免疫抑制性间充质细胞及其形成方法与流程

本申请要求2016年10月27日提交的美国临时申请号62/413,696的权益，并且要求2017年7月10日提交的美国临时申请号62/530,617的权益，两者的全部内容通过引用并入本文。关于联邦政府资助研究的声明本发明借助美国政府支持在国家生物医学成像和生物工程研究所授予的基金号uh3eb17103和eb002520下做出。美国政府享有本发明的一定的权利。序列表本申请包含序列表，其以ascii格式电子提交并且其全部内容通过引用并入本文。将在2017年10月25日创建的所述ascii副本命名为16-50199-wo_sl.txt并且大小为7,568字节。
背景技术：
：由于间充质基质细胞(msc)具有促进免疫抑制和耐受的能力以及同种异体使用的能力，研究其在治疗免疫疾病中的应用。在过去的十年中，许多临床试验已评价msc用于治疗在例如炎症、移植排斥、和自身免疫病等病症中的病理性免疫应答(clinicaltrials.gov)。这些试验由体外和动物模型中的有前景的研究推动，证明msc是免疫原性减退的，可抑制免疫应答的发展并且将免疫细胞群从促炎转向抗炎/调控表型。我们假设在施用前在msc中诱导更强并且更均匀的免疫抑制表型将导致更好的临床结果并且寻求鉴定一种有效的体外激发(priming)方案。虽然临床试验显示出msc为安全的，但他们也揭示出msc在施用几天内死亡但仍引起治疗效果。这导致“击中退出(hit-and-run)”假设，其假定msc在注射后的最初几天中分泌旁分泌因子，其导致的周边组织的免疫调节的改变相对于msc自身为更持久的。即使msc不需要持续植入来产生影响，对于改进细胞疗法而言仍然有很大空间。例如，虽然临床试验仅使用培养扩增的msc，已确定msc在基线时为最低免疫抑制并且仅在暴露于特定环境因素后采用免疫抑制表型。随后，取决于个体病人的内部因素，仅这些天然msc的一部分在注射后变为免疫抑制的。假设仅诱导一部分细胞并且在诱导中有延迟，击中退出模式(paradigm)中的“击中”并不如其在注射时细胞通过均匀免疫抑制开始时那样有效。为此，需要用于在施用前诱导更均匀的免疫抑制性msc表型的体外激发方案。技术实现要素：本公开涉及免疫抑制性间充质基质细胞及其形成方法。在一个实施方案中，提供了用于制备免疫抑制性间充质基质细胞的方法。所述方法包括在体外缺氧培养条件中将促炎细胞因子施加至间充质基质细胞的步骤。在另一个实施方案中，提供了用于制备免疫抑制性间充质基质细胞的方法。所述方法包括获得分离自来源的间充质基质细胞，然后在缺氧培养条件中将促炎细胞因子施加至间充质基质细胞的步骤。在另一个实施方案中，提供了激发的间充质基质细胞(primedmesenchymalstromalcell)。在另一个实施方案中，提供了激发的外来体。在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有选自由细胞因子风暴、败血症、自身免疫病、移植排斥、移植物抗宿主病、和炎性疾病组成的组的病症的受试者的方法。所述方法包括向受试者施用激发的间充质基质细胞的步骤。在另一个实施方案中，提供了用于预防选自由细胞因子风暴、败血症、自身免疫病、移植排斥、移植物抗宿主病、和炎性疾病组成的组的病症的方法。所述方法包括向受试者施用激发的间充质基质细胞的步骤。在另一个实施方案中，提供了用于治疗患有选自由细胞因子风暴、败血症、自身免疫病、移植排斥、移植物抗宿主病、和炎性疾病组成的组的病症的受试者的方法。所述方法包括向受试者施用激发的外来体的步骤。在另一个实施方案中，提供了用于预防患有选自由细胞因子风暴、败血症、自身免疫病、移植排斥、移植物抗宿主病、和炎性疾病组成的组的病症的受试者的方法。所述方法包括向受试者施用激发的外来体的步骤。在另一个实施方案中，提供了用于筛选免疫调节剂的活性的方法。所述方法包括用免疫调节剂处理激发的间充质基质细胞，在所述用免疫调节剂的处理后分离激发的间充质基质细胞；然后对激发的间充质基质细胞进行免疫活性检测来确定免疫调节剂是否改变激发的间充质基质细胞的免疫抑制活性的步骤。在另一个实施方案中，提供了包括在药学上可接受载体中的激发的间充质基质细胞的组合物。在另一个实施方案中，提供了包括在药学上可接受载体中的激发的外来体的组合物。在另一个实施方案中，提供了用于制备免疫抑制性间充质基质细胞的方法。所述方法包括在存在激发的外来体的情况下培养间充质基质细胞，然后分离培养的间充质基质细胞的步骤。在另一个实施方案中，提供了用于制备免疫抑制性间充质基质细胞的试剂盒，所述试剂盒包括第一组分和第二组分。第一组分包括促炎细胞因子和缺氧模拟物。第二组分包括冷冻的间充质基质细胞。在另一个实施方案中，提供了用于制备免疫抑制性间充质基质细胞的试剂盒，所述试剂盒包括第一组分、第二组分和第三组分。第一组分包括促炎细胞因子。第二组分包括缺氧模拟物。第三组分包括冷冻的间充质基质细胞。在另一个实施方案中，提供了用于制备免疫抑制性间充质基质细胞的包括第一组分和第二组分的试剂盒。第一组分包括促炎细胞因子。第二组分包括冷冻的间充质基质细胞。在另一个实施方案中，提供了用于准备施用免疫抑制性间充质基质细胞的试剂盒。试剂盒包括激发的间充质基质细胞。在另一个实施方案中，提供了用于准备施用免疫抑制疗法的试剂盒。试剂盒包括激发的外来体。在上述实施方案的任一项中，将间充质基质细胞暴露于缺氧培养条件1小时至48小时。在上述实施方案的任一项中，将间充质基质细胞暴露于缺氧培养条件24小时。在上述实施方案的任一项中，将间充质基质细胞暴露于缺氧培养条件48小时。在上述实施方案的任一项中，促炎细胞因子选自由il-1α、il-1b、tnf-α、ifn-γ、il-6、il-12、il-17、和il-23组成的组。在上述实施方案的任一项中，促炎细胞因子为ifn-γ。在上述实施方案的任一项中，ifn-γ的浓度为0.1ng/ml至100ng/ml。在上述实施方案的任一项中，ifn-γ的浓度为1ng/ml至10ng/ml。在上述实施方案的任一项中，缺氧培养条件包括将间充质基质细胞暴露于37℃、5％co2、和约1％o2至约5％o2。在上述实施方案的任一项中，缺氧培养条件包括将间充质基质细胞暴露于37℃、5％co2、和1％o2。在上述实施方案的任一项中，缺氧培养条件包括缺氧模拟物。在上述实施方案的任一项中，缺氧模拟物选自由去铁胺、氯化钴、肼屈嗪、氯化镍、二氮嗪、和二甲基草酰甘氨酸组成的组。在上述实施方案的任一项中，缺氧模拟物的浓度为50μμ至200μμ。在上述实施方案的任一项中，其进一步包括在暴露于促炎细胞因子和缺氧培养条件后分离从间充质基质细胞分泌的外来体的步骤。在上述实施方案的任一项中，来源选自由脂肪组织、脐带、骨髓、牙龈、和ipsc组成的组。在上述实施方案的任一项中，其进一步包括向受试者施用免疫抑制剂。在上述实施方案的任一项中，免疫抑制剂与激发的间充质基质细胞同时向受试者施用。在上述实施方案的任一项中，免疫抑制剂在施用激发的msc之前或之后立即向受试者施用。在上述实施方案的任一项中，免疫抑制剂选自由钙调神经磷酸酶抑制剂、类固醇、霉酚酸酯、抗cd3抗体、硫唑嘌呤、环磷酰胺、异环磷酰胺、和用于免疫抑制的其他单克隆抗体组成的组。在上述实施方案的任一项中，其进一步包括对受试者进行免疫疗法。在上述实施方案的任一项中，免疫疗法与激发的间充质基质细胞同时向受试者施用。在上述实施方案的任一项中，免疫疗法在施用激发的间充质基质细胞之前或之后立即向受试者施用。在上述实施方案的任一项中，免疫疗法包括嵌合抗原受体t细胞。在上述实施方案的任一项中，嵌合抗原受体t细胞与激发的间充质基质细胞同时向受试者施用。在上述实施方案的任一项中，嵌合抗原受体t细胞在施用激发的间充质基质细胞之前或之后立即向受试者施用。在上述实施方案的任一项中，免疫抑制剂与激发的外来体同时向受试者施用。在上述实施方案的任一项中，免疫抑制剂在施用激发的外来体之前或之后立即向受试者施用。在上述实施方案的任一项中，嵌合抗原受体t细胞与激发的外来体同时向受试者施用。在上述实施方案的任一项中，嵌合抗原受体t细胞在施用激发的外来体之前或之后立即向受试者施用。附图说明图1a表明了对照脂肪来源的msc的三谱系分化能力。图1b显示了暴露于不同激发条件下的msc表面标志物和hla-dr的表达。图2显示了在抑制mlr(顶部)或由cd2/cd3/cd28珠活化的t细胞(底部)时，不同比率的对照和双重激发的msc的试验。