用于清除组织的组合物和方法与流程

所公开的发明一般地属于组织清除领域，并且特别是属于使用组织清除组合物以使生物组织透明的生物组织分析领域。发明背景虽然生物标本本质上是三维的，但是光散射的模糊效应妨碍了高分辨率深部组织成像。可视化厚组织的一种方法是通过将它们连续切割成薄切片并使用这些切片用计算方法重建三维图像。然而，这种方法不仅费力，而且在由薄切片无法确定组织的真实三维性质的情况下也受到限制。研究具有大突起的复杂细胞，例如神经系统和病理组织中的精细结构的那些，最好在完整组织中进行。为了保持组织的真实三维结构，人们对开发组织清除剂和技术的兴趣激增。组织清除技术直接使组织透明，允许在组织深处成像。通过使用能够对选择的深度平面成像(即，对组织进行光学切片)的显微镜，可以快速获取3d图像，在连续切片方法中没有切割伪像或样品破坏。良好的光学清除方法通过减轻原位光散射同时保持组织完整性以便精确地重建信号来促进深层组织生物成像。组织清除技术通常改变组织的物理化学性质。目前可用于清除组织的组合物可能引起导致结构变形的显著的膨胀。在某些情况下，清除剂仅适用于非常小的样品，因为它们的清除功效有限。现有的清除剂也需要很长时间来清除组织，并且在光学清除之前需要多个步骤用于组织处理。此外，它们与长期用福尔马林固定的存档的组织不相容。组织清除的整个过程可以被视为组织折射率(ri)均质化(即，均质化组织的折射率或使组织的折射率更均一)。目前可用的方法可分为(1)水基简单ri均质化，(2)脱脂辅助的ri均质化，和(3)有机溶剂基ri均质化。后两种类别各自具有其各自的优势，但可能引起显著的组织损伤，并且通常不适用于死后的人体组织(表1)。表1相反，即使类别(1)造成的损害最小，其组织清除效果也不如其它两种方法的组织清除效果好。这产生了对改进的水基组织清除方法的需求，其导致改善的组织透明度和最大的结构保存。优选地，这些方法适用于人体组织，并且不仅与所有现有的化学染色方法和电子显微镜相容，而且还与未来的诊断和研究方法相容。在基础研究中对三维成像和分析的需求增加。三维成像有助于在发育和发病过程中理解器官的生物结构和功能。染色后的组织清除导致改善的图像质量。本发明的一个目的是提供一种具有改善的组织清除能力的组织清除组合物。本发明的另一个目的是提供改善的清除组织的方法。本发明的另一个目的是提供改善的清除人体组织的方法。发明简述本文公开了用于清除组织的组合物和方法，所述组织用于例如随后的三维分析。在一些形式中，所公开的组织清除组合物由三个核心组分组成：(1)均质剂(如n-甲基葡糖胺(nmg)、尿素或乙二胺)；(2)细胞质、水溶性ri调节剂(如碘海醇、硫代硫酸钠或聚乙二醇)；和(3)膜、脂溶性ri调节剂(如2,2'-硫代二乙醇(tde)或丙二醇)。在优选的形式中，所公开的组织清除组合物不含洗涤剂或变性剂，其允许保留脂质膜用于亲脂性追踪和随后的成像。在一些形式中，所公开的方法可以包括在公开的组织清除组合物中组织的单步孵育。所公开的组织清除组合物的不同形式特别适用于不同的组织和来源物种，例如脑特异性组合物、肝特异性组合物或人脑组织特异性组合物相对于小鼠脑组织特异性组合物。一些特定的组织清除组合物特别适用于从存档来源(例如那些存档长达50年的来源)取回的组织相对于最近固定的组织(例如那些在3周至3个月内固定的组织，这是人体组织的典型组织)。在一些形式中，所公开的组织清除组合物可含有10％尿素、25％2,2'-硫代二乙醇和32％碘海醇。在一些形式中，组织清除组合物可含有20％n-甲基葡糖胺、25％2,2'-硫代二乙醇和32％碘海醇。在一些形式中，组织清除组合物可含有20％n-甲基葡糖胺、35％丙二醇和32％碘海醇。如可适用于任何特定应用，这些化合物的浓度可以变化。在一些形式中，该组合物适用于最稳健的(robust)一般应用。在一些形式中，该组合物适用于长期固定的人体组织。在一些形式中，该组合物适用于体内清除应用。所公开的组织清除组合物可以包含另外的组分，例如，使组合物可用于或适合于其待应用的特定组织和来源物种。在一些形式中，所公开的组织清除组合物与例如用于常规组织学和电子显微镜研究的进一步处理方法、其它组织清除方法、不同组织染色方法(例如免疫组织化学、化学染色、转基因细胞标记方法、成像探针、组织原位化学和病毒示踪方法)或其组合相容。所公开的方法和组合物的其它优点将部分地在下面的描述中阐述，或者可以通过实践所公开的方法和组合物来学习。所公开的方法和组合物的优点将通过所附权利要求中特别指出的元素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般性描述和下面的详细描述都只是示例性和说明性的，并不是对要求保护的本发明的限制。附图的简要说明包含在本说明书中并构成其一部分的附图示出了所公开的方法和组合物的若干实施方案，并与说明书一起用于解释所公开的方法和组合物的原理。图1是描绘理论折射率(ri)调谐的示意图。两个相对介质之间的ri差异引起光路弯曲，并且理论上可以通过调整每个介质的折射率以彼此匹配来消除。图2是描绘细胞中清除效果的示意图。通过选择性溶解不同细胞区室中的化学物质来调谐不同细胞区室(例如细胞核和细胞质的细胞区室)的折射率，产生最小破坏性的、高效的组织清除效果。图3是描绘通过蛋白质变性辅助的ri均质化的示意图。除了ri调节化学物质的选择性溶解(由分散在整个图示中的深灰色球体表示)之外，可以添加温和的添加剂(由浅灰色球体表示)以促进光学均质化过程。这种添加剂可以是，例如，由面板(letpane)底部的箭头右侧的球体表示的变性剂。这样允许实现更好的物理均质化，从而导致更有效的清除。图4显示ffpe组织可以用我们的方法取回和处理，并使用opticlear清除，以允许脑结构的三维可视化(在左侧两个图像上显示抗神经丝和核染色dapi的抗体)，与对照相比，具有最小的形态学干扰。在更高的放大倍数下也保留了精细的结构细节(gfap，d.)。图5是显示包埋在各种丙烯酰胺配方中的每克组织中从脱脂中渗漏的蛋白质的量的图。图6a-6e是描绘claritytm组织水凝胶的化学背景的示意图。图6a描述了所提出的claritytm水凝胶-组织杂交反应(路径a)，其中假设丙烯酰胺的氮原子攻击当允许组织蛋白质与甲醛反应时形成的甲醛亚胺碳；虽然良好地确定，蛋白质胺可以攻击甲醛亚胺碳(路径b)，导致蛋白质交联，这是常规固定的基础。图6b描绘了使用溶菌酶作为模型蛋白质的模型反应，以模拟用于蛋白质质谱分析的claritytm蛋白质-水凝胶杂交。图6c-6e描绘了甲醛修饰的蛋白质和丙烯酰胺之间可能的反应。图6c显示了如claritytm中提出的酰胺氮对甲醛亚胺基团的亲核加成。图6d显示来自蛋白质中半胱氨酸残基的巯基亲核加成到丙烯酰胺的迈克尔受体双键上，使其不能通过聚合作用交联到聚丙烯酰胺网状结构上。图6e显示了简单加合物的形成，这可能解释了见于光谱测定数据中的异质性和噪声。图7示出了用于公开的组织清除组合物的实例的组织染色和处理的示例性方案。发明详述本文公开了用于清除组织的组合物和方法，所述组织可用于例如随后的三维分析。