溶瘤病毒和治疗分子的制作方法

本发明属于溶瘤病毒和治疗基因领域。本发明提供了包含一种或多种治疗基因的溶瘤病毒。更确切地说，本发明的治疗基因是核苷库调节剂。更具体地，本发明的核苷库调节剂是胞苷脱氨酶或具有胞苷脱氨酶活性。溶瘤病毒与本文定义的一种或多种治疗基因的组合赋予溶瘤病毒增强的抗肿瘤功效。本发明最后提供了用于预防和/或治疗增殖性疾病的溶瘤病毒。

背景技术：

溶瘤病毒是一类具有肿瘤依赖性自永续性(self-perpetuation)独特性质的治疗剂(hermiston等，2006，curr.opin.mol.ther.，8(4)：322-30)。使用这些病毒的好处是，随着它们复制，它们裂解宿主细胞。溶瘤病毒能够在分裂细胞(例如，癌细胞)中选择性复制，同时非分裂细胞(例如，正常细胞)不受伤害。随着被感染的分裂细胞因裂解而被破坏，这些细胞释放出新的感染性颗粒，可以感染周围的分裂细胞。因此，溶瘤病毒提供了用于治疗癌症的新领域，任选结合癌症的常规治疗(fisher等，2006，curr.opin.mol.ther.，8(4)：301-13)。癌细胞是许多病毒的理想宿主，因为它们具有失活的抗病毒干扰素途径或具有突变的肿瘤抑制基因，其使得病毒复制能够不受阻碍地进行(chernajovsky等，2006，bmj，332(7534)：170-2)。包括腺病毒、呼肠弧病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、新城疫病毒和痘苗病毒在内的几种病毒现已作为溶瘤剂在临床上进行测试。

一些病毒天然是溶瘤的，并且具有选择性感染和杀死肿瘤细胞的先天能力。然而，也可以通过修饰天然存在的病毒，将溶瘤病毒工程化。为此，目前用于修饰病毒的主要策略包括：病毒基因的功能性缺失、使用肿瘤-或组织-特异性启动子来控制这些病毒基因的表达、用于将病毒重定向到癌细胞表面的向性修饰，以及许多其他可能方案。

在天然溶瘤病毒中，痘苗病毒(痘病毒科)具有许多用于溶瘤病毒疗法中的理想病毒骨架所必需的关键属性。这些包括生命周期短、细胞到细胞的扩散快、溶解能力强、克隆能力强以及分子生物学定义明确。此外，尽管能够在人细胞中复制，但这些病毒被认为不构成天然的健康问题，并且得到尤其充分的表征，在根除天花的斗争期间已被传递给数百万人。使用疫苗株或基因修饰的痘苗株的早期临床结果已经证明了抗肿瘤作用(thorne等，2005，curr.opin.mol.ther.，7(4)：359-65)。

可以实施病毒的病毒修饰以增强病毒能力，以感染和裂解100％肿瘤细胞，这在体内环境中是难以实现的。因此，溶瘤病毒通常用酶-前药系统“武装”，其通过发挥强烈的旁观者效应来增强病毒治疗的溶瘤功效，从而允许消除相邻的未受感染的肿瘤细胞。例如，具有所谓的fcu1自杀基因的武器，所述基因编码结合了fcy1和fur1的酶活性的双功能嵌合蛋白，可以有效地催化5-氟胞嘧啶(5-fc)(一种无毒的抗真菌剂)直接转化成毒性代谢产物5-氟尿嘧啶(5-fu)和5-氟尿嘧啶-5'单磷酸盐(5-fump)，从而绕过某些人肿瘤细胞对5-氟尿嘧啶的天然抗性(erbs等，2000，cancerres.，60(14)：3813-22)。

病毒修饰也可以用于增加安全性。在这方面，与野生型病毒相比，胸苷激酶(tk)缺失的病毒显示出具有降低的致病性，但保留了在肿瘤细胞中的复制(buller等，1985，nature，317(6040)：813-5)。foloppe等证明，在人结肠肿瘤的小鼠模型中，表达fcu1基因的tk基因缺失的vacv在体外和体内均具有有效的抗肿瘤作用(foloppe等，2008，genether.，15：1361-71)。

显然，迫切需要开发治疗癌症的有效方法。已经研发了用于治疗和诊断应用的减毒溶瘤病毒株，并且正在临床研究中进行评估。然而，使溶瘤病毒减毒的方法导致其功效降低。从治疗的角度来看，这种疗效的降低可导致整体应答减少、患者存活率降低、死亡率增加、病理耐药性......因此，需要新的安全的应当更有效的溶瘤病毒。

在本发明的内容中，发明人已经测试了包含一种或多种治疗基因的溶瘤病毒。更具体地，治疗基因是核苷脱氨酶。甚至更特别地，治疗基因是胞苷脱氨酶。

胞苷脱氨酶(cdase)-也称为脱氧胞苷脱氨酶或胞苷氨基水解酶-是参与嘧啶补救途径的核苷库调节剂(nucleosidepoolmodulator)，并且因此参与脱氧核糖核苷酸(dntp)的平衡。

dntp的适当平衡对于dna复制的忠实性是必不可少的。事实上，dntp池平衡的调节看起来对dna完整性、基因组稳定性有影响，并且可导致遗传毒性损害。核基因组的两条dna链处于由这种dntp池不平衡引起的相似突变风险中，即使两种主要的复制错误纠正机制在遗传上完整时，这种风险也不会被完全抑制。(buckland等，2014年12月，plosgenet.，10(12)：e1004846)。虽然已知dntp的减少或不平衡会导致遗传毒性和增加的诱变，但dntp的增加常常会导致忠实性降低的不受控dna复制，从而可能促进癌症发展(kohnken等，2015，mol.cancer；14：176)。

靶向dntp合成和代谢的治疗剂可用于几种类型的癌症的治疗。尽管进行了数项研究，但尚未完全了解调节胞内dntp水平和维持其体内平衡的分子机制。(kohnken等，2015，mol.cancer；14：176)。

据报道，cda酶缺陷导致过量的脱氧胞苷三磷酸(dctp)。由于基础聚-adp-核糖聚合酶1(parp-1)活性的部分抑制，cda酶缺陷细胞中的dna复制是不成功的。实际上，dctp的胞内积累抑制parp-1活性，损害检查点激酶1的激活和下游检查点的功效，从而允许随后在有丝分裂中累积未复制的dna。这种未复制的dna导致在“难以复制”的位点(如，着丝粒和脆性位点)处姐妹染色单体之间形成超细后期桥(ufb)。(gemble等，2015，plosgenet，11(7)e1005384)

已知cda酶具有抗病毒作用。apobec3g是一种使复合胞苷脱氨基的cda酶，是一种先天防御蛋白，显示出对抗逆转录病毒和逆转录转座子的活性(oliva等，2016，immunol.cell.biol.94：689-700)。首先针对hiv-1描述了apobec3蛋白在抑制病毒感染中的作用。然而，许多研究也显示出apobec3作用于与人类疾病相关的其他病毒的证据，所述其他病毒包括htlv、hcv、hbv、hpv、hsv-1和ebv。apobec3g通过一系列编辑依赖性和非依赖性的机制来抑制这些病毒。许多病毒已经进化出抵抗apobec作用的机制，并且增强apobec3活性的策略构成了抗病毒药物开发的新方法。(vieira等，2013，biomed.res.int.，2013：id683095)。

据报道，apobec是针对多种含dna病毒的限制因子(moris等，2014，frontmicrobiol，5：534)。然而，已经表明apobec3家族成员不是痘苗病毒(一种痘病毒)复制的限制因子，并且痘苗病毒不能降解apobec3g(kremer等，2006，virol.j.，3：86)。

据报道，apobec基因在非小细胞肺癌中过表达。apobec3g可能是各种癌症中突变簇的起源，所述癌症如乳腺癌、肺癌、头颈癌。已经在癌和正常肺组织中比较了mrnaapobec的比率，并且显示出mrnaapobec在癌组织中比在正常组织中显著升高(hidefumi等人，2014，biomed.rep.，2(3)：392-395)。

此外，进行了一项关于cda酶的酶活性对用铂-吉西他滨治疗的nsclc患者的临床问题的影响的研究。据报道，通过hplc检测，cda酶的酶活性与铂-吉西他滨疗法的活性和功效相关。更确切地说，具有低cda酶活性的患者比具有高cda酶活性的患者具有更好的反应率、更好的临床益处、更好的进展时间和更好的总体存活。在40名胰腺癌患者中的另一项初步研究报道了在基于吉西他滨的治疗后，高cda酶活性与进展之间存在相似的关联。作者建议使用cda酶活性作为用铂-吉西他滨方案治疗的患者的活性和疗效的生物标志物(tibaldi等，2012，ann.oncol.，23：670-677)。

已经报道了使用胞苷脱氨酶或具有胞苷脱氨酶活性的核苷库调节剂时的一些问题。使用一系列编辑依赖性和非依赖性机制，apobec3抑制病毒，但也是病毒遗传多样化和进化的源头。许多病毒发展出抵消apobec效应的新机制(vieira等，2013，biomed.res.int.，2013，articleid683095)。而且，如上所述，cda酶可以抑制一些癌症治疗。wo2010118013和wo2010118010涉及cda酶抑制剂和基于胞苷的抗肿瘤药物的组合，所述药物例如地西他滨、吉西他滨、ara-c和5-氮杂胞苷。事实上，cda酶使基于胞苷的药物脱氨基，并且因此降低其作用。这些申请还涉及这些组合用于治疗癌症的用途。cda酶抑制剂(er-876437)和吉西他滨在a2780人卵巢癌异种移植模型中的体内功效研究表明，尽管单独使用er-876437和单独使用吉西他滨对肿瘤生长没有影响，但在吉西他滨前30分钟给药er-876437分别在10％和30％的评估小鼠中导致完全肿瘤消退和部分肿瘤消退。

在本发明中，发明人已经发现，完全出乎预期地，工程化以表达胞苷脱氨酶的溶瘤病毒具有改善的功效。包括给药表达胞苷脱氨酶的溶瘤痘苗病毒的抗肿瘤病毒疗法，导致肿瘤进展的显著减少。而且，与其他核苷库调节剂(如胞嘧啶脱氨酶)相反，由表达cda酶的溶瘤病毒提供的抗肿瘤作用不需要添加任何前药，这也有助于本发明的易用性和安全性。

基于这些结果，可以预期本发明的溶瘤病毒可以成功地用作其他现有溶瘤病毒的替代物，并且可以具有更好的功效谱。本发明的溶瘤病毒也可以与其他一种或多种抗癌疗法组合使用。

发明概述

本发明的一个方面涉及包含编码胞苷脱氨酶(cda酶)多肽的核苷酸序列的溶瘤病毒。

在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒是属于正痘病毒属(orthopoxvirus)的痘病毒，并且尤其是痘苗病毒或牛痘病毒。

在另一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒在编码胸苷激酶(tk-)的j2r基因座中是有缺陷的。

在再另一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒在i4l和/或f4l基因座中是有缺陷的(可替换或结合缺陷的tk-基因座)。

在进一步的实施方案中，所述溶瘤病毒进一步包含目标核酸，特别是编码不同于cda酶的治疗分子的基因，所述治疗分子如免疫刺激多肽、抗原、渗透酶(permease)或任何其他目标分子。

在另一个方面中，本发明进一步提供了包含本发明的溶瘤病毒和药物学上可接受载体的组合物。在一个实施方案中，溶瘤病毒优选配制用于静脉内或肿瘤内给药。

在再一个方面中，本发明还涉及用于制备溶瘤病毒的方法，至少包括将所述溶瘤病毒引入生产细胞、在适于能够产生所述溶瘤病毒的条件下培养生产细胞、以及从细胞培养物回收生产的病毒的步骤。任选，收集的溶瘤病毒可以至少部分纯化。

