油％x0.01)x(lc-pufa％x0.01)x籽粒产量(t/ha)x1000。
作为epa的脂肪酸的％在所有八个地点的品系中显著地(p<0.05)变化。转基因品系的％的变异显著地(p<0.05)高于非转基因栽培种表示的变异。与转基因插入片段相关的这一结果不影响农艺性状或籽粒生产，但确实使籽粒更有价值。
作为dpa的脂肪酸的％在所有地点的品系之间显著地(p<0.05)变化。转基因品系的％的变异显著地(p<0.05)高于所有地点的非转基因栽培种表示的变异。该结果与转基因插入片段相关，并且将不在商业上影响农艺性状或籽粒生产。
作为dha的脂肪酸的％在所有八个地点的品系之间显著变化。转基因品系的％的变异显著地(p<0.05)高于所有地点的非转基因栽培种表示的变异。该结果与转基因插入片段相关，并且不影响商业农艺性状或籽粒生产。转基因姐妹品系之间的方差用作选择的基础。跨地点的dha百分比和将优良种事件ns-b50027-4与非转基因栽培种进行比较(如通过gc-fid确定的)在表6中示出(分析型reml；对于所有地点，fpr<0.001sig)。
基于脂肪酸谱、种子油％和籽粒产量计算的表示为kg/ha的预测的dha在所有地点的品系之间显著变化(p<0.05)。转基因品系的％的变异显著地(p<0.05)高于所有位置的非转基因品系表示的变异。该结果与转基因插入片段相关，并且除了使籽粒更有价值外，不影响商业的农艺性状或籽粒生产。转基因姐妹品系之间的方差用作选择的基础。在每面积的产量(kg/ha)单位方面dha的稳定性高，这是因为种子油和种子中产生的dha％的跨地点变异低。跨地点的dha的预测的产量(kg/ha)以及将优良种事件ns-b50027-4与非转基因栽培种的比较在表7中示出(分析型reml；对于所有地点，fpr<0.001sig)：
关于种子lc-pufaω3——epa、dpa和dha百分比——在所有八个地点的品系中lc-pufa百分比显著变化(p<0.05)。对于转基因品系的％的变异显著地(p<0.05)高于所有试验的栽培种表示的变异。该结果与转基因插入片段相关，并且除了增加籽粒的价值外，不影响农艺性状或商业的籽粒生产。转基因姐妹品系之间的变异用作选择的基础。在非转基因品系中观察到的痕量水平的lc-pufa可能与花粉流动、种子移动或gc-fid误差相关。
表8示出了通过gc-fid测定的百分比值(分析型reml；对于所有地点，fpr<0.001sig)
基于脂肪酸谱、种子油％和籽粒产量计算的表示为kg/ha的预测的lc-pufa，在所有地点的不同处理品系之间显著变化。统计学上，转基因品系的％的变异显著高于所有实验的栽培种表示的变异。该结果与转基因插入片段相关，并且不在商业上影响农艺性状和子粒产量。转基因姐妹品系之间的方差用作选择的基础。栽培种种子中的痕量水平可能与花粉流动、种子移动或gc-fid误差有关。由于种子油和种子中产生的％dha的低的跨地点变异，在每面积产量的单位(kg/ha)方面，lc-pufa具有高稳定性。表9示出了预测的kg/halc-pufa值(在所有地点fpr<0.001)。
对于每个栽培地点，将使用nmr确定的种子油含量制表并且在表10中显示(单位为百分比；分析型reml；对于所有地点，fpr<0.001sig)：
ns-b50027-4种子的脂肪酸含量的另外的分析在表11中显示：
表11中的数据证实，ns-b50027-4的种子除了lc-ω3脂肪酸外，还含有比常规油菜品种实质上更多的ala。也可参见表5。尽管ala不是lc-pufa，但它是ω3脂肪酸。表11中ns-b50027-4种子油中ω3/ω6脂肪酸的比率为约3.59至约6.12；常规菜子油中ω3/ω6脂肪酸的比率为约0.5。patterson等人，j.nutr.metab.(2012)。
表12显示了关于来自在澳大利亚实验培养中生长的16代优良种事件ns-b50027-4的种子中dha和lc-pufa百分比的数据。在澳大利亚进行的另外的田间试验生成了具有9.6％dha和10.1％lc-pufa的大量种子：
此外，在2016年在两个不同地点的受控实验条件下测试了ns-b50027-4在加拿大生长的能力。表13显示了将ns-b50027-4与几种非转基因油菜品系比较的农艺性状和产量数据：
因为油菜品系ns-b50027-4基本上是均一的，所以其可以通过种植这种品系的种子、在充分分离情况下自花授粉或近缘授粉条件下使所得油菜植物生长来繁殖，并使用常规农艺方法收获所得的种子。
实施例2.竞争性等位基因特异性pcr(kasp)检测