图3显示了在48小时激发后与免疫抑制相关的基因的诱导。图4a显示了将msc暴露于双重ifn-γ/缺氧激发后基因上调的动力学。图4b显示了将来自三个供体的msc暴露于48小时双重ifn-γ/缺氧激发后的基因表达、然后返回至常氧、并在返回至正常条件后量化表达的动力学。图4c显示了将msc暴露于48小时的双重ifn-γ/缺氧激发(第2天)后的基因表达与在正常条件下7天后将msc暴露于第二轮刺激的基因表达相比较的动力学。图5显示了通过双重激发刺激msc2天对4天的mrna转录变化，标准化至在起始时间点对照msc中的表达。图6显示了在激发48小时后msc中的蛋白质表达。图7a显示了与混合淋巴细胞反应(mlr)共培养的不同激发的msc的免疫抑制效果，标准化至阳性对照(mlr无msc)。还显示出在整个cd8+t细胞群中的cd107+细胞的％，标准化至阳性对照。图7b显示了与混合淋巴细胞反应(mlr)共培养的不同激发的msc的免疫抑制效果，对于对照msc共培养物，标准化至％扩增的、cd25+、或cd107+(n＝7-11)。图8显示了与mlr共培养的不同激发的msc的免疫调节效果。图9显示了分泌至培养基中的ifn-γ、tnf-α、和il-1α的量(通过elisa)。图10显示出用于评价激发的msc抑制混合淋巴细胞反应共培养物(msc-mlr)中t细胞的能力的实验设计。图11a显示了msc-mlr共培养实验，其描述了通过对照和激发的msc所引发的可变抑制，其通过cd4和cd8t细胞中的％分裂的、％cd25+、％cd107+(n＝7-11)显示。图11b显示了msc-mlr共培养实验，其描述了msc-mlr共培养物在第1天和第3天时cd4+和cd8+t细胞中的glut1表达。图11c显示了msc-mlr共培养实验，其描述了msc-mlr共培养物在第1天和第3天时测定的促炎细胞因子水平。图12描述了来自msc-mlr共培养实验的cd4+t细胞记忆板表征(t-cellmemorypanelcharacterization)。图13显示了来自48小时激发的msc的条件培养基中的相对可溶性hgf水平。图14显示了在单一或双重激发48小时后的蛋白质的表达。图15a显示了不同mrna对蛋白质水平趋势的证明，其描述了不同激发方案48小时后的msc中的相对ido活性。图15b显示了不同mrna对蛋白质水平趋势的证明，其描述了不同激发方案48小时后的msc溶解产物中的相对hla-g蛋白水平。图16a描述了对在激发条件中培养然后在seahorsetc板(10,000/孔)上培养24小时的msc的seahorse线粒体应激试验数据。图16b显示了在第1天和第3天的msc:mlr共培养物上清液中的葡萄糖水平(显示重复读数的标准平均值)。图17a显示了msc激发对细胞代谢的影响，其中在激发48小时后，将msc以10000细胞每孔再接种至seahorse组织培养板中并且通过seahorse线粒体应激试剂盒来评价。n＝5。图17b显示了msc激发对细胞代谢的影响，其描述了在激发48小时后msc中的glut1表达。图17c显示了msc激发对细胞代谢的影响，其描述了在第1天和第3天的msc-mlr共培养实验中的葡萄糖和乳酸(盐)(lactate)水平。n＝2。图18a显示了如通过增加染料强度和ph降低所揭示的外部l-乳酸对细胞内ph的影响，n＝3。图18b显示了当外部l-乳酸浓度达到30mm时，pbmc散射特性的变化。图18c显示了乳酸浓度对应答伴刀豆球蛋白a的t细胞分裂的影响。图19显示了在对照、ifn-γ、缺氧、和双重刺激的msc中外来体的尺寸分布。图20显示了msc衍生的外来体向激活的pbmc中的剂量依赖性混入。图21表示评价msc单一(ifn-γ或缺氧)和双重(ifn-γ+缺氧)体外激发方案的促进强力且均匀免疫抑制表型的能力的图文摘要。图22显示了ifn-γ滴定，其中将msc暴露于不同浓度的ifn-γ48小时，然后通过流式细胞术分析ido表达。图23显示了初始动力学，其中将msc暴露于10ng/mlifn-γ，然后在不同时间点取样来分析免疫抑制蛋白ido和pd-l1的表达。图24显示了缺氧模拟物滴定实验，其中将msc暴露于不同浓度的氯化钴(cocl2)或甲磺酸去铁胺/去铁胺(dfo)，然后分析作为增强的糖酵解的标志物的glut1。具体实施方式本公开描述了制备免疫抑制性msc表型，其更可成功地用作涉及病理性免疫应答(炎症、自身免疫病、移植排斥)的多种病症的细胞疗法。目前的msc疗法使用未激发的msc，其在基线时不为免疫抑制的，并且该msc还在注射后短期内死亡。我们试图使用受生物学启发的策略、即缺氧和促炎细胞因子以在注射前激发我们的msc来克服这些挑战。我们的数据支持我们关于炎症和缺氧组合的有益效果的假设。已发现ifn-γ和缺氧在mrna中上调不同的免疫抑制蛋白，当组合时在蛋白质水平上协同改善多种免疫抑制蛋白的表达。重要的是，当这两种因素之一单独激发msc时导致比未激发的msc更具免疫抑制性的msc表型，ifn-γ和缺氧的组合导致更加抑制的表型。我们认为这与当这两种因素组合并且由于缺氧影响msc代谢效果时发生的免疫抑制蛋白增强的表达相关。我们已示出缺氧激发导致msc更依赖于糖酵解，极大增加其葡萄糖的消耗和乳酸的产生。由于炎性/激活的t细胞和巨噬细胞同样依赖于葡萄糖和糖酵解，我们的msc可与它们竞争营养，该情况被描述为肿瘤中的免疫逃逸(immuneescape)机制。同样，通过高乳酸水平来抑制炎性细胞是免疫逃逸的另一手段。最后，通过发现缺氧(单独或与ifn-γ组合)的msc从氧化磷酸化转换至糖酵解意味着其为较低氧依赖性的，这与缺血性损伤(其中氧有限)的动物模型中缺氧激发的msc的存活更好的说法相一致。总之，我们使用干扰素/促炎细胞因子(不为tlr3配体)和缺氧来诱导抗炎、促存活(pro-survival)的msc表型，这与本领域中干扰素的形成方式相反并且超出了缺氧仅作为可实现“干细胞性(stemness)”的因素的作用的描述。如上所述，一方面，提供了用于增强间充质干细胞/基质细胞(msc)用作治疗或预防不需要的免疫应答的疾病(例如自身免疫病、炎症、移植排斥)的细胞疗法的潜力。可通过局部或全身施用悬浮在缓冲液、基础培养基、或其他制剂中的msc或外来体来向人类施用激发的msc或激发的外来体。局部施用可包含但不限于，在例如糖尿病性溃疡或烧伤等伤口部位施用、肌内注射、脊髓注射、在心脏上心脏贴片(cardiacpatch)施用、或注射至上腔静脉、肠系膜血管、或冠状动脉。全身施用可包含但不限于iv注射、动脉内注射、或腹腔内注射。msc或外来体的剂量和施用时间将使用常规方法最优化。关于在人类中使用msc作为基于细胞的疗法的一般论述，参见junzhang等人，thechallengesandpromisesofallogeneicmesenchymalstemcellsforuseasacell-basedtherapy，stemcellresearch&therapy，2015年12月1日，其全部内容通过引用并入本文。可在试剂盒中为临床医生准备msc。试剂盒可潜在包含预先激发的msc或外来体。可选地，试剂盒可包含冷冻msc和医师/医院可用于激发msc其自身的材料。材料可包含促炎细胞因子和/或缺氧模拟剂的组合或混合物。本公开的msc可来源于脂肪组织、脐带、骨髓、牙龈、ipsc、或用于衍生msc的本领域公知的任何其他msc来源。也可根据本公开激发例如多能成体祖细胞等类似于msc的细胞。应理解的是，可通过各种方式创造缺氧培养条件。可通过降低培养环境中的氧来创造缺氧培养条件(例如在1％至5％o2中培养)。另一种创造缺氧培养的方法为向培养环境添加缺氧模拟剂，例如去铁胺/甲磺酸去铁胺、氯化钴、肼屈嗪、氯化镍、二氮嗪、或二甲基草酰甘氨酸。还可通过将例如缺氧诱导因子(hif)等因子施加至培养基以引发类似于环境缺氧的细胞反应来创造缺氧培养条件。本文使用的术语“激发的间充质基质细胞”定义为在体外暴露于促炎细胞因子和缺氧培养条件的间充质基质细胞。本文使用的术语“激发的外来体”为来自激发的间充质基质细胞的外来体。本文使用的术语“缺氧模拟物”为稳定缺氧诱导因子或诱导相关缺氧响应(hypoxicresponse)的任何制剂。实施例在以下实施例中说明本发明，应理解的是，这些实施例仅是为了说明目的，并不旨在限制本发明。