在再进一步的方面中，本发明提供了本发明的溶瘤病毒或组合物，用于疾病的预防和/或治疗。在一个实施方案中，所述疾病是增生性疾病，如癌症、肿瘤和再狭窄。所述癌症优选选自肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、黑素瘤、卵巢癌和成胶质细胞瘤，并且尤其是转移性癌症。在另一个实施方案中，所述疾病是与提高的破骨细胞活性相关的疾病，如类风湿性关节炎和骨质疏松。

在再一个方面中，本发明提供了一种治疗疾病的方法，其包括将治疗有效量的本发明溶瘤病毒或组合物施用于有需要的宿主生物。所述治疗方法可以结合一种或多种其他治疗来使用，所述其他治疗如选自外科手术、放疗、化疗、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法的疗法。

在一个特别的实施方案中，就不需要前药以在胞苷脱氨酶存在下获得治疗效果而言，胞苷脱氨酶用作治疗基因，而不是作为自杀基因。具体地，卡培他滨可以转化成5’-dfcr(脱氧-5-氟胞苷)，其随后通过胞苷脱氨酶转化成5’-dfur(5’-脱氧-5-氟尿苷)，其最后转化成有毒的5-fu(5-氟-尿嘧啶)。对于获得本发明溶瘤病毒的溶细胞活性，不需要这种反应级联。因此，本发明的溶瘤病毒不组合卡培他滨来使用，并且根据本发明的治疗方法不包括施用药物前体(如卡培他滨)的任何步骤。通常，cda酶以外的核苷库调节剂可以结合前药来使用，其中所述前药通过所述核苷库调节剂的作用转化成细胞毒性药。这样的酶促转化通常有利于抗肿瘤作用。例如，依赖于编码胞嘧啶脱氨酶的溶瘤病毒的治疗方法，在结合5-氟胞嘧啶(5-fc)施用时，可以提供有效的抗肿瘤作用，其中5-氟胞嘧啶在受感染的细胞中转化成细胞毒性的5-氟尿嘧啶(5-fu)并促进所述细胞的溶解。

附图描述

图1.通过抗人cda的抗体(hcd)在western印迹上特异地检测cda(胞苷脱氨酶)。

用vvtk-rr-和vv-tk-rr-/hcd感染miapaca-2和lovo细胞。显示了(箭头)hcd(16kda)的存在。

图2.一次i.v.注射vvtk-rr-/gfp或vvtk-rr-/cdd1后s.c.植入的人结直肠lovo肿瘤的生长抑制

缩写：gfp：绿色荧光蛋白；cdd1：酵母胞苷脱氨酶

用1×10⁷pfu的溶瘤痘苗病毒(箭头指示)全身治疗后的平均肿瘤体积。在第11天，一次i.v.施用(在尾静脉中)单独的溶媒(◇：对照)或表达绿色荧光蛋白(gfp)(□：vvtk-rr-/gfp)或表达酵母cda酶(■：vvtk-rr-/cdd1)的tk和rr-缺陷型病毒，治疗带有lovos.c.异种移植物的小鼠。数据表示12只动物的平均值。

图3.一次i.v.注射vvtk-rr-/gfp或vvtk-rr-/cdd1后s.c.植入的人结直肠hct-116肿瘤的生长抑制。

用1×10⁵pfu的溶瘤痘苗病毒(通过箭头指示)全身治疗后的平均肿瘤体积。在第16天，一次i.v.施用(在尾静脉中)单独的溶媒(◇：对照)或表达gfp(□：vvtk-rr-/gfp)或表达酵母cda酶(■：vvtk-rr-/cdd1)的tk和rr-缺陷型病毒，治疗带有hct-116s.c.异种移植物的小鼠。数据表示12只动物的平均值。

图4.一次i.v.注射vvtk-rr-/gfp或vvtk-rr-/cdd1后s.c.植入的人食道oe-19肿瘤的生长抑制。

用1×10⁶pfu的溶瘤痘苗病毒(通过箭头指示)全身治疗后的平均肿瘤体积。在第13天，一次i.v.施用(在尾静脉中)单独的溶媒(◇：对照)或表达gfp(□：vvtk-rr-/gfp)或表达酵母cda酶(■：vvtk-rr-/cdd1)的tk和rr-缺陷型病毒，治疗带有oe-19s.c.异种移植物的小鼠。数据表示12只动物的平均值。

图5.一次i.v.注射vvtk-rr-/gfp或vvtk-rr-/hcd后s.c.植入的人食道oe-19肿瘤的生长抑制。

用5×10⁵pfu的溶瘤痘苗病毒(通过箭头指示)全身治疗后的平均肿瘤体积。在第14天，一次i.v.施用(在尾静脉中)单独的溶媒(◇：对照)或表达gfp(□：vvtk-rr-/gfp)或表达人cda酶(■：vvtk-rr-/hcd)的tk和rr-缺陷型病毒，治疗带有oe-19s.c.异种移植物的小鼠。数据表示12只动物的平均值。

图6.一次i.v.注射vvtk-rr-或vvtk-rr-/fcu1后s.c.植入的人结直肠lovo肿瘤的生长抑制。

用1×10⁷pfu的溶瘤痘苗病毒(通过箭头指示)全身治疗后的平均肿瘤体积。在第27天，一次i.v.施用(在尾静脉中)单独的溶媒(◇：对照)或非重组tk和rr缺陷型病毒(■：vvtk-rr-)或表达酵母胞嘧啶脱氨酶和uprt酶的tk和rr缺陷型病毒(δ:vvtk-rr-fcu1)，治疗带有lovos.c.异种移植物的小鼠。数据表示12只动物的平均值。

图7.一次i.v.注射vvtk-rr-/gfp或vvtk-rr-/apobec2后s.c.植入的人结直肠hct-116肿瘤的生长抑制。

用1×10⁵pfu复制性痘苗病毒(通过箭头指示)全身治疗后的平均肿瘤体积。在第17天，一次i.v.施用(在尾静脉中)单独的溶媒(◇：对照)或所示的病毒(□:vvtk-rr-/gfp；■:vvtk-rr-/apobec2)，治疗带有hct-116s.c.异种移植物的小鼠。数据表示9只动物的平均值。

发明详述

定义

如在整个申请中所使用的，术语“一个(a)”和“一个(an)”以表示“至少一个”、“至少第一”、“一个或多个”或“多数个”所提及的组分或步骤的意义来使用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“溶瘤病毒”包括多种溶瘤病毒，包括其混合物。

术语“一个或多个”是指一或一以上的数字(例如，2、3、4等)。

在本文的任何位置使用的术语“和/或”均包括“和”、“或”、以及“由所述术语连接的元素的全部或任何其他组合”的含义。

本文使用的术语“约”或“大约”表示，给定值或范围的20％以内，优选10％以内，并且更优选5％以内。

如本文使用的，用于定义产品和组合物时，术语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)、或“含有(containing)”(和含有(containing)的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)，是开放式的并且不排除另外的、未描述的元素或方法步骤。表述“基本上由……组成”表示排除任何重要意义的其他组分或步骤。因此，基本上由所述组分组成的组合物将不排除微量物质、杂质和药物学上可接受的载体。“由……组成”应当表示排除不仅仅是微量元素的其他组分或步骤。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，其包含至少九个或更多个通过肽键键合的氨基酸。聚合物可以是直链、支链或环状的并且可以包含天然产生的和/或氨基酸类似物，并且可以间插非氨基酸。作为一般说明，如果氨基酸聚合物超过50个氨基酸残基，则优选称为多肽或蛋白质，而如果长度为50个氨基酸或更少，则称为“肽”。

在本发明的内容内，术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用并且定义了任何长度的聚脱氧核糖核苷酸(dna)(例如，cdna、基因组dna、质粒、载体、病毒基因组、分离的dna、探针、引物及其任意混合物)或聚核糖核苷酸(rna)(例如，mrna、反义rna、sirna)或混合的聚核糖-聚脱氧核糖核苷酸的聚合物。它们包括单链或双链、直链或环状、天然或合成、修饰或未修饰的多核苷酸。此外，多核苷酸可以包含非天然产生的核苷酸并且可以间插非核苷酸组分。

本文使用的术语“类似物”、“突变体”或“变体”是指相对于天然对应物呈现出一个或多个修饰的分子(多肽或核酸)。可以设想任何修饰，包括一个或多个核苷酸/氨基酸残基的置换、插入和/或缺失。当考虑几个突变时，它们可以涉及连续的残基和/或非连续的残基。优选的是与天然对应物的序列保持至少80％，有利地至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少98％同一性的序列同一性程度的类似物。为了举例说明的目的，“至少80％同一性”是指80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。一般而言，术语“同一性”是指两个多肽或核酸序列之间氨基酸与氨基酸，或核苷酸与核苷酸的对应关系。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数，考虑了为最佳整体比对需要引入的缺口数和每个缺口的长度。本领域中可获得各种计算机程序和数学算法来确定整体比对后氨基酸序列之间的同一性百分比，如，例如needlemanetwunsh的算法，j.mol.biol.48，443-453，1970，以及可以在蛋白质序列和结构的图谱(atlasofproteinsequenceandstructure)中在ncbi或align获得的blast程序(dayhoffed，1981，suppl.，3：482-9)。用于确定核苷酸序列之间的同一性的程序也可以在专门的数据库中获得(例如，genbank，wisconsin序列分析数据包，bestfit、fasta和gap程序，以及可从ebi.ac.uk网依据名称<<align>>可获得的针软件)。

如本文使用的，术语“宿主细胞”应当宽泛地理解，对于组织、器官或分离的细胞中的特定构造没有任何限制。这样的细胞可以是独特的一类细胞或一组不同类型的细胞，如培养的细胞系、原代细胞和分化细胞。在本发明的内容中，术语“宿主细胞”包括原核细胞、低等真核细胞(如酵母)和其他真核细胞，如昆虫细胞、植物和哺乳动物(例如，人或非人)细胞，以及能够产生本发明的溶瘤病毒的细胞。该术语还包括可以是或已经是本文所述病毒的受体的细胞以及此类细胞的后代。

术语“病毒”、“病毒颗粒”、“病毒载体”和“病毒粒”可互换使用，并且宽泛地理解为表示包含野生型病毒基因组的至少一个元件的载体，并且可以包装至病毒颗粒中或包装成病毒颗粒。尽管，病毒颗粒可以含有或可以不含有核酸(即，病毒基因组)，但优选病毒包含包装至病毒颗粒(或病毒粒)中的dna或rna病毒基因组，并且是感染性的(即，能够感染并进入宿主细胞或受试者中)。期望地，本发明的病毒与dna基因组相连，并且最优选双链dna基因组。在本发明公开的内容中，“病毒”包括野生型和工程化病毒。

术语“天然产生的”或“野生型”或“天然的”用于描述可以在自然界找到的生物分子或生物体，与通过人工产生的区分开来。例如，可以从自然界的来源分离的病毒是野生型的。本发明还包括可以获自特定保藏机构(例如，eccac、atcc、cncm等)的野生型病毒。已经在实验室通过人为有意修饰的生物分子或生物体不是天然产生的。非天然产生的病毒的代表性实例包括，例如，通过在病毒基因组中插入一个或多个目标基因而工程化的重组病毒，和通过病毒基因的完全或部分删除来制备对于编码的基因产物具有缺陷的修饰病毒而工程化的突变病毒(例如，tk-病毒)、以及含有获自不同病毒来源的基因组片段的嵌合病毒。

术语“获自”、“源于”或“源自”用于确定组分(例如，多肽、核酸分子、病毒等)的最初来源，而不意在限制制备所述组分的方法，所述制备方法可以是例如化学合成或重组方式。

如本文使用的，术语“溶瘤病毒”是指能够在分裂细胞(例如，增殖细胞，如癌细胞)中选择性复制的天然产生的、工程化的或另外修饰的任何病毒，目的在于在体外或体内减缓所述分裂细胞的生长和/或裂解所述分裂细胞，同时在非分裂细胞(例如，原代细胞)中显示出没有或最少的复制。