对具有大突起的复杂细胞如神经系统和病理组织中的精细结构的那些细胞的研究最好在完整组织中进行。所公开的组合物和方法消除了对组织切片的需要，使得该过程比常规组织学研究更快(通常快12-15倍)。通过使用所公开的组合物和方法实现的透明度可以增强细胞结构的观察能力和信号检测灵敏度，包括例如荧光细胞结构和非荧光细胞结构。所公开的组合物和方法还允许以任何取向对组织进行三维观察，可以是整体的，也可以是虚拟部分，并且避免其它问题，例如载玻片的损失。已经发现，通过调谐细胞和组织的不同部分(例如水性部分、脂质/疏水部分、蛋白质部分、细胞质、细胞核)的折射率(ri)来匹配(相同或相似)，可以实现完整或整个组织的相对透明度或者半透明度。发现通过使用至少一种调节组织的水性部分的ri的试剂和一种调节组织的脂质/疏水部分的ri的试剂，可以使这些不同组织部分的ri在值上相同或更接近。组织部分的ri的这种调谐导致较少的折射变形并因此增加透明度或半透明度。通常，选择试剂以分割或分馏成它们要调节的组织组分。这通常可以通过使用例如用于调节组织的水性部分的ri的相对亲水性试剂和用于调节组织的脂质/疏水部分的ri的相对疏水性试剂来实现。优选选择试剂以将其靶组织部分的ri朝向其它组织部分(多个部分)的ri调节。还发现，因为用于调节组织部分的ri的试剂不能有效地物理上与组织中的一些未变性蛋白质结合，并且因为这种未经调节的未变性蛋白质可以影响它们发生的组织部分的ri，所以对于一些组织来说，使用使一些或所有有问题的蛋白质更容易被ri调节剂接触(accessible)的试剂是有用的。因此，这样的均质剂因此允许不同组织部分的ri的更完全的调谐或匹配。在上面讨论的基本发现之后，认识到，因为不同组织包含不同组分，所以不同组织中组织部分的折射率可以不同。因此，认识到所公开的组合物和方法的结果可以通过选择试剂、它们的浓度/比例或它们的组合来改善，所述试剂、它们的浓度/比例或它们的组合可以基于靶组织的组分的特定性质将靶组织部分和靶组织的ri调节到正确的程度。通过记录靶组织的给定部分的ri，并选择试剂和试剂的浓度/比例以将该组织的不同部分的ri调谐到相同或相似的ri值，通常可以简化试剂选择的特征以及待调谐或匹配给定目标组织的试剂的浓度/比例。以这种方式，本发明的发现允许通过遵循发现和开发的明确原理来配制组织清除组合物，所述组合物清除组合物调谐或匹配多种不同组织。在一些形式中，所公开的组织清除组合物的特征是低粘度、低渗透压、低浓度的化学物质或其组合。这些性质转化为更容易操作、更快的组织清除时间、单步方法、更好的组织保存、更低的生产成本或其组合。所公开的组织清除组合物可称为“opticlear组合物”。在优选形式中，所公开的组织清除组合物不含洗涤剂或变性剂，其允许保留脂质膜用于亲脂性追踪和随后的成像。在一些形式中，所公开的方法可以包括在公开的组织清除组合物中组织的单步孵育。在一些形式中，所公开的组织清除组合物在人体组织中表现出改善的清除能力，这已经难以用其它方法和其它组合物实现，允许在3小时内可视化低至300μm的结构。在一些形式中，所公开的组织清除组合物可用于清除存档的和福尔马林固定的、石蜡包埋的(ffpe)组织。在一些形式中，所公开的组织清除组合物可用于从临床环境中清除活检组织以促进病理诊断。在一些形式中，组织清除后的长时间储存也是可能的。表2中提供了所公开的组织清除组合物的实例与其它目前可用的清除剂之间的比较。表2i.定义。如本文所用的术语“组织清除”是指具有调谐、匹配或均质化组织的折射率(ri)的效果的过程，通常导致组织透明度的增加。如本文所使用的术语“均质化”是指通过共混不同的元素或特征使组合物如溶液、组织或组织部分在整个过程中均匀的行为。例如，在组织的ri的背景下，均质化在整个组织中产生更均匀或匹配的ri。本文在组织的ri的上下文中使用的术语“调谐”是指使ri中的不同组织部分在整个过程中更均匀的行为。例如，在组织的ri的背景下，调谐在整个组织中产生更均匀或匹配的ri。在用于调谐组织ri的试剂的背景下，调谐是指选择试剂和试剂的比例以完成组织ri的调谐。本文在组织ri的上下文中使用的术语“匹配”是指使ri中的不同组织部分彼此更均匀的行为。例如，在组织的ri的背景下，匹配在整个组织中产生更均匀或匹配的ri。在用于匹配组织ri的试剂的背景下，匹配是指选择试剂和试剂的比例以实现组织ri的匹配。如本文所用的术语“均质剂”是指增加难以共混的混合物(例如组织)的均质性的化合物或组合物。本文所用的术语“水溶性调节剂”和“水溶性ri调节剂”是指可以选择性调节组织的水性区室例如细胞质、细胞溶质、细胞外区室、间质液、血液、血浆和淋巴液的ri的化合物或组合物。本文所用的术语“水溶性”是指组分溶解在水中的能力。如本文所用的术语“脂溶性调节剂”和“脂溶性ri调节剂”是指可以选择性地调节组织的富含脂质、膜质或脂肪区室的ri的化合物或组合物。如本文所用，关于组分的术语“脂溶性”是指组分溶解于脂肪、油、脂质和非极性溶剂中的能力。如本文所用的术语“折射率调节剂”或“ri调节剂”是指选择性地调节组织的富含脂质或水性区室的ri的化合物或组合物。本文使用的术语“折射率”或“ri”是指一种介质(例如空气、玻璃或真空)中的辐射速度(例如电磁辐射或光)与另一种介质中的辐射速度的比率。如本文所用的术语“存档的组织”是指已经保存用于短期或长期储存的组织。可以通过热固定、浸入固定溶液、血液低灌注、冷冻、福尔马林固定和石蜡包埋、或任何其它化学或其它可用方法来保存组织。ii.组合物本文提供了用于清除组织以用于随后的三维分析的组合物。所公开的组合物可以包括另外的组分，例如，使组合物可用于或适合于其应用的特定组织和来源物种。在一些形式中，所公开的组织清除组合物由三种核心组分组成：(1)均质剂，(2)细胞质、水溶性ri调节剂，和(3)膜、脂溶性ri调节剂。a.均质剂均质化是用于使两种互不溶液体的混合物在整个过程中相同或相似的几种方法中的任何一种。这通常通过将一种液体转变成由在整个另一种液体中均匀分布的极小颗粒组成的状态来实现。均质剂是改善难以共混的混合物的均匀性的产品。这有利于水溶性和水不溶性试剂与组织组分的真正均质化，以实现更好的光学均匀性。在一些形式的组织清除组合物中，n-甲基葡糖胺可用作均质剂。在其它形式中，尿素可用作均质剂。在一些形式中，乙二胺可用作均质剂。然而，如本领域技术人员所理解的，本领域技术人员已知许多其它可用于均质化混合物的试剂或方法。这些试剂和方法可与所公开的组合物和方法一起使用。组织清除组合物中均质剂的最终浓度可以变化。然而，较高浓度的均质剂可能损害组织完整性或荧光蛋白信号强度。在一些形式中，组织清除组合物中尿素的浓度范围可以为10％至24％。优选地，尿素的浓度为10％。在一些形式中，组织清除组合物中n-甲基葡糖胺的浓度范围可以为20％至50％。优选地，n-甲基葡糖胺的浓度为20％。b.折射率(ri)调节剂在大多数形式中，所公开的组织清除组合物采用各种化学物质的光学特性，以减少穿过组织样品的光的损失，且因此提高光恢复效率(lightretrievalefficiency)。