材料和方法对于本文使用的全部实施例，使用以下材料和方法：msc培养和激发。jeffreygimble博士(tulaneuniversity)友情提供了来自完全去识别的人类脂肪抽吸物的msc的冷冻小瓶，并且成功试验了三谱系分化以及体外msc标志物的阳性表面表达和抗原呈递细胞的阴性表达(图1a&1b)。在实验中使用来自3个不同供体的msc来表明细胞对激发方案应答的普遍性。细胞在msc培养基(具有10％fbs和1％青霉素/链霉素(pen/strep)的dmem11965)中培养，并且接种至6孔板中以在第5代次进行激发实验。图1a描述了通过对软骨细胞(阿尔新蓝)、成骨细胞(碱性磷酸酶)、和脂肪细胞(油红)的组织学染色来表明对照脂肪来源的msc的三谱系分化能力。图1b显示出在激发48小时后，msc标志物：cd29、cd73、cd90、和cd105和抗原呈递细胞标志物：hla-dr和cd40的相对表面蛋白表达。唯一存在的抗原呈递细胞标志物为hla-dr，其在经受激发方案中的ifn-γ的msc中可见(39.2％+来自ifn-γ激发；30.2％+来自双重激发)。msc在6孔板中培养汇合(confluence)，并且随后暴露于：对照条件(常氧、常规msc培养基)、单独ifn-γ或缺氧激发、或双重ifn-γ/缺氧激发(4种不同条件)。使用的ifn-γ(peprotech)的浓度为100ng/ml。使用在37℃、5％co2、和1％o2下的newbrunswickgalaxy145培养箱实现缺氧培养环境。除非另外指出，施加激发48小时，然后分析msc的基因和蛋白质表达或在功能研究中进行评价。收集的msc总是具有>95％的生存力，并且生存力在激发组之间没有差异。qrt-pcr。基于已公开的研究建立涉及基于msc的免疫抑制/保护的15个基因的综合列表。msc激发实验使用来自3个不同供体的msc重复4次。使用rnaqueousmicro试剂盒(lifetechnologies)来分离rna并且使用nanodropd1000来量化。使用dnasei、扩增级试剂盒(invitrogen)处理rna并且按照制造商的说明书使用高容量cdna反转录试剂盒(appliedbiosystems)将rna转换为cdna。使用每反应20ngcdna、和sybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems)来进行定量rt-pcr(qrt-pcr)分析。将各个时间点的靶基因的表达标准化至gapdh，随后在其基线时间点(2-δδct)标准化至未激发的表型。使用ncbiprimer-blast检查所有引物(表1)的理论靶基因特异性。表1.用于免疫调节基因的正向和反向引物。对于动力学研究，评价基因亚组(hla-g、ido、pd-ll、和cox-2)。为了研究基因上调的起始动力学，通过双重激发(或保持在对照条件下)刺激msc48小时，并且在第0、4、12、24和48小时收集rna样品。对于偏移动力学(offsetkinetics)研究，进行相同的48小时方案，但细胞随后返回至新鲜msc培养基的常氧中。在返回至对照条件后的第4天和第7天取样，同时在研究中途更换标准培养基。在第二次48小时刺激后重复实验来评价基因表达变化是否可被再诱导。msc蛋白表达研究。在激发后立即使用bdfacscantoii流式细胞分析仪(总是>20,000事件计数)分析msc细胞内和表面标志物。对于细胞内蛋白，使用bdcytofix/cytoperm试剂盒固定并且透化细胞。在4℃下在bdbsa染色缓冲液中染色细胞20分钟，然后使用染色缓冲液清洗两次。在表2和表3中可发现抗体克隆和稀释的完整列表。表2.对于msc和pbmc二者染色的流式细胞术抗体详情。cf/cp表示用bdcytofix/cytoperm的初始处理。染色体积始终＝100kl。表3.对msc和pbmc染色的流式细胞术抗体详情。混合淋巴细胞反应(mlr)。对于mlr，使用来自10个不同供体的完全去识别的样品来制备冷冻保存细胞的外周血单核细胞(pbmc)库，来产生一组刺激物-应答物对。使用基于histopaque-1077(sigma)的密度梯度离心从新鲜leukopaks(newyorkbloodcenter)中分离pbmc，使用骨髓培养基(bmm；具有1％hepes、1％pen/strep、和20kudnasei的培养基199)清洗两次，使用红细胞裂解用ack裂解缓冲液(thermofisher)处理，并冷冻保存。在48小时激发后，使用0.25％胰蛋白酶-edta收集msc，并且以40μl中1x106/ml或2x106/ml(即总计40,000或80,000细胞)接种在96孔u形底板中的补充有5％的热灭活人类ab血清、1％pen/strep、1％hepes、和50μμ2-巯基乙醇的完全aim-v(caim-v)中。两批次的同种异体pbmc在1:1bmm:caim-v中解冻并且清洗两次。按照制造商的说明书使用bd紫色增殖染料(violetproliferationdye)染色应答物pbmc(最终浓度：1μμ)。使用30gyx-射线照射(x-rad320)或10mg/ml丝裂霉素c来灭活刺激物pbmc(在比较研究中总是提供类似结果)。调节刺激物和应答物pbmc细胞浓度至2.5x106/ml，并且将各个细胞悬浮液(即200,000细胞)的80kil层叠在先前铺板的msc的顶部。因此，刺激物对应答物的比为1:1，并且msc对应答物pbmc的比为1:2.5或1:5，其为初步研究中确定的作为最佳比较的比率(图2)。进行mlr实验5天，在中途添加50μlcaim-v。对于终点分析，使用了两个抗体组：cd3/4/8/25/107a(激活/细胞毒性)和cd3/4/8/45ra/197(天然对记忆)。除cd4和cd8外，以推荐的试验尺寸使用第一缀合抗体(bdpharmingen)，cd4和cd8分别以1:80和1:40稀释使用(再次，对于克隆参见表2和表3)。在不用bdbsa染色缓冲液固定的情况下完成全部表面染色。在染色30分钟内完成流式细胞术分析。当分析cd4+和cd8+亚群时，通过将各个试验的％分裂的(紫色阴性)、％cd25+、或％cd107+除以对于仅mlr条件的情况的相应值，将各组标准化至无msc的mlr(阳性对照设定至100％)。然后将这些组数据取7-11次实验的平均值。对于一些实验，对不同的第1天和第3天分析设定额外的mlr-msc反应。使用人类细胞因子16-plexelisa试剂盒(pblassayscience，piscataway，nj)检测促炎细胞因子水平。通过在哥伦比亚大学医疗中心的激素和代谢物核心实验室确定上清液葡萄糖水平。在初始脱蛋白步骤(如指示)和1:3稀释至试剂盒范围内后，通过比色l-乳酸检测试剂盒(abeam，cambridge，ma)确定上清液乳酸水平。还收集来自第1天和第3天msc-mlr实验的细胞，固定，透化，并且对glut1转运蛋白染色。代谢检测(seahorse)。在激发后，将来自不同激发方法的msc接种在seahorse组织培养板上(100μl中10,000细胞)并且在37℃下在标准5％co2培养箱中过夜培养。第二天，使用包含(1ml200mml-谷氨酰胺、1ml100mm丙酮酸钠、和400μl45％d-葡萄糖；ph7.4)的seahorse检测培养基(100ml)清洗孔两次，并且在进行线粒体应激检测(mitostressassay)(1μμ寡霉素、1μμfccp、1μμ鱼藤酮/抗霉素)前在无co2培养箱中保持板2小时。使用wave软件分析数据。对msc蛋白的流式细胞术。最初针对标准msc标志物(cd29、cd73、cd90、cd105)和可以表明激发之前和之后的抗原呈递能力的那些(cd40、hla-dr)染色msc。激发msc24至48小时。然后针对在qrt-pcr的mrna水平中显示出上调的免疫调节蛋白(hla-g、cox-2、ido、pd-l1、hla-e；以及针对代谢研究的glut1)染色这些细胞。对于细胞内蛋白，固定、透化并且使用bdcytofix/cytoperm试剂盒中的试剂染色细胞。对于表面染色，在4℃下在bdbsa染色缓冲液中染色细胞20分钟，然后使用染色缓冲液清洗两次。在bdfacscantoii流式细胞仪上进行全部数据的收集，接着在flowjo(ashland，or)中分析。表3中可发现抗体克隆和稀释的完整列表。