用于治疗中枢神经系统疾病和病症的组合物和方法与流程

美国联邦政府赞助的发明的陈述

引导至本发明的工作得到了欧盟第七框架协议计划(fp7/2007-2013)和意大利卫生部的资助，分别在研究基金协议n°[[617162]]与研究基金n°gr-2011-02347261的资助下。

背景技术：

大多数中枢神经系统(cns)受累的贮积症(sd)，即神经贮积症(neurosd)，缺乏有效的与治愈性的治疗，患者最终无法战胜自身的毁灭性的疾病。通常，该疾病发作发生于婴儿期之非常早期，其特征为不明显(subtle)的临床表征，导致症状明显时才会确诊，如果不是晚期的话。neurosd另一特征为快速的早期疾病进程，特别是在早发型患者中。由于这些原因，在临床前期的神经贮积症儿童中已经被应用并取得一定程度成功的治疗手段，包括例如造血细胞移植(hct)用于治疗克拉伯病和肾上腺脑白质营养不良症，或造血干细胞(hsc)基因疗法(hscgt)用于治疗异染性脑白质营养不良症(mld)，对大多数神经贮积症患者并无益处，而其益处几乎完全与应用于临床前期或症状早期患者的治疗程序相关。这些基于hsc的手段未能改善快速进行性的sd脑疾病的关键原因之一是，与原发性神经疾病的快速进程相比，以移植的造血细胞后代去替换驻留的cns组织的巨噬细胞/组织细胞和小胶质细胞的速度缓慢。实际上，虽然hct后的以供体来源的细胞对内脏器官巨噬细胞的快速重建已经被清楚地展示，但以供体细胞对脑实质的更加有限的和缓慢的渗透应该是会发生的。因此，非常需要旨在增强和更快地呈现这种现象的策略。这些策略也有潜力与成年期的一些后天的神经退化性病况具有治疗相关性，这可能受益于通过移植的造血干细胞与祖细胞(hspc)后代的跨越血脑屏障的治疗性分子输送和/或调节已被激活的小胶质细胞的表型，该被激活之表型为大多数这些病况的特征。这些病症，包括例如，肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默症(ad)和帕金森症(pd)，与neurolsd共享几种常见的疾病/致病机制，例如神经炎症反应和小胶质细胞的积极角色。因此，迫切地需要新的组合物和治疗方法。

技术实现要素：

如下所述，本发明的特征为用于治疗或预防中枢神经系统的神经疾病或病症(例如，神经退化性贮积病症，后天的神经退化性疾病，等)的组合物和方法，其手段为用供体来源的细胞或工程化的细胞建立cns髓样细胞/小胶质细胞嵌合体，该嵌合体能够通过不同机制有助于疾病改善，例如蛋白质递送或局部炎症的调节或其他。

本发明提供以下一种或多种的组合物和方法：(i)用于上述病况的治疗目的，于cns中有效率地植入具有或将获得小胶质细胞特征的细胞，包括富含小胶质细胞重建潜力的细胞，及小胶质细胞祖细胞；(ii)用于上述病况的治疗目的，于cns中选择性地和专门地植入具有或将获得小胶质细胞特征的转基因细胞，包括富含小胶质细胞重建潜力的细胞，及小胶质细胞祖细胞；和(iii)以cns选择性的方法(这些方法可包括靶向小胶质细胞和/或小胶质细胞祖细胞的纳米颗粒)，在脑中消融驻留的髓样细胞群，例如具有增殖能力的细胞。该研究方法可用于实现成功的、及时的，并在只有涉及cns的情况下，移植细胞在脑中的选择性cns植入和髓样/小胶质细胞特征的获得，用于治疗性分子的递送和/或在细胞库部分更新时对髓样/小胶质细胞特征进行调节。

于一个方面中，本发明提供一种给受试者递送造血干细胞(hsc)的方法，该方法涉及与消融处理相结合的以脑室内注射(icv)给予hsc。另一方面，本发明提供一种经分离的、已被表达治疗性多肽或多核苷酸的载体所转化的hsc，其中hsc有如下表型：cd34⁺,cd38^-,和fgd5⁺(例如,cd34⁺,cd38^-；cd34⁺,cd38^-,和fgd5⁺)的一种或多种。

另一方面，本发明提供一种经分离的、已被表达治疗性多肽或多核苷酸的载体所转化的造血干细胞(hsc)，其中hsc有kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺,cx3cr1^-,和cd11b^-(例如,kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,cx3cr1^-；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺,cx3cr1^-；和kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺,cx3cr1^-,和cd11b^-)的一种或多种。

另一方面，本发明提供一种治疗患有溶酶体贮积症或神经退化性疾病，或上述病症发病风险增高的受试者的方法，该方法涉及给予有一种或多种的如下表型的造血干细胞(hsc)：cd34⁺,cd38^-,和fgd5⁺(例如,cd34⁺,cd38^-；cd34⁺,cd38^-,和fgd5⁺)，其中hsc以静脉注射(iv)或以脑室内注射(icv)给予，并结合消融处理。

另一方面，本发明提供一种治疗患有溶酶体贮积症或神经退化性疾病，或有溶酶体贮积症或神经退化性疾病风险的受试者的方法，该方法涉及给予造血干细胞(hsc)kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺,cx3cr1^-,和cd11b^-(例如,kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,cx3cr1^-；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺,cx3cr1^-；和kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺,cx3cr1^-,和cd11b^-)的一种或多种,其中hsc以静脉注射(iv)或以脑室内注射(icv)给予，并结合消融处理。

另一方面，本发明提供了一种在受试者体内消融内源性小胶质细胞并以hsc植入重建小胶质细胞的方法，该方法涉及给予受试者含有细胞毒性剂的纳米颗粒。纳米颗粒可以通过与其表面共价结合而与一种或多种捕获分子结合，其中的捕获分子特异性地结合小胶质细胞或其祖细胞上表达的一种或多种标记物；而hsc以iv或icv给予受试者。

另一方面，本发明提供一种在受试者体内治疗溶酶体贮积症的方法，该方法涉及给予受试者含有细胞毒性剂的纳米颗粒，而一种或多种捕获分子以共价键连接在纳米颗粒的表面，其中的捕获分子特异性地结合小胶质细胞或其祖细胞上表达的一种或多种标记物；而造血干细胞(hsc)以iv或icv给予受试者，其中的hsc表达一种治疗性多肽。

另一方面，本发明提供一种在受试者体内治疗神经退化性疾病的方法，该方法涉及给予受试者含有细胞毒性剂以及一种或多种捕获分子以共价键连接在该纳米颗粒的表面的纳米颗粒，其中该捕获分子特异性地结合小胶质细胞或其祖细胞上表达的一种或多种标记物；而造血干细胞(hsc)以静脉注射(iv)或以脑室内注射(icv)给予受试者，其中的hsc表达一种治疗性多肽或多核苷酸。

另一方面，本发明提供一种在受试者脑中产生小胶质细胞嵌合体的方法，该方法与cns外的造血组织的嵌合体无关，该方法涉及在白消安骨髓消融0至5天后以icv移植hspc和以iv移植总骨髓细胞。

另一方面，本发明提供一种在受试者的脑中与其cns外的组织中短期内产生持续性的混合造血细胞嵌合体的方法，该方法涉及在白消安骨髓消融后以icv和iv移植外源性细胞。

另一方面，本发明提供一种在工程化的小胶质细胞内实现外源性基因的可调控型表达的方法，该方法包括以载体对小胶质细胞祖细胞的造血细胞等同物进行传导，该载体编码的目标基因在tspo启动子控制之下。

另一方面，本发明提供一种通过检测γh2ax信号而鉴定脑驻留小胶质细胞祖细胞之功能的方法，其中检测到γh2ax信号表明脑驻留小胶质细胞祖细胞的存在。

另一方面，本发明提供一种试剂盒，其包含根据本文描述的任何方面的如权利要求所述的经分离的造血干细胞(hsc)或纳米颗粒。

另一方面，本发明提供一种能靶向小胶质细胞或其祖细胞的纳米颗粒。

另一方面，本发明提供一种向受试者递送纳米颗粒的方法，该方法涉及以脑室内注射(icv)给予受试者纳米颗粒。

另一方面，本发明提供一种在受试者体内消融小胶质细胞或其祖细胞的方法，该方法涉及给予受试者含有细胞毒性剂的纳米颗粒，而一种或多种捕获分子以共价键连接在纳米颗粒的表面，其中的捕获分子特异性地结合小胶质细胞或其祖细胞上表达的一种或多种标记物。

在本文描述的任何方面的各种具体例中，造血干细胞(hsc)(例如人类的)有cd34⁺,cd38^-,和fgd5⁺(例如,cd34⁺,cd38^-；cd34⁺,cd38^-,和fgd5⁺)。在本文描述的任何方面的各种具体例中，造血干细胞(hsc)(例如鼠的)有一种或多种的如下表型：kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺,cx3cr1^-,和cd11b^-(例如,kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,cx3cr1^-；kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺,cx3cr1^-；和kit⁺,lin^-,sca1⁺,cd150⁺,cd48^-,fdg5⁺,cx3cr1^-,和cd11b^-)的一种或多种。在某些具体例中，人类造血干细胞(hsc)是fgd5⁺。在本文描述的任何方面的各种具体例中，造血干细胞(hsc)是在移植时小胶质细胞祖细胞的功能等同物。在本文描述的任何方面的各种具体例中，hsc能够分化成为小胶质细胞。在本文描述的任何方面的各种具体例中，hsc能够重建被消融的小胶质细胞。

在本文描述的任何方面的各种具体例中，受试者患有一种溶酶体贮积症或有发展溶酶体贮积症的风险。在各种具体例中，该溶酶体贮积症选自下列组成的组：肾上腺脑白质营养不良、激活蛋白缺乏/gm2神经节苷脂贮积症、α-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、胆固醇酯贮积症、慢性已糖胺酶a缺乏症、胱氨酸贮积症、danon氏症(溶酶体相关膜蛋白-2/lamp-2异常而导致的一种溶酶体贮积症)、法布瑞氏症(酰基鞘氨醇己三糖苷贮积症)、farber氏症(酸性神经酰胺酶异常而导致的溶酶体贮积症)、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病(葡萄糖脑苷脂贮积症)、脑白质球状细胞营养障碍、gm1神经节苷脂贮积症、i型细胞病/粘脂贮积症ⅱ型、婴儿型游离唾液酸贮积症/issd、少年型已糖胺酶a缺乏症、婴儿型神经元蜡样脂褐质贮积症、克拉伯病、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良症、粘多糖贮积症、多发性硫酸酯酶缺乏症、尼曼-匹克病、神经元蜡样脂褐质贮积症、庞贝氏症/糖原贮积症ⅱ型、致密性成骨不全症、sandhoff氏症(急性婴儿型gm2神经节苷脂贮积症)、schindler氏症(α-n-乙酰氨基半乳糖苷酶缺陷)、salla氏症/唾液酸贮积症、tay-sachs氏症/(婴儿型)gm2神经节苷脂贮积症以及andwolman氏症(婴儿型溶酶体酸性脂肪酶缺乏症)。在本文描述的任何方面的各种具体例中，溶酶体酶选自下列组成的组：α-葡萄糖苷酶、葡萄糖脑苷酯酶、β-半乳糖苷酶、β-已糖胺酶a、β-已糖胺酶b、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、β-半乳糖脑苷脂酶、酸性神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶a、α-l-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖-2-硫酸酯酶、乙酰肝素n-硫酸酯酶、α-n-乙酰葡萄糖胺糖苷酶、乙酰-辅酶a:α-氨基葡萄糖苷n-乙酰基转移酶、n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶、酸性β-半乳糖苷酶、芳基硫酸酯酶b、β-葡萄糖醛酸苷酶、酸性α-甘露糖苷酶、酸性β-甘露糖苷酶、酸性α-l-岩藻糖苷酶、唾液酸酶、α-n-乙酰半乳糖胺酶、以及棕榈酰蛋白-硫酯酶-1。

在本文描述的任何方面的各种具体例中，受试者患有一种神经退化性疾病或有发展经退化性疾病的风险。在各种具体例中，该神经退化性疾病选自下列组成的组：肌萎缩侧索硬化症(als)、阿尔茨海默症(ad)和帕金森症(pd)。

在本文描述的任何方面的各种具体例中，治疗性多肽或多核苷酸为一种溶酶体酶、abcd蛋白、抑制性核酸或shrna，该核酸或shrna靶向一种或多种如下基因：mir155和nox2(例如als)、trem2、apoe，以及ɑ-apps(例如阿尔茨海默症)。

在本文描述的任何方面的各种具体例中，hsc在给予受试者时结合消融处理。在各种具体例中，消融处理包括给予受试者一种细胞毒性剂。在各种具体例中，烷化剂为白消安、依托泊苷与洛莫司汀的一种或多种。在各种具体例中，消融处理先于给予hsc执行。

在本文描述的任何方面的各种具体例中，多肽或多核苷酸的表达是由tspo启动子所启动。在本文描述的任何方面的各种具体例中，多肽或多核苷酸表达自插入tspo基因座的一段多核苷酸。

在本文描述的任何方面的各种具体例中，纳米颗粒进一步包含一种细胞毒性剂。在各种具体例中，递送至小神经胶质细胞或其祖细胞的细胞毒性剂以固定剂量提供。在某些具体例中，烷化剂为一种或多种如下药剂：白消安、依托泊苷与洛莫司汀。在本文描述的任何方面的各种具体例中，纳米颗粒具有一种或多种如下优点：优化的药物承载效率，优化的药物释放和优化的稳定性。在本文描述的任何方面的各种具体例中，纳米颗粒包含一种或多种以共价键连接在纳米颗粒表面的捕获分子，其中的捕获分子特异性地结合小胶质细胞或其祖细胞上表达的一种或多种标记物。在本文描述的任何方面的各种具体例中，纳米颗粒以静脉注射(iv)或脑室内注射(icv)给予受试者。

在本文描述的任何方面的各种具体例中，外源性细胞是在第0天以icv或iv移植的hsc。在本文描述的任何方面的各种具体例中，嵌合体产生于次要的hla(人类白细胞抗原)错配的移植环境中。

在本文描述的任何方面的各种具体例中，病毒性载体是一种慢病毒载体。在本文描述的任何方面的各种具体例中，该方法涉及在小胶质细胞祖细胞的造血细胞等同物中，在tspo基因座靶向添加目标基因。在本文描述的任何方面的各种具体例中，该方法包括给予受试者自体工程化的小胶质细胞祖细胞群体，其中受试者已接受用于选择性小胶质细胞重建的、以icv实施的脑消融。在本文描述的任何方面的各种具体例中，该方法进一步涉及给予未经操作的自体骨髓细胞。在本文描述的任何方面的各种具体例中，该方法进一步涉及检测fdg5之表达以识别脑驻留的小胶质细胞祖细胞。

从本发明的详细说明以及权利要求中，可以明显看到本发明的其他特征和优点。

定义

除非另做界定，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员一般理解的意义。下述参考文献向该领域技术人员提供本发明中所用的多数术语的通常定义：

singleton等人编撰的《微生物学和分子生物学词典(第二版)》(dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology(2nded.1994))；《剑桥科技词典》(thecambridgedictionaryofscienceandtechnology(walkered.,1988))；《遗传性词汇(第五版)》(theglossaryofgenetics,5thed.,r.riegeretal.(eds.),springerverlag(1991))；以及hale和marham编撰的《哈珀柯林斯生物学词典》(theharpercollinsdictionaryofbiology(1991))。本文中，除非另做说明，否则下述术语具有其下方所述的意义。

“剂”意为任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子、或多肽，或其片段。

“改善”意为降低、抑制、衰减、减少、停滞、或稳定化疾病的发展或进展。

术语“抗体”，如本文所用，是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。

“改变”或“变化”意为增加或减少。一个改变可以是低如1％,2％,3％,4％,5％,10％,20％,30％,或40％,50％,60％,或甚至高达70％,75％,80％,90％,or100％。

“生物样品”意为任何组织、细胞、体液，或其他从生物体来源的材料。

“捕获试剂”意为与核酸分子或多肽特异性结合的一种试剂，以选出或分离核酸分子或多肽。

如本文所用，术语“确定”，“评估”，“测定”，“测量”和“检测”是指定量和定性的测定，因此，术语“确定”在本文中可与“测定”和“测量”互换使用，等等。在意图进行定量测定的情况下，会使用短语“确定分析物的数量”，等等。在意图进行定性和/或定量测定的情况下，会使用短语“确定分析物的水平”或“检测分析物”。

“检测”指的是鉴别待检测的分析物的存在、不存在或其数量。

“可检测的标记”意为当与目标分子连接时，通过分光的、光化学的，生物化学的，免疫化学的或化学的手段使得目标分子可被检测到的组合物。例如，有用的标记包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如elisa/酶联免疫吸附剂测定中常用的)、生物素、地高辛或半抗原。

“疾病”意为任何损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的病况或病症。

“有效量”意为改善未经治疗患者的疾病症状的必要用量。用来实践本发明之用于治疗疾病的活性化合物的有效量，依据给药方式、受试者的年龄、体重和一般健康状况而变化。最终，主治医生或兽医将决定适宜的量和(给药的)剂量方案。此量被称为“有效”量。

“fgd5多肽”意为与ncbi登录号np_689749，np_001307205，np_766319或其片段具有约85％或更高的氨基酸序列同一性的蛋白质，并且该蛋白质具有染色质结合或转录调节活性。提供示例性的人类fgd5蛋白的序列如下：

提供示例性的鼠fgd5蛋白的序列如下：

“片段”意为蛋白质或核酸的一部分，且该部分与参考蛋白质或核酸实质上相同。在一些具体例中，该部分保留了本文所述的参考蛋白质或核酸的生物学活性的至少50％、75％或80％，或更优选90％、95％或甚至99％。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指材料和天然状态下通常与其相伴的组分之分离的不同程度。“分离的”表示与原始来源或周围环境的一种分离程度。“纯化”表示高于分离的一种分离程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质充分地不含其他材料，使得任何杂质不会实质地影响蛋白质的生物学特性或造成其他不利后果。也就是说，本发明的核酸或肽，如果以重组dna技法生产而充分地不含细胞材料、病毒材料或培养介质；或，如果以化学合成而充分地不含化学前体或其他化学品，则本发明的核酸或肽即视为纯化的。纯度和同质性通常用分析化学技法确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一条带。对于可以被修饰的蛋白质，例如磷酸化或糖基化，不同的修饰可能产生不同的分离的蛋白质，其可以被单独纯化。

“分离的多肽”意为已同与其天然相伴的组分分离的本发明的多肽。通常，当多肽至少60％，以重量计，不含与其天然伴随的蛋白质和天然存在的有机分子时，该多肽即视为分离的。优选地，制备为至少75％，更优选至少90％，最优选至少99％，以重量计，本发明的多肽。分离的本发明的多肽可以被得到，例如，通过从天然来源提取，通过表达编码这种多肽的重组核酸，或通过蛋白质的化学合成。纯度可以通过任何适当的方法测量，例如柱色谱，聚丙烯酰胺凝胶电泳或通过hplc/高效液相色谱分析。

如本文所用，“贮积症(sd)”是指由异常代谢导致的一组疾病中的任何一种，该异常代谢造成溶酶体或其他细胞器中的底物(例如硫脑苷脂、硫酸乙酰肝素、糖脂、神经酰胺)的累积。例如，溶酶体贮积症(lsd)由溶酶体功能障碍导致，通常是由于缺乏脂质、糖蛋白(包含糖的蛋白质)或所谓粘多糖的代谢所需的单一酶的结果。

“标记物(marker)”意为具有与疾病、病症或病况相关改变的任何临床指标、蛋白质、代谢物或多核苷酸。

“小胶质细胞”意为中枢神经系统的一种免疫细胞。

“纳米颗粒”意为纳米级尺寸的复合结构。特别地，纳米颗粒通常是大小在约1至约1000nm/纳米范围内的颗粒，并且通常是球形的，尽管取决于纳米颗粒组合物可能有不同形态。纳米颗粒的与其外部环境接触的部分通常被识别为纳米颗粒的表面。在本文所述的纳米颗粒中，大小限制可以限于二维，因此本文所述的纳米颗粒包含直径为约1至约1000nm的复合结构，其中特定的直径取决于纳米颗粒组合物和根据实验设计的预期用途。纳米粒子根据实验设计。例如，在若干治疗应用中所使用的纳米颗粒通常具有约200nm或以下的大小，并且，特别地，与治疗剂相连的用于递送的纳米颗粒通常具有约1至约100nm的直径。

如本文所用，“神经退化性疾病”是指以神经元的结构和/或功能的进行性丧失为特征的一组疾病中的任何一种，包括神经元的死亡。示例性的神经退化性疾病包括但不限于肌萎缩侧索硬化症和阿尔茨海默症。

“增加的增殖(increasingproliferation)”意为在体内或在体外的一种细胞的不断增加的细胞分裂。

如本文所用，术语“预防(prevent)”，“预防(preventing)”，“预防(prevention)”，“预防性治疗(prophylactictreatment)”等是指降低在受试者体内发生病症或病况的概率，该受试者暂无病症或病况，但有风险或容易发生。

术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验的对象的动物。仅举例来说，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人类的哺乳动物，例如非人类的灵长类动物、鼠、牛、马、犬、绵羊或猫科动物。

“降低(reduces)”意为至少10％、25％、50％、75％或100％的负向改变。

“参考”意为比较或对照条件之标准。

“实质上相同”意为与参考氨基酸序列(例如本文所述的任何一段氨基酸序列)或核酸序列(例如本文所述的任何一段核酸序列)展现出至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，这种序列与用于比较的序列在氨基酸或核酸水平上是至少60％相同的，更优选是80％或85％，更优选90％、95％、96％、97％、98％或甚至99％或更高相同的。

序列同一性通常使用序列分析软件来测量(例如，sequenceanalysissoftwarepackageofthegeneticscomputergroup,universityofwisconsinbiotechnologycenter,1710universityavenue,madison,wis.53705,blast,bestfit,gap,orpileup/prettyboxprograms)。这种软件匹配相同或相似的序列，通过将同源性程度指定为各种替换、缺失和/或其他修饰。保守性替换通常包含以下组中的替换：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其中e^-3和e^-100之间的概率分数表示密切相关的序列。

可用于本发明之方法的核酸分子包含任何编码本发明的多肽或该多肽片段的核酸分子。这种核酸分子不需要与内源性核酸序列100％相同，但将通常展现出实质的同一性。与内源性序列具有“实质的同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意为在各种严格条件下，互补的多核苷酸序列(例如本文所述的基因)，或其部分，之间配对并且形成双链分子(参见，例如，wahl,g.m.ands.l.berger(1987)methodsenzymol.152:399；kimmel,a.r.(1987)methodsenzymol.152:507)。