水溶性ri调节剂选择性地调节组织的水性区室，例如细胞质、细胞溶质、细胞外区室、间质液、血液、血浆和淋巴的ri。适用于所公开的组织清除组合物的水溶性ri调节剂包括但不必限于诸如碘海醇、硫代硫酸钠或聚乙二醇的试剂。在其它形式中，水溶性调节剂可包括甲泛葡胺、碘克沙醇、泛影酸钠和碘化钠。脂溶性ri调节剂选择性地调节组织的富含脂质、膜质或脂肪区室的ri。适用于所公开的组织清除组合物的脂溶性ri调节剂包括但不必限于诸如2,2'-硫代二乙醇(tde)或丙二醇的试剂。在其它形式中，脂溶性调节剂可包括甘油、乙二醇、十二烷基硫酸钠、三甲胺、三乙醇胺、三乙醇胺-硼酸(1：1)加合物。特定ri调节剂的适用性可以使用各种测定来确定。在一些形式中，该测定包括在均质器(例如n-甲基葡糖胺或尿素)存在下在不同浓度的调节剂中孵育组织匀浆。优选地，该测定法包括水溶性调节剂和脂溶性调节剂两者，以实现期望的匀浆不透明度的降低。可以通过使用分光光度计在uv光、可见光和近红外光范围内测量匀浆不透明度。c.辅料本文公开的组合物还可包含药学上可接受的赋形剂，如本文所用，其包括适合于特定组合物的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体载体、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如通过产生任何不希望的生物效应或以有害方式与药物组合物的任何其它组分(多种其它组分)相互作用，否则其用途被认为是在本发明的范围内。示例性稀释剂包括但不限于浓盐酸、水、磷酸盐缓冲盐水(ph6.8-7.6)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(ph6.8-7.6)、0.01％叠氮化钠及其组合。在一些形式中，组合物还可以进一步含有氯化钠(142-148mm)、氯化钾(3-7mm)、乳酸钠(28-32mm)、氯化钙(1.2-2.4mm)和葡萄糖(5-7mm)。d.具体组成在一些形式中，所公开的组织清除组合物包含n-甲基葡糖胺、碘海醇和2,2'-硫代二乙醇，这些组分中的每一种的浓度范围为10％至50％。优选地，组织清除组合物可以由20％n-甲基葡糖胺、32％碘海醇和25％硫代二乙醇组成。在一些形式中，所公开的组织清除组合物包含n-甲基葡糖胺、碘海醇和丙二醇，n-甲基葡糖胺和碘海醇各自的浓度范围为10％至50％，并且丙二醇的浓度范围为10％至60％。优选地，组织清除组合物可以由20％n-甲基葡糖胺、32％碘海醇和35％丙二醇组成。在一些形式中，所公开的组织清除组合物包含尿素、碘海醇和2,2'-硫代二乙醇，尿素浓度范围为5-50％，并且碘海醇和2,2'-硫代二乙醇各自的浓度范围为10％至50％。优选地，组织清除组合物可以由10％尿素、32％碘海醇和25％2,2'-硫代二乙醇组成。在一些形式中，均质剂可以是组织清除组合物的5至60％、5至59％、5至58％、5至57％、5至56％、5至55％、5至54％、5至53％、5至52％、5至51％、5至50％、5至49％、5至48％、5至47％、5至46％、5至45％、5至44％、5至43％、5至42％、5至41％、5至40％、5至39％、5至38％、5至37％、5至36％、5至35％、5至34％、5至33％、5至32％、5至31％、5至30％、5至29％、5至28％、5至27％、5至26％、5至25％、5至24％、5至23％、5至22％、5至21％、5至20％、5至19％、5至18％、5至17％、5至16％、5至15％、5至14％、5至13％、5至12％、5至11％、5至10％、5至9％、5至8％、5至7％、5至6％、6至50％、7至50％、8至50％、9至50％、10至50％、11至50％、12至50％、13至50％、14至50％、15至50％、16至50％、17至50％、18至50％、19至50％、20至50％、21至50％、22至50％、23至50％、24至50％、25至50％、26至50％、27至50％、28至50％、29至50％、30至50％、31至50％、32至50％、33至50％、34至50％、35至50％、36至50％、37至50％、38至50％、39至50％、40至50％、41至50％、42至50％、43至50％、44至50％、45至50％、46至50％、47至50％、48至50％、49至50％、6至48％、6至46％、7至46％、7至44％、8至44％、8至42％、9至42％、9至40％、10至40％、10至38％、11至38％、11至36％、12至36％、12至34％、13至34％、13至32％、14至32％、14至30％、15至30％、15至28％、16至28％、16至26％、17至26％、17至24％、18至24％、18至22％、19至22％、19至20％、10至20％、10至19％、11至19％、11至18％、12至18％、12至17％、13至17％、13至16％、14至16％、14至15％、15至25％、15至24％、16至24％、16至23％、17至23％、17至22％、18至22％、18至21％、19至21％、19至20％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、或5％。在一些形式中，水溶性调节剂可以是组织清除组合物的5至60％、5至59％、5至58％、5至57％、5至56％、5至55％、5至54％、5至53％、5至52％、5至51％、5至50％、5至49％、5至48％、5至47％、5至46％、5至45％、5至44％、5至43％、5至42％、5至41％、5至40％、5至39％、5至38％、5至37％、5至36％、5至35％、5至34％、5至33％、5至32％、5至31％、5至30％、5至29％、5至28％、5至27％、5至26％、5至25％、5至24％、5至23％、5至22％、5至21％、5至20％、5至19％、5至18％、5至17％、5至16％、5至15％、5至14％、5至13％、5至12％、5至11％、5至10％、5至9％、5至8％、5至7％、5至6％、6至50％、7至50％、8至50％、9至50％、10至50％、11至50％、12至50％、13至50％、14至50％、15至50％、16至50％、17至50％、18至50％、19至50％、20至50％、21至50％、22至50％、23至50％、24至50％、25至50％、26至50％、27至50％、28至50％、29至50％、30至50％、31至50％、32至50％、33至50％、34至50％、35至50％、36至50％、37至50％、38至50％、39至50％、40至50％、41至50％、42至50％、43至50％、44至50％、45至50％、46至50％、47至50％、48至50％、49至50％、14至49％、14至48％、15至48％、15至47％、16至47％、16至46％、17至46％、17至45％、18至45％、18至44％、19至44％、19至43％、20至43％、20至42％、21至42％、21至41％、22至41％、22至40％、23至40％、23至39％、24至39％、24至38％、25至38％、25至37％、26至37％、26至36％、27至36％、27至35％、28至35％、28至34％、29至34％、29至33％、30至33％、30至32％、31至32％、27至37％、27至36％、28至36％、28至35％、29至35％、29至34％、30至34％、30至33％、31至33％、31至32％、20至30％、20至29％、21至29％、21至28％、22至28％、22至27％、23至27％、23至26％、24至26％、24至25％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、或5％。