术语“复制”和“繁殖”可互换使用并且是指病毒再生和增殖的能力。可以使用本领域标准的和本文所述的测定，如病毒滴定测定、噬斑测定、吸光度、荧光检测、质谱等，在核酸水平或在感染性病毒颗粒的水平定量病毒复制。

本文使用的术语“治疗基因”是指编码也称为“治疗分子”的产物的核酸序列，当适当地施用于受试者时，尤其是施用于患有疾病或病症或应当被保护以对抗这种疾病或病症的患者时，能够提供生物活性。预期这种生物活性通过加强抗肿瘤功效或增强病毒的溶瘤性质，引起对病理状况的过程或症状的有益作用。

本文使用的术语“治疗(treatment)”(和治疗的任何形式，如“治疗(treating)”、“治疗(treat)”)涵盖预防(例如，在有风险罹患待治疗的病理状况的受试者中的预防措施)和/或治疗(例如，在诊断为患有病理状况的受试者中)，任选结合常规的治疗方法。治疗的结果是减缓、治愈、改善或控制靶向的病理状况的进展。例如，如果单独或联合施用本文所述的溶瘤病毒后，患者显示出可观察的临床状态的改善，则患者得到了成功的癌症治疗。

本文使用的术语“施用(administering)”(或施用(administration)的任何形式，如“施用(administered)”)是指将治疗剂(如本文所述的溶瘤病毒)递送至受试者。

如本文使用的，术语“增殖性疾病”包括由不受控的细胞生长和扩散引起的任何疾病或病症，包括癌症、肿瘤和一些心血管疾病(由血管壁的平滑肌细胞的增殖引起的再狭窄等)。术语“癌症”可以与术语“肿瘤”、“恶性疾病”、“瘤”等中的任何一个互换使用。这些术语用来包括任何类型的组织、器官或细胞、任何阶段的恶性疾病(例如，从病变前到iv期)。

如本文使用的，术语“与提高的破骨细胞活性相关的疾病”包括导致骨再吸收或破坏的任何疾病或病症(例如，类风湿性关节炎、骨质疏松等)。

术语“受试者”通常是指需要本发明的任一种产品和方法或本发明的任一种产品和方法对其可能是有益的生物体。通常，生物体是哺乳动物，特别是选自家畜、农场动物、运动动物和灵长类的哺乳动物。优选，受试者是诊断为患有增殖性疾病或处于患有增殖性疾病风险中的人，所述增殖性疾病如癌症。术语“受试者”和“患者”提及人生物体时可以互换使用，并且包括男性和女性。待治疗的受试者可以是新生儿、婴儿、年轻人、成人或老年人。

术语“联合治疗(combinationtreatment)”、“联合的治疗(combinationtherapy)”、“组合的治疗(combinedtheatment)”或“组合治疗(combinatorialtreatment)”可以互换使用并且是指用至少两种不同治疗剂治疗受试者。在一个实施方案中，治疗剂中的一种是所述溶瘤病毒。第二种治疗剂可以是任何临床上确立的治疗剂，特别是选自外科手术、放疗、化疗、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法、细胞因子疗法、靶向癌症疗法、基因疗法、光动力学疗法、移植等。联合治疗可以包括第三种或甚至更多种治疗剂。对于联合治疗，可以理解，可以通过本领域技术人员确定组合的每种组分的最佳浓度。在特定实施方案中，本发明的溶瘤病毒(例如，野生型溶瘤病毒，或修饰的衍生溶瘤病毒)可以结合胞苷脱氨酶递送，其中所述胞苷脱氨酶不是由溶瘤病毒编码的。胞苷脱氨酶可以是多肽(例如，重组产生的胞苷脱氨酶，或其类似物)或核酸分子(例如，为表达此类胞苷脱氨酶而工程化的载体所携带的核酸分子)以及(一种或多种)多肽和(一种或多种)核酸分子(例如，(一种或多种)胞苷脱氨酶和(一种或多种)表达载体)的混合物的形式。

溶瘤病毒

本发明的溶瘤病毒可以从目前鉴定的任何病毒成员获得，只要与非分裂细胞相比，它在分裂细胞中具有更高的复制并杀灭分裂细胞的倾向性。它可以是天然溶瘤的天然病毒，或者可以通过修饰一个或多个病毒基因来改造，从而提高肿瘤选择性和/或在分裂细胞中的优先复制，所述基因为例如参与dna复制、核酸代谢、宿主向性、表面附着、毒力、裂解和扩散的那些基因(参见例如kirn等，2001，nat.med.7：781；wong等，2010，病毒2：78-106)。还可以设想将一个或多个病毒基因置于事件或组织特异性调控元件(例如启动子)的控制下。

示例性溶瘤病毒包括，不限于，呼肠弧病毒、塞内卡谷病毒(senecavalleyvirus,svv)、水疱性口炎病毒(vesicularstomatitisvirus,vsv)、新城疫病毒(newcastlediseasevirus,ndv)、单纯疱疹病毒(hsv)、morbillivirus、腺病毒、痘病毒、逆转录病毒、麻疹病毒(measlesvirus)、泡沫病毒(foamyvirus)、α病毒、慢病毒、流感病毒、sinbis病毒、粘液瘤病毒(myxomavirus)、弹状病毒(rhabdovirus)、小核糖核酸病毒(picornavirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、细小病毒(parvovirus)等。

在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒获自呼肠弧病毒。代表性的实例包括reolysin(由oncolyticsbiotech研发；nct01166542)。

在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒获自塞内卡谷病毒。代表性的实例包括ntx-010(rudin等，2011，clin.cancer.res.17(4):888-95)。

在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒获自水疱性口炎病毒(vsv)。代表性实例描述于文献中(例如，stojdl等，2000，nat.med.6(7):821-5；stojdl等，2003，cancercell4(4):263-75)。

在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒获自新城疫病毒。代表性的实例包括，不限于，73-tpv701和hdv-huj株，以及文献中描述的那些(例如，phuangsab等，2001，cancerlett.172(1):27-36；lorence等，2007，curr.cancerdrugtargets7(2):157-67；freeman等，2006，mol.ther.13(1):221-8)。

在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒获自疱疹病毒。疱疹病毒科是一个大的dna病毒家族，它们都具有共同的结构，并由相对较大的双链支链dna基因组组成，编码包在二十面体衣壳内的100-200个基因，所述衣壳包在脂质双层膜中。尽管溶瘤疱疹病毒可以源自不同类型的hsv，但特别优选的是hsv1和hsv2。疱疹病毒可以进行遗传修饰，以限制病毒复制在肿瘤中或降低其在非分裂细胞中的细胞毒性。例如，任何参与核酸代谢的病毒基因可以被灭活，如胸苷激酶(martuza等，1991，science252：854-6)、核糖核苷酸还原酶(rr)(boviatsis等，genether.1：323-31；mineta等，1994，cancerres.54：3363-66)，或尿嘧啶-n-糖基化酶(pyles等，1994，j.virol.68：4963-72)。另一方面涉及病毒突变体，其在编码毒力因子的基因(如icp34.5基因)的功能上是有缺陷的(chambers等，1995，proc.natl.acad.sci.usa92：1411-5)。溶瘤性疱疹病毒的代表性实例包括nv1020(例如geevarghese等，2010，hum.genether.21(9)：1119-28)和t-vec(harrington等人，2015，expertrev.anticancerther.15(12)：1389-1403)。

在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒获自morbillivirus，其可以获自副粘病毒科，特别优选麻疹病毒(measlesvirus)。溶瘤性麻疹病毒(measlesvirus)的代表性实例包括但不限于mv-edm(mcdonald等，2006；breastcancertreat.99(2)：177-84)和hmwmaa(kaufmann等，2013，j.invest.dermatol.133(4)：1034-42)。

在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒获自腺病毒。本领域存在可用于工程化溶瘤性腺病毒的方法。一种有利的策略包括，用肿瘤选择性启动子替代病毒启动子，或修饰(一种或多种)e1腺病毒基因产物以灭活其与肿瘤细胞中改变的p53或视网膜母细胞瘤(rb)蛋白的结合功能。在自然环境中，腺病毒e1b55kda基因与另一个腺病毒产物协作，来灭活p53(p53在癌细胞中常常是失调的)，由此防止凋亡。溶瘤性腺病毒的代表性实例包括onyx-015(例如，khuri等，2000，nat.med6(8):879-85)以及也称为oncorine的h101(xia等，2004，aizheng23(12):1666-70)。

在一个并且优选的实施方案中，本发明的溶瘤病毒是痘病毒。如本文使用的，术语“痘病毒”或“痘病毒载体”是指属于痘病毒科的病毒，特别优选属于脊椎动物痘病毒(chordopoxviridae)亚科的痘病毒，且更优选为正痘病毒属。各种痘病毒的基因组序列，例如痘苗病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、鼠痘病毒(ectromeliavirus)、粘液瘤病毒的基因组可在本领域和专门的数据库中获得，例如genbank(分别为登录号nc_006998、nc_003663或af482758.2、nc_005309、nc_004105、nc_001132)。

有利地，溶瘤痘病毒是溶瘤性牛痘病毒，并且可以源自任何牛痘病毒株，例如cpxv_ger1980_ep4(genbankhq420895)、cpxv_ger2002_mky(genbankhq420898)、cpxv_ger1991_3(genbankdq437593)、cpxv_fra2001_nancy(genbankhq420894)、cpxv_ger1990_2(genbankhq420896)、cpxv_uk2000_k2984(genbankhq420900)、cpxv_br(genbankaf482758.2或nc003663)和cpxv_nor1994-man(genbankhq420899)、cpxv_ger1998_2(genbankhq420897)、cpxv_gri(genbankx94355)、cpxv_fin2000_man(genbankhq420893)和cpxv_aus1999_867(genbankhq407377)。

期望地，溶瘤痘病毒是溶瘤痘苗病毒。痘苗病毒是痘病毒家族的成员，其特征在于200kb双链dna基因组，其编码许多病毒酶以及因子，使得病毒可以独立于宿主细胞机制进行复制。大部分痘苗病毒颗粒是胞内的(imv，胞内成熟病毒粒)，具有单个脂质包膜并保留在受感染细胞的胞质溶胶中直至裂解。另一种感染形式是双包膜颗粒(eev，胞外包膜病毒粒)，它从受感染的细胞出芽而不裂解细胞。

尽管可以源自任何痘苗病毒株，但特别优选elstree、wyeth、copenhagen和westernreserve株。本文使用的基因命名是copenhagen痘苗病毒株的。除非另有说明，否则本文也将其用于其他痘病毒科的同源基因。然而，根据该痘病毒株，基因命名可能不同，但copenhagen与其他痘苗病毒株之间的对应关系通常可在文献中找到。

优选，通过改变一个或多个病毒基因来修饰本发明的溶瘤痘苗病毒。所述修饰优选导致缺陷蛋白质的合成(或缺乏合成)，所述缺陷蛋白质不能确保未修饰基因在正常条件下产生的蛋白质的活性。修饰包括病毒基因或其调节元件内的一个或多个(连续的或不连续的)核苷酸的缺失、突变和/或置换。可以使用常规重组技术以本领域技术人员已知的多种方式进行修饰。在文献中公开了示例性修饰，特别优选可以改变参与dna代谢、宿主毒力、ifn途径的病毒基因的那些修饰(参见例如guse等，2011，expertopinionbiol.ther.11(5)：595-608)等。

更优选，通过改变编码胸苷激酶的基因(基因座j2r)来修饰本发明的溶瘤病毒。tk酶参与脱氧核糖核苷酸的合成。在正常细胞中病毒复制需要tk，因为这些细胞通常具有低浓度的核苷酸，而在含有高核苷酸浓度的分裂细胞中，这是不必要的。