例如，严格的盐浓度将一般小于约750mm氯化钠和75mm柠檬酸钠，优选小于约500mm氯化钠和50mm柠檬酸钠，更优选小于约250mm氯化钠和25mm柠檬酸钠。低严格度杂交可在无有机溶剂，例如甲酰胺，的情况下得到，而高严格度杂交可在至少约35％甲酰胺，而更优选至少约50％甲酰胺的存在下得到。严格的温度条件将一般包含至少约30℃，更优选至少约37℃，最优选至少约42℃的温度。变化其他参数，例如杂交时间、洗涤剂浓度，例如十二烷基硫酸钠(sds)、以及载体dna的包含或排除，是本领域技术人员熟知的。通过根据需要组合这些不同的条件来实现各种严格程度。在一优选的具体例中，杂交将发生在30℃下、750mm氯化钠，75mm柠檬酸钠和1％sds中。在一更优选的具体例中，杂交将发生在37℃下、500mm氯化钠，50mm柠檬酸钠，1％sds，35％甲酰胺和100μg/ml变性的鲑鱼精子dna(ssdna)中。在一最优选的具体例中，杂交将发生在42℃下、250mm氯化钠，25mm柠檬酸钠，1％sds，50％甲酰胺和200μg/mlssdna中。对于本领域技术人员来说，变化这些条件的用处是显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤在严格度方面也将变化。洗涤的严格条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上，洗涤的严格度可以通过降低盐浓度或通过升高温度而提高。例如，洗涤步骤的严格盐浓度将优选是小于约30mm氯化钠和3mm柠檬酸钠，最优选是小于约15mm氯化钠和1.5mm柠檬酸钠。洗涤步骤的严格温度条件将一般包含至少约25℃的温度，更优选至少约42℃，甚至更优选至少约68℃。在一优选的具体例中，洗涤步骤将发生在25℃下、30mm氯化钠，3mm柠檬酸钠和0.1％sds中。在一更优选的具体例中，洗涤步骤将发生在42℃下、15mm氯化钠，1.5mm柠檬酸钠和0.1％sds中。在一更优选的具体例中，洗涤步骤将发生在68℃下、15mm氯化钠，1.5mm柠檬酸钠和0.1％sds中。对于本领域技术人员来说，这些条件的其他变化是显而易见的。杂交手段是本领域技术人员熟知的，并且例如，在如下文献中描述：benton和davis(science196:180,1977)；grunstein和hogness(proc.natl.acad.sci.,usa72:3961,1975)；ausubel等.(currentprotocolsinmolecularbiology,wileyinterscience,newyork,2001)；berger和kimmel(guidetomolecularcloningtechniques,1987,academicpress,newyork)；以及sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,newyork。

“特异性结合”意为一化合物(例如肽)识别并结合样品(例如生物学样品)中的一种分子，但实质上不识别和结合样品中的其他分子。

如本文所用，术语“治疗(treat)”，“治疗(treating)”，“治疗(treatment)”等是指减少或改善一种病症和/或伴随其的症状。应知悉，尽管不排除，对病症或病况治疗不需要该病症、病况或伴随其的症状被完全消除。

除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常容许偏差范围内，例如在平均值的2个标准差内。约可以理解为在所载明的数值的10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％或0.01％的范围内。处于所指明的值的规定的价值。除非上下文中另有说明，否则本文提供的所有数字数值全部由术语约修饰。

本文提供的范围应理解为该范围内的所有数值的简写。例如，1至50的范围应理解为包含由1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,或50所组成的组中的任何数字、数字组合或子范围。

本文提供的任何化合物、组合物或方法可与本文提供的任何其他组合物和方法中的一种或多种合并。

如本文所用，单数形式“一(a)”，“一(an)”和“该”包含复数形式，除非上下文另有明确说明。因此，例如，指称“生物标记物”包含指称一种以上的生物标记物。

除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或”应理解为包含在内。

术语“包含”在本文中用于表示短语“包含但不限于”，并且两者可互换使用。

如这里所使用的，术语“包括(comprises)”，“包括(comprising)”，“含有(containing)”，“具有(having)”等可以具有美国专利法中赋予它们的含义，并且可以表示“包含(include)”，“包含(including)”等；“基本上由...组成(consistingessentiallyof)”或“基本上由...组成(consistsessentially)”同样具有美国专利法中赋予的含义，并且该术语是开放式的，即允许存在多于所述及的，只要该多于所述及的并不会改变所述及的基本或新颖的特征，但不包括现有技术的具体例。

附图说明

图1a-1h描绘了脑室内注射鼠和人类的hspc后的脑中的髓样细胞重建。图1a描绘了用于在骨髓消融小鼠中(bu：以白消安处理的骨髓消融；irr：致死照射)icv移植谱系阴性细胞(lin^-)(代表小鼠中的hspc)的实验方案。不同的分析时间点如图表示。lin^-细胞已被编码绿色荧光蛋白(gfp)的lv(慢病毒载体)转导。图1b的图表描绘在bu-tx(bu/白消安处理)和irr小鼠中，分别以icv和iv进行hspc移植后，在不同时间点、于总髓样(cd45⁺cd11b⁺)脑室区内被识别到的gfp⁺细胞的频率。每个时间点和组有n≥5只小鼠；显示平均值和sd(标准差)。双向anova(方差分析)显示在bu和irr小鼠中细胞给予(hspc)路径和时间的显着效果(icv对比iv和时间，p<0.005)。这些数据显示进行脑室内注射hspc后的脑中快速且稳健的髓样细胞植入。图表的条形图显示为三组，每组四个条形图。从左到右依次为irriv(灰色)，irricv(白色)，buiv(深灰色)，buicv(深灰色)。图1c描绘了一只代表性的经icv被移植的bu-tx小鼠的矢状脑切片的重构，其显示了被gfp转导的hspc于icv注射后90天时，其gfp⁺细胞的广泛分布。显示用于细胞核的toproiii(tpiii，浅蓝/浅灰色)与gfp(绿/灰色)。图像在deltavisionolympus以20倍的放大率获得，并由softwork3.5.0处理；使用adobephotoshopcs8.0软件执行重构。图1d描绘被gfp转导的hspc于icv移植后90天时，来自bu_tx小鼠的脑切片上的gfp(绿/灰色)和iba-1(红/浅灰色)的免疫荧光分析。m＝合并。显示相对虚线框的20倍和40倍的放大率。在共焦显微镜radiance2100(bio-rad)1x70上获得图像并由softwork3.5.0处理。图1e是用于在小鼠中移植已被编码gfp或arsa(芳基硫酸酯酶a)的慢病毒载体所转导的人类cd34⁺细胞(代表人类中的hspc，且被认为是小鼠的lin^-细胞的等同群体)的实验方案。该小鼠包括：用bu16mg/kg×4天(nsg)或亚致死剂量照射(ragmld)处理过的nsg小鼠(一种高度免疫缺陷小鼠，jacksonlab编号005557)与rag^-/-γ-chain^-/-as2^-/-(ragmld/mld疾病模型)小鼠，其中的nsg小鼠还接受了来自nsg供体的未经操作的单核细胞。

图1f描绘了20周前移植了已被gfp慢病毒载体转导的人类cd34⁺细胞的nsg小鼠的脑单核细胞的分析的代表性点状图。小鼠脑中人类细胞的频率显示在两个代表性动物中，且有两种分析方法(人类cd45对ssc，人类cd45对鼠cd45)。该图亦显示移植后的nsg脑中识别到的人类cd45⁺细胞会表达cd11b、cx3cr1和gfp。图1g，在经bu处理或亚致死辐射(rag^-/-γ-chain^-/-as2^-/-)后，nsg和ragmld小鼠被以iv或icv移植了脐带血来源的cd34⁺细胞；图1g的图表描绘了从小鼠的脑中回收的人类cd45⁺cd11b⁺细胞的频率，回收时间为移植后的第12-20(nsg)和5(rag^-/-γ-chain^-/-as2^-/-)周。数值表示为iv之倍数，在nsg小鼠中iv等于3+/-1.3，而在ragmld中为2,9+/-0.7。n≥5只小鼠/组；显示平均值和sd。在nsg小鼠的studentt检验中p<0.001；在ragmld小鼠中使用bonferroni事后检验的单向anova之p<0.05。图1h描绘在以icv移植被gfp转导的cd34⁺细胞后的90天时，nsg小鼠脑切片的gfp，iba-1(共染色)，cd11b(共染色)，cd68(无共染色)和cd163(无共染色)的免疫荧光分析的结果。在蓝色中，细胞核被tpiii染色。显示相对虚线框的20倍和40倍的放大率。m＝合并。

图2a-2d显示被icv移植gfp⁺lin^-hspc的小鼠的短期监测。图2a和b描绘两个图表，其显示以icv注射被编码gfp的lv转导的lin^-hspc后，在指定的各个时间点，于经bu处理和移植(bu_tx)小鼠的脑(图2a)和骨髓(图2b)中的cd45⁺细胞内所识别到的gfp⁺细胞的频率。每个时间点n≥3只小鼠；显示平均值和sd。用单向anova和bonferroni事后检验进行分析，4天与1、3、6和24小时相比显示p值为<0.001。以icv移植的细胞的植入大多在脑中，在移植受鼠的骨髓中检测到gfp⁺细胞的微量或零存在。图2c和2d以两个图表显示在以icv注射转导的lin^-hspc后的不同时间点(input代表注射时刻的hspc)，从bu_tx小鼠脑中所回收的cd45⁺细胞(gfp⁺为供体/gfp^-为受体)中的造血干细胞(图2c)和髓样/小胶质细胞(图2d)的标记物的表达。每个时间点n≥3只小鼠；显示平均值和sd。双向anova显示对标记物和时间的显着效果(p<0.0001)。

在图2c中，对于gfp⁺细胞，箭头指示c-kit，sca1，cd34，cxcr4，cd93和tie2的表达百分比。在图2c中，对于gfp^-细胞，圆圈在每列中从上到下依次为：cxcr4，cd34，cd93，c-kit，sca1和tie2。在图2d中，对于gfp⁺细胞，箭头指示cd11b，cx3cr1和cd115的表达百分比。在图2d中，对于gfp^-细胞，圆圈在每列中从上到下依次为：cd11b，cx3cr1和cd115。移植的细胞/其后代瞬时地增加造血干细胞的表达，并随后增加髓样/小胶质细胞标记物的表达水平。

图3a-3j显示优化的组合移植方案允许调节iv移植细胞与icv移植细胞对移植后的供体髓样脑嵌合体的相对贡献，以用于适当的临床应用。图3a的图表显示在第0天移植的(最后一剂白消安的24小时之后)或5天后(在第5天)移植的供体(gfp⁺)lin^-hspc的脑植入情况，以总髓样cd45⁺cd11b⁺细胞，小胶质细胞(μ)，瞬时扩增μ(taμ)和cns巨噬细胞为考察对象。该图表显示在该2个时间点移植的hspc在所测群体导致相似的脑植入。图3b描绘在出生后3天的(pnd)新生小鼠，21pnd，60pnd成年小鼠，和移植后2个月的成年hspc移植动物中，识别μ,taμ和cns巨噬细胞(cnsmac)作为cd45^+lowcd11b^high，cd45^+low，cd11b^+low和cd45^highcd11b^high的门控策略。图3c描绘了iv和/或icv给予白消安处理的受者以差异标记的(用编码gfp或δngfr的lv)造血细胞的移植策略的实验方案。移植的造血细胞是lin^-hspc,或c-kit⁺sca1⁺lin^-(ksl)细胞或总骨髓(bm)。图3d的图表描绘在移植3个月后被牺牲的移植小鼠的bm内的供体来源细胞的频率(cd45.1＝iv移植细胞的后代，而表达gfp的细胞＝icv移植细胞的后代)。gfp⁺icv移植细胞没有显示出在bm中稳健的植入。图3e的图表描绘了在第0天移植小鼠(如颜色代码所示)的cd45⁺cd11b⁺细胞、μ、taμ和cnsmac内的供体来源细胞(作为表达δngfr细胞和表达gfp细胞的总和)的频率。与仅iv的lin^-移植相比，icv和iv共同递送造血细胞导致所有测试组合中的移植后脑供体嵌合体都增加。每组中最左边的条是仅iv(白色)，linivlinicv(深灰色)，klsivlinicv(中灰色)和bmivlinicv(灰色)。图3f的图表描绘在第0天移植的小鼠的cd45⁺cd11b⁺细胞、μ、taμ和cnsmac内的表达供体来源δngfr的细胞(iv移植细胞的后代)和表达供体来源gfp(icv移植细胞的后代)的细胞的差异频率。lin^-icv递送与总bmiv移植的结合导致iv-移植细胞/其后代在脑中的最低植入。这些条形(4条/组)从左到右依次为：ivonly(ngfr),linivlinicv(dngfr),linivlinicv(gfp),klsivlinicv(dngfr),klsivlinicv(gfp),bmivlinicv(dngfr),以及bmivlinicv(gfp).图3g描绘一实验方案，其为用iv和/或icv给予白消安处理的受者以差异标记的(用编码gfp或δngfr的lv)造血细胞的移植策略，其中iv细胞在化疗后第5天被移植，而icv细胞在第0天。被移植的造血细胞是lin^-hspc，或ksl细胞或总bm。图3h的图表描绘从移植后3个月被牺牲的移植小鼠中回收的总bm细胞内的供体来源细胞(cd45.1＝iv移植细胞的后代，和gfp表达细胞＝icv移植细胞的后代)的频率。gfp⁺icv移植的细胞不会植入bm中。图3i的图表描绘在移植后第5天的移植小鼠(如颜色代码所示)的cd45⁺cd11b⁺细胞、μ、taμ和cnsmac内的供体来源细胞(作为表达δngfr细胞和表达gfp细胞的总和)的频率。与仅iv的lin^-移植相比，icv和iv共同递送造血细胞导致所有测试组合中的移植后脑供体嵌合体都增加。每组中最左边的条是仅iv(白色)，linivlinicv(深灰色)，klsivlinicv(中灰色)和bmivlinicv(灰色)。图3j的图表描绘在第5天移植的所示小鼠的cd45⁺cd11b⁺细胞、μ、taμ和cnsmac内的表达供体来源δngfr的细胞(iv移植细胞的后代)和表达供体来源gfp(icv移植细胞的后代)的细胞的差异频率。lin^-icv递送与总bmiv移植的结合导致iv-移植细胞/其后代在脑中的最低植入。条形图(4条/组)从左到右依次为：仅ivonly(ngfr),linivlinicv(dngfr),linivlinicv(gfp),klsivlinicv(dngfr),klsivlinicv(gfp),bmivlinicv(dngfr),以及bmivlinicv(gfp).用bonferroni事后检验进行单向anova,*＝p<0.05,**＝p<0.01,***＝p<0.001,****＝p<0.0001。

图4a-4e显示小胶质细胞特征存在于从移植小鼠的脑中回收的髓样细胞中。图4a的图表描绘以iv或icv移植gfp⁺hspc后90天时小鼠脑中μ和taμ细胞的频率(每组n＝5)。

图4b描绘了用于基因表达分析的所分选的细胞群的代表性点状图。特别地，显示了在天然p10和成年对照(adult_ct)动物的脑中、以及在hct后90天的经白消安处理和移植的小鼠(bu_tx)的脑中的，由cd45和cd11b标记物识别的μandtaμ。包含在虚线方块中的点状图显示了代表性的经bu处理的移植小鼠的μandtaμ群体内的gfp^-内源细胞和gfp⁺供体来源细胞嵌合体。图4c的图表描绘所选小胶质细胞基因表达的倍数变化(以2^-ddct计算)，数据由实时pcr(聚合酶链式反应)得到，每个所示群体从经白消安处理、iv和icv移植小鼠、或p10小鼠中回收，以在adult_ctμ细胞中相同基因的表达为基准进行计算。显示平均值。图4d是主成分分析(pca)，图4e是热图，均显示被butovsky识别为小胶质细胞特征的样品内的基因表达分析(butovsky等natureneuroscience17,131-143(2014))。μ和taμ从天然p10、adult_ct、hct动物，以及gosselin等人(gosselinetal.,cell159,1327-1340(2014))报告过的样品中回收，包括小胶质细胞和巨噬细胞(lpm＝大腹腔巨噬细胞；spm＝小腹腔巨噬细胞；bmdm＝骨髓来源的巨噬细胞；tgem＝巯基乙酸诱导的腹腔巨噬细胞)。总之，这些数据表明，从icv和iv移植小鼠的脑中分离出的细胞的这些基因的表达水平与从对照小鼠中分离出的μ细胞相似，而非巨噬细胞。

图5a-5e显示，来自移植小鼠脑的髓样细胞显示出成熟中的小胶质细胞的功能。图5a显示相比μ移植细胞，μct细胞中的差异性上调基因的功能富集。图5b显示相比μ移植细胞，μct细胞中的差异性下调基因的功能富集。图5c显示相比taμ移植细胞，μct细胞中的差异性上调基因的功能富集。图5d显示相比taμ移植细胞，μct细胞中的显示差异性下调基因的功能富集。以默认的参数使用geneontology(go)生物过程(http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection)上的rna-seq差异化基因表达数据，来执行基因集富集分析(gsea)的预先排序分析。go的语义相似性(gosemsim)用于聚集显着富集的go(为了增强表达清晰度，上调的fdr<0.05与下调的fdr<0.001被选定)。

图5e的图表显示，从经白消安处理的移植小鼠或p10小鼠的脑中回收的所示(细胞)群体中，在成年小鼠中表达上调的基因(matcovitch-natanetal.，science.353:6301(2016))的表达数值经rna-seq标准化后的倍数变化，与adult_ctμ细胞相比。图5f的图表显示，从经白消安处理的移植小鼠或p10小鼠的脑中回收的所示(细胞)群体中，在p10小鼠中表达上调的基因(matcovitch-natanetal.，science.353:6301(2016))的表达数值经rna-seq标准化后的倍数变化，与adult_ctμ细胞相比。有关统计检验，请参阅表2。

图6a-6d显示与天然或移植后小鼠的脑实质相关的造血细胞具有克隆形成和造血再增殖潜力和小胶质细胞重建潜力。图6a描绘了hct的实验方案。取天然小鼠(ut)、bu处理和照射小鼠(irr)以及先前用cd45.2gfp转导的hspc的移植小鼠(bu-hct)的骨髓(bm)和脑，从其中培养cfu。图6b描绘从bu和irr动物的组织中得到的集落数(#cfc/#集落形成细胞)。图6c描绘从bu-hct动物的组织中得到的集落数(#cfc)和gfp⁺cfc的数目。图6d是描绘通过facs(荧光流式细胞分选仪)分析从接受了初级受体的bm或脑细胞或外周血单核细胞的次级受体小鼠的bm和脑中回收的gfp⁺细胞的频率(和bm的谱系分化)的图表。小鼠于移植后4个月被牺牲。

图7a-7e显示hspc的icv共递送在两种lsd动物模型中具有治疗相关性。图7a描绘了通过iv、iv+icv或仅icv的三种路径将人cbcd34⁺hspc移植到亚致死辐射(sub-l-irr)rag2^-/-γ-chain^-/-as2^-/-新生小鼠(即mld/异染性脑白质营养不良症的免疫缺陷动物模型)中的移植方案的实验计划方案。在转导之前，用编码芳基硫酸酯酶a(arsa)的lv转导hspc(sessaeta.,lancet2016)。图7b显示，在如所示以icv或iv或icv+iv移植了arsa转导细胞的rag^-/-γ-chain^-/-as2^+/+小鼠的脑和骨髓(bm)中所测量到的arsa活性(表示为在rag^-/-γ-chain^-/-as2^+/+野生小鼠组织中测量值的倍数)的图。n＝3只小鼠/组。移植小鼠于移植后5个月被牺牲。总体而言，与仅iv或仅icv手段相比，转导的hspc的共递送(iv+icv)导致向脑中的更多的arsa递送。

图7c是将野生型(ids^+/+)供体的lin^-hspc移植到艾杜糖硫酸酯酶活性缺乏的小鼠(ids^-/-，粘多糖贮积症ii型-mpsii的动物模型)中的移植实验的方案。野生型细胞在白消安骨髓消融后，以iv或iv+icv给予2个月大的ids^-/-小鼠。进行180天追踪研究考察移植小鼠的行为。图7d-7e显示在转棒仪试验中移植和对照ids^-/-小鼠的表现。图7d显示动物对转棒仪的逃避潜伏期。图7e显示了第4天(最后一次试验)和第1天(第一次试验)之间的转棒仪的逃避潜伏期的差异。与仅iv和对照小鼠相比，icv+iv移植小鼠显示出更好的转棒仪表现。显示平均值和标准误(sem)，每组n＝3-8只小鼠。

图8a-8f显示小鼠中hla-次要抗原错配的hspciv+icv移植。图8a描绘了在小鼠中进行hla-次要抗原错配hspciv+icv移植的实验方案；小鼠接受10x10⁶个总bm细胞iv和0.3或1x10⁶个lin^-细胞(鼠的人类cd34⁺细胞的等同物)icv。图8b是移植动物的kaplan-meyer存活曲线。在实验结束时，与iv+icvday01e6组相比，iv+icvday03e5和仅iv组显示100％存活率。图8c描绘被牺牲的移植小鼠的外周血(pb)、bm、脾(sp1)和胸腺(thy)中的供体cd45.2细胞嵌合体。图8d显示移植动物组织中供体cd45.2细胞内的gfp⁺细胞的频率，表明icv移植的gfp⁺细胞未植入到移植小鼠的造血组织中。每组n＝5。图8e描绘被牺牲的移植小鼠的脑髓样细胞群(总cd45⁺cd11b⁺细胞)中的供体cd45.2细胞嵌合体。图8f显示移植动物的脑髓样细胞中的供体cd45.2细胞内的gfp⁺细胞频率，表明icv移植的gfp⁺细胞有助于增加供体脑嵌合体。每组n＝5。

图9a-9f显示小鼠中mhc错配的hspciv+icv移植。在这种设定下，icv递送对脑供体嵌合体的累加效应得以维持。图9a描绘了小鼠中hla-次要抗原错配的hspciv+icv移植的实验方案；小鼠接受10x10⁶个总bm细胞iv和0.3x10⁶个lin^-细胞(鼠的人类cd34⁺细胞的等同物)icv。图9b是移植动物的kaplan-meyer存活曲线。在实验结束时，与仅iv组相比，iv+icvday03e5组显示100％存活率。图9c是描绘牺牲时在移植小鼠的pb、bm、sp1和thy中的供体cd45.2细胞嵌合体。

图9d显示移植动物组织中的供体cd45.2细胞内的gfp⁺细胞频率，表明icv移植的gfp⁺细胞没有植入移植小鼠的造血组织中。每组n＝5。图9e描绘牺牲时在移植小鼠的脑髓样细胞群中的供体cd45.2细胞嵌合体。图9f显示移植动物的脑髓样细胞中的供体cd45.2细胞内的gfp⁺细胞频率，表明icv移植的gfp⁺细胞有助于增加供体脑嵌合体。每组n＝5。

图10a-10b显示了小鼠的鞘内(it)hspc移植。图10a描绘了与icv+iv和仅iv(对照iv)比较的差异性标记的hspc移植it+iv在小鼠中的实验方案。图10b描绘了在牺牲时，移植小鼠的bm、脑和脊髓中的供体细胞嵌合体，其通过gfp⁺和cherry⁺细胞植入的总和而得到。在每一柱中，gfp位于底部而cherry位于顶部。每组n＝3-5。ithspc递送可以成为实现稳健的造血和cns嵌合的可贵路径。

图11a-11j显示移植后脑髓样细胞来源于早期造血干/祖细胞。图11a描绘了显示如何使用c-kit、sca-1和谱系阴性染色以及slam受体标记物cd150和cd48前瞻性(prospectively)分离hspc库中的长期(lt)-hsc和祖细胞的实验方案。用编码gfp(ksl)和δngfr(not-ksl)、gfp(lt-hsc)、δngfr(mpp)、tag-bfp(hpc-1)和cherry(hpc-2)的慢病毒载体(lvs)差异性转导所示的分选的群体，而随后以竞争方式以它们的原始比例用iv或icv移植到经白消安骨髓消融的小鼠中。icv移植的动物在移植后第5天也接受未经操作的总bm细胞用于造血功能恢复。图11b显示了用所示lvs转导并移植到a中所描述之小鼠的细胞的体外液体后代中的标志物之基因表达的直方图。图11c描绘了在牺牲时经白消安处理的移植(bu_tx)小鼠的总cd45⁺造血bm细胞、骨髓(cd11b)和淋巴(cd3和b220)谱系中，来源于每个移植的ksl亚群的细胞频率。n＝10只小鼠/组。在每柱中，从下到上依次为：lt-hsc(浅灰色)、mpp(深灰色)、hpc2(灰色)和hpc1(浅灰色)。图11d描绘在移植后90天，在bu_tx小鼠的总脑髓样(cd45⁺cd11b⁺)细胞、μ和taμ中，来源于iv移植的ksl和not-ksl的细胞的频率。