转基因在油菜中的表型表达由转基因盒本身的结构及其在植物基因组中的插入位置二者决定：转基因在植物基因组的特定位置的存在可能影响转基因的表达和整体表型。在植物基因组中掺入重组dna分子通常是由细胞或组织的转化(或由另一种遗传操作)引起的。掺入的特定位点可能是随机的或预定的(如果使用了靶向整合方法)。通过遗传操作将商业上感兴趣的性状的农艺上或工业上成功的引入可以是依赖于不同因素的漫长过程。遗传转化的植物的实际转化和再生只是包括广泛的遗传表征、育种和田间试验评估，最终导致选择优良种事件的一系列选择步骤中的第一步。
ns-b50027-4是按照广泛选择育种和田间试验开发的品系，并且提供了产生至少约7％-15％dha的油菜栽培种。遗传分析表明，ns-b50027-4在染色体a02上具有转基因插入片段，并且在染色体a05上具有另一个转基因插入片段。a05上的插入片段包含头对头对齐(rb-lb:lb-rb)的两个完整的以t-dna为边界的八个基因的盒(micpu-δ6d、pyrco-δ5e、pavsa-δ5d、picpa-ω3d、pavsa-δ4d、lack1-δ12d、pyrco-δ6e和pat标记)。染色体a02上的插入片段包含一组四个基因micpu-δ6d、pyrco-δ5e、pavsa-δ5d和picpa-ω3d。令人惊讶的是，分离杂交显示染色体a02和染色体a05二者上的插入片段都是达到约11％的dha产量所需要的。
将来自dha油菜基因渗入育种的8个不同的bc和f2群体的约1200个子代用于基于woodland的nuseedmolecularlab开发的lgcoctopuresop的dna提取。简而言之，将直径为0.25英寸的两个冻干叶圆片在300μl的dna提取缓冲液(100mmtris-hcl，ph8.0；25mmedta，ph8.0；0.5％sds，1.5mnacl)中，使用genogrinder以1,400rpm研磨5分钟。在55℃水浴中孵育45分钟并以4,500rpm离心30分钟后，将50μl的上清液转移到100μl的具有磁性sbeadex珠的lgc结合缓冲液中。结合并洗涤后，将dna洗脱至80μl的lgcdna洗脱缓冲液中。
dna浓度用nanodrop8000(thermoscientific)测量并且在5.0ng/μl-20.0ng/μl的范围内，平均为10.0ng/μl。将dna样品稀释1倍。对于每个反应，将2.0μl(～5.0ng/μl)基因组dna样品和2μl具有引物的主混合物分配至384孔板用于kasp基因分型。
除了来自dha油菜基因渗入群体的子代，将八个对照包括在基因分型中。这些包括两个非gmo对照(dwarf和avjade)、两个半合子对照(2.5ngavjade或2.5ngdwarf+2.5ngb0050-027-18-20-12-19)；两个事件阳性对照(b0050-027-18-20-12-19)和四个非模板对照(ntc)。阳性对照(t5植物b0050-027-18-20-12-19)之前被用于通过测序表征dha油菜事件。
开发了kasp测定以提供简单、经济、高通量和灵活的方法来检测和监测8种转基因和4种ns-b50027-4特异性连接，并进一步促进育种程序中的ns-b50027-4基因渗入。根据具有修改的制造商(lgcltd.，middlesex，uk)的标准方案进行kasptm基因分型化学、测定设计、基因分型和评分。
序列信息被上传到lgckrakenworkflowmanager，并且使用它的测定设计程序primerpicker设计kasp测定。典型的kasp测定包括两个等位基因特异性引物(用于转基因等位基因的引物_等位基因x和用于非转基因、野生型等位基因的引物_等位基因y)和一种共同基因座特异性引物(引物_共同)。引物_等位基因x与荧光fam缔合，并且引物_等位基因y与荧光hex缔合。
靶向连接的大多数测定是这种类型的三引物测定(表14)。为了检测dha油菜，除了上文提及的常规三引物测定之外，还开发了四引物测定。四引物测定在反应中具有转基因等位基因特异性的引物_等位基因x、野生型等位基因特异性的引物_等位基因y、ω3基因特异性的引物_共同和野生型特异性的引物_共同2。为了检测ω3盒中的8个基因，在每个测定中仅使用两个引物，引物_等位基因x和引物_共同(双引物测定)；两种引物均为ω3基因特异性的(表14)：
kasp基因分型系统需要两个组分：测定混合物和主混合物。测定混合物是所需的引物的混合物，并且主混合物包含所有其他所需组分，包括pcr缓冲液、通用荧光报告系统和taq聚合酶。