在一些形式中，脂溶性调节剂可以是组织清除组合物的5至70％、5至69％、5至68％、5至67％、5至66％、5至65％、5至64％、5至63％、5至62％、5至61％、5至60％、5至59％、5至58％、5至57％、5至56％、5至55％、5至54％、5至53％、5至52％、5至51％、5至50％、5至49％、5至48％、5至47％、5至46％、5至45％、5至44％、5至43％、5至42％、5至41％、5至40％、5至39％、5至38％、5至37％、5至36％、5至35％、5至34％、5至33％、5至32％、5至31％、5至30％、5至29％、5至28％、5至27％、5至26％、5至25％、5至24％、5至23％、5至22％、5至21％、5至20％、5至19％、5至18％、5至17％、5至16％、5至15％、5至14％、5至13％、5至12％、5至11％、5至10％、5至9％、5至8％、5至7％、5至6％、6至60％、7至60％、8至60％、9至60％、10至60％、11至60％、12至60％、13至60％、14至60％、15至60％、16至60％、17至60％、18至60％、19至60％、20至60％、21至60％、22至60％、23至60％、24至60％、25至60％、26至60％、27至60％、28至60％、29至60％、30至60％、31至60％、32至60％、33至60％、34至60％、35至60％、36至60％、37至60％、38至60％、39至60％、40至60％、41至60％、42至60％、43至60％、44至60％、45至60％、46至60％、47至60％、48至60％、49至60％、16至44％、16至43％、17至43％、17至42％、18至42％、18至41％、19至41％、19至40％、20至40％、20至39％、21至39％、21至38％、22至38％、22至37％、23至37％、23至36％、24至36％、24至35％、25至35％、25至34％、26至34％、26至33％、27至33％、27至32％、28至32％、28至31％、29至31％、29至30％、25至35％、25至34％、26至34％、26至33％、27至33％、27至32％、28至32％、28至31％、29至31％、29至30％、20至30％、20至29％、21至29％、21至28％、22至28％、22至27％、23至27％、23至26％、24至26％、24至25％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、5至50％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、或5％。然而，如本领域技术人员可以理解的，组分、任何此类组分的浓度的范围和子范围可以根据组织清除组合物的具体应用而变化。在一些形式中，组织清除组合物适用于最稳健的(robust)一般应用。在一些形式中，组织清除组合物适用于长期固定的人体组织。在一些形式中，组织清除组合物适用于体内清除应用。在大多数形式中，所公开的组织清除组合物与例如进一步的处理方法或常规组织学和电子显微镜研究、其它组织清除方法和不同的组织染色方法，例如免疫组织化学、化学染色、转基因细胞标记方法、成像探针，组织原位化学和病毒追踪方法相容。可以配制单独形式的组织清除组合物并用于不同的组织和来源物种。在一些形式中，该组合物适用于清除脑组织。在一些形式中，该组合物适用于清除肝组织。在一些形式中，该组合物适用于清除人体组织。在一些形式中，该组合物适用于清除小鼠组织。在一些形式中，该组合物适用于清除从存档来源中取回的组织。在一些形式中，该组合物适用于清除已存档3个月至50年的组织。在一些形式中，该组合物适用于清除最近固定的组织，例如3周至3个月之间的组织。在一些形式中，待清除的组织可以是存档的组织，其中存档的组织已经存储至少3周、4周、1个月、5周、6周、7周、8周、2个月、9周、10周、11周、12周、13周、3个月、14周、15周、16周、17周、4个月、18周、19周、20周、21周、5个月、22周、23周、24周、25周、26周、6个月、27周、28周、29周、30周、7个月、31周、32周、33周、34周、8个月、35周、36周、37周、38周、39周、9个月、40周、41周、42周、43周、10个月、44周、45周、46周、47周、11个月、48周、49周、50周、51周、52周、12个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、24个月、2年、30个月、36个月、3年、42个月、48个月、4年、54个月、60个月、5年、6年、7年、8年rs、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、22年、24年、25年、26年、28年、30年、35年、40年或50年。然而，如本领域技术人员将理解的，在应用所公开的组织清除组合物之前，组织固定的时间范围可以变化，并且因此不限于上述确定的时间范围。还应理解，本文公开的组合物的用途不限于上述确定的组织、来源或来源物种，并且因此可以变化。iii.试剂盒所公开的组织清除组合物以及其它材料可以以任何合适的组合包装在一起，作为用于实施或帮助实施所公开的方法的试剂盒。如果给定试剂盒中的试剂盒组分被设计并适于在所公开的方法中一起使用，则是有用的。所公开的组合物可以包括另外的组分，例如，使组合物可用于或适合于其应用的特定组织和来源物种。在一些形式中，所公开的组织清除组合物由三种核心组分组成：(1)均质剂，(2)细胞质、水溶性ri调节剂，和(3)膜、脂溶性ri调节剂。在一些形式中，组织清除试剂盒可包含含有10％尿素、25％2,2'-硫代二乙醇和32％碘海醇的组合物。在一些形式中，试剂盒可包含含有20％n-甲基葡糖胺、25％硫代二乙醇和32％碘海醇的组合物。在一些形式中，试剂盒可包含含有20％n-甲基葡糖胺、35％丙二醇和32％碘海醇的组合物。然而，如本领域技术人员将理解的，特定试剂盒中的组分、任何此类组分的浓度的范围和子范围可根据组织清除组合物的具体应用而变化。为不同的组织和来源物种提供单独的组合物。在一些形式中，该组合物适用于清除脑组织。