可替换地，或组合地，通过改变编码核糖核苷酸还原酶(rr)的至少一个基因或两个基因来修饰本发明的溶瘤病毒。在自然环境中，该酶催化核糖核苷酸还原为脱氧核糖核苷酸，这代表了dna生物合成中的关键步骤。病毒酶在亚基结构上与哺乳动物酶相似，由两个异源亚基组成，即，分别由i4l和f4l基因座编码的r1和r2。i4l和f4l基因的序列及其在各种痘病毒基因组中的位置可在公共数据库中获得，例如通过登录号dq437594、dq437593、dq377804、ah015635、ay313847、ay313848、nc_003391、af482758.2、nc_003389、nc_003310、ay243312、dq011157、dq011156、dq011155、dq011154、dq011153、y16780、af438165、u60315、af410153、af380138、l22579、nc_006998、dq121394和nc_008291。在本发明的内容中，i4l基因(编码r1大亚基)或f4l基因(编码r2小亚基)或两者都可以被灭活。

可替换地，或组合地，还可以采用其他策略来进一步提高病毒的肿瘤特异性。合适修饰的代表性实例包括，破坏来自病毒基因组的vgf编码基因。vgf(vv生长因子)是分泌性蛋白质，其在细胞感染后早期表达，并且其功能对于病毒在正常细胞中的传播似乎是重要的。另一个实例是编码血凝素的a56r基因的破坏，任选组合tk缺失(zhang等，2007，cancerres.67：10038-46)。(一种或多种)干扰素调节基因的破坏也可能是有利的(例如b8r或b18r基因)或caspase-1抑制剂b13r基因。另一种合适的修饰包括破坏编码病毒dutp酶的f2l基因，所述病毒dutp酶参与维持dna复制的保真度和提供胸苷酸合酶产生tmp的前体(broyles等，1993，virol.195：863-5)。痘苗病毒f2l基因的序列可通过登录号m25392在genbank中获得，并且在f2l基因座中缺陷的痘病毒可从wo2009/065547获得。

在优选实施方案中，本发明的溶瘤病毒是j2r基因座缺陷的痘病毒，由失活突变引起，因此缺乏病毒tk活性。在另一个优选实施方案中，本发明的溶瘤病毒是tk和rr活性缺陷的痘病毒，其由j2r基因座和病毒基因组携带的编码rr的i4l和/或f4l基因座中的至少一个的失活突变引起(例如，如wo2009/065546和foloppe等，2008，genether.，15：1361-71中所述)。

在另一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒是由于f2l基因中的失活突变(例如，如wo2009/065547中所述)导致的dutp酶缺陷的痘病毒，任选地组合tk和rr活性中的至少一个或两个的破坏(导致f2l；f2l和j2r基因；f2l和i4l；或f2l，j2r和i4l中具有失活突变的病毒)。

核苷库调节剂和胞苷脱氨酶

术语“核苷”是指由糖(通常为核糖或脱氧核糖)和嘌呤或嘧啶碱基组成的各种化合物中的任何一种。更确切地说，术语“核糖核苷”表示与核糖连接的任何嘌呤或嘧啶碱基。类似地，术语“脱氧核糖核苷”是指与脱氧核糖连接的任何嘌呤或嘧啶碱基。因此，表述“核苷”表示核糖核苷和脱氧核糖核苷。核苷的实例是胞苷和脱氧胞苷。

术语“核苷酸”是指由核苷和一个或多个磷酸组成的各种化合物中的任何一种。表述“核苷酸”表示核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。核苷酸的实例是胞苷一磷酸，胞苷二磷酸或胞苷三磷酸。

如本文所用，术语“核苷库调节剂”或“核苷库的调节剂”是指以负的或正的方式直接或间接作用于核苷库的任何成分。类似地，术语“核苷酸库调节剂”或“核苷酸库的调节剂”是指以负的或正的方式直接或间接作用于核苷酸库的任何成分。术语“调节剂”表示完整的调节剂、其部分(例如截短的)及类似物。术语“调节剂”包括天然存在于宿主细胞中的“细胞”调节剂，所述宿主细胞如人、动物、昆虫或微生物(例如，病毒、细菌)。细胞核苷库调节剂的表达在分裂细胞中可能增加(depas等，2008，j.clin.oncol.，20；26：14644)。在本发明的内容中，这种“调节剂”包括增加核苷/核苷酸库的调节剂以及减少核苷/核苷酸库的调节剂。这种调节剂可以直接或间接作用于核苷或核苷酸库。本发明的核苷和核苷酸可以是内源的(例如从头生物合成，补救途径)或外源的(例如食物或药物的降解)。它们也可以是游离的(例如，在细胞质中)或复合的(例如，在dna中)。在一个实施方案中，本发明的核苷和核苷酸是氟化的。

有利地，这种核苷或核苷酸库调节剂是核苷或核苷酸脱氨酶。脱氨酶是催化脱氨反应的酶，其是从分子中除去胺基。核苷脱氨酶催化在核苷上的脱氨反应。优选，用于本发明的核苷库调节剂具有胞苷脱氨酶活性。更优选，它是天然存在的胞苷脱氨酶或其类似物。本文所用的术语“胞苷脱氨酶”或“cda酶”表示胞苷脱氨酶及其任何类似物，只要这种类似物保留了基本的胞苷脱氨酶酶活性(野生型对应物的至少50％)。术语类似物包括cda酶片段(例如截短的cda酶)以及(优选在催化位点外)包含一个或多个氨基酸修饰的突变cda酶。在文献中，胞苷脱氨酶也被称为“脱氧胞苷脱氨酶”和“胞苷氨基水解酶”。

胞苷脱氨酶属于多亚基酶家族，其催化其底物水解脱氨成相应的尿嘧啶产物(somasekaram等，1999，j.biol.chem.274(40)：28405-12)。cda酶在嘧啶核苷和核苷酸补救中起主要作用。更确切地说，cda酶催化基于胞苷的成分脱氨基成尿苷基成分，例如胞苷(c)至尿苷(u)，以及脱氧胞苷(dc)至脱氧尿苷(du)(demontis等，1998，biochim.biophys.acta.1443：323-33)。这种脱氨作用可以针对其他基于胞苷的成分。例如，cda酶对dc和5-甲基-2'-脱氧胞苷(5mdc)的脱氨作用导致du和胸苷(t)，它们是胸腺嘧啶三磷酸合成的正常前体。另一个实例是将5-羟甲基-2'脱氧胞苷(5hmdc)和5-甲酰-2'脱氧胞苷(5fdc)转化为尿苷变体，分别为5hmdu和5fdu，当它们掺入dna时对细胞有毒，因为它们被认为是受损的碱基(zauri等，2015，nature，524：114-118)。再一个实例是化疗核苷类似物，如ara-c、5-氮杂胞苷和2,2-二氟脱氧胞苷(吉西他滨)的脱氨基作用，这导致其细胞毒性和抗肿瘤活性的丧失(fitzgerald等，2006，hum.genet.，119(3)：276-83)。

胞苷脱氨酶的两个家族表现出不同的生物学功能，如通过胞苷脱氨酶(cda或cdd；ec3.5.4.5)进行的游离胞苷脱氨作用，或如通过aid/apobec蛋白(激活诱导的脱氨酶和载脂蛋白bmrna编辑酶催化多肽样蛋白)进行的、对dna或rna聚合物中掺入的胞苷的脱氨作用(mameri等人，2016，clin.cancer.res.doi：10.1158/1078-0432.ccr-16-0626；conticello等，2005，mol.biol.evol.22：367-77)。

各种胞苷脱氨酶可用于本发明中，包括哺乳动物(例如人)、昆虫、细菌或低等真核细胞胞苷脱氨酶。在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒编码人源cda酶或与人源cda酶组合使用。人胞苷脱氨酶的代表性实例包括但不限于人cda，也称为hcd(genbank登录号：nm_001785；np_001776)、激活诱导的胞苷脱氨酶(aid或aicda，genbank登录号：nm_020661；eaw88615.1；bab12721)、apobec蛋白家族的成员(apobec1(genbank登录号:nm001644；baa23882)、apobec2(genbank登录号:nm_006789；af161698_1)、apobec3a(genbank登录号:km_266646；ake33285)、apobec3b(genbank登录号：nm_004900；aah53859)、apobec3c(genbank登录号:nm_014508)、apobec3d(genbank登录号:nm_152426)、apobec3e(genbank登录号:nm_152426)、apobec3f(genbank登录号:nm_145298)、apobec3g(genbank登录号:nm_021822；aah61914.1)、apobec3h(genbank登录号:nm_001166003)、apobec4(genbank登录号:nm-203454.2))和胞苷脱氨酶样蛋白。

胞苷脱氨酶也可以源自微生物，如真菌、酵母、病毒或细菌。非人胞苷脱氨酶的实例源自酵母(例如cdd1：genbank登录号:nm_001182132；edn59461)、光滑假丝酵母(candidaglabrata)(genbank登录号：ktb24532)、拟南芥(arabidopsisthaliana)(genbank登录号:aj005687)、大肠杆菌(genbank登录号：np_416648)等。

在一个实施方案中，溶瘤病毒编码选自cda、cdd、ec3.5.4.5、apobec、aid和胞苷脱氨酶样蛋白的cda酶多肽。

在优选实施方案中，本发明的溶瘤病毒编码酵母胞苷脱氨酶(cdd1)，其中所述cdd1包含与seqidno:1具有至少80％，优选高于90％，并且更优选高于95％同一性的氨基酸序列。

在另一个优选实施方案中，本发明的溶瘤病毒编码人胞苷脱氨酶(hcd)，其中所述hcd包含与seqidno:2具有至少80％，优选高于90％，并且更优选高于95％同一性的氨基酸序列。

在再另一个优选实施方案中，本发明的溶瘤病毒编码人apobec2，其中所述apobec2包含与seqidno:3具有至少80％，优选高于90％，并且更优选高于95％同一性的氨基酸序列。

本发明优选涉及包含一种或多种胞苷脱氨酶编码核酸分子的溶瘤病毒。例如，如下文所述的，编码酵母胞苷脱氨酶(cdd1)和人胞苷脱氨酶(hcd)的核酸分子可以在适当的调节元件的控制下插入病毒基因组中(例如在不同位置)。(一个或多个)cda酶编码核酸分子可以插入病毒基因组的任何位置，特别优选非必需基因座。例如，tk基因、rr基因或基因间区域特别适合用于溶瘤痘苗病毒中的插入。在一个优选的实施方案中，本发明涉及病毒tk和rr编码的活性具有缺陷并编码人或酵母cda酶的减毒痘苗病毒，例如在实施例部分中举例说明的vvtk-rr-/cdd1、vvtk-rr-/hcd或vvtk-rr-/apobec2。

“胞苷脱氨酶编码核酸分子”可以基于本文提供的信息和本领域技术人员的一般知识通过克隆、通过pcr或通过化学合成容易地获得。用于本文中的cda酶编码核酸分子可以是天然cda酶编码序列(例如cdna)、或通过一个或多个核苷酸的突变、缺失、置换和/或添加衍生自天然cda酶编码序列的类似物。此外，可以优化cda酶编码核酸分子，以在特定的宿主细胞或受试者中提供高水平表达，如下文所述。

目的核酸

根据特定的实施方案，本发明的溶瘤病毒可以进一步包含一个或多个不同于cda酶编码核酸分子的目的核酸，插入其基因组中。根据本发明，(一个或多个)目的核酸与其引入的宿主生物体可以是同源或异源的。更具体地，可以是人源的或不是人源的(例如，细菌、酵母或病毒来源的)。有利地，所述目的核酸编码多肽的全部或部分。多肽应理解为多核苷酸的任何翻译产物，与大小以及是否糖基化无关，并且包括肽和蛋白质。