在每柱中，从下到上依次为：ksl(灰色)和非ksl(白色)。图11e描绘在移植后90天，在bu_tx小鼠的总脑髓样(cd45⁺cd11b⁺)细胞、μ和taμ中，来源于icv移植的ksl和not-ksl的细胞的频率。在每柱中，从下到上依次为：ksl(灰色)和非ksl(白色)。图11f描绘在hct后的不同时间点，iv移植的白消安骨髓消融小鼠的总脑髓样细胞、μ和taμ内的，每个移植的ksl亚群的细胞的频率。每组n＝10只小鼠。在每柱中，从下到上依次为：lt-hsc(浅灰色)，mpp(深灰色)，hpc2(灰色)和hpc1(浅灰色)。图11g描绘在hct后的不同时间点，iv移植的白消安骨髓消融小鼠的总脑髓样细胞、μ和taμ内的，每个移植的ksl亚群的细胞的频率。在每柱中，从下到上依次为：lt-hsc(浅灰色)，mpp(深灰色)，hpc2(灰色)和hpc1(浅灰色)。每组n＝10只小鼠。图11h和图11i描绘了在移植后90天，用ksl亚群iv移植的bu处理的小鼠的脑切片的免疫荧光分析。图11h中，lt-hsc的后代细胞是gfp⁺，而mpp的后代细胞是δngfr⁺(浅灰色)。iba1染色在蓝色通道中。放大20倍。m＝合并。在右侧面板中显示的是20x(顶部)和40x放大(底部)的其他代表性的合并图片。在图11i中，hpc2的后代细胞是cherry⁺，mpp的后代细胞是δngfr⁺(灰色)。在没有δngfr免疫荧光的情况下未检测到gfp⁺染色。显示用于细胞核的tpiii(深灰色)。上部面板放大20倍。在底部面板中，显示的是20x(顶部)和40x放大(底部)的其他代表性的合并图片。图像通过共焦显微镜(radiance2100，bio-rad，由softwork3.5.0.100处理)获得。图11j描绘了梯形频补图，其显示了在移植时的，ksl和not-ksl细胞和ksl亚群的cxcr4表达的差异性水平。

图12a-12e显示，在icv移植和iv移植时，fgd5⁺hsc都在脑中产生小胶质细胞样的后代。图12a描绘从cd45.2fdg5-zsgreen供体小鼠中分离fgd5⁺hsc(lin^-ckit⁺sca-1⁺flk2^-cd34^-)的实验方案。将fgd5⁺hsc(n＝500)iv或icv移植到白消安骨髓消融或致死照射的cd45.1受体小鼠。在移植后第5天，移植的动物也接受未经操作的cd45.1总bm细胞用于造血功能恢复。图12b描绘在经白消安和照射处理后，用fgd5细胞iv移植的小鼠的脑髓样cd11b+细胞内的供体细胞(cd45.2⁺)的频率。每组n≥4。图12c描绘在经白消安和照射处理后，用fgd5细胞icv移植的小鼠的脑髓样cd11b+细胞内的供体细胞(cd45.2⁺)的频率。每组n≥4。图12d描绘在iv移植的白消安处理小鼠的供体来源细胞中的μ、taμ和cnsmac群体。每组n≥4。图12e描绘在icv移植的白消安处理小鼠的供体来源细胞中的μ、taμ和cnsmac群体。每组n≥4。

图13a-13b描述表达cx3cr1的和未表达的细胞对脑髓样细胞嵌合体的贡献。图13a是一系列图表，显示cx3cr1-gfp小鼠的骨髓之特征，特别是在所示的不同骨髓亚群中gfp的表达。在每列中，从下到上：gfp无(浅灰色)，gfp低(深灰色)和gfp高(浅灰色)。图13b描绘了以从cx3cr1-gfp报告基因小鼠中分离的细胞产生嵌合小鼠的实验设定，和所得到的脑中的嵌合体。接受gfp^+/highlin^-hspc的小鼠在脑中未被植入cx3cr1cd45.2供体细胞(代表性点状图示于左侧框)，而总cx3cr1未分选骨髓的移植则显示持续植入的供体细胞，其在小胶质细胞分化后稳健地表达gfp(代表性点状图示于左侧框)。这表明gfp^-细胞(不表达cx3cr1)将被移植以建立脑髓样细胞嵌合体。

图14a-14d显示了人类lt-hsc，其被定义为cd34⁺andcd38^-，对产生脑髓样细胞后代细胞的贡献。图14a是代表性的点状图，显示了从人类动员(mobilized)的外周血中识别人类cd34⁺cd38⁺(祖细胞)和cd34⁺cd38^-(干细胞富集的细胞)的门控策略。对细胞以所示频率差异性转导编码gfp和tag-bfp的lvs，并混合这些细胞，用于移植到nsg骨髓消融小鼠中。图14b显示，从移植了如a所示细胞的nsg小鼠脑中回收的人类cd45⁺细胞部分之中，用gfp(cd38^-)或tag-bfp(cd38⁺)标记的细胞的频率。n≥5只小鼠/组。显示平均值和sem/标准误。在每柱中，从下到上：cd38^-(灰色)和cd38⁺(白色)。图14c是代表性点状图，显示了从人动员的外周血中，根据cd34⁺细胞上标记物cd38和cd90的表达，而识别人长期和短期hsc和祖细胞的门控策略。对细胞以所示频率差异性转导编码gfp、cherry、tag-bfp(青色)和mo2(橘色)的lvs，并混合这些细胞，用于移植到nsg处理小鼠中。图14d描绘从移植了如14a所示细胞的nsg小鼠的脑中回收的人类cd45⁺细胞部分之中，用如所示标记物标记的细胞的频率。从下到上：cd38^-cd90⁺(灰色)，cd38^-cd90^-低(浅灰色)，cd38⁺cd90^-(中灰色)和cd38⁺cd90⁺高(浅灰色)。n≥5只小鼠/组。显示平均值和sem。总体而言，cd34⁺cd38^-显示对脑髓样细胞嵌合体的最大贡献。

图15a-15c描绘了如何通过bu易感性而识别脑驻留的推定μ祖细胞。图15a显示，在1或4个剂量的白消安后5天，在造血髓样细胞和最重要的cd45⁺c-kit⁺细胞中，检测到凋亡膜联蛋白+细胞的份额增加。每组中最左边的条是co(白色)，1xbu(深灰色)和4xbu(黑色)。图15b显示了在对照动物和经bu处理小鼠的活的cd45⁺脑细胞内的代表性的γh2ax⁺细胞之facs图。图15c显示在白消安处理或对照未操作小鼠(ctr)后一天分析得到的小鼠脑中γh2ax标记物分布。插图是γh2ax，神经元(neun)，小胶质细胞(iba1)或星形胶质细胞(gfap)的共免疫染色的代表性激光扫描共焦显微镜显微照片。比例尺＝10微米。图像在共焦显微镜radiance2100(bio-rad)1x70上以20x放大倍数获得，并通过softwork3.5.0处理；用adobephotoshopcs8.0软件执行图像重构。插图放大40倍。

图16a-16d描绘了用于可调节的治疗性基因表达的小胶质细胞的分子工程。图16a描绘了鼠tspo启动子的图式和序列。图16b显示了通过将tspo基因上游的2.7kbp克隆到sinlv质粒中，且在该质粒gfpcdna上游，而得到的lv。我们用上述得到的转导载体bv-2细胞(小鼠小胶质细胞系)以评估该启动子所驱动的表达。已知tspo的表达在小胶质细胞中可因回应压力而被激发，且可以通过活体内的lps注射来模拟。图16c是梯形频布图，显示gfp阳性的被转导的bv2细胞，以及lps刺激后gfp平均荧光强度的移动。图16d显示在基底条件下和lps刺激时被转导的bv2细胞的gfp(已对载体含量标准化)的平均荧光强度(mfi)(n＝4：平均值±sem/标准误)，*＝p<0.0001studentt-检验。

图17a-17i描绘了icv递送时的纳米颗粒(np)特征和生物分布。图17a显示了所用第一代罗丹明酸盐纳米颗粒的大小。图17b-17d显示以流式细胞仪评估的icv注射的第一代纳米颗粒在脑中的分布。cd45⁺细胞对纳米颗粒的摄取在甘露醇的存在下增加(图17b)；在cd45⁺c-kit⁺细胞中比在cd45⁺cd11b⁺细胞中更高(图17c)，在cd45⁺edu⁺细胞中比在cd45⁺edu^-中更高(图17d)。图17e是在icv注射np后3天的小鼠矢状脑切片中的罗丹明酸盐np信号(红色/浅灰色)和dapi核染色(蓝色/深灰色)的代表性落射荧光显微镜显微照片。图像在deltavisionolympus以20倍的放大率获得，并由softwork3.5.0处理；使用adobephotoshopcs8.0软件执行重构。图17f显示在所示的脑区域中纳米颗粒的分布，表示为总面积(为rho⁺)的百分比。图17g是图17e的插图，其突显icv注射np后3天的小鼠矢状脑切片中的脑室下区(svz)和喙侧迁移流(rms)附近有np(红色有蓝色dapi核)的突出分布，以及罗丹明酸盐np信号(红色)、iba1(绿色)、ki67(增殖标记，蓝色)和dapi核染色(浅蓝色)的代表性的共焦显微镜图像。np在ki67⁺小胶质细胞内部。图17h显示，np被增殖中的细胞所内化。是iba1⁺、f4/80、罗丹明和增殖标记物edu的共免疫染色的代表性激光扫描共焦显微镜显微照片。rh⁺np可以在iba1⁺(箭头)以及iba1^-(三角)增殖中的细胞中检测到。图17i，以荧光显微镜在注射np小鼠的脑切片上回收到的数据对edu和罗丹明信号的重构，显示edu和np信号的共定位。图像在共焦显微镜radiance2100(bio-rad)ix70上获得并由softwork3.5.0处理。

图18显示了自组装np和化疗药物复合物的制备。

图19a-19e描绘了封装在npnp中的化疗剂的体外和体内的效果。图19a是经白消安曝露的bv2小胶质细胞样细胞系中对γh2ax的代表性流式细胞仪分析和免疫荧光染色。该图显示在曝露于装载或不装载白消安的不同纳米颗粒制剂后，γh2ax⁺细胞的百分比(以流式细胞仪确定)(梯形频布图表示平均值+/-sem，n>＝3个独立实验)。

图19b描绘了经bu-np曝露的bv2小胶质细胞样细胞系的mtt细胞存活测定之结果，其突显了暴露于包封在np中的白消安所施加的细胞毒性。图19c描绘在icv给予np后3天(通过流式细胞仪)评估小鼠脑中γh2ax⁺小胶质细胞的频率(直方图代表平均值+/-标准误，n＝4只动物/组)。图19d和19e显示，曝露于含有或不含有具化疗效果的依托泊苷的np(自组装制剂、大小为50和100nm和plc制剂)的以及曝露于如所示浓度作为游离制剂的依托泊苷的bv2小胶质细胞的存活。mtt测定用于评估存活率。在温育48和72小时后测量存活率。与游离制剂相比，以np内形式的依托泊苷递送增加了其杀死细胞的能力。在图19d和19e中，每组中最左边的条是自组装np(50nm)(深灰色)，自组装np(100nm)，pclnp(100nm)(灰色)和依托泊苷(中灰色)。

图20a-20e显示了在诱导小胶质细胞祖细胞增殖和cd45⁺c-kit⁺细胞库扩增后给予的含有依托泊苷的np诱导cd45⁺c-kit⁺和cd45⁺cd11b⁺细胞的凋亡。图20a和20c是在成年野生小鼠中，通过单次白消安剂量或10天口服给药csf1r抑制剂，然后再iv给予包含依托泊苷的np，以诱导小胶质细胞祖细胞增殖的实验设计((elmore等,neuron.82(2):380-397(2014))。图20b和20d显示对给予np后5天得到的脑样品以流式细胞仪测量得到的膜联蛋白+早期凋亡细胞的百分比。膜联蛋白+细胞百分比在所示细胞亚分区中计算得到。使用空的np作为对照组。图20e显示了相同样品中cd45⁺c-kit⁺细胞的百分比。总体而言，在接受了负荷依托泊苷的np的动物的cd45⁺c-kit⁺和cd45⁺cd11b⁺细胞内检测到了细胞凋亡的增加，而该增加与在接受了4种白消安剂量的对照小鼠中观察到的一致。

具体实施方式

本发明的特征为可用于在hspc移植时重建小胶质细胞的组合物和方法，以及用于治疗和预防中枢神经系统的神经疾病和病症(例如贮积症，包括溶酶体贮积症，神经退化性疾病等)。

本发明至少部分地基于本文描述的若干发现。使用hsc移植用于治疗贮积症和神经退化性疾病的现行方法对cns疾病表征的效果很差，因为移植细胞的后代对驻留小胶质细胞的替换过于缓慢。将hsc移植进sd和神经退行性病症患者体内的现行方法包含，使用总骨髓、血球分离的产物或脐带血，或在自体基因疗法之情况下使用造血干细胞与祖细胞(hspc，cd34选择性表达)。在这里，在这些细胞来源中可以识别出富含小胶质细胞-再增殖活性的细胞群，其使用最终可以改善移植后供体的小胶质细胞重建。并且，已发现使用脑内脑室注射(icv)将造血干细胞与祖细胞(hspc)或部分hspc库直接递送到脑中，会改善移植的供体细胞重建小胶质细胞的速度和程度；而与单一静脉注射(iv)移植手段相比，也会增加治疗性蛋白质到脑中的递送。这种手段因此被赋予很大的治疗潜力且可以被优化，以得到icv移植的细胞对小胶质细胞增生的普遍贡献，其可用于意图实现移植细胞专一性替换小胶质细胞而不替换造血组织的进阶策略。这可能与本文开发的新颖策略有很大关联，该策略是为了得到，回应神经炎症或神经退化性刺激的、用于可调节的治疗性基因表达的小胶质细胞分子工程。

如本文所展示的，hspc移植可通过一个逐步的过程产生转录性可靠的新小胶质细胞，该过程使人想起生理性出生后小胶质细胞的成熟过程。在移植入骨髓消融受体后能够产生新小胶质细胞的造血细胞被保留在人类和鼠的长期造血干细胞(hsc)中。类似的转录性可靠的新小神经胶质细胞也可以通过hspc的内室递送产生。重要的是，与全身性hspc注射相比，此新颖路径伴随着与临床相关的更快更广泛的小胶质细胞替换。因此，已显示：

·静脉注射(iv)或以脑室内注射(icv)移植鼠和人类的hspc产生脑髓样细胞后代

·与iv相比，icv递送鼠和人类的hspc在脑中产生后代髓样细胞具有更快的动力学和更大的数量

·icv注射的hspc在脑中植入并扩张，同时它们不植入造血器官

·在特定条件下，icv注射的hspc对脑髓样嵌合体的贡献可以胜过iv共注射的hspc的贡献

·在特定条件下，iv与icv注射的hspc对脑髓样嵌合体的贡献可以相同

·iv与icv移植的hspc后代细胞都具有与小胶质细胞一致的转录图谱

·在脑中，与iv注射的hspc的后代相比，icv注射的hspc的后代细胞更像小胶质细胞

·移植后小鼠的脑实质相关的造血细胞具有克隆形成和造血再增殖潜力和小胶质细胞重建潜力

·icv+iv联合递送工程化的hspc的在两个代表性lsd(动物模型)中具有治疗相关性

·icv+iv联合递送hspc在同种异体环境下是可行的

·在组合hspc移植策略下，鞘内(it)hspc递送的hspc可有助于脑和造血嵌合体

·特定的纳米颗粒可以通过c-kit⁺和nestin⁺髓样增殖细胞上传到脑的目标区域

·纳米颗粒可以有效率地封装依托泊苷

·当封装在np中，而非在标准制剂中，依托泊苷可有效地杀死细胞

·诱导小胶质细胞祖细胞增殖后，依托泊苷-np被小鼠脑中的c-kit⁺cd45⁺cells摄取

·诱导小胶质细胞祖细胞增殖后，依托泊苷-np可诱导小鼠脑中的c-kit⁺cd45⁺和cd45⁺细胞的早期凋亡

之前的工作已假设cns驻留的小胶质细胞祖细胞的存在，且其在hct前的消融对于建立小胶质细胞的重建是必需的。在此，(申请人)建议使用新颖工具以识别上述这些细胞和移植它们的新颖方法，以便与移植的细胞后代产生全身性的cns嵌合体或选择性的cns嵌合体。因此，本发明提供了为达成下述目标的新工具：

·在hspc库中识别细胞，该细胞用于在移植时产生髓样脑嵌合体和转录性-可靠的新小胶质细胞(定义为“小胶质细胞祖细胞的功能等同物”)；

·在治疗疾病需要持续的脑和造血组织嵌合体的情况下，用于移植小胶质细胞祖细胞的功能等同物的最佳路径和条件；

·在选择性脑嵌合体足够和/或治疗疾病需要的情况下，用于移植小胶质细胞祖细胞的功能等同物的最佳路径和条件；

·使用纳米载具定位和靶向小胶质细胞祖细胞；

·用于选择性脑处理，而将消融药剂靶向递送至小胶质细胞祖细胞；

·在用于神经性退行疾病的、对髓样cns细胞/小胶质细胞重建的进阶hsc移植方案的脉络下，实施新颖的治疗策略。

本文所述的结果表明，hsc移植的优化方案，通过用被赋予新颖/治疗功能的新细胞替换罹病的小胶质细胞，可用于治疗中枢神经系统的神经疾病或病症，包括例如贮积症和神经退化性疾病。为此目的，通过优化的小胶质细胞重建手段以识别用于治疗神经退化性疾病的分子标靶。因此，已显示下列事实：

·鼠和人类lt-hsc能在iv和icv递送时产生脑髓样细胞后代

·较少未成熟ksl部分有助于在icv递送时脑髓样细胞后代的产生

·hspc库中μ祖细胞的功能等同物是包括在lt_hsc(鼠和人类细胞皆然)中

·鼠hspc库中μ祖细胞的功能等同物是fdg5+

·鼠hspc库中μ祖细胞的功能等同物是cd11b阴性

·鼠hspc库中μ祖细胞的功能等同物是cx3cr1阴性

·μ祖细胞的功能等同物是包括在cd34+人类hspc中

·μ祖细胞的功能等同物是富集在cd38-部分的cd34+人类hspc中。

造血细胞移植(hct)

最近的临床前和临床证据表明，造血干细胞与祖细胞(hspc)和/或它们的后代可以通过促进脑中髓样细胞群的更替而充当跨越血脑屏障的治疗性分子递送的运载工具。然而，移植后重建的细胞的分化和功能特征仍有待确定，特别是真正的小胶质细胞是否可以通过移植后供体细胞后代而被重建这件事有待评估。在过去的三十年中，基于造血细胞移植(hct)和造血干细胞(hsc)的基因疗法已经应用于，其对罹患非血液病和非肿瘤疾病、作用于神经系统的疾病的患者有一些益处，例如过氧化物酶体病症和溶酶体贮积病(lsd)(cartier等science326,818-823(2009)；biffi等science341,1233158(2013)；sessa等lancet388,476-487(2016))和神经退化性疾病(simard等neuron49,489-502(2006))。这些早期临床证据以及临床前支持性数据表明，造血干细胞与祖细胞(hspc)和/或其后代可以充当跨越血脑屏障(bbb)的治疗性分子递送的运载工具。实际上，hspc和/或它们的后代可能有助于脑中髓样细胞群的更替(ajami等natneurosci10,1538-1543(2007)；ajami等natneurosci14,1142-1149(2011)；biffi等j.clin.invest.116,3070-3082(2006)；mildner等natneurosci10,1544-1553(2007)；capotondo等procnatlacadsciusa.109,15018-15023(2012))，可能包括小胶质细胞，其在这些疾病的进程和结果中的关键作用已被广泛描述(jeyakumar等brain126,974-987(2003)；wada等procnatlacadsciusa97,10954-10959(2000)；ohmi等proc.natl.acad.sci.usa100,1902-1907(2003)；eichler等annneurol63,729-742(2008))。重要的是，一旦整合到患病组织中，来源于移植物的细胞被证明会有利地影响局部环境，即通过在移植小鼠或患者的脑中释放治疗分子。此概念在以hsc基因疗法治疗的罹患异染性脑白质营养不良症(一种髓鞘脱失的lsd)的患者中得到展示(biffi等science341,1233158(2013)；sessa等lancet388,476-487(2016))。

芳基硫酸酯酶a(即前述患者体内所缺陷的酶)通过整合进入患者hsc及其后代细胞的慢病毒载体(lvs)而被诱导表达；在治疗后长时间内，仍能在已接受治疗儿童的脑脊髓液(csf)内测量到正常的或高于正常的芳基硫酸酯酶a活性(biffi等science341,1233158(2013)；sessa等lancet388,476-487(2016))。值得注意的是，该酶本身不能有效地穿过bbb(biffi等j.clin.invest.116,3070-3082(2006)；matzner等humanmoleculargenetics14,1139-1152(2005))。与在临床前期接受治疗的患者中的显着的临床益处相关的上述这些发现，正式证明患者的脑是通过基因校正的hspc后代细胞而被播种的。然而，脑中的移植来源的细胞的分化和功能特征仍有待确定，特别是，真正的小胶质细胞是否可以通过移植后供体细胞后代而被重建这件事仍需要被展示(ajami等natneurosci10,1538-1543(2007)；capotondo等procnatlacadsciusa.109,15018-15023(2012)；bennett等procnatlacadsciusa113,e1738-1746(2016))。

尽管小胶质细胞具有不同于骨髓来源的骨髓单核细胞的发育起源(ginhoux等science330,841-845(2010))，但其他人和我们最近展示了在特定实验条件下，显示小胶质细胞样的表型并表达一些小胶质细胞表面标记物的供体来源细胞，可以在移植了供体hspc的小鼠脑中产生。这种现象可重复并高比例发生的必要条件是移植前给予基于烷化剂白消安的处理方案，该剂能消融以功能定义的脑驻留小胶质细胞前体(capotondo等procnatlacadsciusa.109,15018-15023(2012)；wilkinson等molther21,868-876(2013))。在这种设置下，在移植动物脑中找到的供体来源细胞显示其来源于移植后不久迁移到大脑的hspc的局部增殖和分化。

在本工作中，已经向前迈出了实质性的一步，以更好地了解这些事件并增加其治疗神经疾病的转化(从实验室到临床)潜力。实际上，这里是第一次展示，在基于白消安处理后接受hspc的小鼠脑中出现的供体来源髓样细胞，不仅共享小胶质细胞的形态和表面标记物，而且还有非常相似的转录图谱。此外，通过使用全基因组表达分析，显示移植的hspc通过重现了出生后小胶质细胞的生理性成熟的某些方面的过程而产生小胶质细胞样后代细胞。