ido活性测定。将刚刚激发48小时的msc以10000细胞每孔再接种在96孔板中的新鲜对照asc培养基中并且放置过夜来使其粘附。按照制造商的方案通过试剂盒(bpsbioscience，sandiego，ca)实现ido活性的测定，其中修改为不进行ido的转染，并且在不同激发条件的msc中简单测定。样品以6次的重复进行。hla-g蛋白质印迹。在使用pbs清洗两次后，使用含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的np-40裂解缓冲液(thermofisher)，各自以1:50的比将激发的msc在冰上裂解30分钟。在4℃下以13,600xg离心裂解物15分钟。通过bca蛋白质检测(thermofisher)确定蛋白质浓度。在标准化来自不同msc激发组的蛋白质浓度后，将上清液与2xlaemmli上样缓冲液(bio-rad，hercules，ca)以1:1稀释，并且在95℃煮沸5分钟。通过sds-page在4-20％预制的聚丙烯酰胺凝胶(bio-red)中分离蛋白质样品，并且电转移至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。在转移后，用5％牛血清血蛋白(bsa)tbst封闭膜1小时，然后使用抗hla-g一抗(1:500，origenetechnologies)在4℃过夜探测。然后使用tbst清洗膜3次，并且将其暴露于山羊抗兔iggalexafluor680二抗(1:10000，thermofisher)1小时。在3次最终清洗后，将膜在licorodyssey扫描仪上成像(lincoln,ne)。hgfelisa。收集在48小时激发结束时收集的msc的上清液，离心沉降细胞碎片，然后转移至新试管中以在-80℃下储存。根据制造商的说明书，将elisa样品置于室温下并且以invitrogen人hgfelisa试剂盒(carlsbad，ca)未稀释地使用。乳酸滴定。如上所述解冻pbmc，并且根据制造商的说明书(染料稀释1000x)，在37℃下在hepes缓冲盐水中用redam(thermofisher)染色30分钟。在用hepes缓冲液单次清洗后，将样品分入5个离心管中，离心并且在添加有l-乳酸的caim-v(sigma)中重悬，使得浓度为：0mm、5mm、10mm、20mm、和30mm。在这些新培养基中重悬细胞并且在37℃下培养30分钟。在各个流式细胞仪读数之前即刻，将各个样品用bd染色缓冲液以1:9稀释并且充分混合。这中和了外部的ph和稀释的培养基组分，且并不允许输出细胞内乳酸的时间。对于淋巴细胞增殖实验，如上所述将pbmc解冻并用bd紫色增殖染料染色，在添加有l-乳酸以达到上述浓度的caim-v中重悬。细胞以200000细胞每孔接种在96孔u形底板中。添加cona为5μg/ml，并且在第3天通过流式细胞术分析pbmc。质谱法。用冰冷的pbs清洗msc板3次来去除残留的fbs并且添加细胞因子。将由含有3％sds和50μl蛋白酶抑制剂(sigma)的tbs组成的裂解缓冲液添加至各个msc板。收集裂解物并且在氯仿/甲醇中沉淀蛋白质。使用偶联至qexactivehf(orbitrap)质谱仪的ultimate3000rslcnano超压液相色谱仪(thermofisher，bremen，germany)在哥伦比亚大学的定量蛋白质组学和代谢组学中心进行质谱法。统计学分析。使用与tukey事后检验结合的单向anova分析并且使用graphpadprism6软件来比较来自不同激发组的pcr、mlr、流式细胞术、elisa、乳酸和葡萄糖结果。数据以平均值±标准差示出；p<0.05视为统计学上显著的。实施例1在此我们提出msc的可增强其免疫抑制性质的特异性体外激发方案。我们首先比较了3种不同刺激的组合：缺氧(1％o2)、ifn-γ(100ng/ml)、和il-10(10ng/ml)。基于对>12种免疫抑制/保护因子的基因表达研究，两天的ifn-γ和缺氧组合的预调节方案导致已知诱导免疫抑制的基因的靶表达。刺激后最大增加倍数的那些包括pdl1、ido、hla-g、和cox2，前两者应答ifn-γ组分，而后两者主要通过缺氧上调。重要的是，这些基因的表达在刺激后一周后仍保持超过基线的增加，该现象可以在再刺激时再现。在此，我们研究了人类msc的ifn-γ和缺氧组合激发。在48小时的刺激后，几种免疫抑制因子上调，最显著的是ido和pdl1(通过ifn-γ)、和cox2和hla-g(通过缺氧)。基因表达在刺激去除后一周持续变化。当ifn-γ刺激上调典型mhc蛋白的表达时，未观察到人类pbmc的同种异体反应。实际上，用ifn-γ/缺氧预调节的msc抑制cd4+和cd8+t细胞群应答cd2/cd3/cd28珠刺激的扩增，比未调节的msc的程度更大。这些体外数据表明在细胞治疗中使用均匀免疫抑制的msc群。为了研究组合刺激后的细胞归巢是否也具有更大潜力，我们研究了趋化因子受体表达中的变化，并且观察到ccr1和ccr7相对于其他趋化因子受体持续更高的表达。在ifn-γ和缺氧的不同程度的贡献下双重激发导致多重免疫调节因子的上调。如qrt-pcr所证明的，通过两天的ifn-γ或缺氧激发导致不同免疫调节基因的上调(图3)。图3表示在代表性实验中，通过ifn-γ、缺氧、或双重ifn-γ/缺氧激发48小时后，通过qrt-pcr获得的mrna数据。图3中的数据标准化至对照msc(常氧并且常规msc培养基，n＝4-6)中的表达。柱形图将倍率差从0.01缩放至100(并且在两端饱和)。通过anova和tukey事后检验(p<0.05)确定的组之间的显著差异在各个基因的右侧显示如下：a，ifn-γ对缺氧刺激；b，ifn-γ对双重刺激；和c，缺氧对双重刺激。通过ifn-γ诱导的基因包含：hgf、inos、hla-e和最显著的pd-l1和ido，当与对照条件下的msc比较时，其表达各自增加102倍和104倍。ifn-γ激发导致>5倍的hla-g、hla-e、hgf、inos的诱导，最显著的各自以730倍和31,000倍诱导的pd-l1和ido。相反，缺氧激发导致hla-g的诱导比ifn-γ激发的诱导(100倍对5倍)和cox-2的诱导更大。虽然通过ifn-γ对cox-2和hla-g有一些轻微的诱导，这些基因通过缺氧被更加强力的诱导。当这两种激发刺激组合时，诱导通过ifn-γ和缺氧单独上调的全部因子，使得7/15因子显著上调。虽然ido和pd-l1的表达的双重激发不如单独激发高，但诱导的水平仍为相同的数量级。相比之下，通过双重激发诱导hla-g比通过单独用两者任一刺激单一激发地更多。总之，这两种激发条件的组合导致通过ifn-γ和缺氧单独获得的两种转录上调模式的增加(图3)。该效果不完全是累加的，由于通过ifn-γ诱导的一些基因(例如ido、hla-e、pd-l1)的表达被双重激发部分地抑制，而其他(例如，hla-g)的诱导反而增强。大多数高度诱导的基因在48小时处于峰值表达。为了确定基因诱导的动力学，对对照msc和双重激发的msc，在48小时内跟踪基因亚组：通过ifn-γ高度诱导的两个基因(ido、pd-l1)和通过缺氧诱导的两个基因(hla-g、cox-2)。对在激发最初48小时内多个时间点采集的样品进行qrt-pcr。基因表达的诱导在第4小时已经是明显的，尽管其通常需要8-12小时来到达mrna峰值水平(图4a)。hla-g和pd-l1在48小时时期内保持峰值表达，然而ido继续上升趋势，并且cox-2经历瞬时表达。出人意料的是，当在8小时采样时，cox-2的mrna表达比48小时时高超过10倍，显示出比最初从48小时激发实验推断的更多的诱导。然而，由于其他跟踪的基因在48小时达到其峰值，并且蛋白质翻译相比于mrna转录有延迟，对于所有msc激发实验保持48小时持续时间。长于48小时的激发未显示出有益效果(图5)。实施例2通过双重激发诱导的基因保持上调长达一周并且可被再诱导。为了更好地理解基因表达改变如何在治疗应用的背景下保持，将双重激发的msc返回至对照条件，并且在4天和7天后对hla-g、ido、pd-l1和cox-2进行qrt-pcr。显著并且出乎意料的是，对于全部三种msc供体hla-g、ido和pd-l1在返回至对照条件7天后保持显著的上调，尽管在第4天可看到从其峰值表达显著的下降(图4b)。