可以在本发明中考虑各种目的核酸，例如所述核酸可以编码预期对待治疗的病理状况的过程或症状可以产生有益效果的多肽，如可以补偿受试者中缺陷或缺乏的蛋白质的多肽，或可以通过毒性作用限制或去除体内有害细胞的多肽、或赋予免疫力的多肽(例如，免疫刺激多肽、和/或诱导或激活免疫体液和/或细胞应答的抗原)、或增加细胞核苷/核苷酸库的渗透酶，等。此类目的核酸可以从天然存在的序列获得、或通过突变、缺失、置换和/或添加一个或多个核苷酸来修饰。

在本发明中，目的核酸可以源自原核生物(包括细菌、古细菌界)，无核生物(acaryotes)(包括病毒)、或真核生物(包括原生生物、真菌、植物、动物界)。

合适的目的核酸的实例在下列中给出：本发明的溶瘤病毒可以进一步携带编码多肽的核酸，所述多肽选自酶(脲酶、肾素、凝血酶、金属蛋白酶、一氧化氮合酶nos、sod、过氧化氢酶，透明质酸酶，...)、酶抑制剂(α1-抗胰蛋白酶、抗凝血酶iii、病毒蛋白酶抑制剂、纤溶酶原激活物抑制剂pai-1)、蛋白质、i类或ii类mhc抗原、可调节/调控细胞基因表达的多肽、能够抑制细菌，寄生物或病毒感染或其发展的多肽(抗原多肽、抗原表位、通过竞争抑制天然蛋白质作用的反式显性变体(transdominantvariants)...，凋亡诱导剂或抑制剂，(bax、bak、bok、bad、bidetbim、bax抑制剂、bak抑制剂、bok抑制剂、bad抑制剂、bid抑制剂、bim抑制剂、bcl-2、bcl-xl、bcl-w、nr13、bcl2抑制剂、bcl-xl抑制剂、bcl-w抑制剂、nr13抑制剂)、细胞抑制剂(p21、p16、rb...)、载脂蛋白(apoai、apoaiv、apoe...)、血管生成抑制剂(血管抑素，内皮抑素...)、抗vegf抗体或scfv、氧自由基清除剂、具有抗肿瘤作用的多肽、抗体、毒素、免疫毒素、标记物(β-半乳糖苷酶、萤光素酶...)、或本领域公认的可用于治疗或预防临床病症的任何其他目的核酸。合适的抗肿瘤核酸包括但不限于编码肿瘤抑制基因的那些(例如rb、p53、dcc、nf-1、wilm’s肿瘤、nm23、brush-1、p56、p73及其各自的突变体)、抗体、抑制细胞分裂或转导信号的多肽。

免疫刺激多肽

在本发明的另一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒可以进一步包含免疫刺激多肽。如本文所用，术语“免疫刺激多肽”是指多肽或蛋白质，其具有以特异性或非特异性方式刺激免疫系统的能力。本领域已知大量蛋白质具有发挥免疫刺激作用的能力。在本发明的内容中，合适的免疫刺激蛋白的实例包括但不限于免疫检查点抑制剂，包括但不限于抗pd1、抗pdl1、抗pdl-2、抗ctla4、抗tim3、抗-lag3、抗btla；细胞因子，如α、β或γ干扰素、白细胞介素(特别是il-2、il-6、il-10或il-12)或肿瘤坏死因子(tnf)；影响细胞表面受体调节的药剂，例如，表皮生长因子受体抑制剂(特别是西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗、马妥珠单抗、吉非替尼、厄洛替尼或拉帕替尼)或人表皮生长因子受体-2抑制剂(特别是曲妥珠单抗)；影响血管生成的药剂，例如，血管内皮生长因子抑制剂(特别是贝伐单抗或雷珠单抗)；刺激干细胞产生粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、巨噬细胞的物质，例如粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(gm-csf、c-csf、m-csf...))和b7蛋白(b7.1、b7.2等)。

抗原

术语“抗原”通常是指被抗体或t细胞抗原受体识别并选择性结合的物质，以引发免疫应答。可以考虑，术语抗原包括天然抗原以及片段(例如表位、免疫原性结构域等)及其衍生物，只要这种片段或衍生物能够成为免疫应答的靶标。在本发明的内容中，合适的抗原优选是多肽(例如，肽、多肽、翻译后修饰的多肽等)，包括一个或多个b细胞表位或一个或多个t细胞表位、或b和t细胞表位两者并且能够引起免疫应答，优选，对该抗原具有特异性的体液或细胞应答。通常，与待治疗的疾病有关，选择一种或多种抗原。用于本文的优选抗原是癌抗原和肿瘤诱导性病原体的抗原。

在某些实施方案中，包含在溶瘤病毒中或由溶瘤病毒编码的(一个或多个)抗原是与癌症相关和/或作为癌症标志物的癌抗原(也称为肿瘤相关抗原)。癌抗原包括各种类型的多肽，例如，在正常细胞中通常是沉默的(即不表达的)那些，仅在低水平或在某些分化阶段表达的那些、和依时表达的那些，如胚胎和胎儿抗原、以及由细胞基因突变引起的那些，如致癌基因(例如，激活的ras致癌基因)、原癌基因(例如erbb家族)，或由染色体易位产生的蛋白质。癌抗原还包括由能够在受试者(尤其是慢性感染的受试者)中诱导恶性病症的病原生物体(细菌、病毒、寄生虫、真菌、类病毒或朊病毒)编码的抗原，如rna和dna肿瘤病毒(例如hpv、hcv、ebv等)和细菌(例如幽门螺旋杆菌(helicobacterpilori))。

癌抗原的一些非限制性实例包括但不限于mart-1/melan-a、gp100、二肽基肽酶iv(dppiv)、腺苷脱氨酶结合蛋白(adabp)、亲环蛋白b、结直肠相关抗原(crc)-c017-1a/ga733、癌胚抗原(cea)及其免疫原性表位cap-1和cap-2、etv6、aml1、前列腺特异性抗原(psa)及其免疫原性表位psa-1、psa-2和psa-3、前列腺特异性膜抗原(psma)、t细胞受体/cd3-δ链、mage-家族的肿瘤抗原(如mage-a1、mage-a2、mage-a3、mage-a4、mage-a5、mage-a6、mage-a7、mage-a8、mage-a9、mage-a10、mage-a11、mage-a12、mage-xp2(mage-b2)、mage-xp3(mage-b3)、mage-xp4(mage-b4)、mage-c1、mage-c2、mage-c3、mage-c4、mage-c5)，gage家族的肿瘤抗原(例如，gage-1、gage-2、gage-3，gage-4、gage-5、gage-6、gage-7、gage-8、gage-9)、bage、rage、lage-1、nag、gnt-v、mum-1、cdk4、酪氨酸酶、p53、muc家族(例如muc1、muc16等；参见例如us6,054,438；wo98/04727；或wo98/37095)、her2/neu、p21ras、rcas1、α-甲胎蛋白、e-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白和γ-连环蛋白、p120ctn、gp100.sup.pmel117、prame、ny-eso-1、cdc27、腺瘤性结肠多发性息肉蛋白(apc)、fodrin、connexin37、ig-独特型、p15、gp75、gm2和gd2神经节苷脂，smad家族的癌抗原脑糖原磷酸化酶、ssx-1、ssx-2(hom-mel-40)、ssx-1、ssx-4、ssx-5、scp-1和ct-7，以及c-erbb-2，和病毒抗原，如hpv-16和hpv-18e6和e7抗原以及ebv编码的核抗原(ebna)-1。

适用于本发明中的其他抗原是标记抗原(β-半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白等)。

本发明还包括表达两种或多种本文所述的目的多肽的溶瘤病毒，例如，至少两种抗原、至少一种抗原和一种细胞因子、至少两种抗原和一种细胞因子等。

渗透酶

根据另一个实施方案，本发明的溶瘤病毒可以进一步包含至少一种目的核酸，其是渗透酶。

如本文使用的，术语“渗透酶”是指参与核苷和核碱基转移的跨膜蛋白。涉及核苷、核苷类似物和核碱基转移的渗透酶的实例是hcnt1、hcnt2、hcnt3、hent1和hent2。hcnt1、hcnt2和hcnt3蛋白以na+偶联方式转移核苷，具有高亲和力和一些底物选择性，hcnt1和hcnt2分别为嘧啶-和嘌呤-偏爱性，hcnt3为宽泛选择性的转运蛋白。hent1和hent2明确地与核苷和核碱基的转移有关(pastor-anglada等，2015，front.pharmacol.，6(13)：1-14)。

其他目的核酸：

在一个实施方案中，本发明的溶瘤病毒可以进一步包含至少一种目的核酸，其包括，但不限于：

-编码核酸内切酶的核酸，如限制酶(例如i、ii、iii、iv或v型限制酶，人工限制酶，如转录激活因子样效应核酸酶(talen)或锌指核酸酶)、crispr/cas9；

-rna，包括但不限于靶标特异性mirna、shrna、sirna。

可以使用常规技术，通过克隆、通过pcr或通过化学合成容易地获得目的核酸序列。此外，它们的序列在文献中被广泛描述，本领域技术人员可以参考这些文献。对于cda酶编码核酸分子，可以将目的核酸插入病毒基因组的任何位置，特别优选非必需基因座。例如，tk基因、rr基因或基因间区域特别适用于溶瘤痘苗病毒中的插入。

cda酶编码核酸分子和目的核酸的表达

如前所述，可以优化待插入本发明的溶瘤病毒基因组中的cda酶编码核酸分子和/或目的核酸，以在特定宿主细胞或受试者中提供高水平表达。已经确实观察到，生物体的密码子使用模式是高度非随机的，并且密码子的使用在不同宿主之间可以显著不同。由于这样的核酸可能来自细菌或低等真核生物来源，对于在高等真核细胞(例如，人)中的有效表达，它们可能具有不适当的密码子使用模式。通常，通过用一个或多个编码相同氨基酸的更常用的密码子替换对应于目标宿主生物体中不常用的密码子的一个或多个“天然”(例如细菌或酵母)密码子来进行密码子优化。没有必要替换对应于不常使用的密码子的所有天然密码子，因为即使部分替换也可以实现提高的表达。

除了优化密码子使用，还可以通过核酸序列的其他修饰来进一步改善宿主细胞或受试者中的表达。例如，防止稀有的非最佳密码子聚集存在于浓缩区域中和/或抑制或修饰预期会对表达水平产生负面影响的“负性”序列元件，可能是有利的。这种负性序列元件包括但不限于具有非常高(>80％)或非常低(<30％)gc含量的区域；富含at或富含gc的序列延伸；不稳定的直接或反向重复序列；和/或内部隐蔽调节元件，如内部tata盒、chi位点、核糖体进入位点、和/或剪接供体/受体位点。

根据本发明，溶瘤病毒包含表达目的核酸所必需的元件。更确切地说，插入本发明的溶瘤病毒基因组中的cda酶编码核酸分子和/或目的核酸，与合适的调节元件可操作地连接，用于它/它们在宿主细胞或受试者中的表达。如本文所用，术语“调节元件”或“调节序列”是指允许、有助于或调节给定宿主细胞或受试者中的表达(包括核酸或其衍生物(即mrna)的复制、重复、转录、剪接、翻译、稳定性和/或转运)的任何元件。如本文所用的，“可操作地连接”是指，所连接的元件被布置成使得它们可以协调地用于其预期目的的方式。例如，如果启动子在许可性宿主细胞中可以转录所述核酸分子从转录起始到终止，则启动子与核酸分子可操作地连接。

本领域技术人员将理解，调节序列的选择可取决于诸如核酸分子本身、其插入的病毒、宿主细胞或受试者、所需的表达水平等因素。启动子尤为重要。在本发明的内容中，它可以是组成型的，指导编码产物(例如cda酶和/或治疗分子)在许多类型的宿主细胞中表达，或是对某些宿主细胞具有特异性(例如肝特异性调节序列)、或响应于特定事件或外源因素(例如，温度、营养添加剂、激素等)而受调节的、或根据病毒周期的阶段(例如晚期或早期)受调节的。还可以使用在生产步骤中应答特定事件或外源因子而被抑制的启动子，以优化病毒生产并避免表达的多肽的潜在毒性。

