本发明属于合成生物学技术领域，具体地，本发明涉及系列天蓝色链霉菌高效异源表达宿主的构建与应用。
背景技术：
微生物来源的天然产物具有广泛的生物学活性，在医学、动物保健和植物保护等领域发挥着十分重要的作用。伴随大规模的微生物基因组和宏基因组测序，大量的次级代谢产物生物合成基因簇(biosyntheticgeneclutsers，bgc)被揭示。令人惊讶的是，90％左右的基因簇在常规的实验条件下均未表达(被称之为隐性或沉默的基因簇，crypticorsilentbgcs)。这些等待挖掘的“宝贵财富”标志着我们正进入抗生素研发的第二个黄金时代。如何快速、高效获取并表达这些未知的基因簇，是目前亟需解决的关键问题之一。由于百分之九十九的微生物不可培养，而可培养的微生物中大部分也难以进行有效的遗传操作，因此开发高效异源表达宿主是十分重要而迫切的。
最近，对100种重要的微生物次级代谢产物的调查显示，其中83％是由放线菌(actinomycetes)产生的。因此，通用、高效的放线菌底盘菌的开发在新的天然产物鉴定与开发中不可或缺。天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)，作为放线菌研究的模式菌，具有生长快、遗传操作简单等优点。2011年，johninnescenter的merynbibb实验室在出发菌m145的基础上开发了新一代异源表达宿主m1146和m1152。他们首先删除了m145中四个活性的生物合成基因簇，包括放线紫红素(actinorhodin,act)、十二烷基灵菌红素(undecylprodigiosin，red)、钙依赖型抗生素(calcium-dependentantibiotic，cda)和黄色i型聚酮类化合物(yellowtypeicrypticpolyketide,ycpk)，构建出了基因组简化、代谢物谱简单的底盘菌m1146。其后，他们继续在m1146中引入了rna聚合酶β亚基的一个特定的点突变[rpob(s433l)]，提高次级代谢产物的合成能力)，构建出了第二个底盘菌m1152。过去几年里，多种不同结构类型的天然产物合成基因簇在m1146和m1152中均实现了成功表达。不过，这些天然产物异源表达的产量还是很低，有时不能满足新化合物的鉴定和/或组合生物合成的研究。
因此，十分必要开发在m1146或m1152的基础上开发更为高效的表达宿主。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一系列天蓝色链霉菌高效异源表达宿主，用于新的活性天然产物挖掘、组合生物合成研究和重要药物的产量优化。
本发明第一方面提供经基因工程改造的天蓝色链霉菌，所述天蓝色链霉菌的基因组中含有2个以上attb位点，例如含有2～5个或2～4个attb位点。
在一个或多个实施方案中，相邻两个attb位点之间间隔500kb以上。
在一个或多个实施方案中，所述attb位点存在于所述天蓝色链霉菌的被删除的基因簇的位置上。
在一个或多个实施方案中，所述天蓝色链霉菌的基因组中被删除的基因簇选自：放线紫红素(act)、十二烷基灵菌红素(red)、钙依赖型抗生素(cda)和黄色i型聚酮类化合物(ycpk)的生物合成基因簇。
在一个或多个实施方案中，所述天蓝色链霉菌的rna聚合酶β亚基中存在s433l突变。
在一个或多个实施方案中，所述天蓝色链霉菌是天蓝色链霉菌m1146或m1152，在其基因组中被删除的放线紫红素(act)、十二烷基灵菌红素(red)、钙依赖型抗生素(cda)和黄色i型聚酮类隐性化合物(ycpk)的生物合成基因簇位置中的1～4个位置中存在所述attb位点。
在一个或多个实施方案中，在被删除的放线紫红素(act)、十二烷基灵菌红素(red)、与黄色i型聚酮类隐性化合物(ycpk)的生物合成基因簇位置中的1个、2个或3个位置中存在所述attb位点。
在一个或多个实施方案中，在所述一个或多个attb位点插入了天然产物合成基因簇。
在一个或多个实施方案中，所述天然产物选自：氯霉素、ym-216391、埃博霉素和多杀菌素。