与动力学研究相一致，其显示出到48小时cox-2表达的下降，对于预先已在对照或激发条件中保持的msc，cox-2表达持续略微下降。由于在患者中激发的msc可再暴露于炎症和缺氧诱因，在返回至对照条件7天后可重复激发方法，比较在第一轮(第2天)和第二轮(第11天)的48小时激发后的诱导。可再诱导全部四种基因，并且ido和pd-l1的mrna水平在再暴露于相同激发诱因时为显著更高(图4c)。实施例3双重激发在蛋白质水平诱导免疫调节因子。在图6中，数据显示出多种48小时激发方案。直方图来自代表性实验。为了清楚起见，在左侧仅显示对照msc对双重激发的msc，而右侧显示全部条件。图6底部的表显示对于n＝3次实验，标准化至对照msc的mfi的激发的msc的平均荧光强度(mfi)。显著性对于ifn-γ对缺氧刺激显示为(*)并且对于ifn-γ对双重刺激为(t)。对hla-g、ido、pd-ll、和cox-2的流式细胞术证明其在双重激发48小时后在蛋白质水平的上调(图6，顶部)。考虑到单一因素和双重因素激发方案，与初始pcr发现相比较，其在蛋白质水平存在一些不同模式(图6，底部)。在蛋白质水平，ido通过双重激发的诱导(尽管不显著)比通过单独的ifn-γ的诱导略多，其与显示出在双重激发背景下mrna表达降低的pcr发现不同。通过缺氧在mrna水平上更大程度诱导的hla-g，在蛋白质水平上通过ifn-γ比通过缺氧的诱导缺氧更强。与pcr发现相一致，pd-l1通过ifn-γ和双重激发更强力地上调，同时cox-2通过缺氧更强力地诱导。值得注意的是，缺氧/双重激发的msc和ifn-γ激发的msc之间的cox-2在蛋白质水平上的差异为适度的但是统计学上显著的。对于ifn-γ激发的msc和双重激发的msc，四种基因的蛋白质表达为相似的。实施例4双重激发的msc在抑制t细胞的激活和扩增方面优于单一激发的msc。图7a和7b表明不同激发方案如何影响cd4和cd8阳性的t细胞的百分比，显示出第5天的msc和pbmc之间的指定比率。当mlr与msc共培养时，预先保存在对照条件下的msc仍可抑制t细胞激活(cd25+表达)和扩增(％紫色阴性)，但当它们用ifn-γ或缺氧预先激发时，该效果更强，并且在将细胞暴露于双重激发后最强(图7a)。抑制作用为剂量依赖性的，当以1:2.5msc:pbmc比使用时，全部msc提供最强的抑制。对于cd4+和cd8+t细胞都已发现组差异，尽管其对于cd4+t细胞更明显。激发的msc以1:5的比同样更好地抑制cd8+t细胞cd107+表面表达(细胞毒性的测定)，尽管在1:2.5之比下不再存在组差异。由于对照msc的基线抑制能力在某种程度上取决于使用的刺激物-应答物pbmc对，对于实验中所有激发组的分裂细胞(当标准化至mlr)的分数(fraction)存在略微改变。这些改变导致对全部组的更大标准偏差并且人为掩饰组差异。为了消除这些改变在基线msc抑制中的作用，将数据进一步标准化至各个实验的对照msc的％分裂(division)然后取平均值(图7b)。该标准化带来组差异并且清楚地表明，为了产生最具免疫抑制性的msc，双重激发优于单一激发，并且通过缺氧或ifn-γ的单一激发仍优于无激发。仅比较单一激发方案，通过缺氧或ifn-γ的msc预调节未显示出产生显著差异效果，尽管个体实验表明缺氧的略微优势。实施例5双重激发将t细胞转为更加天然的表型。为了进一步分析不同激发的msc对t细胞群的作用，进一步评价具有对照msc或双重激发的msc的mlr的ccr7和cd45ra的表达，来区别天然、记忆、和效应t细胞群(图8)。图8显示出通过记忆面板标记物评价的第5天的1:5的msc:pbmc比。从右上角开始以逆时针方向在象限中显示出天然、中枢记忆、效应记忆、和效应t细胞的各种比率。这些数据进一步地在底部的堆叠柱形图中概述。正如预期的，mlr(无msc)的天然t细胞比由单独应答物pbmc组成的阴性对照(无同种异体刺激)更少。这种天然部分的缺失对应于中枢记忆(cm)、效应记忆(em)、和效应t细胞(et)群的增加。mlr与对照msc的共培养将平衡再移动至主要为天然细胞。应注意的是，与双重激发的msc共培养导致甚至更大的天然t细胞部分以及从效应物向中枢记忆细胞的转变。由于随着t细胞从天然表型→cm→em→et的发展使t细胞变得更加活化，双重激发的msc将该平衡向最低活化状态移动。实施例6双重激发的msc抑制混合淋巴细胞反应中的促炎细胞因子的分泌。多重elisa分析表明对于与对照、单一、或双重激发的msc共培养的mlr而言促炎细胞因子上清液水平中的组差异(图9)。在图9中，显示出经历各种激发方案并且与mlr共培养的msc的数据。显示出在mlr实验的第1或第3天收集的细胞上清液的定量elisa结果(n＝4)。虽然第1天的组差异小或不显著，这些差异在第3天更明显，其反映出在mlr实验中几种促炎细胞因子的峰值细胞因子分泌期。具有对照msc的mlr显示出促炎细胞因子(ifn-γ、tnf-α、和il-1α)的最高水平，有时甚至大于在单独mlr中测定的那些。通过msc激发极大地抑制了该分泌，到第3天，双重激发导致全部四种细胞因子的最低水平。实施例7用ifn-γ或缺氧单一激发msc导致t细胞抑制中的改善，同时双重激发导致增强的免疫抑制效果。图10中显示了实验方法的概述。在初步研究(pilotstudy)中确定激发方案的最佳持续时间(48小时)后，我们使用免疫抑制功能性试验来试验msc的单一激发和双重激发的效力。对照msc(在常氧下在基础培养基中培养的)向混合淋巴细胞反应(mlr)的添加导致在msc-mlr共培养的第6天cd4+和cd8+t细胞增殖(图11a直方图，紫色的-)和激活(cd25+；未显示)的低至中度的抑制。该基线与mlr中使用的供体pbmc对略有不同，与公知的生物学变体一致。因此，在与对照msc共培养后的增殖程度用作试验间的比较基线。具有用ifn-γ或缺氧激发的msc的mlc显示出类似的抑制水平并且一致地比具有对照msc的mlr—在cd4+t细胞的抑制增殖(紫色-)和激活(cd25+)方面更有效25-30％，—在抑制cd8+t细胞方面更有效20％(图11a)。在图11a中，通过对照和激发的msc的可变抑制通过在第5天将其％分裂的群体与单独mlr条件的(设定为100％分裂)相比较是明显的。在第5天类似地确定t细胞激活状态(％cd25+)和细胞毒性能力(％cd107+)。“仅应答物”组为阴性对照，其缺乏同种异体刺激物pbmc。对于具有双重激发的msc的mlr，该抑制优势大约翻了一番。无论预调节方案如何，通过使用1:2.5的msc/pbmc比使msc的剂量加倍导致更大的t细胞抑制，然而在激发组之间保持相对的抑制能力(图11a)。在msc的存在下，cd8+t细胞的细胞毒性(cd107+)的抑制具有增加的趋势，尽管激发组之间的差异并不显著(图11a)。在图11c中，除非另外说明，所有成对比较都为显著的。对于仅应答物组的细胞因子浓度低于检测限，n＝4p<0.05*，<0.01**，<0.001***，<0.0001****。通过分析ccr7和cd45ra的表达来研究共培养对mlr中应答t细胞的影响。在图12中，来自代表性实验的数据显示了第5天的1:5的msc:pbmc比。从右上角开始以逆时针方向在象限中显示出天然(n)、中枢记忆(cm)、效应记忆(em)、和末端效应(temra)t细胞的不同比例。到第6天，仅应答物组(无同种异体pbmc与msc共培养的阴性对照)在天然亚组(ccr7+cd45ra+)中具有48％的cd4+t细胞，而mlr(阳性对照)仅具有该亚组中15.7％的细胞。与msc共培养抑制天然表型的损失(图12)，在分别与对照msc、ifn-γ-激发的msc、缺氧-激发的msc、和双重-激发的msc培养后，24.7％、31％、33.5％、和39.3％的应答cd4+t细胞保留在天然亚组中。msc-mlr共培养物中天然部分的这些差异反映了从中枢记忆t细胞区室的转变，这是因为该部分随着天然部分的增加而减少。为了研究在msc-mlr实验早期t细胞如何表现出不同的激活模式，我们研究了第6天终点分析之前的两个t细胞激活指标(即％分裂)：上清液中的glut1表达和促炎细胞因子水平。葡萄糖转运蛋白glut1在激活的t细胞中上调以为糖酵解供能。正如预期的，mlr(无msc)条件下的t细胞直至第3天才在仅应答物组中上调glut1，反映出缓慢激活。