尽管常规启动子，如巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子(us5,168,062)、rsv启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子(adra等，1987，gene60：65-74)、单纯疱疹病毒(hsv)-1的胸苷激酶(tk)启动子、和t7聚合酶启动子(wo98/10088)，可用于本发明中。痘苗病毒启动子特别适宜调整以在溶瘤痘病毒中表达。代表性实例包括但不限于痘苗7.5k、h5r、11k7.5(erbs等，2008，cancergenether.15(1)：18-28)、tk、p28、p11pr13.5(wo2014/063832)、pb8r、pf11l、pa44l、pc11r(wo2011/128704)和k1l启动子，以及合成启动子，例如chakrabarti等所述的那些(1997，biotechniques，23：1094-7；hammond等，1997，j.virol.methods，66：135-8；和kumar和boyle，1990，virology，179：151-8)以及早期/晚期嵌合启动子(例如us8,394,385；us8,772,023)。牛痘启动子也是合适的(例如ati启动子)。在一个优选的实施方案中，将cda酶核酸分子插入本发明的溶瘤病毒的tk基因座中并置于痘苗病毒p11.5k启动子的控制下。

本领域技术人员将理解，控制核酸表达的调控元件可以进一步包含其他元件，所述其他元件可以用于转录的正确启动、调节和/或终止(例如转录终止序列)、mrna转运(例如，核定位信号序列)、加工(例如剪接信号)和稳定性(例如，内含子和非编码5'和3'序列)、翻译(例如，起始met、三联前导序列、ires核糖体结合位点、信号肽等)、靶向序列、转运序列、分泌信号、和复制或整合中涉及的序列。所述序列已在文献中有报道，并且可由本领域技术人员容易地获得。

制备溶瘤病毒的方法

本发明还涉及用于制备本发明的溶瘤病毒的方法，在该方法中：

(i)将本发明的溶瘤病毒引入生产细胞中，

(ii)在适于能够产生所述溶瘤病毒的条件下培养所述生产细胞，和

(iii)从细胞培养物收集所述溶瘤病毒。

通常，使用常规技术在合适的宿主细胞系中产生本发明的溶瘤病毒，所述常规技术包括在合适的条件下培养转染或感染的宿主细胞，以便产生感染性病毒颗粒并从所述细胞的培养物收集产生的感染性病毒颗粒，并任选地纯化所述收集的感染性病毒颗粒。用于产生溶瘤病毒的合适宿主细胞包括，不限于，人细胞系，如hela(atcc)、293细胞(graham等，1997，j.gen.virol.36：59-72)、her96、per-c6(fallaux等，1998，humangenether.9：1909-17)、猴细胞，如vero(atccccl-081)、cv1(atccccl-70)和bsc1(atccccl-26)细胞系，禽类细胞，如wo2005/042728、wo2006/108846、wo2008/129058、wo2010/130756、wo2012/001075等中所述的细胞，仓鼠细胞系，如bhk-21(atccccl-10)、以及从受精卵获得的鸡胚制备的原代鸡胚成纤维细胞(cef)。宿主细胞优选在不含动物或人来源产物的培养基中培养，使用不含动物或人源产物的化学成分确定培养基。培养在适合生产细胞的温度、ph和氧含量下进行。这种培养条件在本领域普通技术人员的能力范围内。如果存在生长因子，它们优选重组产生并且不从动物物质中纯化。合适的无动物培养基是可商购的，例如用于培养cef生产细胞的vp-sfm培养基(invitrogen)。感染前，优选将生产细胞在+30℃至+38℃(更优选约+37℃)的温度下培养1至8天(优选地，对于cef培养1至5天，对于永生化细胞培养2至7天，)。如果需要，可以进行1至8天的几次传代以增加细胞总数。

生产细胞用溶瘤病毒感染，使用适当的感染复数(moi)，其可以低至0.001(更优选地在0.05和5之间)以允许生产性感染。

在步骤ii)中，然后在本领域技术人员熟知的适当条件下培养感染的生产细胞，直至产生子代病毒载体。受感染的生产细胞的培养也优选在化学成分确定的不含动物或人衍生产物的培养基中进行(其可以与用于培养生产细胞和/或用于感染步骤的培养基相同或不同)，在+30℃至+37℃的温度下持续1至5天。

在步骤iii)中，可以从培养物上清液和/或生产细胞中收集病毒颗粒。从生产细胞(以及任选地还从培养物上清液)中收集可能需要允许破坏生产细胞膜以从生产细胞中释放病毒的步骤。可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来诱导生产细胞膜的破坏，包括但不限于冷冻/解冻、低渗裂解、超声处理、微流化或高速均质化。

在根据本发明使用之前，可以将收集的溶瘤病毒至少部分纯化。可以设想各种纯化步骤，包括澄清、酶处理(例如，内切核酸酶，如benzonase、蛋白酶)、超离心(例如，蔗糖梯度或氯化铯梯度)、色谱和过滤步骤。本领域描述了合适的方法(例如wo2007/147528；wo2008/138533、wo2009/100521、wo2010/130753、wo2013/022764)。

溶瘤病毒组合物

本发明还涉及一种组合物，其包含治疗有效量的本发明溶瘤病毒、或根据本文所述的方法制备的溶瘤病毒。优选地，组合物进一步包含药物学上可接受的载体。

“治疗有效量”对应于包含在本发明组合物中的每种活性剂的量，其足以产生一种或多种有益结果。这种治疗有效量可以根据各种参数而变化，例如，施用方式；疾病状态；受试者的年龄和体重；受试者应答治疗的能力；并行治疗的种类；治疗频率；和/或对预防或治疗的需求。当涉及预防用途时，本发明的组合物以足以预防或延迟病理状况(例如增殖性疾病，如癌症)的发作和/或建立和/或复发的剂量施用，尤其是在处于风险中的受试者中。对于“治疗”用途，将本发明的组合物给予诊断为患有病理状况(例如增殖性疾病，如癌症)的受试者，目的是治疗疾病，任选地与一种或多种常规治疗方式结合。特别地，如下文所述，治疗有效量可以是引起临床状态超过基线状态或如果不治疗则超过预期状态所需的量。通过医生和熟练医护人员通常使用的任何相关临床测量，可以容易地评估临床状态的改善。例如，实验室中通常使用的技术(例如，流式细胞术、组织学、成像技术等)可用于进行肿瘤监测。治疗有效量也可以是引起有效的非特异性(先天性)和/或特异性抗肿瘤应答发展所必需的量。通常，可以在体外、在合适的动物模型中或使用从受试者收集的生物样品，评估免疫应答(特别是t细胞应答)的发展。还可以使用各种可用的抗体，以鉴定在治疗的受试者中存在的参与抗肿瘤应答的不同免疫细胞群，如细胞毒性t细胞、激活的细胞毒性t细胞、自然杀伤细胞、和激活的自然杀伤细胞。

溶瘤病毒的适当剂量可以作为各种参数的函数进行调整，并且可以由医师根据相关情况常规确定。适当地，溶瘤病毒的个体剂量可以在约10³至约10¹²vp(病毒颗粒)、iu(感染单位)或pfu(噬斑形成单位)的范围内变化，这取决于病毒和所用的定量技术。为了举例说明的目的，用于人类使用的溶瘤痘苗病毒的合适剂量包括约10⁴至约10¹¹pfu，优选约10⁵pfu至大约10¹⁰pfu；特别优选大约10⁶pfu至约5x10⁹pfu的剂量(例如10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、10⁸、2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×10⁸、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、或5×10⁹pfu的剂量)。样品中存在的病毒量可通过常规滴定技术测定，例如，在许可性细胞(例如bhk-21或cef)感染后计数噬斑数、免疫染色(例如，使用抗病毒抗体；caroll等，1997，virology238：198-211)、测量a260吸光度(vp滴度)，或再有通过定量免疫荧光(iu滴定)来测定。

术语“药学上可接受的载体”旨在包括与哺乳动物并且特别是人类受试者的施用相容的任何和所有载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、助剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂，吸收剂等。

本发明的溶瘤病毒可以独立地置于适合人或动物使用的溶剂或稀释剂中。溶剂或稀释剂优选是等渗的、低渗的或弱高渗的并且具有相对低的离子强度。代表性实例包括无菌水、生理盐水(例如氯化钠)、林格氏溶液、葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液、hank’s溶液和其他水性生理平衡盐溶液(参见例如最新版的remington：thescienceandpracticeofpharmacy，a.gennaro，lippincott，williams&wilkins)。

在其他实施方案中，溶瘤病毒被适宜地缓冲用于人类。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(例如pbs)，碳酸氢盐缓冲液和/或能够维持生理或微碱性ph(例如，约ph7至约ph9)的tris缓冲液。

本发明的组合物还可含有其它药物学上可接受的赋形剂，用于提供所需的药学或药效学性质，包括例如渗透压、粘度、透明度、颜色、无菌性、稳定性、制剂的溶出速率，改变或维持释放或吸收至人或动物受试者中，促进穿过血液屏障的运输或透过特定器官。

在再一个实施方案中，本发明的组合物可以配以佐剂以进一步增强免疫力(尤其是t细胞介导的免疫力)或促进施用时肿瘤细胞的感染。合适的佐剂的代表性实例包括，不限于，明矾、矿物油乳液，如弗氏完全和不完全(ifa)、脂多糖或其衍生物(ribi等，1986，plenumpubl.corp.，407-419)、皂苷类，如qs21(sumino等，1998，j.virol.72：4931；wo98/56415)、咪唑喹啉化合物，如咪喹莫特(suader，2000，j.amacaddermatol.43：s6)、s-27609(smorlesi，2005，genether.12：1324)和相关化合物，如wo2007/147529中描述的那些，多糖如adjuvax和squalenes，水包油型乳剂，如mf59，双链rna类似物，如多聚(i:c)，单链胞嘧啶磷酸鸟苷寡脱氧核苷酸(cpg)(chu等，1997，j.exp.med.，186：1623；tritel等，2003，j.immunol.，171：2358)、和阳离子肽，如ic-31(kritsch等，2005，j.chromatogr.anal.technol.biomed.lifesci.，822：263-70)。

在一个实施方案中，可以配制本发明的组合物，目的是改善其稳定性，特别是在制造以及在冷冻(例如-70℃，-20℃)、冷藏(例如4℃)或环境温度下长期储存(即，至少6个月，优选至少两年)的条件下的稳定性。本领域可以以冷冻、液体形式或冻干形式获得各种病毒制剂(例如wo98/02522、wo01/66137、wo03/053463、wo2007/056847和wo2008/114021等)。固体(例如，干粉或冻干的)组合物可通过涉及真空干燥和冷冻干燥的方法获得。为了举例说明的目的，包括nacl和/或糖的缓冲制剂特别适于病毒的保存(例如tris10mmph8，含蔗糖5％(w/v)、谷氨酸钠10mm、nacl50mm；或磷酸盐缓冲盐水，含甘油(10％)和nacl)。

溶瘤病毒组合物优选以适于施用方式的形式来配制，以确保体内适当的分布和释放。例如，胃耐受性胶囊和颗粒特别适于口服施用，栓剂用于直肠或阴道施用，任选地与用于增加粘膜孔径的吸收促进剂组合。这种吸收促进剂通常是与粘膜的磷脂结构域具有结构相似性的物质(如脱氧胆酸钠、甘氨胆酸钠、二甲基-β-环糊精、月桂基-1-溶血磷脂酰胆碱)。另一个且特别合适的实例是适于通过微针装置(例如，经皮或皮内贴剂)施用的制剂。这样的制剂可以包括无内毒素的磷酸盐缓冲盐水(pbs)中重悬浮的免疫治疗产品。