本发明第二方面提供一种提高天蓝色链霉菌基因簇多拷贝插入效率的方法，所述方法包括在所述天蓝色链霉菌基因组中插入attb位点，使所获得的天蓝色链霉菌的基因组含有2个以上attb位点、例如2～5个或2～4个attb位点的步骤。
在一个或多个实施方案中，相邻两个attb位点之间间隔500kb以上。
在一个或多个实施方案中，在所述天蓝色链霉菌的被删除的基因簇的位置引入所述attb位点。
在一个或多个实施方案中，所述天蓝色链霉菌的基因组中放线紫红素(act)、十二烷基灵菌红素(red)、钙依赖型抗生素(cda)和黄色i型聚酮类隐性化合物(ycpk)的生物合成基因簇被删除，并在1～4个所述被删除的基因簇的位置上插入attb位点。
在一个或多个实施方案中，所述天蓝色链霉菌的rna聚合酶β亚基中存在s433l突变。
在一个或多个实施方案中，所述天蓝色链霉菌是天蓝色链霉菌m1146或m1152，在其基因组中被删除的放线紫红素(act)、十二烷基灵菌红素(red)、钙依赖型抗生素(cda)和黄色i型聚酮类隐性化合物(ycpk)的生物合成基因簇位置中的任意1～4个位置上引入attb位点。
在一个或多个实施方案中，在被删除的放线紫红素(act)、十二烷基灵菌红素(red)和黄色i型聚酮类隐性化合物(ycpk)的生物合成基因簇位置中的1个、2个或3个位置中插入attb位点。
在一个或多个实施方案中，使用crispr/cas9系统将attb位点插入所述天蓝色链霉菌中。
本发明第三方面提供一种天然产物的制备方法，所述方法包括：
(1)在本发明的天蓝色链霉菌的2个或2个以上attb位点插入该天然产物的合成基因簇；和
(2)使用步骤(1)所获得的插入了天然产物合成基因簇的天蓝色链霉菌进行发酵以生产所述天然产物。
在一个或多个实施方案中，所述天然产物选自：氯霉素、ym-216391、埃博霉素和多杀菌素。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：天蓝色链霉菌高效异源表达宿主构建策略(a)和遗传鉴定(b)。其中，m表示1kbdnaladder。(a)中左图中的三角形表示该菌天然(native)存在的attb位点，中图
图2：氯霉素生物合成基因簇多拷贝插入效率的系统鉴定。其中，m表示1kbdnaladder。
图3：抗癌小分子ym-216391生物合成基因簇多拷贝插入效率的系统鉴定。其中，m表示1kbdnaladder。
图4：氯霉素和ym-216391在天蓝色链霉菌m1152-m1452中异源表达。(a)氯霉素和ym-216391化学结构式；(b)含有不同基因簇拷贝的工程菌ym-216391发酵产量；(c)含有不同基因簇拷贝的工程菌对应基因簇的转录分析。
图5：ym-216391在天蓝色链霉菌m1146-m1446中异源表达。(a)含有不同基因簇拷贝的工程菌ym-216391发酵产量；(b)含有不同基因簇拷贝的工程菌ym-216391合成基因簇的转录分析。
具体实施方式
发明人发现天蓝色链霉菌m1146和m1152不能有效地满足新化合物的挖掘或组合生物合成的研究，因此对其菌株进行了改造。通过在其原有删除的基因簇的位点引入不同数目的attb位点，构建了一系列可一次实现目标基因簇多拷贝扩增的底盘菌m1246-m1546与m1252-m1552。通过增加基因簇拷贝数目，从而提高了目标产物的产量。
基于上述发现，本发明提供一种提高天蓝色链霉菌基因簇多拷贝插入效率的方法，该方法包括在所述天蓝色链霉菌基因组中引入attb位点的步骤。通常，引入attb位点后，所构建得到的天蓝色链霉菌的基因组中可含有2个以上attb位点，例如可含有2～5个或2～4个attb位点。对attb位点的插入位置并无特殊限制。此外，相邻的两个attb位点之间通常间隔500kb以上。