重要的是，亦明确证明了移植后的小胶质细胞增生来源于鼠和人类的早期造血干细胞/祖细胞，它们可能通过表达cxcr4而倾向于被运输进入脑中。最后，在经处理的小鼠的侧脑室中直接给予hspc而非静脉给予时，也第一次得到了供体来源的小胶质细胞样细胞的产生。值得注意的是，与全身注射相比，这种新颖的递送路径允许临床相关的、更快的和更普遍的小胶质细胞替换，确定了小胶质细胞增生可能来源于静脉注射移植的hspc对大脑的独立播种(capotondo等procnatlacadsciusa.109,15018-15023(2012))。

总体而言，本工作支持使用hspc更新脑髓样细胞和小胶质细胞的相关性和可行性，而新的细胞群体具有在中枢神经系统(cns)中施加治疗作用的能力，并识别新颖的模式，例如移植富集的干细胞部分和hspc的直接脑递送，用于增加移植细胞对小胶质细胞增生的实际贡献。

贮积症(sd)

贮积症(sd)包括一类遗传性疾病，其特征为正常的溶酶体功能被中断，导致不完全降解的底物的累积，而该底物已被靶向至依赖内吞作用或细胞自噬的降解。随后的底物本身的累积或溶酶体中替代代谢路径的产物的累积影响细胞的构架和功能，导致细胞功能障碍或细胞死亡。进一步的，主要缺陷经常被次要响应加剧。这在中枢神经系统(cns)中特别有相关性，cns中神经炎症发生代表对小胶质细胞和星形胶质细胞内底物累积的主要反应和/或对原发性神经元或少突胶质细胞损伤的炎症反应。

sd的实例包含溶酶体贮积病(lsd)，例如gm1和gm2神经节苷脂贮积症，α-甘露糖苷贮积症，脑白质球状细胞营养障碍(gld)，神经元蜡样脂褐质贮积症(ncl)，异染性脑白质营养不良症(mld)，粘多糖贮积症(mpss)，多发性硫酸酯酶缺乏症(msd)，尼曼-匹克病和过氧化物酶体贮积症，如肾上腺脑白质营养不良。

大约50％的lsd具有cns受累性，如上面列出的实例的情况。表1提供了示例性sd及其相关缺陷蛋白的非详尽的列表。

表1.贮积症(sd)及其相关的缺陷蛋白sd

提供了如本发明中所述hsc-移植方案的使用特别相关的一些lsd的信息。

异染性脑白质营养不良症(mld)

由于芳基硫酸酯酶a(arsa)基因突变导致的一种髓鞘脱失的lsd，异染性脑白质营养不良症(mld)是lsd的一个典型例子，其具有在神经系统中的未降解底物的逐渐累积和继发性的神经炎症反应和退化。mld的遗传传递是常染色体隐性，其整体发病率估计为1:40,000-1:100,000。

临床表征包括严重的和持续的运动和认知障碍，而疾病进程在早发性临床变异体中更严重，通常在生命的前十年内即导致死亡。最近展示了mld患者的表型与其携带的arsa突变类型之间的相关性(cesani等hummutat30,e936-945(2009)；cesani等annneurol75,127-137(2014))。在罹患最为严重的mld变型的儿童中，如果在症状出现前治疗，使用慢病毒载体进行自体hsc转导和曝露于全身白消安处理的hsc基因疗法显示可有效预防或缓解疾病表征(biffietal.science341,1233158(2013)；sessaetal.lancet388,476-487(2016))。

脑白质球状细胞营养障碍(gld)

脑白质球状细胞营养障碍(gld)，也称为克拉伯病，是由溶酶体酶半乳糖脑苷脂酶(galc)缺陷引起的常染色体隐性lsd，galc催化一种重要的髓鞘成分，即半乳糖神经酰胺(galcer)的分解代谢。gld发生率为大约1:100,000。

它通常发生在婴儿中并迅速夺命，但也存在罕见的迟发形式。这种毁灭性的神经退化性病症是由于galc缺陷所引起的鞘糖脂分解代谢的改变：产生的不完全代谢的galcer的累积导致进行性白质损伤疾病，其影响cns以及周围神经系统(pns)。神经鞘氨醇半乳糖苷(或psycosine)也是galc的底物，并且被认为在发病机制中起关键作用。gld儿童可以在临床前期和小于4个月年龄时通过健康相容供体的hct治疗，其可延迟疾病发作并使疾病表征衰减(escolar等nengljmed.352,2069-2081(2005))。hsc基因治疗也被证明在gld临床前模型中有潜在的有效性(gentner等scitranslmed2(2010))。

粘多糖贮积症(mps)

粘多糖贮积症(mps)是由分解糖胺聚糖所需的溶酶体酶的缺失或功能失常引起的一组lsd。根据症状的严重程度将mpsi分为三种亚型。所有三种类型均由酶α-l-艾杜糖苷酸酶的缺乏或水平不足引起。mpsih(也称为hurler综合症或α-l-艾杜糖苷酸酶缺乏症)是mpsi亚型中最严重的，而mpsis，即scheie综合症是mpsi中最温和的形式。mpsih-s，即hurler-scheie综合症，相比独有hurler综合症是较轻的。mpsii，韩特氏综合征或艾杜糖硫酸酯酶缺乏症，是由于缺乏艾杜糖硫酸酯酶引起的。mpsiii，即圣菲利波综合症，以严重的神经(系统)症状为显着特征。共有四种不同类型的圣菲利波综合症，每种由完全分解硫酸乙酰肝素糖链所需的不同酶的改变引起。圣菲利波综合症a型是mpsiii最严重的病症，其由缺少或改变的乙酰肝素n-硫酸酯酶引起。有圣菲利波综合症a型的儿童在mpsiii病症患者中的存活率最低。圣菲利波综合症b型由缺少或缺乏α-n-乙酰葡萄糖胺糖苷酶引起。圣菲利波综合症c型由缺失或改变的乙酰-辅酶a:α-氨基葡萄糖苷n-乙酰基转移酶引起。圣菲利波综合症d型由缺少或缺乏n-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶引起。mpsiv，莫奎欧氏症，是因为缺少或缺乏分解硫酸角质素糖链的酶，n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶(a型)或beta-半乳糖苷酶(b型)。mpsvi，马洛托-拉米氏综合症，具有许多hurler综合症的生理症状，由缺乏n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸盐硫酸酯酶引起。

mpsvii，史莱氏症是粘多糖贮积症最不常见的形式之一，由缺乏β-葡萄糖醛酸苷酶引起。

一些mps患者显示其受益于来自健康相容供体的hct，然而对于另一些mpss，hsc基因疗法的策略正在被优化(visigalli等blood116,5130-5139(2010))。

神经元蜡样脂褐质贮积症(ncl)

神经元蜡样脂褐质贮积症是一类遗传性贮积病症，导致进行性神经退化。一些变异体，例如婴儿ncl(incl)，由缺乏一种溶酶体酶引起。incl由cln2基因的突变引起，该突变导致ppt1缺乏；ppt1是一种负责降解膜蛋白的溶酶体酶。类似地，晚期婴儿ncl(lincl)是由于溶酶体酶tpp1的缺乏。神经元对该贮积材料的溶酶体累积特别敏感，并且罹患incl和lincl的个体在脑的所有部分中具有广泛的、进行性的神经退化，导致植物人状态而在8到12岁时死亡。

x连锁肾上腺脑白质营养不良(x-ald)

x连锁肾上腺脑白质营养不良(x-ald)是一种频率为男性中1:17,000的代谢性遗传疾病，其特征为脑中的进行性的炎性脱髓鞘。位于染色体xq28中的abcd1基因的突变确定了相关ald蛋白功能的丧失，这反过来导致无支化饱和极长链脂肪酸(vlcfas)在磷脂组分如溶血磷脂酰胆碱(lpc)中的累积，特别是在脑和肾上腺皮质中。x-ald的表型变异似乎与脑部炎症有关，脑部炎症主要在儿童中但也在成人中导致神经功能进行性减退。脑脱髓鞘的启动可能与复合脂类中vlcfa的量和小胶质细胞对它们的低效降解直接相关。因此，尽管已显示血管周围的巨噬细胞紧密跟随脱髓鞘损伤的前缘并在髓鞘碎片的去除中发挥关键作用，但小胶质细胞表现不同，其在同一区域中很少，而且在该区域周围的小胶质细胞会凋亡(eichler等annneurol63,729-742(2008))。

eichler等推测，该区域的小胶质细胞不能降解vlcfa，而反过来vlcfa可能导致小胶质细胞激活和凋亡。小胶质细胞的丧失和/或小胶质细胞功能障碍可能在脱髓鞘早期阶段中发挥重要作用，主要由于促炎性细胞因子(ccl2、ccl4、il-1a、cxcl8)的产生和由于向缺陷的少突胶质细胞提供神经保护因子的能力改变。在此情况下，小胶质细胞可能是介入具有脑脱髓鞘迹象的x-ald患者的适合靶标，具有脑脱髓鞘的证据。从这个角度看，hsc移植(aubourg等nengljmed322,1860-1866(1990))以及最近的基因疗法(cartier等science326,818-823(2009)；eichler等nengljmeddoi:10.1056/nejmoa1700554(2017))已被探索作为x-ald的治疗选择。

神经退化性疾病

神经退化性疾病是一类神经疾病，其特征为神经元的结构和/或功能的进行性丧失和/或神经元细胞死亡。炎症已经牵涉到在几种神经退化性疾病中的作用。中，运动和感觉神经元和将感官信息连结到外部物件心智能力的进行性丧失，受到不同种类的神经退化性疾病影响。神经退化性疾病的非限定性实例包含肌萎缩侧索硬化症(als)，例如家族性als或散发性als，和阿尔茨海默症。

小胶质细胞和神经退化之间的关系已经被观察到。als中胶质细胞的激活在疾病进程和病变扩散到其他cns区域中起重要作用。als中小胶质细胞的异常活化协调策划了神经毒性环境。活化的小胶质细胞在ad脑中的aβ斑块附近被发现。

医疗专业人员可通过评估受试者具有一种或多种神经退化性疾病症状来诊断受试者患有神经退化性疾病。受试者的神经退化性疾病的非限定性症状包括：难以抬起脚的前部和脚趾；手臂、腿、脚或脚踝无力；手无力或笨拙；语音不清；吞咽困难；肌肉痉挛；手臂、肩膀和舌头的抽搐；难以咀嚼；呼吸困难；肌肉麻痹；部分或完全丧失视力；复视；身体各处刺痛或疼痛；头部运动时发生的电击感；震颤；不稳定的步态；疲劳；眩晕；失忆；迷失方向；误读空间关系；读写困难；难以集中精神和思考；难以做出判断和决定；难以规划和执行熟悉的任务；抑郁症；焦虑；社交退缩；情绪波动；易怒；侵略性；睡眠习惯的变化；漫游；痴呆；丧失自动活作能力；受损的体态和平衡；僵硬的肌肉；运动迟缓；眼球运动缓慢或异常；非自愿的抽动或扭动身体(舞蹈症)；肌肉的不自主的、持续的挛缩(肌张力不全)；缺乏灵活性；缺乏冲动控制和食欲的变化。医疗专业人员亦可以部分地基于受试者的神经退化性疾病的家族史来诊断。医疗专业人员可以在将受试者转介给医疗机构(例如，诊所或医院)时诊断受试者患有神经退化性疾病。在一些情况下，医疗专业人员可以在受试者被辅助护理机构接纳时诊断受试者患有神经退化性疾病。通常，医生在一种或多种症状呈现后诊断受试者患有神经退化性疾病。

治疗方法

本发明提供治疗疾病和/或其病症或症状的方法，其包括，给予受试者(举例，哺乳动物例如人)治疗有效量的包括本文所述小胶质细胞祖细胞的药物组合物。因此，一个具体例是治疗患有或易患某种疾病或病症或其症状的受试者的方法。该方法包含，在疾病或病症可被治疗的条件下，给予哺乳动物足以治疗疾病或病症或其症状的治疗量的细胞。

本文的方法包含给予受试者(包含被识别为需要此治疗的受试者)有效量的本文所述细胞或本文所述的组合物以产生这种效果。识别需要此治疗的受试者可以是受试者或医疗专业人员的判断，且可以是主观的(例如意见、看法)或客观的(例如通过测试或诊断方法是可测量的)。

移植细胞的植入提供多肽或其他治疗剂的表达或活性。例如，溶酶体酶的功能缺乏或丧失导致溶酶体贮积症。

通过内源或通过重组方法表达治疗性蛋白质(例如酶)的移植的造血细胞植入并分化成为小胶质细胞，因而弥补酶的缺乏。此外，移植的细胞可以作为神经退化性疾病中治疗性多肽的运载工具。

在某些具体例中，通过消融现有的小胶质细胞(例如用烷化剂)来提升植入。特别地，烷化剂的纳米颗粒递送可能有效地产生一种环境，该环境允许来源于移植细胞的小胶质细胞祖细胞专门地植入脑中。此外，通过标准的或创新的路径递送富含骨髓来源小胶质细胞祖细胞的群体可以允许用供体或工程细胞的脑小胶质细胞的持续性重建。

本文的方法包含给予受试者(包含被识别为需要此治疗的受试者)有效量的本文所述化合物或本文所述的组合物以产生这种效果。识别需要此治疗的受试者可以是受试者或医疗专业人员的判断，且可以是主观的(例如意见、看法)或客观的(例如通过测试或诊断方法是可测量的)。此治疗将适当地给予罹患、具有、易患或有患病风险的某种疾病、病症或其症状的受试者，特别是人类。确定“有风险”的受试者可通过诊断测试、或受试者或医疗提供者的意见看法做出任何客观或主观的确定(例如遗传检验、酶或蛋白质标记物、标记物(如本文所定义)、家族史等)。本文的化合物亦可以用于治疗任何其他可能牵涉髓鞘形成缺陷或丧失的病症，包括多发性硬化症。

本发明提供递送包括细胞毒性剂和/或消融小神经胶质细胞或其祖细胞的纳米颗粒的方法，包括给予受试者(举例，哺乳动物例如人类)包括细胞毒性剂的纳米颗粒。

一般来说，“纳米颗粒”是指直径小于1000nm的任何颗粒。在某些优选的具体例中，本发明的纳米颗粒具有500nm或更小的最大尺寸(例如，直径)。在其他优选的具体例中，本发明的纳米颗粒具有25nm至200nm范围内的最大尺寸。在其他优选的具体例中，本发明的纳米颗粒具有100nm或更小的最大尺寸。在其他优选的具体例中，本发明的纳米颗粒具有35nm和60nm范围内的最大尺寸。

本发明包含的纳米颗粒可以以不同的形式提供，例如，作为固体纳米颗粒(举例，金属例如银、金、铁、钛)，非金属，基于脂质的固体，聚合物)，纳米颗粒的悬浮液，或其组合。可以制备金属、电介质和半导体纳米颗粒，以及杂合型的结构(例如，核-壳型纳米颗粒)。由半导体材料制成的纳米颗粒也可以标记为量子点，如果它们足够小(通常10nm之下)，则发生电子能级的量子化。这种纳米级颗粒在生物医学应用中被用作药物载具或成像剂，且可以被调整用于本发明中的相似目的。半固体和软纳米颗粒已被制造出来，且在本发明的范围内。具有半固体性质的原型纳米颗粒是脂质体。目前临床上使用各种类型的脂质体纳米颗粒作为抗癌药物和疫苗的递送系统。一半有亲水性和另一半有疏水性的纳米颗粒被称为janus(詹纳斯)颗粒，且对于稳定乳状液特别有效。它们可以在水/油界面自组装并充当固体表面活性剂。在一个具体例中，基于自组装的生物粘附性聚合物的纳米颗粒被检视，其可应用于药剂的口服递送、药剂的静脉内递送和药剂的鼻腔递送，以上皆为递送到脑。其他具体例，例如口服吸收和疏水性药物的眼部递送也被检视。分子包膜技术涉及工程化的聚合物包膜，其被保护并递送至疾病部位(mazzaetal.,acsnano7,1016-1026(2013)；siewetal.,molpharm9,14-28(2012)；lalatsaetal.,jcontrolrelease161,523-536(2012)；lalatsaetal.,molpharm9,1665-1680(2012)；garrettetal.,jbiophotonics5,458-468(2012)；uchegbu,expertopindrugdeliv3,629-640(2006)；uchegbu等intjpharm224,185-199(2001)；quetal.,biomacromolecules7,3452-3459(2006)。

几种类型的颗粒递送系统和/或制剂已知可用于多样光谱的生物医学应用。通常，颗粒被定义为一个小物体，该物体在其运输和特性的方面表现为一个整体。颗粒根据直径被进一步分类。粗颗粒的大小在2,500到10,000纳米之间。细颗粒的大小在100和2,500纳米之间。超细颗粒，或纳米颗粒，的大小通常在1至100纳米之间。100nm限制是基于如下事实，即将粒子与散装材料区分开的新颖特性通常在小于100nm的临界长度下发展出来。

如本文所用，颗粒递送系统/制剂定义为任何生物递送系统/制剂，其包含符合本发明的颗粒。符合本发明的颗粒是具有小于100微米(μm)的最大尺寸(例如直径)的任何实体。在一些具体例中，本发明的颗粒具有小于10微米的最大尺寸。在一些具体例中，本发明的颗粒具有小于2000纳米(nm)的最大尺寸。在一些具体例中，本发明的颗粒具有小于1000纳米(nm)的最大尺寸。在一些具体例中，本发明的颗粒具有小于900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm或100nm的最大尺寸。通常，本发明的颗粒具有500nm或更小的最大尺寸(例如直径)。在一些具体例中，本发明的颗粒具有250nm或更小的最大尺寸(例如直径)。在一些具体例中，本发明的颗粒具有200nm或更小的最大尺寸(例如直径)。在一些具体例中，本发明的颗粒具有150nm或更小的最大尺寸(例如直径)。在一些具体例中，本发明的颗粒具有100nm或更小的最大尺寸(例如直径)。在本发明的一些具体例中使用较小的颗粒，例如具有50nm或更小的最大尺寸。在一些具体例中，本发明的颗粒具有25nm至200nm范围内的最大尺寸。

颗粒的特征化(包含例如，描绘形态、尺寸等)使用了各种不同的技法。常用技法有：电子显微镜(tem穿透式电子显微镜、sem扫描式电子显微镜)，原子力显微镜(afm)，动态光散射(dls)，x射线光电子能谱分析(xps)，粉末x射线衍射(xrd)，傅立叶变换红外光谱(ftir)，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(maldi-tof)，紫外可见光谱，双偏振干涉法和核磁共振(nmr)。可以对天然颗粒(即，预装)或在装载货物之后进行特性分析(尺寸测量)(本文中的货物是指例如crispr-cas系统的一种或多种组分，例如crispr酶或mrna或指导rna，或其任何组合，且可包含另外的载具和/或赋形剂)，以提供最佳尺寸的颗粒，用于本发明的任何体外、离体和/或体内应用的递送。在某些优选的具体例中，颗粒尺寸(例如直径)的特性分析是基于使用动态激光散射(dls)的测量。

本发明范围内的颗粒递送系统可以任何形式提供，包括但不限于固体、半固体、乳化液或胶体颗粒。因此，本文描述的任何递送系统可以在本发明范围内作为颗粒递送系统。

抗体

如本文所报道的，特异性结合标记物(例如小胶质细胞或其前体的)的抗体可用于本发明的方法，包括治疗方法。在特定的具体例中，本发明提供消融小胶质细胞的方法，该方法包括使小胶质细胞与具有捕获分子的纳米颗粒接触，而该捕获分子特异性结合小神经胶质细胞的标记物并含有细胞毒性剂(例如烷化剂)。

抗体可以是来源于自然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白，且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。四聚体可以是自然存在的或由单链抗体或抗体片段重构。如本文所用，术语“抗体”不仅意指完整的抗体分子，还意指保留免疫原结合能力的抗体分子的片段。此类片段也是本领域熟知的，且在体外和体内都经常被使用。抗体片段的实例包括但不限于：fab、fab'、f(ab')2和fv片段、线性抗体、scfv抗体、单结构域抗体(例如由对靶标展现出足够亲和力的一个vl或一个vh结构域组成的骆驼抗体(riechmann1999,journalofimmunologicalmethods231:25-38))，和由抗体片段构成的多特异性抗体。

本发明中的抗体可以以多种形式存在，包含例如多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab')2、以及单链抗体(scfv)、人源化抗体和人抗体(harlowetal.,1999,in:usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,ny；harlowetal.,1989,in:antibodies:alaboratorymanual,coldspringharbor,newyork；houston等,1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；bird等,1988,science242:423-426)。例如，f(ab')2和缺少完整抗体fc片段的fab片段，从循环中更快地清除，且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(wahl等,j.nucl.med.24:316-325(1983))。因此，本发明的抗体包括但不限于：全天然抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、fab、fab'、单链v区片段(scfv)、融合多肽和非常规抗体。

非常规抗体包含但不限于纳体(nanobody/纳体为开发该单域抗体技术的赛诺菲-ablynx公司的商标)、线性抗体(zapata等proteineng.8(10):1057-1062,1995)、单结构域抗体、单链抗体和具有多个化合价的抗体(例如，双价抗体、三价抗体，四价抗体和五价抗体)。纳体是自然存在的重链抗体的最小片段，其在没有轻链的情况下已进化为具有完全功能性。纳米抗体具有常规抗体的亲和力和特异性，尽管它们仅是单链fv片段的一半大小。这种独特的结构、它们的极端稳定性和与人抗体框架的高度同源性三者相结合的结果，使得纳米抗体可以结合常规抗体无从接近的治疗靶标。具有多种化合价的重组抗体片段提供对癌细胞的高结合亲合力和独特的靶向特异性。这些多聚体scfvs(例如双价抗体、四价抗体)提供了对亲本抗体的改进，因为大小约60-100kda的小分子提供更快的血液清除和快速组织摄取。参见power等(generationofrecombinantmultimericantibodyfragmentsfortumordiagnosisandtherapy.methodsmolbiol,207,335-50,2003)；和wu等(anti-carcinoembryonicantigen(cea)diabodyforrapidtumortargetingandimaging.tumortargeting,4,47-58,1999).