施用

本发明的溶瘤病毒或组合物可以单剂量或多剂量施用。如果考虑多剂量，可以通过相同或不同的途径进行施用，并且可以在相同的部位或在交替部位进行。每次施用之间的间隔可以是数小时至8周(例如24小时，48小时，72小时，每周，每两周或三周，每月等)。间隔也可以是不规则的。还可以通过在休息期后重复的连续施用周期(例如每周3至6次施用的循环，然后是3至6周的休息期)进行。对于每次施用，剂量可以在上述范围内变化。

任何常规施用途径都适用于本发明，包括胃肠外、局部或粘膜途径。胃肠外途径用于注射或输注施用，并包括全身和局部途径。常见的胃肠外注射类型是静脉内(进入静脉)、动脉内(进入动脉)、皮内(进入真皮)、皮下(在皮肤下)、肌内(进入肌肉)和肿瘤内(进入肿瘤或其附近)。输注通常通过静脉途径施用。可以使用透皮方法(例如，贴剂等)进行局部施用。粘膜施用包括但不限于口服/消化道、鼻内、气管内、肺内、阴道内或直肠内途径。在鼻内、肺内和气管内途径的情况下，有利的是通过气溶胶或通过滴注进行施用。本发明的溶瘤病毒的优选施用途径包括静脉内和瘤内途径。

施用可以使用常规注射器和针头(例如quadrafuse注射针头)或本领域可用的任何能够促进或改善受试者中活性剂递送的化合物或装置。透皮系统也是合适的，例如，使用固体、空心、涂层或可溶解的微针(参见例如，vandermaaden等，2012，j.controlrelease161：645-55)并且优选硅和蔗糖微针贴片(参见，例如carrey等，2014，scirep4：6154doi10.1038；和carrey等，2011，plosone，6(7)e22442)。

特别优选的组合物包含10⁶pfu至5×10⁹pfu的溶瘤病毒，其包含cda酶编码核酸分子，并优选在j2r基因座(tk-)、i4l和/或f4l基因座(rr-)或在j2r基因座(tk-)和i4l/f4l基因座(tk-rr-)两者中具有缺陷的溶瘤痘苗病毒，特别优选具有插入以代替tk基因座并置于p11.5k启动子下的cda酶核酸分子的痘苗病毒，例如本文描述的vvtk-rr-/cdd1或vvtk-rr-/hcd；配制用于静脉内或瘤内施用。

方法和用途

在另一方面中，本发明提供一种溶瘤病毒或其组合物，用于治疗或预防有需要的受试者中的疾病或病理状况。本发明还涉及一种治疗方法，包括以足以治疗或预防有需要的受试者中的疾病或病理状况的量施用所述溶瘤病毒或其组合物。

“疾病”(和任何形式的疾病表述，例如“疾患”或“病理状况”)通常以可识别的症状来表征。

可以使用本发明的溶瘤病毒或其组合物预防或治疗的疾病的实例包括增殖性疾病，如癌症、肿瘤或再狭窄，以及与增加的破骨细胞活性相关的疾病，如类风湿性关节炎和骨质疏松。

本发明特别适用于治疗或预防癌症，并且特别是肾上腺皮质腺癌(adrenocorticalcarcinoma)、肾上腺皮质癌(adrenalcortexcancer)、肛门癌、胃肠道类癌(例如，阑尾癌和类癌)、胆管癌(例如，胆管细胞癌)、膀胱癌、骨癌(例如尤文肉瘤、骨的恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤)、脑瘤(例如，星形细胞瘤、胚胎肿瘤、生殖细胞肿瘤、中枢神经系统非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、胶质瘤和胶质母细胞瘤)、乳腺癌(例如，原位导管癌)、支气管肿瘤、未知原发癌、心脏(cardiac，heart)肿瘤、宫颈癌、脊索瘤、慢性髓性增生性肿瘤、结肠直肠癌(例如直肠癌)、成感觉神经细胞瘤(esthesioneuroblastoma)、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、睾丸癌、妊娠滋养细胞疾病、头颈癌(例如，下咽癌、咽癌、喉癌、唇和口腔癌、隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌、口腔癌、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、唾液腺癌、咽喉癌、食道癌)、肝细胞癌(肝癌)、组织细胞增多症、朗格汉斯细胞、肾癌(例如，wilms肿瘤、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌)、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌和乳头状瘤病、白血病(例如毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(cll)、慢性髓性白血病(cml)、急性髓性白血病(aml)、急性淋巴母细胞白血病(all))、肝癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、淋巴瘤(例如艾滋病相关淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、原发性淋巴瘤、蕈样肉芽肿，非霍奇金淋巴瘤、巨球蛋白血症、原发性中枢神经系统(cns)淋巴瘤、sézary综合征、t细胞淋巴瘤)，眼内黑色素瘤、间皮瘤，涉及nut基因的中线癌(midlinetractcarcinoma)、多发性内分泌赘生综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、骨髓增生异常综合征、慢性骨髓增生性肿瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌(例如原发性腹膜癌和输卵管癌)、胰腺癌和胰腺神经内分泌肿瘤(岛细胞瘤)、乳头状瘤病、副神经节瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、嗜铬细胞瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、血管瘤、皮肤癌(例如基底细胞癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌和merkel细胞癌)、小肠癌、软组织肉瘤(例如，胃肠道间质瘤(gist)，aids-相关癌、kaposi肉瘤、卡波西肉瘤和横纹肌肉瘤)、胃(stomach，gastric)癌、睾丸癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜和子宫肉瘤、阴道癌和外阴癌。本发明还可用于治疗转移性癌症。

在优选实施方案中，本发明的溶瘤病毒或组合物用于治疗胃肠癌，包括食道、胆囊、肝脏、胰腺、胃、小肠、肠(大肠或结肠和直肠)和肛门的癌症。特别优选的方法包括以每周至每月的间隔给予1至6次本发明的溶瘤病毒或其组合物的静脉内或瘤内施用，特别优选每两周3次施用(例如，在约d1、d14和d29)包含10⁶-5×10⁹pfu的溶瘤痘苗病毒的组合物，其包含在其基因组中插入的cda酶编码核酸分子(例如置于p11.5k启动子下)，优选在j2r基因座中(tk-)、在i4l和/或f4l基因座中(rr-)或在j2r基因座(tk-)和i4l/f4l基因座(tk-rr-)两者中有缺陷，如vvtk-rr-/cdd1或vvtk-rr-/hcd。

本发明方法提供的有益效果可以表现为：临床状态高于基线状态或高于未用根据本文所述的方式治疗时的预期状态的可观察改善。通过医生和熟练医护人员通常使用的任何相关临床测量，可以容易地评估临床状态的改善。在本发明中，治疗益处可以是暂时的(在停止施用后一个月或几个月)或持续的(几个月或几年)。由于临床状态的自然过程(其可能在受试者之间显著变化)，不需要在每个受治疗的受试者中都观察到治疗益处，但是需要在相当多的受试者中观察到治疗益处(例如，两组之间的统计学显著差异可以通过本领域已知的任何统计检验来确定，例如tukey参数检验、kruskal-wallis检验、根据mann和whitney的u检验、student’s检验、wilcoxon检验等)。

在一个特别的实施方案中，由于根据本发明的方法特别适于治疗癌症，这些方法可以与以下的一种或多种相关：在根据本发明治疗的受试者中，抑制或减缓肿瘤生长、增殖和转移，预防或延迟肿瘤侵袭(肿瘤细胞在邻近组织中的扩散)，减少肿瘤数量；减少肿瘤大小、减少转移的数量或程度、提供延长的总生存率(os)、增加无进展生存期(pfs)、提高缓解期长度、稳定(即不恶化)疾病状态、提供更好的对标准治疗的应答、改善质生活量和/或诱导抗肿瘤应答(例如非特异性(先天性)和/或特异性，如细胞毒性t细胞应答)。

可用于评估临床益处的适宜测量，如血检、生物流体和活检组织的分析以及医学成像技术可以在医学实验室和医院中常规评估，并且大量试剂盒是可商购获得的。它们可以在施用前(基线)以及治疗期间和治疗停止后的不同时间点进行。

本发明还涉及治疗有需要的受试者的疾病或病理状况的方法，包括施用本发明的或根据本文所述的方法制备的溶瘤病毒或组合物。在一个实施方案中，所述疾病是增殖性疾病，如癌症、肿瘤和再狭窄。在另一个实施方案中，所述疾病是与提高的破骨细胞活性相关的疾病，如类风湿性关节炎和骨质疏松。更确切地说，本发明涉及一种抑制体内肿瘤细胞生长的方法，包括在有需要的受试者中施用溶瘤病毒或其组合物，以抑制肿瘤的生长。对于一般指导，可以常规地评估肿瘤细胞生长的抑制，例如通过放射线照相方法。溶瘤病毒或其组合物的施用理想地导致肿瘤质量减少至少10％。

联合治疗

在根据本发明的任何方法中，溶瘤病毒或组合物可以与任何可用于治疗或预防靶向疾病或病理状况的常规治疗方式联合施用。常规疗法的代表性实例包括但不限于外科手术、放疗、化疗、冷冻疗法、激素疗法、毒素疗法、免疫疗法、细胞因子疗法、移植(例如干细胞)、热疗和光动力疗法。这些常规疗法可以在溶瘤病毒或其组合物施用之前、之后、基本上同时或以穿插的方式根据标准实践向受试者施用。

在一个实施方案中，根据本发明的溶瘤病毒、组合物或方法可以与放疗联合使用。本领域技术人员可以容易地制定适当的放射治疗方案和参数(参见例如perez和brady，1992，principlesandpracticeofradiationoncology，第2版，jblippincottco；使用本领域技术人员显而易见的适当和改编修改)。可以使用的放射类型是本领域公知的，并且包括电子束、来自线性加速器的或来自诸如钴或铯等放射源的高能光子、质子和中子。放射性同位素的剂量范围可以由从业者根据同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型、以及肿瘤细胞的摄取来限定。本发明考虑长时间(3至6周)或高单剂量的常规x射线剂量。

在其他实施方案中，所述方法可以与外科手术结合使用。例如，溶瘤病毒或其组合物可以在切除肿瘤后施用(例如通过局部施用在切除区域内)。

在本发明任何方法的其他实施方案中，溶瘤病毒或其组合物可以与一种或多种在抗癌疗法中有效的物质(如化疗药物或免疫治疗产品)组合使用。

在一个特定的实施方案中，本发明的溶瘤病毒或组合物可以与目前用于治疗癌症的化学治疗药物联合使用。尽管任何抗癌化疗药物可以与本发明的溶瘤病毒或其组合物组合使用，但可以更具体地提及烷化剂、拓扑异构酶i抑制剂、拓扑异构酶ii抑制剂、铂衍生物、酪氨酸激酶受体的抑制剂、抗代谢物和抗有丝分裂剂。

在更进一步的实施方案中，本发明的溶瘤病毒或组合物可以与免疫疗法联合使用，尤其是与抗肿瘤抗体以及sirna和反义多核苷酸一起使用。其中，代表性实例包括阻断免疫检查点的单克隆抗体(例如伊匹单抗、tremelimumab、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、纳武单抗、pidilizumab、amp-224medi4736、mpdl3280a、bms-936559等)，α、β或γ干扰素，白细胞介素(特别是il-2、il-6、il-10或il-12)或肿瘤坏死因子；影响细胞表面受体调节的试剂，例如，阻断表皮生长因子受体的单克隆抗体(特别是西妥昔单抗、帕尼单抗、扎鲁木单抗、尼妥珠单抗、马妥珠单抗、曲妥珠单抗(herceptin^tm)、吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼等)和阻断血管内皮生长因子的单克隆抗体(特别是贝伐单抗和雷珠单抗)。其中，适用于本发明的此类免疫治疗产品的其他代表性实例是质粒dna载体、痘苗病毒(例如copenhagen、wr、wyeth、mva等)、腺病毒、慢病毒、疱疹病毒、重组多肽等。