在其它形式中，该组合物适用于清除肝组织。在一些形式中，该组合物适用于清除人体组织。在其它形式中，该组合物适用于清除小鼠组织。在一些形式中，该组合物适用于清除从存档来源中取回的组织。在一些形式中，该组合物适用于清除已存档3个月至50年的组织。在其它形式中，该组合物适用于清除最近固定的组织，例如3天至3个月的组织。在一些形式中，该组合物适用于最稳健的(robust)一般应用。在一些形式中，该组合物适用于体内清除应用。然而，如本领域技术人员可以理解的，在应用所公开的组合物之前组织固定的时间范围可以变化，并且因此不限于上述确定的时间范围。在一些形式中，所公开的试剂盒还可包含10％w/v叠氮化钠溶液、10x磷酸盐缓冲盐水浓缩物、含0.1％tritonx-100和0.01％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水、在ph8.5的0.2m硼酸钠缓冲液中的4％w/v十二烷基硫酸钠、在ph7.4的磷酸盐缓冲盐水中的8％w/v十二烷基硫酸钠。iv.使用方法a.用组织清除组合物进行ri均质化本公开内容还包括用于使受试者的生物材料透明的方法。在一些形式中，该方法可以包括在特定温度下在本文所述的合适的组织清除组合物中孵育样本组织足够时间段的单个步骤。孵育可以在范围为约37℃至约55℃的温度下进行，持续范围为3小时至24小时的时间段。优选地，将样品在组织清除组合物中于37℃孵育6小时。可以取回用福尔马林化学固定的，或者是福尔马林固定、石蜡包埋(ffpe)的人或啮齿动物组织；例如通过一系列有机溶剂和洗涤方法再水合，以及随后的“sds处理”的准备。sds-处理涉及制备的组织的部分脱脂用于随后的标记。这可以通过将制备的组织浸入特定缓冲液中的4％或8％sds中，然后在一定温度下孵育，允许透化和部分脱脂来实现。在一些形式中，将样品组织在组织清除组合物中孵育，所述组织清除组合物包含n-甲基葡糖胺、碘海醇和2,2'-硫代二乙醇，其中这些组分中的每一种的浓度范围为10％至50％。优选地，将样品组织在含有20％n-甲基葡糖胺、32％碘海醇和25％硫代二乙醇的组织清除组合物中孵育。在其它形式中，将样品组织在组织清除组合物中孵育，所述组织清除组合物包含n-甲基葡糖胺、碘海醇和丙二醇，其中n-甲基葡糖胺和碘海醇各自的浓度范围为10％至50％，并且丙二醇的浓度范围为10％至60％。优选地，将样品组织在含有20％n-甲基葡糖胺、32％碘海醇和35％丙二醇的组织清除组合物中孵育。在另外的其它形式中，将样品组织在组织清除组合物中孵育，所述组织清除组合物包含尿素、碘海醇和2,2'-硫代二乙醇，其中尿素的浓度范围为5-50％，并且碘海醇和2,2'-硫代二乙醇中每一种的浓度范围为10％至50％。优选地，将样品组织在含有10％尿素、32％碘海醇和25％2,2'-硫代二乙醇的组织清除组合物中孵育。然而，如本领域技术人员可以理解的，可以将样品组织在组合物中孵育，所述组合物的组分、任何此类组分的浓度的范围和子范围根据组织和特定应用而变化。样品组织可以是植物或动物的组织或器官，优选动物例如昆虫、鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物的组织或器官；更优选地，哺乳动物的组织或器官。哺乳动物可包括但不限于实验动物，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠和灵长类动物；宠物，如狗和猫；农场动物，如牛、马、羊；和人类。优选地，组织或器官来源于人类。根据本公开内容的某些实施方案，生物材料是小鼠的脑、心脏、胃、胰腺、肠、肝、肺和耳以及苍蝇的头部或生物工程胶原支架。b.用组织清除组合物进行组织染色和处理样品组织可以用成像示踪剂预先标记，所述成像示踪剂是染料、荧光蛋白或抗体，使得在样品组织经过透明处理并变得透明之后，可以在显微镜下，优选通过共聚焦显微镜来追踪成像示踪剂。组织染色和处理的示例性方案在图7中示出。在一些形式中，可以取回已经在福尔马林中固定一年或更长时间的人或其它组织，并进行各种处理步骤，例如通过一系列有机溶剂和洗涤方法的再水合，以及随后的“sds处理”的准备。“sds处理涉及在先前步骤中对制备的组织进行部分脱脂，以便随后标记组织。从技术上讲，这是通过将制备的组织浸入某种缓冲液中的4％或78％sds中并在某一温度下孵育来实现的，该温度允许组织的透化和部分脱脂。在一些形式中，取回的存档组织经受亲脂性染料追踪。dii和cm-dii染料可直接应用于已经用福尔马林固定≥1年的非sds处理的人脑组织。随后可以用组织清除组合物清除组织，并使用各种成像方法在3d中可视化，例如通过微分干涉对比、共聚焦显微镜、光片显微镜、超显微镜、随机光学重建显微镜、光活化定位显微镜、结构照明显微镜、基态耗尽显微镜、受激发射耗尽显微镜、扫描电子显微镜、透射电子显微镜、宽场荧光显微镜、常规透射光显微镜、解剖显微镜、分光光度法、荧光板检测和荧光芯片检测等。在其它形式中，使取回的存档组织经受化学染色。这些化学染色可包括但必须限于3d尼氏染色、3d淀粉样蛋白染色或morph488染色。在3dnissl染色中，可以将甲酚紫与结合动力学控制器一起应用于组织。在一些形式中，组织可以是福尔马林固定的、石蜡包埋的(ffpe)。在一些形式中，它可能是脱脂的或非脱脂的。通过随后在酸性醇溶液中消退(regression)组织，可以实现高信噪比染色和非特异性染色的减少。在一些形式中，随后可以通过用组织清除组合物进行ri均质化来清除组织，并使用各种成像方法在3d中进行可视化。在一些形式中，该方法与随后的3d免疫组织化学兼容。在3d淀粉样蛋白染色中，淀粉样蛋白染色硫磺素s可以在乙醇溶液中应用于组织，其可以是ffpe取回的、脱脂的或非脱脂的。在一些形式中，随后可以通过用组织清除组合物进行ri均质化来清除组织，并使用各种成像方法在3d中进行可视化。在一些形式中，该方法与随后的3d免疫组织化学兼容。在morph488染色中，通过组合肽和马来酰亚胺-alexafluor488合成的染料可以应用于组织，该组织可以是ffpe回收的、脱脂的或非脱脂的。在一些形式中，随后可以通过用组织清除组合物进行ri均质化来清除组织，并使用各种成像方法在3d中进行可视化。在一些形式中，该方法与随后的3d免疫组织化学相容。在其它形式中，使用任何合适的抗体对取回的存档组织进行免疫染色。在一些形式中，抗体可以以连续方式以高稀释度应用，允许它们进一步渗透到组织中。在其它形式中，除了结合动力学控制器之外，抗体可以在单个步骤中以低稀释度应用，促进其渗透到组织中。在一些形式中，免疫染色技术可以在有或没有信号放大技术的情况下应用。在一些形式中，免疫染色技术可以结合其它制备方法以及随后的方法进行。c.应用在一些形式中，所公开的方法适用于植物。在其它形式中，所公开的方法适用于神经科学和神经病理学领域。优选地，所公开的方法适用于动物例如昆虫、鱼类、两栖动物、鸟类和哺乳动物的组织或器官；更优选地，哺乳动物的组织或器官。哺乳动物可包括但不限于实验动物，如小鼠、大鼠、兔、豚鼠和灵长类动物；宠物，如狗和猫；农场动物，如牛、马、羊；和人类。