制备和使用非常规抗体的各种技术已被描述。kostelny等描述了使用亮氨酸拉链生产双特异性抗体(j.immunol.148(5):1547-1553,1992)。hollinger等描述了二价抗体技术(proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448,1993)。gruber等描述了通过使用单链fv(scfv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略(j.immunol.152:5368,1994)。tutt等描述了三特异性抗体(j.immunol.147:60,1991)。。单链fv多肽抗体包含一个共价连接的vh::vl异二聚体，其可以从包含vh-和vl-编码序列的一段核酸表达出来，所述vh-和vl-编码序列是直接连接，或通过一个肽编码的连接子连接，如huston等所描述(proc.nat.acad.sci.usa,85:5879-5883,1988).也请参见美国专利nos.5,091,513,5,132,405and4,956,778；以及美国专利出版物nos.20050196754and20050196754。

在各种具体例中，抗体是单克隆的。或者，抗体是多克隆抗体。多克隆抗体的制备和使用也是本领域技术人员已知的。本发明亦包括杂合抗体，其中一对重链和轻链从第一个抗体得到，而另一对重链和轻链从不同的第二个抗体得到。这种杂合体也可使用人源化的重链和轻链形成。此类抗体通常被称为“嵌合”抗体。

通常，完整抗体可说含有“fc”和“fab”区。fc区参与补体激活且不参与抗原结合。已经被酶切掉fc'区的抗体或者生产时即无fc'区的抗体，被指为“f(ab')2”片段，保留了完整抗体的两个抗原结合位点。类似地，已经被酶切掉fc'区的抗体或者生产时即无fc'区的抗体，被指为“fab”片段，保留了完整抗体的一个抗原结合位点。fab片段由共价结合的抗体轻链和抗体重链的一部分组成，表示为“fd”。fd片段是抗体特异性的主要决定因素(单个fd片段可与多达十个不同的轻链相关联而不改变抗体特异性)。分离的fd片段保留特异性结合免疫原性表位的能力。

制备抗体的方法是免疫科学领域普通技术人员所熟知的。可以通过本领域已知的任何方法，利用可溶性多肽或其免疫原性片段作为免疫原来制备抗体。得到抗体的一种方法是用免疫原去免疫合适的宿主动物，并遵循多克隆或单克隆抗体生产的标准流程。免疫原将促进免疫原在细胞表面上的呈递。免疫合适的宿主可以用多种方式完成。编码多肽或其免疫原性片段的核酸序列可以由递送运载工具提供给宿主，其被宿主的免疫细胞摄取。细胞将反过来表达多肽，因而在宿主中产生免疫原性应答。或者，编码人类多肽或其免疫原性片段的核酸序列可以在细胞中体外表达，然后分离多肽并将多肽给予合适宿主，其体内将产生抗体。

或者，如果需要，抗体可以来源于抗体噬菌体展示文库。噬菌体能够感染且在细菌内繁殖，可以被工程化；当与人类抗体基因相结合时，即可以展示人类抗体蛋白质。噬菌体展示是使噬菌体在其表面上“展示”人类抗体蛋白质的过程。将来自人类抗体基因文库的基因插入噬菌体群体中。每个噬菌体携带不同抗体的基因，因此在其表面上显示不同的抗体。

然后可以通过本领域已知的任何方法从宿主中纯化制备好的抗体。抗体纯化方法可包括：盐沉淀(例如用硫酸铵)、离子交换层析(例如，在阳离子或阴离子交换柱上，优选在中性ph下运行并用离子强度渐增的阶跃梯度洗脱)、凝胶过滤层析(包含凝胶过滤hplc)、以及用亲和性树脂例如如蛋白a、蛋白g、羟基磷灰石和抗免疫球蛋白的层析法。

抗体可以从表达该抗体的工程化杂交瘤细胞中方便地生产。制备杂交瘤的方法是本领域熟知的。杂交瘤细胞可以在合适的培养基中培养，且用过的培养基可以用作抗体来源。编码目标抗体的多核苷酸可以反过来从生产抗体的杂交瘤中获得，然后抗体可以从这些dna序列合成或重组生产出来。为了生产大量抗体，得到腹水液通常更方便。养成腹水的方法通常包括将杂交瘤细胞注射到免疫学上幼稚的组织相容性或免疫耐受性哺乳动物，尤其是小鼠中。通过预先给予合适的组合物(例如姥鲛烷)，可以对哺乳动物进行引发以产生腹水。

通过本发明方法生产的单克隆抗体(mabs)可以通过本领域已知的方法“人源化”。“人源化”抗体中的至少部分序列已经从其初始形式被改变，使其更像人类免疫球蛋白。当产生非人类动物(例如鼠)抗体时，人源化抗体的技法特别有用。人源化鼠抗体的方法的实例在以下文献中提供：美国专利4,816,567,5,530,101,5,225,539,5,585,089,5,693,762和5,859,205。

重组多肽的表达

为了表达本发明的多肽，通过本领域熟知的技法，可以将通过本文所述的任何方法或本领域已知的方法得到的dna分子插入到适合的表达载体中。例如，可以通过限制酶连接，包括使用合成的dna连接子或通过平末端接合，将双链dna克隆到合适的载体中。dna连接酶通常用于连接dna分子，且可以通过用碱性磷酸酶处理来避免不希望的连接。

因此，本发明包含载体(例如重组质粒)，其包含如本文所述的核酸分子(例如，基因或编码基因的重组核酸分子)。术语“重组载体”包含已经被改变、修饰或工程化的载体(例如质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒、粘粒/柯斯质粒(cosmid)、福斯质粒(fosmid)或其他纯化的核酸载体)，使得其比起自身所来源于的天然或自然核酸分子的序列含有更多、更少或不同的核酸序列。例如，重组载体可包含编码多肽或其片段的核苷酸序列，其被可操作地连接于调节序列，例如本文所定义的启动子序列和终止子序列等。允许表达自身所包含的基因或核酸的重组载体称为“表达载体”。

在本文所述的本发明的一些分子中，具有编码本发明的一种或多种多肽的核苷酸序列的一种或多种dna分子是与一种或多种调节序列可操作地连接，该调节序列能够将所需的dna分子整合到原核宿主细胞中。被引入的dna稳定转化的细胞可以被选择，例如，通过引入一种或多种标记物来选择，该标记物允许选择含有表达载体的宿主细胞。可选择的标记物基因可以直接与待表达的核酸序列连接，或通过共转染引入同一细胞。亦可能需要额外的元件来达到本文所述的蛋白质最优合成。使用哪些额外元件对于本领域普通技术人员是显而易见的。

选择某一特定质粒或病毒载体的重要因素包括但不限于：识别含有载体的受体细胞并把它们从不含载体的受体细胞中挑选出来的容易程度；特定宿主所需载体的拷贝数；以及是否希望能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”载体。

当包含欲表达的dna序列的载体建构完成，即可以通过本领域已知的多种合适方法中的一种或多种将其引入适合的宿主细胞，方法包括但不限于例如：转化、转染、接合(conjugation)、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀和直接显微注射等。

在引入一种或多种载体后，宿主细胞通常在选择性培养基中生长，该选择培养基选择含有载体的细胞的生长。重组蛋白的表达可以通过免疫测定法检测，包含蛋白质印记法(westernblot)分析、免疫印迹法和免疫荧光。重组蛋白的纯化可以通过本领域已知的或本文描述的任何方法完成，例如，包括提取、沉淀、层析法和电泳的任何常规方法。可用于纯化蛋白质的进一步纯化方法是使用结合靶标蛋白的单克隆抗体的亲和层析。通常，将含有重组蛋白的粗制剂通过固定有合适单克隆抗体的柱。当杂质通过时，蛋白质通常通过特异性抗体与柱结合。洗涤柱后，例如通过改变ph或离子强度从凝胶中洗脱蛋白质。可用于纯化蛋白质的进一步纯化程序是使用结合靶蛋白的单克隆抗体的亲和层析。通常，将含有重组蛋白的粗制剂通过其上固定有合适的单克隆抗体的柱。当杂质通过时，蛋白质通常通过特异性抗体与柱结合。洗涤柱后，例如通过改变ph或离子强度从凝胶中洗脱蛋白质。

评估治疗功效的方法

在一种方法中，治疗功效是通过测量例如被治疗的器官的生物学功能(例如神经元功能)来评估。这些方法是本领域的标准方法，并且被描述于例如textbookofmedicalphysiology，第10版(guytonetal.，w.b.saundersco.，2000)。特别地，本发明的方法将一组织或一器官的生物学功能提高至少5％，10％，20％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，150％，200％，或甚至高达300％，400％或500％。优选地，组织是神经元组织，以及优选地，器官是脑。

在另一种方法中，与相应对照组的组织或器官(例如未接受治疗的组织或器官)相比，通过测量被治疗组织或器官中细胞数量的增加来测定本发明方法的治疗功效。优选地，组织或器官中的细胞数相对于相应组织或器官增加至少5％，10％，20％，40％，60％，80％，100％，150％或200％。用于测定细胞增殖的方法是本领域技术人员已知的，且被描述于例如bonifacinoetal.(currentprotocolsincellbiologyloose-leaf,johnwileyandsons,inc.,sanfrancisco,calif.)。例如，用于细胞增殖的测定可包括在细胞复制期间测量dna合成。在一个具体例中，使用标记的dna前体，例如[^3h]-胸腺核苷或5-溴基-2*-去氧尿苷[brdu]检测dna合成，将其加入细胞(或动物)中，然后这些前体在细胞周期s期(复制)时对基因组dna的并入被检测到(ruefli-brasseetal.,science302(5650):1581-4,2003；guetal.,science302(5644):445-9,2003)。

试剂盒

本发明提供用于治疗或预防中枢神经系统的神经疾病或病症(例如，贮积症，溶酶体贮积症，神经退化性疾病等)的试剂盒。在一个具体例中，试剂盒包含含有表达治疗性多肽的分离的造血干细胞的组合物。

在另一个具体例中，试剂盒包含用于消融内源性小神经胶质细胞的纳米颗粒。

在一些具体例中，试剂盒包括无菌容器，其含有治疗性或预防性的细胞组合物；这种容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小药瓶、管子、袋子、小袋，泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸，金属箔或适于容纳药物的其他材料制成。

如果需要，本发明的药剂会与患有中枢神经系统之神经疾病或病症或发病风险增高的受试者的给药说明书一起提供。说明书通常包含关于使用组合物用于治疗或预防疾病或病症的信息。在其他具体例中，说明书包含以下中的至少一种：治疗剂的描述；用于治疗或预防神经疾病或其症状的剂量时程和给药；注意事项；警告；适应症；禁忌症；药物过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接印在容器上(如果有时)，或为贴在容器上的标签，或为在容器中或与容器一起提供的单独的纸页、小册子、卡片或文件夹。

除非另有说明，本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，相当地在本领域技术人员的知识范围内。这些技法在文献中有充分的解释，例如：“molecularcloning:alaboratorymanual”,secondedition(sambrook,1989)；“oligonucleotidesynthesis”(gait,1984)；“animalcellculture”(freshney,1987)；“methodsinenzymology”“handbookofexperimentalimmunology”(weir,1996)；“genetransfervectorsformammaliancells”(millerandcalos,1987)；“currentprotocolsinmolecularbiology”(ausubel,1987)；“pcr:thepolymerasechainreaction”,(mullis,1994)；“currentprotocolsinimmunology”(coligan,1991).这些技法适用于生产本发明的多核苷酸和多肽，而因此可以在制备和实施本发明时考虑这些技术。用于特定具体例的特别有用的技术将在以下部分中讨论。

提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的测定、筛选和治疗方法的完整公开和描述，并非意图限制发明人所视本发明的范围。

实施例

实施例1.脑室内注射鼠hspc导致脑中的快速和稳健的髓样细胞植入

最近的研究结果(capotondoetal.,pnas2012)提出，骨髓造血生态位中的植入和持续的供体嵌合可能不是得到hct后的脑中髓样细胞重建所必需的。基于这些发现，评估了在处理小鼠中、将hspc直接移植到脑室空间中时，是否可能发生髓样和小胶质细胞样细胞重建。以gfp-编码的慢病毒载体(lvs)标记鼠谱系阴性(lin^-)hspc(3x10⁵个细胞)，并icv注射移植到小鼠中，该小鼠之前已曝露于骨髓消融性白消安剂量或致死照射(图1a)。有趣的是，移植导致icv移植小鼠的cd45⁺cd11b⁺脑髓样区室中的高且渐增的gfp嵌合体，可以想象是来源于移植细胞的局部增殖(图1b)。对于每个时间点和条件，使用iv移植了gfp⁺hspc的对照小鼠作为比较项。值得注意的是，与iv相比，当icv移植gfp⁺hspc时，小胶质细胞重建的动力学更快且gfp嵌合体的程度更高(图1b)(双向方差分析显示细胞给予路径和时间的显着效果)。此结果是非常显着的，因考虑到与iv相比，icv移植的细胞数量较少。与iv注射的情况一样，在icv细胞移植时，与照射动物相比，用白消安处理的受体小鼠显示更高的脑髓样细胞供体嵌合体。

来自icv移植小鼠的细胞注射的对侧的矢状脑切片的免疫荧光分析一致地展示了在整个受体小鼠脑中分布的丰富的表达gfp的供体来源的细胞(图1c)。gfp⁺iba1⁺分枝的实质细胞经常分组成小簇，在嗅球、下丘脑区、基底核、侧脑室下区及周围区域、纹状体和脑桥中回收到最高的gfp⁺细胞频率(图1d)。重要的是，gfp⁺细胞形态类似于实质内小胶质细胞，其具有分枝和在移植后相对短期(45-60天)已远离细胞体的薄突起。

实施例2.脑室内注射人类hspc导致脑中的快速和稳健的髓样细胞植入

为了深入了解该现象的临床相关性，测试了人类hspc在处理的免疫缺陷动物模型中在icv递送后产生小胶质细胞样细胞的能力。从脐带血中分离人类cd34⁺细胞，用编码gfp的lvs转导，以icv或iv注入到nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wji/szj(nsg)小鼠中(图1e)。此外，为了确定icv细胞移植在增强移植物将治疗性分子递送入脑的潜力方面的实际作用，采用了新产生的小鼠模型rag^-/-γ-chain^-/-as2^-/，其复制了免疫缺陷背景的由于缺乏芳基硫酸酯酶a引起的溶酶体疾病异染性脑白质营养不良症(mld)。这些小鼠通过仅iv注射、仅icv注射或通过iv和icv路径组合接受了经编码arsa的lvs(biffietal.,science341,1233158(2013)；sessaetal.,lancet388,476-487(2016))转导的人类脐带血cd34⁺细胞(图1e)。

有趣的是，在iv和icv移植后长期都在移植小鼠脑中识别出明确定义的人类髓样(cd45⁺cd11b⁺)细胞后代(图1f)。与iv递送相比，icv细胞递送导致脑中更多的人类细胞植入(图1g)。与iv组合的icv细胞递送导致脑中甚至更多的人类细胞植入(图1g)。在所有测试过的移植设置中，人类细胞在细胞荧光测定中大体上表达小胶质细胞标记物cx3cr1和cd11b(图1f)。植入的细胞分布在脑实质内，且显示小胶质细胞的形态特征。植入的细胞亦表达iba1和cd11b(图1h)标记物，但不表达cd68和cd163(图1h)，其主要与巨噬细胞相关。在icv递送的情况下，识别到的后代细胞通常分组成小簇；该相同区域中识别到icv移植的鼠hspc的子代细胞，即在脑室下区。

实施例3.icv注射的hspc在脑中植入和扩张，而它们不植入造血器官中

对iv或icv移植了有gfp标记的lin^-hspc的小鼠的短期流式细胞仪监测，展示了受体动物脑中icv递送细胞的存在、持续和缓和的扩张(图2a)。相反，在icv移植小鼠的骨髓中仅检测到可忽略量的gfp⁺细胞(<1％)(图2b)。gfp⁺细胞瞬时上调早期造血标记物(图2c)，而后cd11b，cx3cr1和cd115小胶质细胞标记物才达到与内源性小胶质细胞相似的水平(图2d)。gfp^-cd45⁺内源性细胞瞬时且略微下调cd115，是为白消安处理的可能效果(图2d)。

实施例4.优化的组合移植方案允许调节iv移植细胞与icv移植细胞的相对贡献，以用于适当的临床应用

在经处理的受体中开发用于细胞和基因治疗的icv细胞递送需要根据不同的预见靶标疾病优化移植条件-根据疾病设定不同目标，对不同目标应用不同选择。特别的，可以设想两种情况：

a)重建造血组织(包含cns外的髓样细胞群)和小胶质细胞两者，用如下方法：i)自体基因校正或ii)移植来自健康供体hsc后，用于治疗全身和神经系统受累的sd，目标是达成小胶质细胞高效快速的重建；适用此手段的疾病例子包含mld，gld，mpsi，mpsii和mpsiii。

b)用自体基因已校正的hsc移植后重建小胶质细胞，用于治疗具有专门针对神经系统受累或神经退化性疾病的sd；适用此手段的疾病例子包含incl，gm1神经节苷脂贮积症，pd，als，ad。

为了开发用于这两种设置、用供体来源细胞更新脑髓样细胞群的有效方案，我们差异性标记了在不同时间(iv和icv在同一天递送或iv在icv后第5天递送)将被iv移植(根据在lin^-,ckit⁺sca1⁺lin^-(ksl)细胞与总bm细胞中的来源和成熟阶段区分)和icv移植(lin^-hspc)的细胞(图3b和3g)。在这些设置中，icv移植细胞的后代仍然局限于cns，且在造血组织中，即在bm中，未检测到显着水平(图3d和3h)。重要的是，与每种测试设置中与仅lin^-iv的对照条件相比，hspc或ksls或总bm与hspcicv的联合递送都导致脑髓样细胞嵌合体增加。此外：

a)iv和icv注射的hspc对脑髓样嵌合体的贡献在特定条件下是相同的；特别的，在脑和bm水平的更多细胞嵌合体，以及由icv和iv细胞后代组成的脑嵌合体，是通过结合iv和icvlin^-hspc并在同一天在两处移植细胞来实现的；通过结合lin^-icv与总bmiv得到类似的结果，而在所有测试条件下使用ksliv稍稍减少了嵌合体；因此，该方案可应用于如mld或mpsii的条件下，如图6所描述。对于该方案的，作为一种旨在促进移植细胞/其后代的稳定条带固定脑植入的联合/共同移植手段的，临床转化，我们可以设想以下选择：在基因疗法的情况下，已被编码各疾病目标基因的载体转导的自体cd34⁺细胞(人类lin^-细胞的等同物)，将在同一天以icv和iv移植；在使用同种异体健康供体细胞的情况下，供体cd34⁺细胞将以icv给予，而未经操作的骨髓或血球分离的产品将在icv移植的同一天iv移植；

b)在特定条件下，icv注射的hspc对脑髓样嵌合体的贡献胜过iv共注射的hspc的贡献；特别的，在lin^-细胞icv和总bm细胞iv的组合移植后第5天的高嵌合体数值的背景下，达到了iv细胞后代对脑嵌合体的最低贡献；该方案允许得到几乎完全是icv细胞后代的嵌合体，因此可被用于专一性cns受累的相关情况下，例如图7a-7e所述的incl。对于该方案的，作为旨在产生移植的工程化细胞/其后代的专一性脑植入的一种联合/共同移植手段的，临床转化，我们可以设想以下选择：已被编码各疾病目标基因的载体转导的自体cd34⁺细胞将以icv移植，而未经操作的自体骨髓或血球分离的产品可以在icv注入的同一天、或理想情况为icv注入5天后以iv注入，以进一步减少与icv移植细胞的竞争；我们不预期该方案被用于同种异体设置中，其需要移植细胞的造血植入来建立对供体的耐受性。

实施例5.iv与icv移植的hspc后代细胞都具有与小胶质细胞一致的转录图谱

hct后的脑髓样细胞的供体重建显示是由于，一部分在骨髓消融受体脑中找到有利环境的早期脑hspc移入者的局部扩张和分化(capotondoetal.,procnatlacadsciusa.109,15018-15023(2012))。移植后的脑髓样细胞与从新生小鼠脑中分离的髓样细胞共享抗原特征(图3b和4b)。实际上，在两种情况下，cd45⁺cd11b^low髓样细胞，被我们先前描述为瞬时扩增小胶质细胞(taμ)，是丰富的。有趣的是，来自移植小鼠脑的taμ细胞在早期的移植后阶段是高度且被优先富集的供体元件(图4b)，而仅在晚期的移植后期，类似高水平的供体嵌合体可在cd45⁺cd11b^+/high细胞内观察到，其基于抗原和形态学特征鉴定为小胶质细胞(μ)(capotondoetal.,procnatlacadsciusa.109,15018-15023(2012))。有趣的是，我们观察到icv注射的hspc的cd45⁺cd11b^highgfp⁺μ后代比iv注射细胞的μ后代更丰富，前者存在相似但总体更高的对taμ细胞的贡献(图4a)。为了解释这些发现并进一步特性分析供体来源的细胞，我们用facs分选了μ和taμ细胞(总群体和/或gfp⁺相对gfp^-部分)(图4b)，细胞来自90天前icv或iv移植了gfp⁺hspc的经白消安处理的小鼠，以及成年和p10对照动物。先前识别的小胶质细胞基因通过实时pcr被扩增(tmem119,tgfbr1,p2ry13,mertk,olfml3)(bennetetal.,proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica113,e1738-1746(2016)；butovskyetal.,natureneuroscience17,131-143(2014)；chiuetal.,cellrep4,385-401(2013)；hickmanetal.,natureneuroscience16,1896-1905(2013)；grommesetal.,journalofneuroimmunepharmacology3,130-140(2008))，以被分选的脑髓样细胞，

以及来自成年对照动物的骨髓巨噬细胞为样品。将从icv和iv移植小鼠的脑中分离的细胞与小胶质细胞基因表达图谱进行比较，并得到tukey's事后检验的anova之p值。有趣的是，从icv和iv移植小鼠的脑中分离的细胞显示这些基因表达的水平与从对照小鼠中分离的μ细胞的水平相似，而不是巨噬细胞的(图4c)。此外，在μ和taμ两个组分中，icv移植的hspc的gfp⁺后代显示出与成年对照μ和来自iv移植小鼠的μ(gfp^-和gfp⁺)非常相似的表达水平。所选基因在iv移植小鼠(特别是gfp⁺)的taμ群体和从p10小鼠分离的taμ中以略低的水平表达。所有这些指出：i)iv-和icv-移植的hspc的后代细胞具有与小胶质细胞一致的转录图谱，且ii)在脑中，icv注射的hspc的后代细胞与iv注射的hspc的后代相比，更类似于小胶质细胞。

实施例6.来自移植小鼠脑的髓样细胞显示成熟小胶质细胞的相似功能特征

为了分析来自移植小鼠的μ和taμ细胞与从对照天然动物中回收的成熟μ之间的转录组差异，通过illuminarna-seq平台，对来自3个月前用gfp-表达hspc移植的小鼠的以及来自成年和p10对照天然小鼠的分选的μ和taμ群体进行全基因组表达分析(图4d和4e)。为了检查它们的差异性基因表达，得到的表达数据集与来自于gosselin及同事(gosselinetal.,cell159,1327-1340(2014))的数据集一起分离出来，并特别聚焦于由butovsky所识别的239个基因(butovskyetal.,natureneuroscience17,131-143(2014))(图4d和4e)。有趣的是，该分析中包含的所有小胶质细胞样品彼此紧密地群聚(图4d和4e)，证实移植后重建的μ和taμ细胞共享与小胶质细胞一致的基因表达模式。在rna-seq数据上执行与gsea预先排序分析(subramanianetal.,procnatlacadsciusa102,15545-15550(2005))耦合的差异化基因表达(图5a-5f)。相对于移植小鼠的μ(图5a)和taμ(图5c)，从成年对照μ中所得到的富集的geneontology(go)生物过程，是与免疫细胞分化、免疫应答、dna/rna处理和dna甲基化有关，指向对照μ的成熟的免疫功能。另一方面，移植小鼠μ细胞(图5b)富集的(生物)过程涵盖神经元相关过程，例如神经元迁移、分化和神经突触可塑性的调节(colonnaandbutovsky,annurevimmunol,(2017)；tayetal.,jphysiol595,1929-1945(2017))。在富集的过程中，我们亦发现胶质细胞分化、胶质细胞增生、代谢和细胞呼吸/呼吸作用，此结果支持如下构想；移植来源的μ细胞更趋向于与神经元环境相互作用/影响神经元环境，其过程消耗大量能量(miyamotoetal.,frontcellneurosci7,70(2013))。移植后taμ富集的过程(图5d)呈现出更强烈的、且为μ细胞一个推定的不同成熟阶段根本的神经功能特征，与小胶质细胞根据其成熟状态获得不同功能的概念相一致(matcovitch-natanetal.,science353,aad8670(2016))。有趣的是，来自移植小鼠的μ和taμ细胞表达已被证明在小胶质细胞发育过程中被稳健调节的一些基因(matcovitch-natanetal.,science353,aad8670(2016))。值得注意的是，来自移植动物的μ与对照μ，在与成熟小胶质细胞功能相关的5个选定基因中，有4个的表达水平不相上下，而不同的途径在来自移植小鼠的taμ中观察到(图5e和表2)，在与新生仔阶段相关的基因中观察到(图5f和表2)，可能与不同的及动态的成熟阶段有关。