本发明的另一方面涉及溶瘤病毒(例如野生型溶瘤病毒或修饰的衍生溶瘤病毒)与至少一种胞苷脱氨酶的组合，其中所述胞苷脱氨酶不由溶瘤病毒编码。胞苷脱氨酶可以由另一载体编码，例如dna分子(质粒、非溶瘤病毒载体、粘粒和人工染色体)、rna分子、纳米颗粒等。胞苷脱氨酶也可以是其多肽形式。多肽可以是任何来源，例如，人、人源化、动物、昆虫、微生物或嵌合的。此外，多肽可以是糖基化的或非糖基化的。

在另一个实施方案中，溶瘤病毒或其组合物还可以与增强胞苷脱氨酶活性的物质(例如，胞苷脱氨酶表达的增强子、dna甲基化抑制剂，如5-aza-dz)组合使用。

可以顺序地或以穿插的方式向受试者提供溶瘤病毒和其他抗癌疗法，但也可以考虑在相同的时间段内并行施用两种疗法。治疗过程可以由从业者常规确定，并且本发明包括各种方案。例如，1至10次溶瘤病毒的施用(例如，每两周3至6次注射)可穿插在其他抗癌疗法的一次或多次施用中(例如，可以在一周或几周的一个或多个循环中给予化疗)。此外，在治疗过程之后，考虑在重复治疗周期之前有一段时间不施用抗癌治疗。

所有上述引用的专利公开、出版物和数据库条目都特意通过引用整体并入本文。根据说明书、附图和权利要求，本发明的其他特征、目的和优点将显而易见。结合以下实施例来说明本发明的优选实施方案。然而，鉴于本公开，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具有实施方式进行改变。

实施例

材料&方法

病毒和细胞

在该研究中使用的所有重组病毒是源自copenhagen株的双缺失胸苷激酶(j2r)和核糖核苷酸还原酶(i4l)的痘苗病毒。vvtk-rr-/gfp是表达基因标记gfp(绿色荧光蛋白)的双缺失痘苗病毒。vvtk-rr-/cdd1是表达酵母胞苷脱氨酶cdd1基因的双缺失痘苗病毒(kurtz等，1999，curr.genet.，36(3)：130-6)。vvtk-rr-/hcd是表达人胞苷脱氨酶cdacdna的双缺失痘苗病毒(lalibertéetmomparler，1994，cancerres.，54(20)：5401-7)。vvtk-rr-/apobec2是表达人apobec2基因的双缺失痘苗病毒。将gfp、ccd1、hcd和apobec2基因插入胸苷激酶基因座中并置于p11k.5启动子的控制下。通过多重pcr确认病毒结构。在原代鸡胚成纤维细胞(cef)中扩增最终的重组痘苗病毒，并通过菌斑测定在cef上滴定病毒储液。

人结肠癌细胞系lovo(atccccl-229)、miapaca-2(atcccrl-1420)和hct116(atccccl-247)获自美国典型培养物保藏中心(atcc，rockville，md)。人食道癌细胞系oe-19获自欧洲典型培养物保藏中心(ecacc96071721)。所有人肿瘤细胞系在补充有10％胎牛血清(fcs)的dulbecco’s改良的eagle’s培养基(dmem)中生长。原代鸡胚成纤维细胞(cef)用于病毒载体的重组、扩增和滴定。从受精卵(charlesriverspafas)获得的鸡胚制备cef细胞，所述受精卵预先在37℃下在潮湿气氛中孵育11或12天。切下鸡胚并用2.5％(w/v)胰蛋白酶溶液处理。将cef细胞维持在补充有5％胎牛血清的基于eagle的培养基(mbe)中。

western印迹分析。

人肿瘤胰腺癌miapaca-2细胞和人结肠直肠癌lovo细胞用moi为0.1的vvtk-rr-和vv-tk-rr-/hcd感染并孵育24小时。在还原条件下，将30μg细胞裂解物蛋白在10％sds/page凝胶上电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。用人hcd兔多克隆抗体(abcam)孵育膜、洗涤，并与偶联辣根过氧化物酶的二抗(amersham)一起孵育。通过增强的化学发光(amersham)进行信号检测。

体内抗肿瘤活性

雌性swiss裸鼠来自charlesriver实验室。研究中使用的动物的年龄(6周)和体重(20-23g)是均一的。

为了评估痘苗病毒载体在人异种移植肿瘤模型中的治疗活性，将5×10⁶人癌细胞(lovo，hct-116或oe-19)皮下(s.c.)注射到小鼠的侧腹中。当肿瘤达到70-100mm³的直径时，将小鼠以盲方式随机化并用所示的载体处理。

用1×10⁷pfu剂量的所示载体静脉内(尾静脉注射)感染一次携带已建立的s.c.lovo肿瘤的裸鼠。

用1×10⁵pfu剂量的所示载体静脉内(尾静脉注射)感染一次携带已建立的s.c.hct-116肿瘤的裸鼠。

用1×10⁶pfu或5×10⁵pfu剂量的所示载体静脉内(尾静脉注射)感染一次携带已建立的s.c.oe-19肿瘤的裸鼠。

使用卡尺每周测量肿瘤大小两次。使用公式(π/6)(长度×宽度²)以mm³计算肿瘤体积。

液相色谱-高分辨率质谱分析

该研究由“hospicescivilsdelyon”进行，用于定量人hct-116和lovo肿瘤细胞中的胞内核苷酸和核苷。样品的分析方法和制备方法描述于machon等人，2015，j.chromatogr.a.；1405：116-25和machon等，2014，anal.bioanal.chem.，406(12)：2925-41。使用的质谱仪是qexactive^tmplus(thermoficher)，一种高分辨率和orbitrap型检测器。

将涂布在t-25烧瓶中的1.5×10⁶hct-116和lovo细胞用moi为0.01的vvtk-rr-/gfp和vvtk-rr-/hcd感染，并5％co2存在下在37℃下孵育。对于hct-11636小时后和对于lovo60小时后，除去培养基并用冷pbs洗涤细胞三次，然后加入3ml冷甲醇/水(70/30，v/v)。孵育5分钟后，将上清液储存在-80℃直至分析。

在hct-116中感染后36小时和在lovo中感染后60小时评估核苷酸和核苷浓度。将胞苷和尿苷定量。

结果

病毒工程化

使用人cda兔多克隆抗体通过western印迹证实了痘苗病毒中人cda(hcd)蛋白的表达(图1)。western印迹显示vvtk-rr-/hcd在miapaca-2和lovo细胞上表达了预期的16kdacda。

vvtk-rr-表达胞苷脱氨酶在多种肿瘤模型中的抗肿瘤活性

在不同的人癌症模型中检查了vvtk-rr-表达胞苷脱氨酶作为溶瘤病毒的能力。

我们首先比较了结肠直肠lovo模型中表达gfp的双缺失病毒和表达cdd1的双缺失病毒的溶瘤活性，结肠直肠lovo模型是对痘苗病毒溶瘤作用很弱的模型。给携带lovo肿瘤的小鼠i.v.注射1×10⁷pfu的两种病毒。如图2中所示，与对照组(单独的载体)相比，单次i.v.注射vvtk-rr-/gfp导致肿瘤生长的抑制。此外，表达胞苷脱氨酶的病毒的抗肿瘤活性显著优于表达标记基因gfp的病毒的抗肿瘤活性，表明酵母胞苷脱氨酶基因提高了溶瘤痘苗病毒的治疗功效。

为了进一步表征vvtk-rr-/cdd1的抗肿瘤功效，我们在对vv溶瘤更敏感的人肿瘤模型异种移植物中测试了这种病毒与vvtk-rr-/gfp相比的溶瘤活性。两种病毒都是静脉注射一次，在hct-116和oe-19模型中分别为1×10⁵pfu和1×10⁶pfu。如图3和图4所示，在两种模型中，与对照相比，单次i.v.注射vvtk-rr-/gfp诱导了弱的抗肿瘤效果，并且这种效果通过单次i.v.注射vvtk-rr-/cdd1显着提高。

还在oe-19模型中评价了表达人胞苷脱氨酶基因(vvtk-rr-/hcd)的双缺失痘苗病毒的抗肿瘤作用。我们进行了5×10⁵pfu的vvtk-rr-/hcd和vvtk-rr-/gfp的单次i.v.注射。如图5中所示，与表达基因标记gfp的病毒相比，表达人胞苷脱氨酶基因的病毒的单次i.v.注射也导致了强烈的肿瘤生长抑制。

这些数据表明了来自不同来源(酵母和人)的胞苷脱氨酶提高了溶瘤痘苗载体的抗肿瘤活性。

vvtk-rr-表达fcu1的lovo肿瘤模型中的抗肿瘤活性

将编码的cda酶提供的抗肿瘤活性与另一种核苷库调节剂在相同背景下提供的抗肿瘤活性进行比较。这里，用于比较的产物是编码fcu1基因的tk和rr双缺失痘苗病毒(vvtk-rr-fcu1)。所谓的fcu1基因获自酵母胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶序列的融合。胞嘧啶脱氨酶是核苷库调节剂，催化5-fc前药转化为毒性5-fu。在lovo肿瘤模型评估vvtk-rr-fcu1以及vvtk-rr-对照。如图6中所示，与单独的载体相比，在没有5-fc(前药)施用的情况下单次i.v.注射vvtk-rr-或vvtk-rr-fcu1病毒导致相似的且弱的肿瘤生长抑制。这表明，没有前体药物治疗，fcu1编码的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶核苷库调节剂至少在lovo肿瘤模型中不会引起抗肿瘤作用。相反，胞苷脱氨酶表达痘苗病毒在有效抗肿瘤保护中不需要任何前药施用。

vvtk-rr-表达apobec2的体内抗肿瘤活性

我们比较了结肠直肠hct-116模型中表达gfp的双缺失病毒和表达apobec2的双缺失病毒的溶瘤活性。携带hct-116肿瘤的小鼠i.v.注射1×10⁵pfu的两种病毒。如图7中所示，与对照组(单独的载体)相比，单次i.v.注射vvtk-rr-/gfp导致肿瘤生长的抑制。此外，表达apobec2的病毒的抗肿瘤活性显著优于表达标记基因gfp的病毒的抗肿瘤活性，表明apobec2基因提高了溶瘤痘苗病毒的治疗功效。

人hct-116和lovo肿瘤细胞中的胞内胞苷和尿苷的定量。

表1：hct-116中36小时感染后胞内核苷的定量

结果表示内源性胞苷或尿苷与相应内标之间的色谱峰表面比。结果以每100万个细胞来表示。

该评估显示，在用对照或空病毒(vvtk-rr-)感染的细胞中，比率c/u的水平在1.60和1.88之间，是相似的。相比之下，用编码胞苷脱氨酶的病毒(vvtk-rr-/hcd)感染的细胞显示异常水平的c/u比率(0.204)。该低比率表明vvtk-rr-/hcd引起核苷库不平衡。

表2：lovo中60小时感染后胞内核苷的定量

结果表示内源性胞苷或尿苷与相应内标之间的色谱峰表面比。结果以每100万个细胞来表示。在vvtk-rr-/hcd感染后36小时，在lovo细胞中未检测到胞苷。

该评估显示，在用对照或空病毒(vvtk-rr-)感染的细胞中，c/u比率在2.44和2.67之间，是相似的。相比之下，在用编码胞苷脱氨酶的病毒(vvtk-rr-/hcd)感染的lovo细胞中未检测到胞苷。考虑到检测限为0.02(在本实验中检测到的最低水平的胞苷，参见表1)，c/u比率将小于0.51。这种低比率证实vvtk-rr-/hcd引起核苷库不平衡。

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