kasp反应以4.0μl的体积进行，包括2.0μl(10.0ng)的基因组dna、2.0μl的2xkasp主混合物和0.06μl的测定(引物)混合物。对于双引物测定，测定(引物)混合物是12μm的等位基因特异性的引物_等位基因x和12μm的引物_共同的组合，对于三引物测定，测定(引物)混合物是12μm的等位基因特异性的引物_等位基因x、12μm的等位基因特异性的引物_等位基因y、和30μm的引物_共同的组合，并且对于四引物测定，测定(引物)混合物是12μm的等位基因特异性的引物_等位基因x、12μm的等位基因特异性的引物_等位基因y、12μm的引物_共同和12μm引物_共同2的组合。
反应在lgchydrocycler16中的384孔板中按照以下循环参数进行：94℃15分钟的1个循环，然后94℃30秒和64℃-57℃(每个循环降低1.0℃)60秒的8个循环，并且然后是94℃30秒和57℃60秒的30个循环。如果尚未获得清晰的基因分型簇，则通过94℃30秒和57℃60秒的三个额外循环将板进一步热循环。
在完成kasp反应后，转基因等位基因通过引物_等位基因x用fam标记，并且非转基因野生型等位基因通过引物_等位基因y用hex标记。荧光信号在pherastar酶标仪中读取，激发波长为485nm，并且fam的发射波长为520nm且hex的发射波长为535nm/556nm。使用lgckraken数据库分析数据。
开发基因特异性的显性(nbn01-nbn08；一个测定/基因)用于检测构建体盒中的8种基因。开发靶向a02上的插入片段的上游连接(nbn57、nbn68、nbn58、nbn85和nbn14)和下游连接(nbn16、nbn62和nbn64)以及靶向a05上的插入片段的上游连接(nbn52、nbn51、nbn09、nbn50、nbn48和nbn10)和下游连接(nbn83、nbn82、nbn84、nbn66、nbn41和nbn43)的插入片段特异性、共显性kasp测定，并用来自ns-b50027-4基因渗入群体的1200个子代验证(表14)。超过10,000个样品已经使用这些标记物进行基因分型。
开发并验证了30个竞争等位基因特异性pcr(kasp)测定，所述测定针对dha油菜事件ns-b50027-4的两个插入片段的8个基因和4个连接。这些测定提供了简单、经济、高通量和灵活的用于在育种计划中检测和监测ns-b50027-4的方法。
实施例3.ns-b50027-4和非转基因油菜的详细比较
将来自2014年至2016年实验田地块中油菜种子产量的数据制成表格。dha和总epa+dpa+dha的范围基于几个实验田的观察结果。ns-b50027-4和非转基因“对照”油菜二者中主要脂肪酸的含量可以根据生长条件而变化几个百分点。在下表15中，“0.0”可以指被鉴定为低于准确确定组分的量所需要的量的痕量：
将从ns-b50027-4的实验培养中收获的种子压碎并通过冷压获得油。将从亲本等基因系avjade收获的种子进行类似处理，每种油的含量如表16所示地比较：
根据布达佩斯条约，申请人已将油菜ns-b50027-4的至少2500个种子保藏在位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学楼10801，20110-2209的美国典型培养物保藏中心
尽管出于清楚和理解的目的通过说明和实施例详细描述了前述实施方案，但本领域技术人员将清楚某些变化和修饰，诸如单基因修饰和突变、体细胞克隆变体、选自本发明近交品系的植物的大群体的变体个体等可以在本发明的范围内实施，本发明的范围仅由所附权利要求限定。
序列表
<110>纽希得私人有限公司
<120>优良种事件油菜ns-b50027-4
<130>87376.0002
<150>62/351,246
<151>2016-06-16
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<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>27
gtcgtttcccgccttcagttt21
<210>28
<211>46
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>28
gaaggtgaccaagttcatgctaaactatcagtgtttgaacacctcc46
<210>29
<211>44
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>29
gaaggtcggagtcaacggattacaacttgtcgtgctacacacct44
<210>30