当mlr反而与msc共培养时，即使在第1天，t细胞glut1表达迅速增加。然而，在第1天和第3天，存在取决于msc激发的差异，同时双重-激发的msc导致最低的t细胞glut1表达(与仅应答物t细胞水平相似)，尽管单一激发的msc仍导致相对于对照msc为较低的t细胞glut1表达(图11b)。促炎细胞因子水平中的差异仅在第3天可见，并且具有双重激发的msc的msc-mlr的水平比单一激发的msc的水平低(图11c)。令人感兴趣地，对照msc导致促炎细胞因子的上清液浓度高于甚至mlr(无msc)条件，表明初始同种异体性(allogeneicity)。然而，对照msc在mlr中仍为抑制性的，可能是由于对局部促炎细胞因子的免疫抑制反应性。实施例8通过双重激发在mrna水平上调的基因显示出蛋白质水平上强力的诱导。我们接着研究了蛋白质水平上的msc激发的mrna趋势。已确证一些趋势。例如，hgf蛋白仅可在ifn-γ-激发的细胞的上清液中检测到(图13)。值得注意的是，pd-l1、ido和hla-e，具有来自双重激发的mrna诱导小于来自ifn-激发的，显示出通过双重激发的相似或更大的诱导(图16和表3)。在图14中，来自代表性实验的直方图显示20000事件(进行相同实验n＝3次)。除对照对缺氧外，对于ido、hla---g、和pd---l1的全部成对比较为显著的(p<0.0001)。相比之下，对于cox---2，仅对照对缺氧为显著的(p<0.01)。实际上，ido蛋白表达在双重激发后比暴露于单独ifn-γ为更显著的。该意料之外的结果已通过ido活性测定证明(图15a)，其中双重激发的msc显示出的ido活性相对于ifn-γ-激发的msc为显著增强的，这与流式细胞术数据一致。在图15a中，将激发的细胞以10000细胞每孔再接种至96孔板中来评价过夜ido活性，其对应于通过480nm处的吸光度检测色氨酸副产物犬尿氨酸。每种条件下平均6个孔。还通过流式细胞术证明了在mrna水平通过缺氧更高诱导的两个基因的增强(cox-2和hla-g)。然而，通过全部激发方案的cox-2蛋白质表达同等的增强，并且蛋白质水平仅略高于对照msc的那些。虽然在双重激发后mschla-g蛋白质水平最大，与pcr数据相一致，通过ifn-γ激发的蛋白质水平高于通过缺氧的，与pcr结果相反。该结果通过蛋白质印迹分析证实，其显示出hla-g实质上是在蛋白质水平上通过ifn-γ和双重激发诱导的(图15b)。图15b显示了蛋白质印迹，其中各泳道初始加载有相同量的蛋白质(bca检测)。p<0.0001****。总之，缺氧不会比ifn-γ更大程度地上调任何所研究的蛋白质。实施例9缺氧激发和双重ifn-γ/缺氧激发将代谢从氧化磷酸化向糖酵解转变。由于从蛋白质水平研究中不清楚为何msc的缺氧激发导致与ifn-γ激发类似水平的mlr抑制，进行了代谢研究。seahorse检测结果显示出msc的缺氧激发使它们远离氧化代谢(较低耗氧率)并向糖酵解(较高细胞外酸化率，ecar)转变(图16a)。第1天和第3天mlr-msc共培养物上清液的葡萄糖水平的分析支持该发现，其显示了用缺氧和双重激发的msc的mlr的最低的葡萄糖水平(图16b；表4)。表4.msc-mlr实验中每日葡萄糖消耗和乳酸产生。我们研究了是否可使用两种微环境因素通过细胞激发来促进msc的免疫抑制表型：ifn-γ和缺氧，其存在于许多与免疫耐受相关的病症中。我们的目标为三个：(i)在其他类似条件下比较ifn-γ和缺氧对msc的影响，(ii)确定同时应用两种激发因素是否可促进msc中免疫抑制表型，超过两种因子任一单独可实现的水平，并且(iii)识别通过msc激发促进的免疫抑制机制。基于pcr数据，选择48小时激发方案，并且进一步研究通过ifn-γ(ido和pd-l1)和缺氧(hla-g和cox-2)最高上调的两个基因。转录动力学分析表明，除cox-2外，这些基因在从激发条件中移除后保持上调一周，并且一旦再暴露于相同激发方案可被“加强”。该发现很重要，因为其表明即使将msc从激发条件中取出施用至患者，也不会失去表达中的改变，并且细胞保持其应答体内炎症和缺氧诱因的能力。为了证明表达中这些改变的功能意义，将细胞从其激发条件中移除并且与同种异体pbmc共培养后，我们评价了mlr共培养实验中的对照(未激发的)、单一激发的、和双重激发的msc。在对照条件下培养的msc可减弱mlr响应并不意外，这是由于t细胞的激活最终导致促炎细胞因子的释放，这在“对照msc”中可诱导免疫抑制行为。单一和双重激发方案明显增强了mlr共培养实验中msc的免疫抑制能力，并且使用一系列淋巴细胞供体来显示这些效果。在通过ifn-γ和缺氧单一激发的基于msc的t细胞抑制中无显著差异。然而，这两种激发方案对于临床应用具有不同实践价值。由于细胞疗法使用亿万个细胞，基于ifn-γ的方案的成本与细胞数量成比例增加，然而基于缺氧的策略仅需要使用缺氧培养箱。两种刺激的组合明显导致比单独使用两种刺激任一更强的免疫抑制效果。我们使用包括t细胞增殖、t细胞激活、cd8+t细胞细胞毒性、和促炎细胞因子分泌的抑制的多重检验来记录该发现。双重激发的msc进一步将t细胞群向更天然和休眠细胞类型转变。从pcr数据来看，可以解释观察到的基于ifn-γ上调ido和pd-l1和缺氧上调cox-2和hla-g的双重激发的优越性。该解释受到免疫抑制蛋白的流式细胞术数据的挑战。同时，双重激发确实导致蛋白质水平上的全部这些因子的表达，单独的ifn-γ导致几乎相等的蛋白质水平。来自双重激发的ido的相对于ifn-γ单一激发的小幅增加表明缺氧和ifn-γ诱导途径之间的相互作用，使得细胞对ifn-γ信号传导更敏感。流式细胞术数据并未解释为什么缺氧单一激发如此有效，导致msc与ifn-γ激发的那些一样地受到免疫抑制。根据表面标志物的流式细胞术，就cox-2表达而言，缺氧仅略微优于ifn-γ，但对于全部其他三种蛋白质而言其导致比ifn-γ更少的诱导。不可否认，在我们的研究中仅广泛分析了基因和蛋白质的亚组，并且缺氧可上调一些其他的免疫抑制蛋白。然而，应注意的是，在初始pcr筛选中涉及免疫抑制的其他基因，要么不是从任一刺激物中改变的，要么其通过ifn-γ但不通过缺氧诱导(即inos、hgf、和hla-e)。由于蛋白质表达研究尚未提供缺氧激发的功能效果的令人信服的理由，我们开始探究代谢变化。天然t细胞具有通过氧化磷酸化(oxphos)实现的低代谢需求。然而，在激活后，其通过有氧糖酵解转换至高度代谢。虽然这比oxphos产生更少的每葡萄糖atp，但其更快速地提供atp并且导致用于维持细胞增殖所需的合成代谢的重要生物分子的产生。由于这种向有氧糖酵解的转换，增殖中的t细胞变为高度依赖葡萄糖。肿瘤可通过竞争(out-competing)t细胞的营养物来抑制免疫细胞攻击。肿瘤还使用糖酵解，并且肿瘤糖酵解越多，其越可以通过消耗葡萄糖和产生乳酸来抑制效应t细胞。环境营养物中的这些改变通过雷帕霉素机制靶(mechanistic-target-of-rapamycin)(mtor)途径来影响信号传导，使得t细胞不分化为激活的(和分裂的)效应细胞。我们进一步假设，暴露于缺氧(单独或在双重激发方案中)的msc将从氧依赖性oxphos转换至糖酵解。我们通过在第1和第3天对mlr进行seahorse检测和葡萄糖测定来证实了这一点，这是t细胞变为激活的但并未分裂的时期(通过流式细胞术中仅存在非分裂群来证实)。缺氧激发的msc消耗更多葡萄糖并且因此可在mlr的前三天影响初始天然淋巴细胞的细胞命运决定。由于向细胞培养物提供50kil的新鲜培养基(在添加培养基之前对第3天的样品进行葡萄糖分析)，任何激活的t细胞将具有新鲜营养物来为分裂供能。然而，如果周围较少的营养物已经影响了其对效应t细胞的激活和分化，其仍不增殖。这还可以解释为什么缺氧在抑制cd8+t细胞增殖中甚至更有效。虽然cd4+t细胞已显示出在激活后随着糖酵解增加oxphos，但对于cd8+t细胞尚未显示，并且较高的cd8+t细胞糖酵解通量可使得其对葡萄糖损失的抑制更加敏感。从msc的缺氧暴露向糖酵解的转换还可具有其他影响。随着血管生成因子的上调，该转换可帮助解释为什么缺氧激发的msc在几种动物模型中在缺血环境中更好存活。其也可意味着在任何种类的疗法中，使用细胞本身相比于其分泌产品将是有益的。