本发明属于微生物基因工程和发酵工程技术领域，具体地说，涉及一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其在生产小分子量透明质酸中的应用。
背景技术：
透明质酸是d-葡萄糖醛酸及n-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3及β-1,4糖苷键连接而成的高分子多糖类物质，又称玻尿酸。透明质酸广泛地存在于人体的各个部位，具有极其重要的生理作用，如协助水电解质的扩散转运，润滑关节，调节血管壁的通透性，促进伤口愈合等。另外，透明质酸具有极强的保湿作用，被称为理想的天然保湿因子。它是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质。透明质酸具有不同的分子量，其分布从几千到几百万道尔顿，因其分子量的不同，其性能及应用也有所不同。小分子量的透明质酸(分子量<10万)能渗入真皮，容易被人体吸收，因此主要作于保健食品，美容食品及药物载体领域；中分子量的透明质酸(10万<分子量<100万)能够紧致肌肤，因此在保湿、面膜、化妆品领域具有广泛应用；大分子的透明质酸(分子量>100万)，可以作为皮肤填充剂，在美容、医药领域具有广泛的应用。目前全球透明质酸的市场已经超过100亿美元。
目前小分子量透明质酸的生产方法主要是通过机械破碎法或者化学法，能耗和污染较大，且透明质酸的分子量难以控制，不适用规模化生产小分子量透明质酸。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种能够表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其在生产小分子量透明质酸中的应用。
本发明提供的表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌含有透明质酸酶基因。
所述透明质酸酶基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
所述透明质酸酶基因编码蛋白的氨基酸序列如seqidno.1所示。
进一步地，本发明的重组谷氨酸棒杆菌，通过以下步骤构建得到：以seqidno.2所示的基因为模板，以seqidno.3-4所示序列为引物进行pcr，扩增获得约1.6kb的hya片段，将该片段酶切后与载体进行连接，获得的重组质粒，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌即得重组谷氨酸棒杆菌。
在本发明的实施例中，是将得到的hya片段用sali/ecori进行双酶切，并与同样进行sali/ecori双酶切的pec-h36进行连接，获得的重组质粒命名为pec-hya，将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌即得重组谷氨酸棒杆菌。电击条件为电压2.5kv，电阻200ω，电容25μf(电击杯宽度为2mm)。
本发明提供了上述重组谷氨酸棒杆菌在发酵生产透明质酸酶中的应用。
所述应用是将重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中，发酵培养；所述发酵培养基1升配方为：1-3g/lofk2hpo4,1-3g/lkh2po4,1-5g/l尿素,5-30g/l(nh4)2so4,0.5-2.5g/lmgso4,100-500μg/l生物素,1-5mg/l的维生素b1,5-20mg/l的泛酸钙,5-20mg/l的feso4,1-5mg/l的mnso4,1-10mg/l的znso4,100-500μg/l的cuso4,5-20mg/l的cacl2,1-10g/l的酵母粉,1-10g/l的酪蛋白水解物，25-20mg/l的卡那霉素。
上述应用的发酵过程温度控制在28-33℃，溶氧控制在30％以上，ph控制在6.0-7.0，发酵过程流加葡萄糖使得发酵罐中葡萄糖浓度维持在5-10g/l，发酵周期36-48h。
本发明提供了一种生产小分子量透明质酸的方法，是在大分子量的透明质酸溶液中加入权利要求1-4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌的发酵上清液，通过控制反应时间，制备所需小分子量的透明质酸。
进一步地，大分子量的透明质酸溶液的浓度为20-50g/l，并加入1-5倍体积发酵上清液，30-37℃放置6-24h，制得小分子量的透明质酸。