优选地，组织或器官来源于人类。根据本公开内容的某些实施方案，组织样品是小鼠的脑、心脏、胃、胰腺、肠、肝、肺和耳以及苍蝇的头部或生物工程胶原支架。在一些形式中，所公开的方法适用于临床病理学研究以及常规临床用途的试验，以改善患者疾病(例如癌症和自身免疫疾病)的诊断。实施例实施例1.不透明度的模拟。为了了解清除剂如何工作，重要的是要对不透明度的物理基础有一个新的观点。最简单的模型是一层油在一层水的顶部。两种介质都是透明的，然而，由于它们在ri上的差异，光线在穿过边界时弯曲，导致可感知的边界。因此，假设应该将每种介质的ri调整到定义值，使得它们彼此相等。因此，光路中不应有弯曲，也看不到感知的边界(图1)。在组织中，存在水和油的不均匀混合物，并且如果小瓶被剧烈摇动，这可以被视为油和水，因为人们会看到乳液是不透明的。如果能够选择性地将水性区室和脂质区室调节至彼此相等的某个ri，则乳液将仍然是透明的。也就是说，乳液将是光学上均匀的，尽管它将仍然是物理上不均匀的。通过重复摇动油水实验可以很容易地通过实验证明这一点，但是使用甘油将水的ri(1.33)调整到更高的值以匹配氯仿的ri(1.45)，其中即使在摇动之后，乳液仍然是透明的。因此，使用脂溶性膜ri调节剂加上水性细胞质ri调节剂可导致组织内两个主要物理区室的光学均质化(图2)。在该实验过程中，注意到细胞质ri调节剂可能在物理上不与蛋白质紧密结合，导致物理不均匀性的某个方面阻碍光学均质化。这解释了为什么所有当前现有的组织清除配方使用变性剂以获得更好的清除效果(例如scalea2和scales中的尿素；cleart中的甲酰胺；claritytm中的sds)。然而，有理由认为，如果可以实现足够好地用于光学均质化的物理均匀性，那么“变性”可能不是必需的。这将有助于避免组织和抗原破坏、组织扩张以及通常与变性相关的亲脂性示踪剂的不相容性的副作用(注意，神经元中70％的细胞膜干质量是蛋白质而不是脂质)。使用煮鸡蛋白的温和蛋白质“分离剂”的筛选揭示了几种候选物，其中最安全且毒性最小的是n-甲基葡糖胺。均质剂的概念如图3所示，其中可以(通过卷曲结构)促进ri调节剂与大分子紧密结合，从而实现在分子尺度上的光学均质化。实施例2.组织清除组合物的产生。本文表示为“opticlear”的组织清除组合物由三个核心组分组成：(1)均质剂(如n-甲基葡糖胺(nmg)、尿素或乙二胺)；(2)细胞质、水溶性ri调节剂(如碘海醇、硫代硫酸钠或聚乙二醇)；(3)膜、脂溶性ri调节剂(如2,2'-硫代二乙醇(tde)或丙二醇)。根据以前的观察，这三种组分是达到最佳清除效果所必需的。这三种组分的确切组成和化学物质可以变化，这取决于待清除的组织和组织的状态(体内、新鲜或存档)，以实现期望的组织清除效果。表3中列出了针对人脑组织验证的组织清除组合物。表3验证的opticlear组合物推荐应用10％尿素、25％tde、32％碘海醇长期固定的人体组织20％nmg、25％tde、32％碘海醇最稳健的(robust)一般应用20％nmg、25％tde、32％碘海醇体内清除应用20％nmg、35％丙二醇、32％碘海醇体内清除应用提供最佳结果的组合物(20％nmg；25％ide；32％碘海醇)用于动物和人体组织的中试(pilottesting)，以测试上述组合物的功效。虽然单个化学物质的浓度可以变化，但发现当均质剂的浓度对于n-甲基葡糖胺为至少20％而对于尿素为10％时，实现了最佳清除。然而，应该注意，均质剂倾向于在较高浓度下损害组织完整性或荧光蛋白信号强度。细胞质(水溶性)ri调节剂在脂质缺乏但具有高ri的组织中在较高浓度下更好地起作用；组织诸如是肝、肾或肌肉。相反，富含脂质的组织需要较低的细胞质/膜ri调节剂比率，而在这些组织中选择的均质剂将是尿素或十二烷基硫酸钠。将组织在37℃下在任何一种上述公开的组合物中孵育最长达6小时。在4％sds中在55℃下脱脂3个月并且仍然显示出显著的不透明性的5mm-厚的人体组织在37℃下在6小时内在任何上述公开的组织清除组合物中成功清除。实施例3.用组织清除组合物进行ri均质化。产生化学试剂，其以一定比例含有n-甲基葡糖胺、碘海醇、2,2'-硫代二乙醇、浓盐酸和水。当在不同温度下浸入该配方中至少一小时时，厚组织(例如存档的、ffpe取回的、脱脂的、非脱脂的、化学染色的、非化学染色的、免疫染色的、非免疫染色的组织)的浸入将变得比它们的天然状态明显更透明。实施例4.亲脂性染料示踪染色后的光学清除。将dii和cm-dii直接应用于已经用福尔马林固定≥1年的非sds处理的人脑组织。随后在用组织清除组合物ri均质化后，可以在3d中可视化神经元。纤维的透明度允许多个玫瑰花结和树突棘的可视化。实施例5.化学染色后的光学清除。通过3dnissl染色、3d淀粉样染色和morph488染色，对用福尔马林固定≥1年的人脑组织进行化学标记。在3dnissl染色中，将甲酚紫(在薄组织切片中通常的尼氏染色)与结合动力学控制器一起应用以染色厚的组织片，该厚的组织片可以是存档的、ffpe取回的、脱脂的或未脱脂的。随后在酸性醇溶液中的消退实现了高信噪比染色和减少的非特异性染色。这允许在3d中可视化神经元用于细胞计数研究。该方法还与随后的3d免疫组织化学相容。在3d淀粉样蛋白染色中，通常淀粉样蛋白染色剂硫黄素s在乙醇溶液中施用于厚的组织片，该厚的组织片是存档的、ffpe取回的、脱脂的或未脱脂的。当用组织清除组合物在ri均质化中清除时，该方案可以与随后的3d免疫组织化学和3d可视化组合。在morph488染色中，将通过将肽和马来酰亚胺-alexafluor488组合而合成的染料应用于厚组织，该厚组织是存档的、ffpe取回的、脱脂的或未脱脂的。这允许细胞质的整体染色，并且当用组织清除组合物在ri均质化中清除时，有助于组织的精细结构在3d中的可视化。实施例6.免疫染色后的光学清除。用福尔马林固定≥1年的人脑组织进行免疫染色，包括两种用于抗体深度穿透的供选择的方案，有或没有信号放大技术。在少即是多(less-is-more)方法中，抗体以顺序方式以高稀释度应用，允许它们进一步渗透到组织中。在结合动力学控制方法中，除了结合动力学控制器之外，抗体在单个步骤中以低稀释度应用，这有助于其渗透到组织中。这两种方法都与其它制备过程以及随后的方法一起完成。将已经在福尔马林中存档50年并脱脂4个月的样品组织用组织清除组合物清除。然后用抗胶质原纤维酸性蛋白的抗体标记组织，使用少即是多的方法显示抗体深度渗透至300μm。可以使用上述公开的方法取回和处理ffpe组织。随后使用任何上述公开的验证的组合物清除组织，以允许脑结构的三维可视化，例如使用抗神经丝和核染色dapi的抗体，与对照相比具有最小的形态学干扰。精细组织是存档的、ffpe取回的、脱脂的或非脱脂的。随后在酸性醇溶液中复原实现了高信噪比染色和减少的非特异性染色。这允许在3d中可视化神经元用于细胞计数研究。该方法还与随后的3d免疫组织化学相容。在3d淀粉样蛋白染色中，通常淀粉样蛋白染色剂硫黄素s在乙醇溶液中施用于厚的组织片，该厚的组织片是存档的、ffpe取回的、脱脂的或未脱脂的。