表格2.不同目标对比的误判率(benjamini-hochberg)校正后的调节的ttest(limma)

对比

μbutxvstaμ.butxμctvsμbutxp10.taμvsμ.butxμctvstaμ.butxp10.taμvstaμ.butxμctvsp10.taμ

注：limma＝empiricalbayestest经验贝叶斯检验

fdr＝falsediscoveryrate误判率

ct＝control对照，butx＝bu-treated白消安(骨髓消融)处理的，

μ＝小胶质细胞，taμ＝transientlyamplifyingμ瞬时扩增的小胶质细胞。

实施例7.天然或移植后小鼠的脑实质相关的造血细胞具有克隆形成和造血再增殖潜力和小胶质细胞重建潜力

hspc已经在髓外组织中被识别到，被认为在那些位置瞬时定位并能够局部增殖而产生组织驻留的髓样细胞，优选是树突细胞。克隆形成的潜力指向在脑中也有这些细胞的存在，然而，在建立连体对时，与在其他髓外组织中所观察到的不同，在脑中未观察到两种动物之间的嵌合现象。这可能表明，脑克隆形成的活性可能归因于固定的组织细胞，其不适合于连体对中的嵌合体，如对小胶质细胞祖细胞所假设的那样。因此，试图更好地特性分析脑中有克隆形成潜力的细胞并评估它们是否可被移植、在处理时它们是否可被消融、以及在处理小鼠中移植hsc时它们是否可被替换。进一步的工作也将用于确定这些细胞是否确实具有小胶质细胞再增殖潜力。从没有或没有添加gfp-lv转导的谱系阴性hspc的天然小鼠和接受致死性骨髓消融(以白消安或照射处理)的动物的骨髓和脑(percoll(一种梯度分离液)富集的造血谱系细胞)中分离单核细胞(图6a)。将这些细胞培养在补充了细胞因子的甲基纤维素中，用于集落形成单位(cfu)的产生。培养后14天，离散的造血集落从天然小鼠的骨髓和脑培养物中如预期的被回收(图6b)。白消安和照射处理后观察到来自骨髓和脑组织的cfu输出都急剧减少，其中白消安对脑cfu输出的影响更大。重要的是，在骨髓和脑中的cfu输出在冰疗复苏时从移植处理中恢复(图6c)。cfu输出在两个位置的gfp⁺集落中是高度嵌合的，表明hspc移植可以促成固定的脑造血克隆形成祖细胞。来自初级移植受体的经percoll富集的骨髓和脑的单核细胞也用于二次移植到白消安处理的受体中(图6a)。惊奇的是，来源于初级受体的gfp⁺细胞在移植后长时间内，仍能次级受体的造血组织和脑中被识别到(图6d)。造血组织驻留的gfp⁺细胞显示多谱系标记物表达，而脑驻留细胞主要表达cd11b。

实施例8.工程化hspc的icv+iv联合递送具有对异染性脑白质营养不良症的治疗相关性，一种有神经退化性和cns外特征的代表性lsd

为了确定icv细胞移植在增强移植物将治疗性分子递送入脑的潜力方面的实际作用，采用了新产生的小鼠模型rag^-/-γ-chain^-/-as2^-/，其复制了免疫缺陷背景的由于缺乏芳基硫酸酯酶a引起的溶酶体疾病异染性脑白质营养不良症(mld)。这些小鼠通过仅iv注射、仅icv注射或通过iv和icv路径组合接受了经编码arsa的慢病毒lvs(biffietal.,science341,1233158(2013)；sessaetal.,lancet388,476-487(2016))转导的人类脐带血cd34⁺细胞(图1d和图6a)。有趣的是，在iv和icv移植后长期都在移植小鼠脑中识别出明确定义的人类髓样(cd45⁺cd11b⁺)细胞后代(图1d-1g)。与iv递送相比，icv细胞递送导致脑中更多的人类细胞植入(图1g)。与iv递送相比，icv细胞递送导致脑中更多的人类细胞植入(图1g)。然后评估rag^-/-γ-chain^-/-as2^-/-小鼠脑中更多的人类细胞髓样嵌合体是否可以确定更多的arsa酶向脑的递送。重要的是，icv-移植的人类hspc对脑髓样细胞嵌合体的贡献的增加导致更多的arsa酶递送至移植小鼠的脑(图1g)。这对于iv+icv联合递送尤其显着，其达到与as2^+/+对照无法区分的水平。移植后16周，在仅iv移植或iv+icv移植转导细胞的小鼠骨髓中测量到堪比高于正常的arsa活性水平(图6b)。有趣的是，亦在移植小鼠的脑中测量到酶活性的恢复，在以iv和icv组合接受转导细胞的动物中观察到趋向野生型水平的有利增加趋势(图6b)。该数据展示，与标准iv移植手段相比，联合移植手段允许向脑递送更多的酶，因此似乎可作为增加hsc基因疗法对于cns受累sd的总体治疗潜力的有前途的策略。此外，它表明仅icv递送hspc足以像iv细胞递送一样，递送相同量的治疗酶到mld脑中。

共移植不会导致造血系统中酶活性增加。不希望受理论束缚，这表明icv递送的细胞的贡献主要限于脑，而非cns外的造血细胞群。

该动物模型的短寿命和短期内其表型的有限严重性妨碍了对增加的脑arsa递送的表型效应的评估。然而，已经展示当将lv转导的hsc(hsc基因疗法)施用于mld小鼠(biffietal.,j.clin.invest.116,3070-3082(2006)；biffietal.,j.clin.invest.113,1118-1129(2004))和患者(biffietal.,science341,1233158(2013)；sessaetal.,lancet388,476-487(2016))，以及其他溶酶体贮积病模型时，存在剂量-效应关系，即造血细胞和脑中的重建酶的活性越高，控制cns疾病表征的治疗效能越大。因此，使用icv细胞递送具有增强移植基因已校正的hspc的治疗效能的潜力。

实施例9.野生型hspc的icv+iv联合递送具有粘多糖贮积症ii型的治疗相关性，一种有神经退化和cns外特征的代表性lsd

为了证实这些发现，特别是icv细胞移植在增强hspc移植物将治疗性分子递送入脑的潜力方面的实际作用，且对脑和全身受累的lsd施加益处，野生型供体的lin^-hspc和总bm被移植到2个月大的骨髓消融的艾杜糖硫酸酯酶缺失(ids^-/-)受体中，该受体为粘多糖贮积症ii型的小鼠模型(图6c)。仅iv小鼠是完全从野生型ids^+/+供体中以iv接受总bm。对照未经处理。180天后，通过转棒仪试验测试经处理的和对照小鼠的行为。有趣的是，两种治疗均改善了4次试验中的小鼠的转棒仪表现(图6d)，且与第一次试验相比，iv和icv+iv处理的小鼠在第四次时增加了棒上时间(图6e)。然而，icv+iv处理的小鼠的表现超过仅iv移植动物的表现。不希望受理论束缚，这表明使用icv细胞递送在mpsii中具有增强野生型hspc移植的治疗效能的潜力。

实施例10.小鼠中hla-次要和mhc抗原错配匹配的hspciv+icv移植是可行的并且与高度脑供体嵌合体相关

在次要抗原和mch错配移植设置的背景下，评估了icvhspc移植手段在同种异体移植的患者中的潜在适用性，特别是icv和iv联合移植。测试了从错配供体到经历造血细胞移植的小鼠中，icv递送同种异体hspc对该小鼠的总体存活率和cns小胶质细胞植入的影响。icv+ivhct应用于mch错配(balb/cjcd45.2供体到b6.sjlcd45.1受体；一种细胞icv剂量被测试，3x10⁵细胞/小鼠)以及次要抗原错配(mhc匹配；balb_bcd45.2供体进入b6.sjlcd45.1受体；两种icv细胞剂量被测试，3x10⁵和1x10⁶/小鼠)的移植设置。在第1天使用全身照射(tbi)(1000rad)来处理受体小鼠。小鼠接受仅新鲜总骨髓(tbm)或与icv注射的gfp转导的lin^-细胞耦合(图8a和9a)。移植后跟踪它们9至10周(次要抗原错配)和16周(mhc错配)。在受者中观察到罕见的间发性死亡(icd)且与特定处理无关(图8b和9b)。所有存活的动物体重稳定增加，整体健康情况良好。对pb、bm、脾和胸腺执行的细胞荧光分析(后者用于次要抗原错配移植的器官)展示了供体细胞的成功植入(图8c和9c)。重要的是，在测试的造血组织中没有检测到icv移植的hspc的后代，即gfp⁺细胞(图8d和9d)。与仅iv受体相比，iv+icv次要抗原错配的动物展示了脑中的来自供体来源细胞的剂量依赖性植入。在次要抗原和mhc错配的动物中，与仅iv移植相比，hspc的icv递送在cns中都赋予优势给供体衍生的小胶质细胞嵌合体。总之，以联合递送手段将同种异体造血干/祖细胞递送到侧脑室是可行的，并且可以在次要错配和mhc错配的设置中增强供体来源的嵌合体。该数据支持icv移植的适用性，在增强cns相关益处的同种异体造血细胞移植程序的背景下的。

实施例11.在组合hspc移植策略的背景下，hspc的鞘内递送可以促成脑和造血嵌合体

评估了与icv细胞递送相似，鞘内hspc递送是否可以促进cns供体嵌合体。从cd45.2供体小鼠分离lin^-hspc并用编码gfp的lvs转导。转导后，将细胞移植入cd45.1骨髓消融受体，移植分别为：iv(1.0x10⁶细胞/小鼠)，icv8(0.3x10⁶细胞/小鼠)或鞘内(it)(0.3x10⁶细胞/小鼠)。移植后5天，向icv和it移植的小鼠提供来自cd45.1供体以编码mcherry的lvs转导的总bm细胞(图10a)。移植后45天牺牲小鼠。在iv和it移植小鼠的bm中观察到高度和类似的hspc(cd45.2gfp⁺)的植入，而在icv移植小鼠的bm中未观察到(或非常低)cd45.2gfp⁺细胞(图10b左)。icv移植小鼠显示mcherry⁺cd45.1bm移植细胞在bm的良好植入，而相同的细胞在it移植小鼠中显示非常少的植入，可能是由于与在第0天移植的cd45.2gfp⁺hspc的竞争。cd45.2gfp⁺hspc植入到被分析的所有组的脑髓样区室中(图10b中心)，icv+iv注射的小鼠与其他组相比显示出最高的供体嵌合体。iv移植细胞的mcherry⁺cd45.1细胞后代在icv移植的小鼠中观察到。供体(gfp⁺mcherry)细胞植入到被分析的所有组的脊髓髓样区室中(图10b右)，icv+iv注射的小鼠与其他组相比显示出最低的gfp嵌合体。与it组相比，在icv移植小鼠中观察到mcherry⁺cd45.1bm移植细胞的百分比增加。总体而言，这些数据显示it可以用作给予hspc的附加路径，以便在移植受体的脑和脊髓中都实现髓样细胞重建。icv和仅iv递送也与供体的显着的脊髓嵌合体相关。在外周血和骨髓中也广泛观察到it移植的供体细胞，表明它们在移植后不留存在cns中。因此，该移植程序可以特别考虑用于既有cns受累、又有全身受累的那些疾病。

实施例12.移植后的脑髓样细胞来源于早期造血干/祖细胞

hspc中的c-kit⁺,sca-1⁺,lin^-(ksls)部分能够在iv移植后在小鼠脑中产生taμ和μ，不是c-kit和sca-1双阳性的lin^-祖细胞则不能(capotondoetal.,procnatlacadsciusa109,15018-15023(2012))。在严格的竞争设置中进一步探索了前述发现，通过使用iv(图11d)和icv(图11e)两种路径将差异性标记的ksls和非ksl细胞共移植到个体动物中(图11a，11d和11e)，以评估移植细胞对髓样脑细胞更替的潜在差异性贡献。当与非ksls一起iv注射时，ksl细胞几乎完全贡献到不同的脑髓样细胞群(图11d)，其定义为cd45⁺cd11b⁺髓样脑细胞；cd45⁺cd11b^highμ细胞；cd45⁺cd11b^+/low瞬时扩增μ-taμ细胞；cd45^highcd11b^highcns相关巨噬细胞，cnsmac(capotondoetal.,procnatlacadsciusa109,15018-15023(2012))。当icv注射时，ksl和非ksl细胞反而对脑髓样细胞重建的贡献相似(图11e)。通过slam标记物cd150和cd48的差异化表达，在ksl区室内识别到一些差异性标记的亚群，这些亚群的有助于移植后脑髓样细胞植入的能力被述及(图11a，11b)。在竞争性iv移植后，cd48^-/cd150⁺长期hsc(lt-hsc)和cd48^-/cd150^-多能祖细胞(mpp)显示出比其他注射群体更大的重建脑髓样区室的能力(图11f)。相反，更多定型的cd48⁺cd150^-细胞也有助于重建icv移植小鼠的脑髓样群体(图11g)。移植小鼠的造血重建显示于图11c中。来自iv和icv移植小鼠的低温脑切片的组织学证实了这些结果(图11h和11i)。与先前的发现一致，同样在这些设置中，供体来源细胞显示出分枝形态且有远离细胞体的薄突起，表达髓样细胞标记物iba-1和cd11b(图11h和11i)。

为了解读这些发现，cxcr4受体(皆知其参与招募hsc以及引导hsc回到bm)的表达(daretal.,experimentalhematology34,967-975(2006)；rettigetal.,leukemia26,34-53(2012)；sugiyamaetal.,immunity25,977-988(2006))，在ksls、非ksl细胞和上述四个ksl亚群(在移植时、转导结束时分析的细胞)上进行分析。有趣的是，与非ksl、hpc-1和hpc-2相比，在iv注入设置中，富含小胶质细胞样细胞重建潜力的细胞，即ksl、lt-hsc和mpp，都表达更高水平的cxcr4(图11j)。

不希望受理论束缚，该发现表明在iv注入时，表达高水平cxcr4的细胞可能有利于被早期募集入脑，因此也有利于它们贡献脑髓样细胞嵌合体的能力。这不适用于icv递送，其中不同的信号可能是重要的。

为了更严格地评估真正的hsc是否能够在icv移植后产生新的小胶质细胞样细胞，在没有竞争的情况下，在fgd5-zsgreen动物中，以替代标记物和fgd5表达的功能特征分离出lt-hsc(gazitetal.,jexpmed211,1315-1331(2014))。实际上，fgd5-zsgreen报告基因品种允许可信赖地分离高度富集hsc活性的细胞的能力。从cd45.2fgd5-zsgreen供体中分离出500个真正的hsc，其为zsgreen⁺,lineage^-,c-kit⁺,sca1⁺,flkt-2^-,cd34^-；将上述hsc以iv或icv移植到白消安骨髓消融或致死照射的cd45.1受体小鼠中，并辅以未经操作的cd45.1总骨髓支持(造血功能恢复)(图12a)。iv细胞递送导致稳健的造血供体嵌合体，而icv注射的细胞不会对外周血中的造血作用有贡献。有趣的是，尽管icv移植的动物未显示外周血嵌合体，但在两种移植设置中都在脑中识别到了供体来源的cd45.2⁺细胞(图12b和c)。如所述的(capotondoetal.,procnatlacadsciusa109,15018-15023(2012))，脑髓样细胞重建被证实在经照射受体中的效率较低，而非在经白消安消融受体中。供体来源的细胞表达cd45和cd11b，并且大部分是taμ细胞区室的一部分(图12d和12e)。

这些数据展示，真正的hsc在icv或iv移植后在脑中产生小胶质细胞样后代。然而，当早期祖细胞也以icv给予时，该过程是更有效率的。

为了以相关标记物进一步识别hsc中的有μ重建潜能的细胞，使用cx3cr1-gfp报告基因小鼠，其在七次跨膜受体cx3cr1的控制下表达gfp报告基因，cx3cr1是新颖cx3c趋化因子fractalkine(由cx3cl1基因编码)在人中的特异性受体，高度表达于小胶质细胞和髓样细胞谱系造血细胞。特别地，评估了低但可检测水平的cx3cr1表达是否可以在hsc库中识别具有小胶质细胞重建潜力的细胞。

为此目的，对cx3cr1-gfp杂合小鼠的骨髓和hspc库进行了特性分析，证实了hspc库的一部分表达cx3cr1，但在真正的lt-hsc中未检测到实际的表达(图13a)。在lin^-hspc区室内分选出gfp⁺高的细胞，并将这些细胞移植进白消安处理的受体中，辅以正常(norcxcr1-gfp)供体的为经操作的总骨髓作为支持。移植后1.5个月，在重新填充(repopulated)小鼠的骨髓和脑中未检测到gfp⁺后代细胞(图13b)。相反，在移植了来自cx3cr1-gfp小鼠的未分选总骨髓的对照小鼠的脑中，可以识别到表达gfp的μ细胞(图13b)。这些数据表明μ祖细胞的骨髓等同物保留在lt-hsc中且不表达cx3cr1。

在人类设置下进行另一实验，将标记的cd34⁺细胞和亚组分移植到免疫缺陷的nod/ltsz-scidil2rγ^null(nsg)小鼠中。特别地，对差异性标记的cd34⁺cd38⁺(根据文献定义为祖细胞)和cd34⁺cd38^-(富集长期干细胞活性)分选出的细胞执行了共移植(图14a)，有趣的是，仅cd38^-细胞组分(在人类中高度富集干细胞活性)与移植小鼠脑中标记的髓样人类细胞的出现有关(图14b)。与在小鼠设置中所做的类似，在这种设置下，我们继续进行，即以cd38和cd90表达进一步解剖hspc的组分。分离和标记(通过携带不同报告基因的lvs)如下细胞：cd38^-cd90⁺hsc(用gfp标记)，cd38^-cd90^-mpp(用编码mo2的lvs转导)，cd38⁺cd90^-和cd38⁺cd90⁺定型祖细胞(分别用cherry和tag-bfplvs标记)(图14c)。有趣的是，与在小鼠设置中观察到的一致，富含干细胞潜力的群体证实具有更大能力以贡献脑人类细胞嵌合体，与小胶质细胞-回忆(reminiscent)细胞一起(图14d)。

实施例13.用于可调节的治疗性基因表达的小胶质细胞的分子工程

在本文所述的创新方案的背景下，待iv或icv移植的细胞的分子工程需要解决治疗性基因表达的效能、安全性和特异性/调节的精密需求。

就此而言，基于基因转移的两种不同策略正被开发中，即通过整合载体和通过靶向基因添加，这些策略可以应用于可能需要持续的但可调节的转基因表达的特定设置。

成年期的神经退化性疾病，例如肌萎缩侧索硬化症(als)或阿尔茨海默症(ad)，以及神经退化性sd，其特征在于以小胶质细胞活化所维持的突出的神经炎症反应；在病理事件的过程中，被活化的小胶质细胞上调的若干分子中的一种是18kda转位蛋白(tspo)，如其他人和我们使用选择性tspo放射性配体进行正子断层扫描所示(visigallietal.,neurobioldis34,51-62(2009)；turneretal.,neurobioldis15,601-609(2004))。小胶质细胞是导致tspo信号增加的主要细胞类型。因此，tspo是监测脑中小胶质细胞相关神经炎症的有用且敏感的标记物，其启动子序列可用作新工程化的小胶质细胞响应组织损伤和炎症的标记物或治疗性蛋白质生产的最佳调节序列。创新工具正在被开发，允许经由hsc-衍生进行脑小胶质细胞的tspo靶向工程，用于治疗分子的可调节的递送入脑，并可能应用于神经退化性疾病和神经lsd。特别是，脑小胶质细胞在患病脑中重建时，包括“传感器”细胞，其被工程化以在细胞活化时表达目标基因以应对局部神经退化和神经炎症，使用上文详述的先进移植方案(该设置也适用于使用指向μ祖细胞的处理方案)。

为此目的，使用了用于驱动转基因表达的tspo启动子序列。其实现过程为：将基于文献证据选择的tspo启动子序列(wangetal.,celltissueres350,261-275(2012))接在标记物基因或治疗性基因之前；以先进一代的lvs为背景框架，该lvs将用于之后的hsc转导；插入治疗性基因，在tspo基因的第一组内含子/外显子前面或其中，这样可以利用tspo启动子；插入基因是通过靶向基因添加，使用了crispr-cas技术，也测试了其他策略。tspo基因敲除小鼠证明了后一种策略的可行性(banatietal.,natcommun5,5452(2014))。在第3代lv的背景下，选择的tspo启动子序列(wangetal.,celltissueres350,261-275(2012))(图16a)插入作为标记物基因的gfp的前面(图16b)已被证实在小胶质细胞中(在小胶质细胞系bv2中)驱动持续的转基因表达，并且会响应细菌lps的模拟(图16c和16d)，如使用天然序列时所预期的。然后使用转导和/或编辑的细胞用先进方案仅重建受体小鼠中的脑髓样细胞。

一个现行假说是，在tspo基因座上进行了基因修饰/编辑的hsc在移植时，产生一群脑髓样细胞和小胶质细胞，其在神经炎症和退化性环境中被细胞活化后，表达一基因，该基因允许对神经炎症反应进行精确分子监测和/或该基因被赋予治疗活性而有助于疾病表型改善。用于特性分析开发中工具的报告基因在以小胶质细胞活化和tspo上调为特征的动物模型中得到验证，例如als小鼠模型(sod1.g93a小鼠)(pevianietal.,cnsneuroldisorddrugtargets9,491-503(2010))和脑白质球状细胞营养障碍(gld)的动物模型(visigallietal.,neurobioldis34,51-62(2009))。这些工具的功能得到了确认，其治疗效果的潜力在现有动物模型中得到验证。

实施例14.通过使用白消安毒性的γh2ax标记物和fgd5-报告基因小鼠识别小胶质细胞祖细胞。

先前研究已经提供证据存在：i)功能上定义的小胶质细胞前体细胞群，其位于脑中，在给予基于白消安的处理时易于消融，且可能与内源性cns驻留小胶质细胞祖细胞(μp)同时发生。磷酸化组蛋白2ax(γh2ax)是一种敏感的特异性生物标记物，可追踪脑中白消安靶向的细胞。因此，可以利用白消安和γh2ax来识别功能性脑驻留μp，γh2ax是这些细胞内γh2ax细胞毒性的药物效应动力学的标记物。研究了γh2ax作为白消安细胞毒性的生物学标记物。特别地，研究了γh2ax的存在、分布和细胞定位，通过流式细胞仪(fc)和免疫荧光(if)研究来自全身白消安处理的小鼠的脑切片。最后一个白消安剂量起算的第1天和第5天，fc显示相比对照未处理动物，经白消安处理的动物的γh2ax信号增加，特别是在活cd45⁺细胞内(图15b)。同时，白消安处理后的早期细胞凋亡也被膜联蛋白v染色在cd45⁺脑细胞内检测到，特别是在cd11b⁺和c-kit⁺细胞中(图15a)。通过if，γh2ax在对照小鼠中几乎检测不到，除了在少数神经元细胞中发现的一些γh2ax⁺焦点，主要位于海马体中(图16c上)，