来自本研究的一个重要结论是，单剂量的msc在治疗急性病症时比治疗慢性病症更为有效，其中存在正在进行的免疫细胞激活。实施例10缺氧和双重激发诱导代谢伴有快速乳酸产生的糖酵解的转换。我们接着通过研究不同激发方案如何影响msc中主要代谢途径来探究对于基于缺氧的免疫抑制的可能代谢解释。ifn-γ-激发的msc具有最高的耗氧率(ocr，通过seahorse分析)，其视为氧化磷酸化(oxphos)的指标。ocr从对照msc降低至双重激发的msc，并且对于缺氧激发的msc为最低的(图17a)。重要的是，正如通过这两组的细胞外酸化率(ecar)的增加所表明的，在缺氧激发和双重激发的msc中降低的ocr与增强的糖酵解代谢相关(图17a)。通过glut1独特的上调进一步支持了在缺氧激发和双重激发的msc中向糖酵解的转变，glut1也是t细胞糖酵解所需的诱导型葡萄糖转运蛋白(图17b)。然后，我们研究了观察到的代谢变化是否可以解释在msc-mlr共培养中所见的趋势(图11a-11c)，具体地(i)为什么缺氧激发的msc具有与ifn-γ激发的msc一样的抑制性和(ii)是否代谢变化可以解释双重激发的msc的增强的免疫抑制效力。在第1和第3天测定葡萄糖和乳酸水平，时间点在t细胞分裂前(来维持组间一致的细胞数)但在此期间t细胞可被激活。正如预期的，到第3天，在mlr(无msc)条件中的激活的pbmc显示出比仅应答物组更高的葡萄糖消耗和乳酸产生(图17c)。在图17a-17c中，除非另外指出，全部成对比较以p＜0.001为显著的。总而言之，msc对代谢环境具有大的影响。双重激发和缺氧激发的msc导致第1天的最大葡萄糖消耗和乳酸产生，与更高glutl表达和糖酵解诱导相一致。值得注意的是，双重激发和缺氧激发的msc导致上清液中的乳酸增加相对于对照msc分别为3倍和2倍(～15mm和10mm对5mm)。在第1天和第3天之间葡萄糖持续下降，虽然msc-mlr组在该阶段期间的消耗率相似(对于对照、ifn-γ和缺氧激发的msc-mlr共培养的～为40mg/dl的降低；对于双重激发的为45mg/dl；表5)。乳酸积累在第1天和第3天之间开始稳定，尽管仍在具有双重激发的msc的msc-mlr反应中发现最高水平。表5.图14中显示的数据的平均荧光强度±sd。idohla-ghla-ecox-2pd-l1cmscs299±227564±5702396±3640310±2003169±288imscs20900±11087668±6808848±7296337±796611±489hmscs482±2405554±7972375±4580358±1222167±265dmscs31766±16677796±12129721±6944336±827575±435为了探究高细胞外乳酸浓度的后果，我们研究其对细胞内ph和t细胞增殖的效果。在新鲜的完全aim-v培养基中增加细胞外乳酸水平(请参见方法)导致t细胞phi中剂量依赖性下降，其在15mm处开始变为显著，并且随着培养基ph在30mm急剧下降(图18a)。随着乳酸浓度从20mm增加至30mm，t细胞的散射特性也有显著变化，与经历细胞凋亡的细胞一致(图18b)。将乳酸滴定至培养基中也减弱cd4+和cd8+t细胞分裂对强促细胞分裂剂伴刀豆球蛋白a(cona)的应答(图18c)。t细胞分裂降低至最大速率的30-45％，并且在15mm乳酸浓度时，t细胞分裂几乎完全消除(图18c)。总之，结果证明ifn-γ和缺氧在msc中引起完全不同的免疫抑制机制。我们示出通过将msc暴露于两种激发诱因来组合这些不同的途径导致免疫抑制效果的增强。虽然ifn-γ为最常研究的msc激发方案，我们认为缺氧为相对低成本的添加并且不仅促进糖酵解，还增强ifn-γ诱导的ido、hla-g、和hla-e的表达。以该方法激发msc可导致在msc免疫调节的击中退出模式中更加显著的“击中”，并且可促进对许多自身免疫和炎性疾病的治疗更为有效的疗法。实施例11质谱法证明缺氧影响msc代谢但不上调具有直接免疫抑制能力的蛋白质。为了进一步评价我们对缺氧诱导的msc免疫抑制以及对为什么双重激发的msc在免疫抑制中相比于单一激发显示出增强的改善的代谢假设，进行了质谱法。这是为了确证暴露于缺氧的细胞不上调任何具有免疫抑制能力的且在pcr或流式细胞术分析中遗漏的蛋白质。由于缺氧激发导致表达改变的蛋白质主要为细胞代谢中起作用的线粒体蛋白。具体地，参与氧化磷酸化和tca循环的蛋白质下调，线粒体核糖体蛋白也下调。当对缺氧激发(相比于对照msc)的改变超过2倍的蛋白质列表进行string分析时，其没有将任何蛋白质与免疫调相关联。双重激发的细胞在通过单独缺氧改变的代谢途径中显示出相似的改变，尽管在某些情况下，蛋白质被小于2倍的略微下调，使得在缺氧和双重激发细胞之间的下调蛋白列表中没有100％重叠(表6)。表6.与对照msc相比较，通过缺氧激发或双重激发的msc改变的途径的string分析实施例12间充质基质细胞(msc)由于其免疫抑制能力，已研究作为自身免疫和炎性疾病的疗法。取决于病理学，其为血管内或局部导入的。在两种情况中，其仅在应答特定环境因素时变为免疫抑制。我们目前比较了ifn-γ激发与缺氧激发对体外msc的免疫抑制能力的影响。我们发现，通过单独的ifn-γ(100ng/ml)或缺氧(1％o2)激发的msc在混合淋巴细胞反应(mlr)中在抑制cd4和cd8t细胞分裂方面为同样有效的，然而组合这两种因素导致的msc的免疫抑制为两倍的。虽然ifn-γ明显上调免疫抑制蛋白(ido、pd-l1、hla-g、hla-e)，但缺氧却没有。因此，我们研究了基于缺氧的抑制的可能的免疫代谢机制。将msc暴露于缺氧导致msc-mlr共培养物向糖酵解代谢的转换(seahorse检测)、glut1表达的增加(流式细胞术)、和更快的葡萄糖消耗和乳酸产生。事实上，在msc-mlr共培养的第1天，当混入缺氧暴露的msc时，细胞外乳酸已达到可抑制t细胞分裂的水平。因此，我们提出了缺氧激发可对局部植入的msc的ifn-γ激发提供额外的有益效果，其中msc可支配附近的代谢环境来提供另一种免疫抑制机制。实施例13我们使用聚合物方法来从未激发的msc或组合的缺氧/ifn-γ48小时激发的那些的上清液中分离外来体。其他潜在的从msc上清液中分离外来体的方法包括免疫沉淀法、超速离心法、和尺寸排阻色谱法。分泌自激发的msc的外来体一贯为2-4倍多。我们标记这些外来体并将它们添加至浓度为10、50、125和250μg/ml的混合淋巴细胞反应(mlr)中。这显示出单核细胞(pbmc)对外来体的剂量依赖性摄入，但当外来体来自激发的msc时，摄入不明显。同时，当将外来体添加至仅应答物pbmc时未发生分裂，在完整的mlr中，外来体以剂量依赖性方式减弱t细胞分裂。剂量>50μg/ml加剧了来自两种外来体来源的t细胞分裂，但一旦浓度降低至50μg/ml，来自激发的msc的外来体可抑制t细胞分裂。我们仍在研究该剂量和来源依赖性减弱的机制，但明显的是单核细胞(不为t细胞)主要摄入外来体。为了试验这种有关于msc激发中涉及的作用机制的假设，在6孔板中将第5代msc生长至汇合并且暴露于ifn-γ(100ng/mlpeprotech)或缺氧(37℃、5％co2、1％o2)的刺激、双重刺激(ifn-γ和缺氧)、或对照条件(常氧；基础msc培养基)48小时。随后，使用基于聚合物的exoquicktc试剂从5ml来自各个条件的细胞培养物上清液中分离外来体。如通过在抗cd63磁性微珠上捕获荧光标记的颗粒和流式细胞术所确定的，分离的颗粒对cd63跨膜四蛋白外来体表面标志物为阳性。其他用于鉴定外来体的潜在标记物为cd9和cd81。通过nanosight分析测定不同msc培养条件下分离的外来体的浓度和尺寸分布。外周血单核细胞(pbmc)对外来体的摄取是通过首先用dii试剂(25μg/ml)标记外来体、通过旋转柱去除过量试剂、并且添加外来体至激活的pbmc培养物中来证明的。在24小时后，通过流式细胞术分析来检查pbmc对外来体的内化。与对照培养物相比较，当msc经历ifn-γ和/或缺氧刺激时分泌的外来体(标准化至msc的数量)的量为1.8-2.5倍高(图19)。msc培养条件还影响外来体的尺寸分布，在200nm和500nm直径周围为最显著差异(图19)。对于全部msc衍生的外来体群，添加外来体24小时后激活的pbmc中观察到剂量依赖性外来体内化(图20)。