当用组织清除组合物在ri均质化中清除时，该方案可以与随后的3d免疫组织化学和3d中的可视化组合。在morph488染色中，将通过将肽和马来酰亚胺-alexafluor488组合而合成的染料应用于厚组织，该厚组织是存档的、ffpe取回的、脱脂的或未脱脂的。这允许细胞质的整体染色，并且当用组织清除组合物在ri均质化中清除时，有助于组织的精细结构在3d中的可视化。实施例6.免疫染色后的光学清除。用福尔马林固定≥1年的人脑组织进行免疫染色，包括两种用于抗体深度穿透的供选择的方案，有或没有信号放大技术。在少即是多(less-is-more)方法中，抗体以顺序方式以高稀释度应用，允许它们进一步渗透到组织中。在结合动力学控制方法中，除了结合动力学控制器之外，抗体在单个步骤中以低稀释度应用，这有助于其渗透到组织中。这两种方法都与其它制备过程以及随后的方法一起完成。将已经在福尔马林中存档50年并脱脂4个月的样品组织用组织清除组合物清除。然后用抗胶质原纤维酸性蛋白的抗体标记组织，使用少即是多的方法显示抗体深度渗透至300μm。可以使用上述公开的方法取回和处理ffpe组织。随后使用任何上述公开的验证的组合物清除组织，以允许脑结构的三维可视化，例如使用抗神经丝和核染色dapi的抗体，与对照相比具有最小的形态学干扰。在更高的放大倍数下也保留了精细的结构细节(图4)。电子显微照片显示，与浸入pbs中的对照组织相比，用所公开的验证的组合物处理的样品保持完整的亚细胞结构。实施例7.丙烯酰胺在三维组织学成像中的作用是不显著的。以下实施例利用组织清除技术，以下称为“claritytm”。claritytm的特征是采用洗涤剂去除固定组织中的脂质，以达到光学透明度。材料和方法化学物质和试剂检查丙烯酰胺(vwrbdhprolabo，electranl40％w/v溶液，目录号443545p)和双丙烯酰胺(国家诊断，2％w/v溶液，蛋白质和测序电泳级别，目录号ec-820)的任何变色以确保纯度，并按原样使用。va-044热引发剂(wakochemicals)按原样使用。抗体本研究中使用的抗体列于表4中。动物本研究中使用的所有动物均按照香港大学实验动物单位教学和研究活体动物使用委员会(culatr)提供的指导方针批准和处理(culatr参考编号：3699-15)。在进行claritytm程序之前，使用腹膜内戊巴比妥钠(150mg/kg)安乐死后立即采集所有小鼠脑组织，用生理盐水冲洗干净，用4％pbs缓冲的pfa灌注固定10分钟，并在4℃下浸入相同的固定溶液中至少2天(最长达9个月，为每个样品单独指定)。人体样本本研究中使用的人脑组织由伦敦帝国理工学院的帕金森氏英国组织库提供，在进行claritytm之前，这些组织都被固定在10％福尔马林缓冲液中至少3周。用于清除程序的模型蛋白质反应将溶菌酶(10mg)溶解于含有甲醛(4％)的1xpbs缓冲液(500μl)中。将混合物在室温下振荡15分钟。将30％的38(μl)丙烯酰胺-双丙烯酰胺(37.5：1)溶液加入上述混合物中至最终丙烯酰胺浓度为4％。对于对照实验，加入38μl1xpbs代替。将反应混合物在4℃孵育1天。通过lc-ms监测反应进程。蛋白质质谱液相色谱-质谱(lc-ms)在使用phenomenexjupiterc4柱(250×4.6mm×5μm)与watersalliance2790hplc偶联的micromasslct(esi-tof-ms)上进行。各自含有0.1％甲酸的水：乙腈，95：5(溶剂a)和乙腈(溶剂b)以1.0mlmin-1的低速率用作流动相。梯度编程如下：15分钟后，95％a(5分钟等度)至100％b，然后等度5分钟。lct的电喷雾源在毛细管电压为3.2kv和锥电压为25v的条件下操作。氮气用作喷雾器和去溶剂化气体，总流量为600lhr-1。使用由马肌红蛋白的多电荷离子系列中的最少17个匹配峰构建的校准曲线校准光谱，其也在25v的锥电压下获得。使用预先安装在masslynx软件上的maxent算法(来自waters的v.4.0)根据制造商的说明从离子系列重建总质谱。被动claritytm遵循可用的方案，除了以下几点：(1)在我们的实验的水凝胶单体溶液中省略丙烯酰胺和双丙烯酰胺，它们用水代替；(2)在上述指定的一些实验中，在1xpbs中使用8％sds代替硼酸钠清除缓冲液(sbc)；(3)对于折射率匹配，histodenz-rims用于小鼠脑，并且在10mm磷酸盐缓冲液中的47％2,2'-硫代乙醇用于人脑组织。电泳组织清除(etc)etc装置是使用午餐盒、铂丝、dc电源、鱼缸水泵和水浴自行构建的。温度、清除缓冲液的ph、运行电压和电流都每小时监控一次，并通过手动调节保持稳定。常规组织学将澄清的组织(丙烯酰胺包埋的或未包埋的)在自动处理器中脱水并包埋在石蜡中，并使用切片机以20-μm厚度切片。根据帕金森氏英国组织库提供的标准操作程序(程序号分别为msp-s-033和msp-s-034)进行苏木精和伊红(hematoxylin&eosin)染色。简而言之，将组织在meyer的苏木精中染色5分钟，在硬自来水中洗涤5分钟，在曙红中染色5分钟，在水中非常短暂地洗涤，并在安装到派拉蒙(paramount)之前通过一系列乙醇和二甲苯脱水。免疫组织化学所有抗体以1：100稀释度在含有0.01％w/vnan3的pbst中使用。将样品在37℃下染色2天。顺序染色用于双重免疫组织化学，当需要时，从dmso中1mg/ml的储备液中加入dapi至终浓度为1ng/ml。共聚焦成像成像是使用leicasp5共聚焦显微镜(使用的物镜：hcxplapocs10.0x(na0.40)dryuv，hcxplapocs20.0x(na0.70)dryuv和hcxplapo40.0x(na0.85))和carlzeisslsm780共聚焦显微镜(使用的物镜：ecplan-neofluar5x(na0.16)ph1m27，plan-apochromat10x(na0.45)ph1m27，plan-apochromat20x(na0.8)ph2m27，plan-apochromat40x(na1.4)oildigm27，plan-apochromat100x(na1.40)oilph3m27)进行的。共聚焦图像分析使用fiji和zenblack软件进行共聚焦图像最大强度投影和z-深度颜色编码，使用imaris7.2.3进行3d渲染。使用adobeatereffectscs6软件对扫描电子显微照片进行裁剪和对比度调整。扫描电子显微镜根据香港大学电子显微镜组提供的标准程序处理样品(http://www.emunit.hku.hk/documents/samplepreparationtechnique.pdf，第27页，从步骤6开始)。简言之，将样品在一系列乙醇浓度下脱水，在bal-teccpd030临界点干燥器中使用液态二氧化碳作为过渡流体干燥，并使用bal-tecscd005溅射涂布机/碳涂布机进行金涂布。使用hitachis-4800peg扫描电子显微镜和leo1530peg扫描电子显微镜获得图像。