所述发酵上清液是将重组谷氨酸棒杆菌接种于发酵培养基中，发酵培养得到；所述发酵培养基1升配方为：1-3g/lofk2hpo4,1-3g/lkh2po4,1-5g/l尿素,5-30g/l(nh4)2so4,0.5-2.5g/lmgso4,100-500μg/l生物素,1-5mg/l的维生素b1,5-20mg/l的泛酸钙,5-20mg/l的feso4,1-5mg/l的mnso4,1-10mg/l的znso4,100-500μg/l的cuso4,5-20mg/l的cacl2,1-10g/l的酵母粉,1-10g/l的酪蛋白水解物，25-20mg/l的卡那霉素。
本发明的重组谷氨酸棒杆菌能高效分泌表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌，发酵液中透明质酸酶的酶活达12000u/ml。本发明利用该重组谷氨酸棒杆菌发酵产生的透明质酸酶可以在温和的条件下将高分子量透明质酸高效酶解成低分子量的透明质酸，从而精确控制所需的分子量，且生产过程没有明显的污染，能耗小，成本低，适于规模化生产小分子量透明质酸，具有重要的工业应用前景。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。
实施例1构建高效表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌
根据水蛭的透明质酸酶的氨基酸序列，并在其前端添加了谷氨酸棒杆菌的信号肽cg1514(seqidno.5)，设计了可在谷氨酸棒杆菌中分泌表达的透明质酸酶氨基酸序列如seqidno.1所示。根据该氨基酸序列以及谷氨酸棒杆菌的密码子偏好性，设计了优化的核酸序列，如seqidno.2所示，委托青兰生物进行基因合成。以该合成的基因为模板，以hya-f(agaggtcgacatcaggagctctttatgttaaacagagtcagtcgtattg)和hya-r(actggaattcttactttttgcaggcctctaca)为引物进行pcr，扩增获得约1.6kb的hya片段。将该片段用sali/ecori进行双酶切，并与同样进行sali/ecori双酶切的pec-h36(scientificreports,2017,7:42246)进行连接，获得的重组质粒命名为pec-hya。将该质粒电转入谷氨酸棒杆菌atcc13869，获得的重组菌株命名为c.glutamicum-hya。电击条件为电压2.5kv，电阻200ω，电容25μf(电击杯宽度为2mm)。
实施例2利用重组菌发酵生产透明质酸酶
利用实施例1中所述的重组谷氨酸棒杆菌c.glutamicum-hya发酵生产透明质酸酶，其方法为：c.glutamicum-hya接种于100ml的lb液体培养基中(10g/l的蛋白胨，5g/l的氯化钠，10g/l的酵母粉，25ug/ml的氯霉素)，30℃培养16h。
将100ml的上述种子液接种于1l的发酵液培养基中，在发酵罐中进行流加培养。发酵培养基为：30g/l的葡萄糖，3g/lofk2hpo4,1g/lkh2po4,2g/l尿素,10g/l(nh4)2so4,2g/lmgso4,500μg/l生物素,5mg/l的微生物b1,10mg/l的泛酸钙,10mg/l的feso4,1mg/l的mnso4,1mg/l的znso4,200μg/l的cuso4,10mg/l的cacl2,5g/l的酵母粉,7g/l的酪蛋白水解物，25mg/l的卡纳霉素。
发酵过程温度控制在30℃，溶氧控制在30％以上，用氨水控制ph在6.0-7.0，发酵过程流加600g/l的葡萄糖使得发酵罐中葡萄糖浓度维持在5-10g/l，发酵周期48h。
取5ml48h时的发酵液离心，弃去沉淀，检测上清液中透明质酸酶的活性。检测方法如下：在1ml的体系中包含50mm的kh2po4(ph5.5)，2g/l的透明质酸，100ul的发酵上清液，37℃反应20min后检测还原糖的当量。结果显示，发酵中透明质酸酶的酶活达到12000u/ml。说明利用本发明构建的重组谷氨酸棒杆菌可以高效分泌表达有活性的透明质酸酶。
实施例3利用透明质酸酶发酵液制备低分子量透明质酸的方法
利用实施例2中包含透明质酸的发酵上清液可以高效制备特定分子量的透明质酸，方法如下：将分子量约为120万的透明质酸用50mm的kh2po4配制成20g/l的透明质酸溶液(ph5.5)，加入1倍体积的实施例二中的谷氨酸棒杆菌发酵上清液，37℃反应24h小时，每6h取样检测透明质酸的分子量，6h、12h、18h、24h时透明质酸的分子量分别为42万、12万、7万和2万。因此可以通过控制反应的时间，制备所需分子量的透明质酸。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>清华大学
<120>一种表达透明质酸酶的重组谷氨酸棒杆菌及其应用
<130>khp171119363.2
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