<211>22
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>30
ggttgtgtgaaaacgtgtgagc22
<210>31
<211>51
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>31
gaaggtgaccaagttcatgctcttttagctaaataagaggttctgtatact51
<210>32
<211>51
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>32
gaaggtcggagtcaacggattcttttagctaaataagaggttctgtataca51
<210>33
<211>19
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>33
gattgtgattccgggcagt19
<210>34
<211>21
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>34
gtgtgaaaacgtgtgagcaat21
<210>35
<211>40
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>35
gaaggtgaccaagttcatgctttgtgattccgggcagtag40
<210>36
<211>41
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>36
gaaggtcggagtcaacggatttgtgagcaattgttggaggt41
<210>37
<211>31
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>kasp引物
<400>37
tcttatcaacattaagaacataatcttttag31
<210>38
<211>15
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>芸薹属（brassica）染色体a02上的插入缺失
<400>38
gtagcacgacaagtt15
<210>39
<211>20
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>插入缺失芸薹属染色体a05
<400>39
cacggtggaggtcaccatgt20
<210>40
<211>15004
<212>dna
<213>人工序列（artificialsequence）
<220>
<223>转基因插入片段和芸薹属侧翼区
<400>40
gagccttgagtgctactttgggaacaaaaacttggtttgatgctatcctagtctttttct60
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tttttcgacctgatgggtttcttaaagaagttaacggggattttcgggttcgggcacaac600
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gaccacctctcaacttcctgctgctgtccctgctgctggatgtcctgcctcatctggccg11880
attgcacgctccagtcccctgcatgtgcactcgctcctcaattgcttaagatcatcgcag11940
cagctatcgaagtgctggctctgttgccctcctccacggccttggttgtagtagtagctg12000
ccgccgcccttctggactttttcccacaggaaccgccgaataattcgatagaaccacacg12060
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ctggtaacttggtgcttctctttgaattcctcggcggtgtaaggaacgaaaaccatatct13020
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<213>人工序列（artificialsequence）
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