我们报道来自不同刺激的msc的cd63+外来体在群体浓度和尺寸分布上不同，并且以剂量依赖性方式在pbmc中内化。这些差异可告知我们对刺激的msc的免疫调节的理解，因为不同刺激可激活msc来分泌特定的免疫调节外来体。为了理解这些差异的性质，对外来体rna内容物进行二代测序，并且序列比对将能够鉴定msc培养条件特异性rna货物(cargo)。对于功能相关性，还在混合淋巴细胞反应中研究了外来体对t细胞增殖的影响，其中激发的外来体的浓度为1μg/ml至50μg/ml。实施例14进行滴定研究来确定不同浓度或不同时间段的ifn-γ是否对ido和/或pd-l1的msc表达具有不同效果(图22和23)。图22显示出ido需要至少1ng/ml的ifn-γ以在暴露48小时后达到最大诱导，尽管即使0.1ng/ml仍可导致显著诱导。因此，对于未来动物和人类研究，可使用0.1ng/ml至100ng/ml范围的ifn-γ剂量，同时还可再现相同有益表型，同时该范围的下限更可模拟人类的生理状况。图23显示出虽然最大ido和pd-l1表达需要48小时，在暴露仅6小时后，ido和pd-l1已上调。因此，可进行小于48小时的msc激发来实现生物效应。实施例15进行研究来确定缺氧模拟剂cocl2和dfo对msc的效果(图24)。图24显示出cocl2和dfo均可上调作为缺氧途径的度量标准的glut1，其其表明代谢转换为糖酵解。由于我们认为该代谢转换是通过缺氧预调节使得msc抑制免疫细胞的主要方式之一，图24中显示的数据表明50μμ至200μμ浓度的缺氧模拟剂可在我们的激发方案中代替37℃、5％co2、和1％-5％o2的缺氧条件。序列表<110>纽约哥伦比亚大学董事会(thetrusteesofcolumbiauniversityinthecityofnewyork)<120>免疫抑制性间充质细胞及其形成方法<130>16-50199-wo<140><141><150>62/530,617<151>2017-07-10<150>62/413,696<151>2016-10-27<160>32<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>1aaggtgaaggtcggagtcaac21<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>2gaagaggagacacggaaca19<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>3atggaaccctccttttactc20<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>4ggtgaccaaactcctgcca19<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>5cagccatacagcaaatcc18<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>6tcatccgctatgctggctac20<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>7tctcatttcgtgatggagactgc23<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>8ccaacgtgacggacttccc19<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>9tcaaggcgcatgtgaactcc20<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>10ggccagatcctgtccaagc19<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>11gggcagagttggatacccc19<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>12ttttgatgcgtgtctcattacca23<210>13<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>13ggacaagcagtgaccatcaag21<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>14gtggaaacttgcatggacaac21<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>15tcgccagcaacctgaatctc20<210>16<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>16gtgaagcccaatgcaaacaga21<210>17<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>17ggggtcattgatggcaacaata22<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>18tggcctcatagtcaaagaca20<210>19<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>19ggctccaggtgaagcagc18<210>20<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>20acctctggattgcttgtgaaa21<210>21<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>21atcctgtccgggtacaat18<210>22<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>22cccgaaaccactcgtatttgg21<210>23<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>23gtgtcccgttcttgcatttgc21<210>24<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>24tacacgactatgcggtacagc21<210>25<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>25gatgtcaaactcactcatggct22<210>26<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>26gtgggtttccaccattagcac21<210>27<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>27tgcgtgtgggttgtagcaata21<210>28<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>28attttccctcaagcgggttgt21<210>29<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>29cccagaattaccaagtgagtcct23<210>30<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>30aatcctggcacatcgggaatc21<210>31<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>31gcacgaagctcttagcgtca20<210>32<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列说明：合成引物<400>32agcgtgggttaaagtggaagg21当前第1页12