其中先前已经显示了生理神经元活性和h2ax磷酸化之间的相关性。相反，在经白消安处理的小鼠中，γh2ax⁺信号在沿着侧脑室、脑室下区(svz)和喙侧迁移流(rms)排列的细胞之细胞核中增加(图15c底部图)。γh2ax⁺焦点定位在神经元(图15c插图)和神经胶质细胞(即小胶质细胞和星形胶质细胞)中(图15c插图)。总之，这些数据表明定位于大脑中明确定义区域(包括cns干细胞生态位区域)的神经元和非神经元细胞，对白消安变得敏感。因此，这些结果具有识别小胶质细胞祖细胞的潜力。类似的实验在表达由造血干细胞标记物的启动子驱动和由小胶质细胞特异性基因(例如fgd5或cx3cr1)的启动子驱动的报告基因的小鼠中正在进行，以便更好地追踪白消安易受细胞。

实施例15.靶向小胶质细胞祖细胞的选择性脑处理，使用纳米载具用于靶向递送

白消安的全身给药有助于促进供体来源对脑小胶质细胞的有效更替。一个类似但局限于cns的方案可以保护患有cns局限性疾病(例如incl、pd、als等)的患者免于骨髓消融全身处理的副作用。在初步研究中，探索了通过植入小鼠侧脑室的插管脑内给予白消安的可能性。不同的白消安药物制剂被测试，包括临床级白消安制剂。然而，icv给药不能保证脑驻留μp曝露于与全身给药时相当的白消安水平，也不支持移植的hspc植入(数据未显示)。它反而与广泛的神经毒性和局部炎症有关。因此，实施了使用纳米颗粒的靶向药物递送策略。不希望受理论束缚，纳米粒子可能具有将消融药物有效和选择性地递送至功能定义的μp的潜力。

最近，聚合物纳米颗粒(np)作为有希望的、可改善药剂的药理学曲线(包含化疗)的工具引起了很大兴趣。np在组合物材料成，表面功能化和降解速率方面是可调的，并且允许：i)对靶标细胞的高选择性，与不含np的相同药剂相比，与np配制的药物减少了副作用风险；

ii)多种药物递送；iii)可控的药剂随时间的释放。np由人造或自然聚合物制成，大小在10到400nm之间。可使用各种可生物降解的聚合物例如壳聚糖/几丁聚糖、聚(ε-己内酯)(pcl)、聚(氰基丙烯酸烷基酯)(paca)、聚乳酸(pla)或聚乳酸羟基乙酸共聚物(plga)作为核心基质。使用亲水聚合物，如聚(乙二醇)(peg)，的表面功能化可用于改善生物相容性、水溶性和np的稳定性。np的表面特性决定了靶标细胞摄取的选择性，从而影响其在生物体液中的生物分布和半衰期。另一方面，np核心的物理化学特性决定了药剂负荷能力和药物释放曲线。用靶向部分体(包括抗体)对np表面进行的功能化，可以确定优先结合在血脑屏障(bbb)或特定细胞类型上表达的受体或转运蛋白，得到增强的cns生物分布或靶细胞特异性。通过修饰纳米颗粒核的亲脂性、结构和组合物对材料的生物降解时间加以调整，则可以优化药物装载和释放曲线。

一种新的可生物降解且生物相容的药物递送纳米载具(基于pclnp)(图17a)被验证，在脊髓损伤小鼠模型中，在实质内给予后的该纳米载具选择性地靶向小胶质细胞/巨噬细胞。在小鼠中icv给予后，这些靶向小胶质细胞的np的生物分布得到验证，并且证实了小胶质细胞/巨噬细胞对其的有效摄取和其在不同cns区域中的广泛分布(图17a-17i)。对注射的小鼠脑的细胞荧光测定显示np被cd45⁺脑细胞有效摄取，特别是如果icv与甘露醇一起被注射以促进bbb穿透(图17b)，偏好摄取np的有cd45⁺c-kit⁺细胞(图17c)和增殖中的edu⁺细胞(图17d)。这些靶向小胶质细胞的np是基于可生物降解的、fda核准的材料，包括低分子量peg链，其可确保np的稳定性、调整降解速率和调节药物随时间的释放。有趣的是，免疫荧光共焦分析证实了这些发现，并表明np集中在脑区，例如svz和rms，这些区是移植后很快被供体来源的hspc殖民的，在导致脑中脑小胶质细胞重建的过程中，也是在给予白消安之后有强烈的γh2ax阳性信号的区域-因此代表性区域可能富含μp(图17g)。值得注意的是，含有np的rhodamine⁺iba⁺髓样细胞也在增殖，根据是1)ki67阳性信号(图16g)和2)在牺牲之前给予edu然后染色(图17h)。

edu⁺rhodamine⁺细胞对造血髓样细胞标记物也呈阳性，并显示出小胶质细胞样细胞的两种形状，分枝的和圆形的。重要的是，rhodamine⁺iba1⁺细胞也偶尔表达早期/干细胞标记物nestin(图17h右)。rhodamine(罗丹明)信号在np注射的脑中的存在和分布与edu信号的分布有趣地一致，表明np优先在增殖细胞中发生(图17i)，其可能包括具有小胶质细胞祖细胞特征的细胞。

然后，通过从头全新化学合成来优化新的np，以允许加载白消安和依托泊苷，通过利用两种不同的化学部分体，选择它们与药剂的相容性(称为“sp”和“qms”)，部分体是共价接枝在聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)骨架(此处称为bk-510)上。这允许实现将生物学相关量的药物封装在np中(即，白消安在210.7±5.3-257.6±7.2μg/ml范围内)。通过引入所谓的“自组装”手段进一步改善了载有化疗药剂(例如白消安或依托泊苷)的这些纳米颗粒的制剂，从而允许从冻干材料开始形成np(图18)。这使得纳米材料适合于规模放大的合成、冻干药用产品的长期储存而不损失效能、以及不同批次之间的一致性。

通过使用γh2ax作为白消安相关遗传毒性的可靠药物效应动力学标记物，在体外曝露于承载白消安的np后，免疫荧光和流式细胞仪分析突显γh2ax⁺细胞数量的增加(图19a和19b)。这被进一步证实，通过对bv2小胶质细胞样细胞系所做的细胞存活率测定；突显了温育72小时后承载bu的np的特异性细胞毒性，表明np中的bu封装不损害药物效能。相比无np，在小鼠脑侧室中承载白消安的np(np-bus)诱导脑小胶质细胞(cd45⁺/cd11b⁺)中γh2ax信号的显着增加(图19c)。

为了促进有效的脑处理方案的开发，np负荷用其他药剂优化，例如依托泊苷和洛莫司汀，其显示出初步支持性结果(图19d-19e)。对bv2细胞小胶质细胞样细胞系进行细胞增殖测定。将依托泊苷以275ug/ml药剂的名义浓度加载到不同的np制剂(预装配的100nmpclnp；自组装100nmnp或自组装50nmnp)中。

承载依托泊苷的np或未封装的药剂加入细胞培养基中，然后在37℃温育给药48和72小时后，通过celltiter细胞增殖mts测定法测量细胞存活率。测试了不同的药物浓度(1.6,6.25和25ug/ml)。作为对照，测试了空np(无药)；在这种情况下，培养基中的最终np浓度匹配于给予封装在np中的25ug/ml依托泊苷时的np浓度。如在图20d-20e中可以观察到的那样，所有三种np制剂在递送依托泊苷方面同样有效，如是确定细胞死亡。空np或是无毒(预装配100nmpclnp和自组装50nmnp)或在短期温育期间有轻度毒性(自组装100nmnp，48小时时间点)。然而，空np组的细胞存活率总是超过承载依托泊苷的np组的细胞存活率，表明对承载依托泊苷的np观察到的效果是由于药剂的释放而不是np本身。有趣的是，在1.6ug/ml最终药剂浓度下测试的承载依托泊苷的np观察到的效果比用未封装的药物观察到的效果更明显。这种差异在72小时温育时间点变得更加明显，表明依托泊苷在np中的封装增强了其效能，确定了已经非常低浓度下药剂细胞毒性的改善。

icv注射这些np制剂到野生型成年动物的脑中，这些动物经以下事先处理：i)单次剂量的白消安25mg/kg或ii)口服给予csf1r抑制剂10天(elmoreetal.,neuron.82(2):380-397(2014))，其已被显示诱导小胶质细胞祖细胞增殖和/或扩张脑中的cd45⁺c-kit⁺细胞(图19a，19c，19d)。np注射后5天，分析动物的依托泊苷介导的小胶质细胞和/或其祖细胞的杀灭，使用白消安标准处理(4剂25mg/kg)作为脑小胶质细胞祖细胞消融的参照。有趣的是，承载依托泊苷的np在cd45⁺c-kit⁺和cd45⁺cd11b⁺细胞内诱导细胞凋亡(按照流式细胞仪中的每个膜联蛋白v阳性染色)，与标准消融白消安处理时观察到的一致(图19b和19e)。

总的来说，这里测试的np制剂实现了用于选择性脑处理的靶向递送消融药剂至小胶质细胞祖细胞。

实施例16.用于从造血干细胞和祖细胞产生转录可靠的新小胶质细胞的新颖移植模式

使用多方面的手段识别新的策略，以改善hct后供体的真正脑髓样细胞更替，这种现象可以导致转录可靠的新小胶质细胞的稳健和快速植入，此植入是通过一种可能重现了出生后脑髓样细胞的生理性成熟的过程。

首先，将转录剖析分析应用于从白消安处理的嵌合小鼠脑中回收的新形成的髓样细胞(识别为μ和taμ细胞)。该分析揭示，对cd45、cd11b和一供体细胞标记物分选出的供体来源的脑髓样细胞的基因表达模式，是非常接近于不同发育年龄的天然小鼠的内源性小胶质细胞的。值得注意的是，新形成的细胞表达典型的小胶质细胞标记物，例如tmem119，tgfbr1，p2ry13，olfml3，mertk。有趣的是，与巨噬细胞相比，这些细胞以完全分离的方式群聚，证实移植后重建的脑细胞在转录上不同于骨髓驻留或循环髓样细胞，且更类似于内源性脑髓样细胞群(gosselinetal.,cell159,1327-1340(2014))。bennett及同事(bennettetal.,procnatlacadsciusa113,e1738-1746(2016))显示，来自全骨髓移植的成人cns中的细胞不表达tmem119，被作者认为是能够将小胶质细胞与其他髓样细胞区分开来的标记物。这些发现显然与在供体来源的脑髓样细胞中显示稳健tmem119表达的数据相冲突，可以不同实验条件的使用来解释。实际上，就脑后代而言，使用总骨髓细胞代替纯化的hspc可能影响移植程序的结果。实际上，数据表明后者富含产生新小胶质细胞的能力。此外，已加上白消安，再使用强烈照射进行小鼠处理可能通过影响bbb渗透性而诱导循环髓样细胞的募集，而bbb渗透性不受单独使用白消安方案的影响(capotondoetal.,procnatlacadsciusa.109,15018-15023(2012))。

与流式细胞仪耦合的基因表达剖析也证实了先前的数据，其显示从hct小鼠分离的μ和taμ分别显示与来自成年未处理动物的小胶质细胞和来自p10小鼠的未成熟小胶质细胞的相似性。

特别是，生物过程和功能途径分析表明，来自移植小鼠和p10动物的taμ群体的基因模式与神经发育过程、细胞成分组织化和细胞周期/分化更相关，表明它们可以代表未成熟的小胶质细胞群，可能在脑重塑期间发挥作用，如最近所述(matcovitch-natanetal.,science353,aad8670(2016))。不同地，来自移植动物和成年对照小鼠的μ群体富集与免疫应答、细胞通讯和吞噬作用相关的基因，表明这些细胞主要由成熟小胶质细胞组成。因此，这些数据可能支持如下假说，即hct后小胶质细胞重建是通过从中间taμ群体(通常在移植后短期内富含供体来源的元件)到μ阶段(移植后长期内进行性富集供体元件)的转变而发生的。这种现象可能提醒我们注意到出生后小胶质细胞的发育，即从p10时识别的未成熟细胞到从成年对照动物分离的小胶质细胞的转变。为了支持该假说，在数据集之中研究了与小胶质细胞分化相关的选定基因的表达(matcovitch-natanetal.,science353,aad8670(2016))，证实hspc来源细胞遵循hct后的逐步成熟程序。然而，通过分析成年小胶质细胞发育阶段中涉及的转录因子，如mafb(matcovitch-natanetal.,science353,aad8670(2016))，与p10小鼠相比，观察到从hct小鼠中回收的taμ细胞中该基因的更高表达。不愿受理论束缚，与p10细胞相比，在成年处理的小鼠中hscp移植后产生的新形成的taμ小胶质细胞更偏向定型于成熟阶段。对此转变期间中的基因表达数据集和相关变化的深入研究有助于识别小胶质细胞发育和维持中涉及的关键因子，其可用于进一步改善小胶质细胞重建。

研究了供体重建小胶质细胞的过程。有趣的是，在hspc内的非常早期干细胞区室中识别到了大部分保留在移植时重建小胶质细胞的能力的细胞组分。特别是，在竞争性移植不同标记的hspc亚群时，ksl细胞及其内部的lt-hsc和mpp显示出最大的潜力：不仅可重建造血系统，而且还可在脑中引起广泛的小胶质细胞增生。

这些数据表明，具有在移植后作为新颖小胶质细胞来源的能力的细胞被保留在小鼠体内主要富含造血干细胞活性的组分中。有趣的是，这种能力与细胞表面cxcr4表达水平相关。不希望受理论束缚，这表明sdf1-cxcr4信号传导的作用不仅引导hspc回到骨髓生态位，也引导其回脑。通过调试使应用在鼠类设置中基于白消安的处理方案适应于该模型，亦探索了人类hspc对人源化nsg小鼠中小胶质细胞增生的贡献，以有利于人类中的脑植入。通过这种策略，从不同来源(脐带血、骨髓和外周血)纯化的人类cd34⁺细胞展示在受体小鼠脑中产生小胶质细胞回忆细胞。有趣的是，如对鼠类细胞所观察到的，最不成熟的造血室区(cd38^-和cd38^-cd90^+/-细胞)对脑中人类小胶质细胞增生的贡献更大。这些证据可能导致进一步的研究以调查早期hspc/hsc产生小胶质细胞的模式，但也可能对于lsd及相关疾病的移植临床实践具有重要的转化意涵，即支持使用富含干细胞活性的细胞制剂而不是未经操作的产物。此外，这些观察有助于解释在神经退化性贮积症患者中所见的hsc基因疗法试验中的高效能，这些患者接受了富含早期造血细胞的移植物，对比标准的脐带血/血球分离产品/骨髓这些外植体制备。

基于先前观察，即重新填充的移植受体中小胶质细胞和外周造血细胞的克隆独立性(capotondoetal.,procnatlacadsciusa.109,15018-15023(2012))，移植方案受到挑战且在适当受体小鼠处理后直接将hspc注入到脑室空间。有趣的是，在icvhspc移植后，可以在白消安处理小鼠中以及，在较小程度上在被照射小鼠中都观察到小胶质细胞重建，证实供体细胞植入造血组织不是小胶质细胞替换所必需的。相反，脑中的hspc播种可以产生新的真正的小胶质细胞，通过局部植入、增殖和分化。重要的是，与iv移植时实现的替换相比，该移植路径与髓样脑区室(特别是成熟μ细胞库)的更快速的重建相关。与通过iv移植得到的发现不同，当局部注射时，定型的hspc组分参与长期小胶质细胞增生。

这些发现可以用不同的方式解读。首先，脑的微环境可能创造某些条件，其可能反过来有利于更多定型细胞的植入。为了支持这一假说，脑环境影响移植细胞的命运，是通过在移植后早期诱导典型小胶质细胞标记物(cd115和cx3cr1)的表达，可能有利于它们的植入。此外，推测在icv注射时，比与cxcr4-sdf-1信号传导途径无关的其他细胞数量更多的细胞(hpc-2)可能在局部植入和扩张中具有优势且被偏好。最后，如果按照上面所讨论的cxcr4分析来看，与lt-hsc和mpps相比，如果以静脉内移植，比较定型的细胞由于其内在较低的向脑迁移的能力，其可能是不受欢迎的。但是，不能排除在icv细胞注射后移植细胞可以响应不同的信号传导途径。在这方面，进一步的研究，如基因表达分析，将提供可贵的指示，以更好地评估与iv注射相比在icv移植时实现小胶质细胞重建的机制。重要的是，hspc通过icv递送对脑髓样细胞重建的贡献也在将人类hspc移植入nsg小鼠的人源化设置中被证实。为了将这些临床相关的发现转化为当前的基于基因和细胞的移植方案，建议将icvhspc移植的潜力(即与标准移植设置相比，提供更快和更多的小胶质细胞重建)与iv移植时的效益结合起来。此策略可以解决需要预先考虑疗法的临床益处的问题，在以严重cns受累和病理学快速进展为特征的那些疾病中。显然，此手段需要根据细胞给予的不同路径，深入评估移植的时机和待移植的细胞子集。

总之，当下的数据提供了强有力的证据，即在hspc移植后发生具有小胶质细胞特征的细胞的重建。这些细胞的产生通过从中间阶段到更成熟的细胞的成熟作用而发生，这一过程非常类似于出生后小胶质细胞发育。该过程取决于脑中早期hspc的存在，且与从循环系统到脑中的成熟细胞透过无关。实际上，小脑胶质细胞替换可以在直接脑注射hspc后得到甚至增强，产生证据，其支持开发用于治疗有严重且快速病程的cns病症的创新移植手段。

本文所述的结果是使用以下材料和方法得到。

小鼠研究

c57bl6/j和c57bl/6-ly5.1小鼠由查尔斯河(charlesriver)提供。nod.cg-nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wji/szj(nsg)小鼠购自杰克森实验室(jacksonlaboratory)。rag^-/-γ-chain^-/-as2^-/-和rag^-/-γ-chain^-/-as2^+/+小鼠产生于圣拉斐尔科学研究所(sanraffaelescientificinstitute)的动物设施中心(meneghinietal.,stemcellstranslmed,(2016))。fgd5zsgr·zsgr/+(fgd5-zsgreen)(thejacksonlaboratory存货编号027788)由哈佛大学/波士顿儿童医院的derrickj.rossi实验室好心提供(gazitetal.,jexpmed211,1315-1331(2014))。

所有程序均经过圣拉斐尔德尔蒙特塔博基金会的动物照顾与使用委员会(iacuc573)的批准，并根据意大利法律向卫生部和地方当局通报。

鼠造血细胞的分离、转导和移植

年轻的成年小鼠(5至8周)用co2牺牲，而通过冲洗胫骨和股骨收获bm。纯化鼠hspc，用lv对其转导，然后以尾静脉注射移植，如所述(capotondoetal.,procnatlacadsciusa109,15018-15023(2012)).

通过对谱系^-(lin^-)的选择来纯化hspc，使用美天旎生技(miltenyibiotec)的谱系细胞耗尽试剂盒，以automacs^tmseparator进行磁性分离，根据制造商的说明。当分离ksl(c-kit⁺sca-1⁺)时，以及在ksl组分中分离cd150^+/-cd48^+/-细胞时，为了排除在谱系负选择后残留的少量lin+/谱系阳性细胞(5-10％)，lin-/谱系阴性细胞以生物素-抗体鸡尾酒(美天旎生技的谱系细胞耗尽试剂盒)/streptavidinpe-cy5(pharmingen)染色。为了分离ksl组分，然后细胞被使用以下两种抗体染色：大鼠apc-efluor780抗小鼠cd117(c-kit)(ebioscience)和大鼠pe-cy7抗小鼠ly-6a/esca-1(sca-1)(碧迪生科/bdbioscience)。为了选择cd150^+/-cd48^+/-细胞，加入仓鼠抗小鼠pecd48(biolegend)和大鼠apc抗小鼠cd150(biolegend)。

在染色结束时，根据所选基因的表达，细胞用细胞分选器mofloxdp(碧迪医疗)加以分离。使用报告基因的门控策略如图2f所示。分离的lin-、ksl或cd150+/-cd48+/-ksl细胞用不同的慢病毒载体(lvs)转导，转导条件为在感染复数(moi)为100时转导16小时，如所述(biffietal.,j.clin.invest.116,3070-3082(2006))。特别的，以下lvs被使用：

pcclsin.cppt.humanpgk.greenfluorescentprotein.wpre(gfp-lv)(dulletal.,j.virol72,8463-8471(1998))用于lin^-,ksl和cd150⁺cd48^-ksl细胞；pcclsin.cppt.humanpgk.deletednervegrowthfactorreceptor.wpre(δngfr-lv)(dulletal.,j.virol72,8463-8471(1998))用于非-ksl细胞和cd150^-cd48^-ksl细胞；pcclsin.cppt.humanpgk.mcherryprotein.wpre(mcherry-lv)(biffietal.,science341,1233158(2013))用于cd150^-cd48⁺ksl细胞；pcclsin.cppt.humanpgk.tag-bluefluorescentprotein.wpre(tag-bfp-lv)用于cd150⁺cd48⁺ksl细胞。被转导的细胞的一部分被培养10天如所述(biffietal.,j.clin.invest.116,3070-3082(2006))，以便通过细胞荧光分析评估转基因的表达。转导细胞被以尾静脉注射到7/8周大小经处理的c57bl6/j雌性小鼠体内，该小鼠为照射后(2x400毫戈瑞/格雷)24小时或第4剂白消安后(25mg/kgx4天)24小时，注射是以不同浓度，其根据以下实验设置：

静脉内(iv)移植

lin-细胞:10⁶细胞/小鼠；ksl:0.3x10⁵细胞/小鼠；非ksl:5x10⁵细胞/小鼠；细胞/小鼠；细胞/小鼠；细胞/小鼠；细胞/小鼠。移植ksl细胞5天后，小鼠接受来自cd45.1c57小鼠的5x10⁵总骨髓(tbm)细胞作为支持。小鼠保持在无菌条件下。

脑室内(icv)移植

lin-细胞:0.3x10⁶细胞/小鼠；ksl:0.3x10⁵细胞/小鼠；非ksl:3x10⁵细胞/小鼠；细胞/小鼠；细胞/小鼠；细胞/小鼠；细胞/小鼠。移植5天后，小鼠接受来自cd45.1c57小鼠的5x10⁵总骨髓(tbm)细胞作为支持。

为了分离fgd5hsc，使用8周大fgd5^zsgr·zsgr/+cd45.2小鼠(杰克森实验室库存编号027788)作为供体。

按制造商的说明，使用cd117(c-kit)微珠(cd117微珠/microbeads,小鼠-美天旎生技)来执行c-kit⁺细胞的富集。用c-kit富集的细胞然后被染色，染色溶液为：pbs(磷酸缓冲盐溶液),2mmedta(乙二胺四乙酸),2％fbs(胎牛血清)，在4℃用以下抗体的组合染色：谱系标记物ter119,mac-1(m1/70),gr-1(8c5),cd3(17a2),cd4(rm4-5),cd8(53–6.7),b220(ra3-6b2),和il7ra(a7r34)；cd34(ram34),flk2(a2f10),c-kit(2b8),sca1(d7),cd45.2(104)(均来自生物传奇或e生科).染色后，细胞被洗涤和重新悬浮于pbs,2mmedta,2％fbs含pi(0.05μg/μl)中，且保持在冰上。facsariaii(碧迪医疗)用于细胞分选。