蛋白质测定和sds-pagebradford测定(thermoscientific#1856209)用于样品等分试样中的快速蛋白质测量，使用uv分光光度计(perkinelmervictor31420multilabelcounter)在96孔板中测量595nm处的吸光度。使用6％堆积凝胶和15％分离凝胶进行sds-page，在120v下运行约2.5小时，并用1％考马斯亮蓝250r在脱色缓冲液中染色过夜。将染色的凝胶在脱色缓冲液(1：4：5乙酸：甲醇：水)中脱色，直至观察不到背景蓝色色调。然后使用数码相机拍摄凝胶。蛋白酶消化将1％丙烯酰胺包埋的、清除的2mm厚的小鼠脑切片分别用pbst中0.1mg/ml的蛋白酶k；或含有0.018mmcacl2的pbs中0.1mg/ml的溶组织梭菌胶原酶(sigmac0130-100mg，批号slbj7761v)，在37℃过夜消化。结果对sds介导的水凝胶包埋和非包埋组织的脱脂的观察表明，可以清除未包埋的组织，而在水凝胶包埋的组织中看不到显著的组织扩张。此外，充分脱脂组织块所花费的时间在很大程度上取决于甲醛固定的条件而不是用于包埋的丙烯酰胺的浓度(数据未显示)，并且etc的使用没有改变组织清除的时间过程。重要的是，在sds介导的脱脂过程中保持组织的结构完整性更多地取决于甲醛固定条件，但很少取决于是否进行了丙烯酰胺包埋。将2mm称重的小鼠脑切片(固定2天)在包埋在各种丙烯酰胺/双丙烯酰胺组合物中后，于37℃下在5ml8％sds的pbs溶液中清除。接下来，系统地改变用于包埋的丙烯酰胺/双丙烯酰胺/甲醛组合，并使用bradford测定和sds-page分析定量组织中蛋白质损失的量。有趣的是，使用的包埋组合物与蛋白质损失的量之间的相关性很差(图5)。在显微镜下评估清除的组织形态，其中所有样品已经固定或在室温下至少2天。在相同条件下，非包埋的、2％和4％丙烯酰胺包埋的组织在sds-脱脂后用苏木精和曙红染色的石蜡包埋切片中的神经组织形态学方面几乎没有差异。神经丝(丝状，不溶性蛋白)、酪氨酸羟化酶、微管相关蛋白2、胆碱乙酰转移酶和βiii-微管蛋白(球状、可溶性蛋白)的免疫染色表明，非包埋的样品在染色强度和质量方面不逊色于包埋的样品。也许是因为非包埋的样品溶胀较少，th阳性纤维更清晰，并且看起来更少碎片化。在所有情况下，由于组织中致密抗原快速消耗抗体，因此抗体渗透受到限制。这在4％丙烯酰胺包埋的样品中变得更糟，因为水凝胶对扩散施加了进一步的限制。使用thyl-gfp系转基因小鼠脑切片的比较还表明丙烯酰胺对于保持内源荧光是不必要的。在超微结构水平上，扫描电子显微照片(sem)显示在相同条件下固定、清除和处理的包埋的和非包埋的样品之间的表面形态没有差异。在所有病例中神经元和神经炎都清晰可见，组织超微结构和细胞形态保持良好。聚丙烯酰胺凝胶本身被视为4％丙烯酰胺包埋样品的表面上的多孔基质。上述比较提供了证据表明丙烯酰胺在claritytm中原位发挥相对不显著的作用。文献综述提供了关于所提出的丙烯酰胺氮是否确实可以起到claritytm(图6a，路径a)中提出的攻击甲醛亚胺的亲核试剂的作用的不确定的论据，这可能是由于所采用的不同反应条件。为了观察丙烯酰胺是否能够在甲醛的存在下和在claritytm中使用的条件下显著改性蛋白质，设计了蛋白质质谱的模型反应(图6b)。甲醛固定的溶菌酶的进一步甲醛改性在一小时内迅速发生；而丙烯酰胺的作用需要24小时。这表现为m/z峰不均匀的总体右移，以及峰值模式中显著噪声的产生，使得难以识别实际发生的精确改性。似乎丙烯酰胺在claritytm条件下确实在改性溶菌酶中起作用，但是这是否以如图6a中的期望的方式发生是未知的(图6c-6e)。讨论结果表明，如果给予足够的固定，则水凝胶将是用以在侵蚀性脱脂期间保护组织非必要的。尽管细胞在其质膜被破坏时破裂，但细胞完整性与组织完整性不同。虽然前者可能主要通过质膜维持，但组织具有机械强度，并且它们的完整性由一系列细胞内细胞骨架、协同跨膜粘连连接和细胞外结缔组分维持。此外，作为具有极高蛋白质密度的凝胶的细胞质的固定过程通过三维交联蛋白质提供了进一步的稳定化，形成了防止蛋白质渗漏以及抗体渗透的天然屏障。为了支持蛋白质而不是脂质是组织完整性的关键这一假设，非特异性蛋白酶蛋白酶k可以在37℃下在3小时内将1％丙烯酰胺-包埋的、sds-脱脂的脑切片完全消化和溶解到均匀的溶液中，而使用更特异性蛋白酶溶组织梭菌胶原酶，即使在过夜消化的情况下，仍能保留具有可辨别解剖结构的易碎脑切片。sds使蛋白质变性并因此使它们的粘附相互作用变性，这可能通过固定或水凝胶包埋来解释组织保护的必要性。尽管蛋白质质谱数据表明丙烯酰胺确实以某种方式与蛋白质相互作用，但确切的反应产物仍然模糊不清，因为非均相峰变化可以反映(1)丙烯酰胺对甲醛亚胺的亲核加成(图6c-6e)，(2)半胱氨酸、赖氨酸或组氨酸对丙烯酰胺的michael-受体双键的亲核加成(这将使其不能与水凝胶网络交联)(图6d)，或(3)形成简单的加合物(图6e)。而且，在组织固定期间严格发生蛋白质交联，以期望的方式消耗丙烯酰胺加成所必需的反应性甲醛亚胺(图6a中的路径b)。这种蛋白质交联在体外模型反应中是不存在的，和/或这种蛋白质交联由于交联蛋白质的大质量，用当前的蛋白质质谱技术是检测不到的。这些“副反应”的相对重要性是不确定的，因此丙烯酰胺是否能与甲醛改性的蛋白质原位反应是不确定的。尽管所公开的水凝胶单体溶液含有4％多聚甲醛(pfa)，多聚甲醛(pfa)可能产生更多的甲醛亚胺用于与丙烯酰胺反应，但claritytm的供选择的方式所建议的4％pfa的省略在组织蛋白质保留和免疫标记质量方面给出了几乎相同的结果。这表明常规固定将消耗和饱和大多数甲醛亚胺和其它对甲醛有反应性的残基，或者所提出的丙烯酰胺交联反应很大程度上不会原位发生。与此相应的是，对清除缓冲液中蛋白质损失的量的研究发现，与包埋在丙烯酰胺中的那些样品相比，非包埋样品中蛋白质损失仅略有增加，这很可能归因于水凝胶对蛋白质渗漏的扩散限制，而不是稳定交联到物理网状结构上的蛋白质。有趣的是，上述sem和推论表明，即使当省略水凝胶时，我们也可以预期免疫标记速度的最小增加，因为这仅仅消除了由多孔水凝胶产生的抗体的流动限制，而不是由组织的固有高密度引起的扩散限制。根据经验，如果甲醛固定剂的扩散不受限制，则在室温下固定组织3天足以使小鼠的整个大脑用于随后在8％sds中清除组织，而在室温下固定3周的整个人死后大脑在55℃下耐受长达约3个月的8％sds处理。此外，由于随后将组织浸没在ri均质溶液中有助于使组织透明，因此通常不需要将侵蚀性脱脂进行至完成。例如，固定3天至1年的2mm-厚的小鼠脑切片可以在37℃下浸入8％sds中3至7天，之后通过将部分脱脂的组织浸入基于碘海醇的ri均质溶液中可以获得良好的透明度。这种部分脱脂方法节省了时间并避免了过度组织损伤的风险，但可渗透性仍然足以使抗体和化学染料渗透。应理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。当前第1页12