分选的细胞被iv移植(500)或icv移植(500)。移植后五天，小鼠接受来自cd45.1c57小鼠的1.0x10⁶tbm作为支持。细胞移植的受体是2个月大的雌性cd45.2c57bl6/j小鼠，其被处理以腹腔注射给予25-27mg/kg的白消安(西格玛)或以致死照射剂量(2x500毫戈瑞)。对iv移植，细胞被注射进尾静脉。icv移植在麻醉后(氯胺酮(100mg/kg)和甲苄噻嗪(10mg/kg))以手术执行。剃毛并消毒的小鼠头部，用耳棒固定在立体定位框架中且纵向显露皮肤。对前囟进行可视化并记录坐标。以前囟为参考点，调整注射坐标(侧面1mm，前部0.5mm)，然后在视觉控制下用直径0.7mm的钻头封入颅骨。插入颅骨远端2mm的脑中后，以10μlhamilton注射器注射5μl细胞悬液。在伤口闭合后，动物接受一单剂量的阿替美唑(1μl/g)并保持在无菌条件下。

在处理和移植后，以饮用水给予预防性抗生素(硫酸庆大霉素，80mg/250ml)2周。根据品系和实验设置，将小鼠于移植后1.5、3、4和6个月牺牲，并分析外周血/bm和脑的供体细胞植入。

人类cd34⁺细胞的分离、转导和移植

人类脐带血(cb)来源的cd34⁺细胞购自werepurchasedfrom龙沙(lonza)(目录号2c-101)。解冻后，细胞在补充了hil-3[60ng/μl],htpo[100ng/μl],hscf[300ng/μl],hflt3-l[300ng/μl](全部来自派普泰克/peprotech,汉堡,德国)的cellgro培养基(cellgenix,弗莱堡,德国)中被预刺激24小时，并通过moi100的一轮的lv曝露而转导，使用如所述(biffietal.,science341,1233158(2013))编码gfp^-(dulletal.,jvirol72,8463-8471(1998))或arsa(sessaetal.,lancet388,476-487(2016))的实验室等级lv。门控策略如图3m,3n,和3o所示。分离后，如前述对细胞预刺激并用不同的lvs转导。特别的，以下lvs被使用：pcclsin.cppt.humanpgk.morangefluorescentprotein.wpre(orange-lv)用于mpbcd38^-和cd38^-cd90^-细胞；pcclsin.cppt.humanpgk.mcherryprotein.wpre(mcherry-lv)用于mpbcd38mid和cd38⁺cd90^-细胞；pcclsin.cppt.humanpgk.cyanfluorescentprotein.wpre(cyan-lv)用于mpbcd38int细胞；pcclsin.cppt.humanpgk.greenfluorescentprotein.wpre(gfp-lv)用于mpbcd38高,cd38^-cd90⁺细胞和用于bmcd38^-细胞；

pcclsin.cppt.humanpgk.tag-bluefluorescentprotein.wpre(tag-bfp-lv)用于mpbcd38⁺cd90⁺细胞和bmcd38⁺细胞。一部分转导细胞被培养10天如所述(biffi,2013)，以便通过细胞荧光分析评估转基因的表达。转导后，洗涤细胞并注入经亚致死性照射(200毫戈瑞)或经骨髓消融白消安处理(16.25mg/kg/天，计4天)的7-9周大的雌性nsg小鼠的尾静脉。移植5x10⁵hcd34⁺细胞或5x10⁵hcd34⁺细胞，该细胞由不同分选细胞的根据其生理比例的混合物组成。当nsg小鼠被用白消安处理时，移植来自雄性nsg小鼠的4x10⁶tbm作为支持。如在c57小鼠中以icv移植鼠hspc所述，在nsg小鼠中执行hcd34⁺细胞的icv移植。12周后，牺牲小鼠并分析bm和脑的人类造血细胞植入。

出生后2天的rag^-/-γ-chain^-/-as2^-/-用亚致死剂量(300+25拉德)全身照射进行处理。小鼠通过颞静脉注射(2.5x10⁵细胞/小鼠)或icv(在侧脑室中，通过一玻璃毛细管)(nerietal.,stemcells29,1559-1571(2011))(0.75x10⁵胞/小鼠)接受被转导的细胞。移植后5周牺牲小鼠并分析bm和脑的人类造血细胞植入，通过细胞荧光测定和arsa活性(以4-甲基伞形酮基-硫酸盐为底物)(martinoetal.,jbiotechnol117,243-251(2005))。

用于细胞荧光测定和组织学的小鼠组织收集和处理

小鼠在深度麻醉下被安乐死，在股骨捆绑成束后用冷pbs进行大量心内灌流15分钟使其安乐死。

然后收集器官并进行差异性处理。骨髓(bm)细胞从成束的股骨收集，如所述(biffietal.,j.clin.invest.116,3070-3082(2006))。移除大脑并对两个半球进行不同的处理。对免疫荧光分析，一个半球在4％pfa(多聚甲醛)中固定24小时，包埋在oct化合物中，并在蔗糖梯度(10至30％)中平衡后储存在-80℃。对细胞荧光分析，将来自另一个半球的细胞以机械法解开聚集，以得到在20mlgkn/bsa缓冲液(8g/lnacl,0.4g/lkcl,1.42g/lnah2p04,0.93g/lna2hp04,2g/ld+glucose,ph7.4+0.002％牛血清蛋白)中的单细胞悬浮液。

为了分析fgd5⁺细胞的植入，hcd34⁺来源细胞的植入在被移植的nsg小鼠脑中以及在被移植的rag^-/-γ-chain^-/-as2^-/-小鼠脑中的情况，在酶(19mg木瓜蛋白酶,10mg半胱氨酸,2,5mgdnase脱氧核糖核酸酶)消化脑组织后，使用30％percoll梯度(nikodemovaetal.,jneuroinflammation9,147(2012))执行髓样细胞的富集。

流式细胞仪分析

在封闭溶液(pbs5％fbs,1％bsa)中重悬浮后，通过流式细胞仪分析来自bm和脑的细胞，并在4℃下用以下抗体标记15分钟：大鼠pe抗小鼠cd45(碧迪pharmingen)1:100；大鼠apc抗小鼠cd45(碧迪生科)1:150；大鼠brilliantviolet510抗小鼠cd45,(生物传奇)1:150；大鼠pacificblue抗小鼠cd45.2(生物传奇)1:100；小鼠pe抗小鼠cd45.1(碧迪生科)1:100；大鼠apc抗小鼠cd11b(e生科)1:100；小鼠alexafluor647anti-humancd271(ngfreceptor)(碧迪pharmingen)1:30；大鼠apc780抗小鼠cd11b(e生科)1:100；大鼠apc780抗小鼠cd117(c-kit)(e生科)1:100；大鼠pe-cy7anti-mousely-6a/esca-1(sca-1)(碧迪bioscence)1:150；仓鼠pe抗小鼠cd48(生物传奇)1:100；大鼠apc抗小鼠cd150(生物传奇)1:75；大鼠pe抗小鼠cd202b(tie2)(e生科)1:150；大鼠pe抗小鼠cd184(cxcr4)(碧迪bioscence)1:150；大鼠pe抗小鼠cd34(e生科)1:150；大鼠pe-cy7抗小鼠cd93(aa4.1)(e生科)1:150；大鼠biotin抗小鼠cd115(e生科)1:150；山羊apc抗小鼠cx3cr1(r&dsystems)1:75；apcstreptavidin(碧迪pharmingen)1:500；大鼠apc-cy7抗小鼠b220(碧迪生科)1:100；仓鼠apc-cy7抗小鼠cd3e(e生科s)1:100；小鼠apc-cy7抗人类cd45(碧迪pharmingen)；大鼠pe-cy7抗人类cx3cr1(e生科)5:100。

为了排除死亡的细胞，我们使用7-aad(1mg/ml)(西格玛-奥德里奇)，一种不透膜的染料，其在分析死细胞排除前加入细胞中。bm和脑细胞是以lsrfortessa(碧迪医疗)分析。

免疫荧光分析

在低温恒温器上以15μm切片在矢状平面中连续切割脑。将组织载玻片用pbs洗涤两次，空气干燥并用0.3％triton(一种非离子表面活性剂)，2％bsa，10％ngs/正常山羊血清(vectorlaboratories)封闭2小时。然后将切片与在4℃下与在pbs,0.1％triton,2％bsa,10％ngs中稀释的一抗温育过夜，所用一抗如下：大鼠apc抗cd11b(e生科)1:50；兔抗iba1(wako/和光)1:100；鸡抗gfp(abcam)1:250；兔抗gfp(invitrogen)1:100；小鼠pe抗人类cd271(ngf受体)(碧迪pharmingen)1:50；兔抗cherry(abcam)1:100。二抗山羊igg抗鸡alexafluor488，山羊igg抗兔alexafluor488,546或633，山羊igg抗大鼠alexafluor546或633，山羊igg抗小鼠alexafluor546(molecularprobes分子探针，invitrogen)在用于一抗染色的相同封闭溶液中以1:500稀释，并在室温下与切片一起温育2小时。

细胞核用pbs中1:1000的to-proiii(分子探针,invitrogen)或用pbs中1:30的dapi(roche罗氏)染色。切片在pbs中洗涤、空气干燥并用fluorsafereagent/试剂(calbiochem)安装。样品用共焦显微镜分析(zeiss/蔡司andleica/徕卡tcssp2；徕卡microsystemsradiance2100；bio-rad)(λexcitation＝488,586,660)。荧光信号由lasersharp2000软件处理。将图像导入adobephotoshopcs8.0软件，并使用自动级别校正进行处理。对于脑切片的重构，我们使用荧光显微镜deltavisionolympus/奥林巴斯ix70来获取图像，然后由softwork3.5.0软件处理。然后将图像导入adobephotoshopcs8.0软件并重构。

rna提取和通过实时pcr的基因表达分析

从之前从成年或p10天然的对照和移植小鼠中分选的以下群体分离总rna用于基因表达分析：总cd45+cd11b+,μ和taμ,分选是根据cd45,cd11b和gfp(仅hct-小鼠)的表达；巨噬细胞,分选是根据cd45,cd11b,f4/80,ly6c和gfp(仅hct-小鼠)。

使用rna系统和quantus^tm荧光计(promega/普洛麦格)确定rna数量。通过使用superscriptvilomastermix(thermofisherscientific/赛默飞世尔科技)从1ng至100ng纯化的mrna中产生cdna。然后使用customtaqmanpreamppools(赛默飞世尔科技)预扩增cdna。根据制造商的说明，在t100thermalcycler(bio-rad)上执行用于cdna产生和预扩增的热循环。使用定制设计的基于taqman的微流体卡基因表达测定(microfluidiccardgeneexpressionassay)(appliedbiosystems/美国应用生物系统)进行基因表达分析，以测量16个选定基因(13个靶标，2个内源管家基因和1个内部对照)的表达。实时pcr在appliedviia^tm7实时pcr系统上以标准模式运行，使用以下热循环条件：一个循环在50℃下2分钟，一个循环在95℃下10分钟，40个循环在95℃下15秒，在60℃下1分钟(美国应用生物系统)。viia^tm7软件1.2.2版用于提取原始数据。每个基因的阈值循环(ct)与参考基因的阈值循环(hprt和18scts的平均值)之间的差异(dct)用于确定基因表达。通过2-^ddct方法(livaketal.,methods25,402-408(2001))计算icv对比iv移植小鼠中所选小胶质细胞基因表达的倍数变化，其中ddct表示以下两者的差异：从icv移植小鼠回收的每个样品的dct，与从iv移植小鼠回收的每个样品的dct之平均数/均值，其匹配μ和taμ细胞。

rna测序和分析

rneasyplusmicro试剂盒(qiagen/凯杰)用于从分选的髓样脑(细胞)群体中提取rna。特别地，我们在gfphspc移植3个月时回收细胞，通过从以下不同的髓样脑亚群中分选：p10(n＝4且重复一次)(taμ细胞)，5个月大的c57b16/j小鼠(n＝3)(μ细胞)和bu处理的小鼠(n＝3；我们从分析中排除了taμ的一个样品，因为通过facs分析发现其与其他样品的差异)(μ和taμ细胞)。在分选前，小鼠在深度麻醉下在股骨捆绑成束后用冷pbs进行心内灌流而被安乐死。脑如前所述被收集和处理。收集rna并在-80℃下储存。使用小等分样品，以agilentrna6000pico试剂盒检查提取的rna的质量。

rna测序由udine的igatechnologyservices执行。简而言之，使用ovationrna-seqsystemv2(nugen)执行从总rna扩增cdna(起始量＝100ng/样品)，然后将cdna片段化并使用nugen的ovationultralowlibrarysystems连接到测序文库中。条形码化后，合并rna文库、变性并稀释至8pm的终浓度。使用flowcellsv.3在cbot(illumina)(单端)上执行簇形成。根据truseqsr方案(illumina)，sbs(通过合成测序)在hiseq2500(illumina)上执行，设定为50个循环，对每个样品产生平均30x10⁶个簇。使用fastqc软件过滤原始序列(fastq)以获得良好的质量分数。使用staraligner/对准器(star_2.3.0e_r291)(dobinetal.,bioinformatics29,15-21(2013))将得到的序列对准到小鼠基因组(mm10版本)上。只有唯一映射的数据读数(reads)被用来估计基因计数(genecount)，使用已发表的ensemblgeneannotations(v72)，通过thepython脚本‘htseq-count’(modeltype模型类型–union，http://www-huber.embl.de/users/anders/htseq/)(andersetal.,bioinformatics31,166-169(2015))。

在测绘了基因计数之后，将数据归一化，使用“m值的加权修剪平均值”，请另见(robinsonetal.,genomebiol11,r25(2010))。归一化后，执行差异化的基因表达，使用r中的“limma”包(ritchieetal.,nucleicacidsres43,e47(2015))。

rna测序的统计分析

主成分分析(pca)。对以limma库中的voom功能产生的log2归一化的表达数值，其pca是用r中的mixomics库((kim-anhlecao,florianrohart,ignaciogonzalez,sebastiendejean及关键贡献者benoitgautier,francoisbartolo,还有来自pierremonget,jeffcoquery,fangzouyaoandbenoitliquet的贡献.(2016).mixomics:omicsdataintegrationproject.rpackageversion6.0.0.https://cran.r-project.org/package＝mixomics)(lecaoetal.,bioinformatics25,2855-2856(2009))做出的。

阶层式聚类/分群。对以limma库中的voom功能产生的log2归一化的表达数值，阶层式聚类是用同名的r库(‘euclideandistance/欧几里德距离’和‘complete/完整’方法)中的pheatmap功能而做出的。hierarchicalclusteringwasmadeusingthefunctionoftherlibrarywiththesamename

箱线图。qpcr数据的箱线图，是用wereproducedwithr在–dct(gapdh/甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为参考)上的r生成的，以保持数据的log2标度。星号(*p.value<0.05,**p.value<0.01,***p.value<0.001)代表anova-tukey’s事后检验。

gosselin等人的rna-seq数据分析(gosselin,detal.,cell159,1327-1340(2014))。多样来源的对照小胶质细胞和巨噬细胞的原始表达数据，是下载自sra档案的geo数据集gse62826(srr1634675,srr1634676,srr1634677,srr1634678,srr1634708,srr1634709,srr1634710,srr1634711,srr1634712,srr1634721)，且获得具有原始序列的fastq文件。来自gosselin的巨噬细胞和小胶质细胞的数据读数，与来自μ和taμ的数据读书一起被处理，如本文所述，并生成pca与热度地图，以便将μ和taμ群体的表达与gosselin等人的研究中的成年小胶质细胞和巨噬细胞二者都进行对比(gosselinetal.,cell159,1327-1340(2014))。

文氏图(维恩图)。文氏图是用venny在线工具制作的(oliveros,j.c.(2007-2015)venny.一种用于多列表比对的互动工具，借助文氏图。http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)。

功能富集。为了评估与细胞群之间差异相关的途径，执行了gsea预先排序分析。使用limma估计的log2foldchanges(即log2[倍数变化])列表被用作默认参数的gsea预先排序的命令行工具的预先排序列表(gsea2-2.2.3.jar)。使用ensembl-mart同源地图将人类entrezid转换为小鼠基因符号后，使用geneontology生物过程(c5.go.bp)作为gmt文件。由于较高数目的显着类别被发现与μ.butx和taμ.butx细胞相关，富集的标准fdr(误判率)截止值从0.05被增加到0.001。使用gosemsimr包(1.24.1)(yuetal.,bioinformatics26,976-978(2010))计算gosemsim语义相似性矩阵。使用r中的pheatmap(具有欧几里德距离和“complete/完整”聚类方法)将相似性矩阵显示为聚类的gos的热度地图。

入藏代码。基因表达综合数据库(geneexpressionomnibus)：rna-seq数据可在入藏代码gse87799下获得，且gosselin等人的文献中的数据的重新分析可在入藏代码gse62826下获得(gosselin,d.etal.,cell159,1327-1340(2014))。

纳米颗粒(np)的生物合成与给予/施用

材料。甲基丙烯酸羟乙酯(hema,97％,西格玛-奥德里奇),ε-己内酯(cl,97％,西格玛-奥德里奇),2-乙基己酸锡(ii)盐(sn(oct)2,～95％,西格玛-奥德里奇),聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯(pegma950,mn950da,西格玛-奥德里奇),3-磺酸丙基甲基丙烯酸钾盐(spmak,98％,西格玛-奥德里奇),4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(cpa,>97％,西格玛-奥德里奇),4,4'-偶氮双(氰基戊酸)(acva,98％,西格玛-奥德里奇),过硫酸钾(kps；>99％纯度,美国化学学会等级试剂),罗丹明b(rhb,sb敏感度<0.1μg/ml,carloerbareagents),二环己基碳二亚胺(dcc；99％纯度,西格玛-奥德里奇),4-二甲氨基吡啶(dmap；>99％纯度,西格玛-奥德里奇)按原样使用，除非特别说明。聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯(pegma2000,mn2000da,50％重量百分比溶于水,西格玛-奥德里奇)是用dcm萃取，并在减压下干燥。所用的全部溶剂均为分析级纯度(分析纯)，且购自西格玛-奥德里奇。

基于pcl的大分子单体(hema-cln)和hema-rhb的合成和特性分析。基于聚ε-己内酯的大分子单体是通过散装的cl的开环聚合反应(rop)，并以hema作为起始剂和st(oct)2作为催化剂按照先前的方案生产。起始剂与催化剂的比例保持恒定为200，而单体与起始剂的摩尔比设定为3和5，以便分别得到具有3(hema-cl3)和5(hema-cl5)己内酯单元的大分子单体。对于hema-cl5，在室温下将4.5ghema和71mgst(oct)2在10ml小瓶中混合直至完全溶解。将20g己内酯和82.6mgna2so4在隔膜密封烧瓶中混合，并在控温油浴中在搅拌下置于130℃。然后将hema和st(oct)2混合物加入烧瓶中并使反应物反应3小时。冷却后，通过1h-nmr(400mhz，bruker，瑞士)特性分析大分子单体。在dcc和dmap存在下，通过rhb与hema的steglich酯化反应合成基于罗丹明b的荧光单体，并根据文献中报道的方案进行特性分析。

嵌段共聚物的合成和特性分析-自组装np。通过两次随后的raft溶液聚合反应合成两种基于pcl的嵌段共聚物。在第一步中，peg化的大分子raft试剂(5pegma2000)是通过pegma2000的raft聚合反应合成，其中，pegma2000以一个单体对cpa，acva与cpa的摩尔比等于5。简言之，14.8g的pegma2000,425mg的cpa和85mg的acva溶于75ml乙醇中并倒入隔膜密封烧瓶中。用氮气吹扫30分钟后，在控温的油浴中在搅拌下将混合物加热至65℃。24小时后，将另外85mgacva溶解在2.5ml乙醇中并用注射器注入反应器中。再24小时后停止反应，并将混合物在氮气下干燥。将最终的大分子raft试剂用乙醚洗涤3次以除去未反应的pegma2000。

在第二步中，在添加和不添加spmak的情况下合成两种不同的嵌段共聚物，以便分别产生中性和带负电的聚合物表面活性剂。对于中性的嵌段共聚物，称其为510(5是指pegma2000单元的数量，10是指hema-cl5重复单元的数量)，hema-cl5的raft溶液聚合反应完成，其中单体与raft试剂和起始剂与raft剂的摩尔比分别等于10和3。将5.8g的5pegma2000,4g的hema-cl5,54mg的acva和13.8mg的hema-rh溶解在50ml乙醇中并倒入圆底烧瓶中。用氮气吹扫30分钟后，将混合物加热至65℃并在搅拌下反应24小时。将最终聚合物在氮气下干燥并用乙醚洗涤三次。为了生产带负电荷的嵌段共聚物(510-sp)，将相同数量的起始剂、大分子raft试剂、hema-rh和5pegma2000与0.28gspmak一起溶解在39g乙酸缓冲液/乙醇中(20/80％重量百分比)的混合物。应用510的相同反应条件和纯化方案。使用jasco(系列)仪器通过gpc确定每个步骤的转换率、mw和分散度(d)。将样品以4mg/ml的浓度溶解在thf中，并在注射前通过0.45μm孔径的过滤器注射器过滤。分离在35℃下以0.5ml/min的流速通过三个superchromplgel5μm柱(600×7.5mm，测量范围0.5-1000kda)执行。mn、gpc和分散度通过示差折射率(ri)数据的直接校准测定，并且以聚(苯乙烯)为相对的标准物(580至3,250,000g/mol,polymerlaboratories)。转换率的估计是通过聚合物(apol)和单体(amon)的ri信号曲线下的面积，根据以下公式：

xgpc＝apol/(apol+amon)

在嵌段共聚物510sp的情况下，由于其在gpc的洗脱液中的不溶性，通过1h-nmr执行特性分析。将10mg510sp溶解在0.7mgdmso-d6中，以便进行1h-nmr分析。

通过510和510sp的纳米沉淀生产np–自组装np。两种荧光嵌段共聚物被用来通过自组装将np直接生产到pbs溶液中。将60mg聚合物表面活性剂(例如510)溶解在0.3gdmso中，然后用预先装有3mlpbs的5ml注射器吸取。在抽吸和排出三个循环后，将混合物通过0.2μmpes/聚醚砜树脂孔径过滤器注射器(millex)过滤。通过动态激光光散射分析(dlls,zetasizernanoseries,马尔文仪器/malverninstruments)测定npdn和pdi。

通过乳状液聚合生产的np-第一代np。如前所述，通过hema-cl3的单体饥饿半间歇乳状液聚合反应(mssep)合成peg化的基于pcl的np。简言之，将0.4gpegma950溶解在三颈圆底烧瓶中的45ml去离子水中并加热至80℃。在三次氮气/真空循环后，将2.1ghema-cl3与2.1mghema-rh混合，并以2ml/h的进料速率加入反应器中。将0.02gkps溶解在2.5ml去离子水中，并在亲脂性单体进料开始时用注射器注射。3小时后，停止反应并通过dlls特性分析最终的胶乳。

统计分析

所有统计检验都是双侧的。对于rna-seq结果以外的比较，student'st检验用于2组之比较。为了进行多于两组的比较，使用了具有tukey’s事后检验的单因素方差分析。在p值<1.5(*0)、**p<0.01和***p<0.001时，差异被认为是统计学上显着的。在所有带有误差杠的图中，该图表描绘平均值±标准差。

其他具体例

从前面的描述中显而易见的是，可以对这里描述的本发明进行变化和修改以将其适用于各种用途和条件。这些具体例也在以下权利要求的范围内。

本文中对变量的任何定义中的元素列表的叙述包含将该变量定义为所列元素的任何单个元素或组合(或子组合)。这里对具体例的描述包含作为任何单个具体例的该具体例或者与任何其他具体例或其部分的组合。

本说明书中提及的所有专利，出版物和登录号在此通过引用并入，其程度如同每个独立的专利、出版物和入藏号码被具体和单独地指出通过引用并入。