本发明中，天蓝色链霉菌(streptomycescoelicolor)可以是本领域周知的各种天蓝色链霉菌。优选的是，本发明使用的天蓝色链霉菌是敲除了部分基因簇的天蓝色链霉菌。被敲除的基因簇包括但不限于生物合成基因簇，如放线紫红素、十二烷基灵菌红素、钙依赖型抗生素和黄色i型聚酮类隐性化合物(ycpk)中的一个或多个。优选的是，本发明使用的天蓝色链霉菌是本领域放线菌研究中常用的模式菌。在某些实施方案中，本发明使用的天蓝色链霉菌是天蓝色链霉菌m1146或m1152。其中，天蓝色链霉菌m1146中放线紫红素、十二烷基灵菌红素、钙依赖型抗生素和黄色i型聚酮类隐性化合物的生物合成基因簇被删除，且含有一个attb位点。天蓝色链霉菌m1152是在天蓝色链霉菌m1146的基础上在rna聚合酶β亚基中引入s433l突变。
换言之，在某些实施方案中，本发明的方法是在天蓝色链霉菌m1146或m1152中引入一个或多个人工attb位点，例如1～4个、1～3个、2～5个或2～4个人工attb位点。应理解，本文所述的“人工attb位点”是指新插入/引入的attb位点，不包括亲本天蓝色链霉菌天然存在或先前已插入的attb位点。
本发明中，attb位点指细菌染色体上噬菌体整合酶的整合位点，包括但不限于本领域周知的以下类型的attb位点：φc31attb位点、φbt1attb位点、r4attb位点、tg1attb位点和sv1attb位点。在某些实施方案中，所述φc31attb位点、φbt1attb位点、r4attb位点、tg1attb位点和sv1attb位点分别如下所示：
φc31attb：
cggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactccacc(seqidno:54)；
φbt1attb：
ctgccgtccttgaccaggtttttgacgaaagtgatccagatgatccagctccacaccccgaa(seqidno:55)；
r4attb：
agttgcccatgaccatgccgaagcagtggtagaagggcaccggcagacac(seqidno:56)；
tg1attb：
gatcagctccgcgggcaagaccttctccttcacggggtggaaggtc(seqidno:57)；
sv1attb：
ttcatcagggcggtcaggccgtagatgtggaagaacggcagcacggcgaggacgc(seqidno:58)。
应理解的是，考虑到不同类型attb位点的作用相同，因此各种类型的attb位点均可用于外源dna的整合。为了实现一次接合转移插入多个外源基因或基因簇，优选的是所引入的多个attb位点为同一类型。在这种情况下，若亲本天蓝色链霉菌先前已插入了attb位点或存在天然的attb位点，优选的是，新引入的attb位点与亲本天蓝色链霉菌原本已存在的attb位点(已插入或天然存在的attb位点)属于同一类型的attb位点，或具有相同的核苷酸序列；或者，新引入的attb位点也可与亲本天蓝色链霉菌原本已存在的attb位点类型不同，但通常优选的是新引入2个以上相同类型或序列相同的attb位点。在某些实施方案中，如还需插入更多的外源基因或基因簇，可以考虑引入多个(例如2～5个或2～4个)其他同一类型的attb位点，以次类推。在某些实施方案中，本发明天蓝色链霉菌所含的attb位点均为φc31attb位点。
通常，基因工程改造后，本发明的天蓝色链霉菌中所含的attb位点(包括改造前天然已存在的attb位点)为至少2个，至少3个，至少4个，例如2、3、4、5或更多个。
通过在天蓝色链霉菌中引入attb位点后，本发明可利用位点特异性重组方法将外源质粒整合到本发明的天蓝色链霉菌中。“位点特异性重组”是指由噬菌体整合酶促进质粒中attp位点与基因组attb位点的重组，介导外源质粒整合至天蓝色链霉菌染色体的过程。
外源质粒通常用于将表达目的产物的基因或基因簇整合到天蓝色链霉菌的染色体中。这些目的产物可以是任何感兴趣的蛋白质，例如酶、抗体或其它功能分子。或者，目的产物的表达可促进目的天然产物的合成。目的天然产物可以是本领域感兴趣的小分子化合物，如药物分子，例如氯霉素、ym-216931(其分子式如图4所示)、埃博霉素和多杀菌素。因此，目的产物的基因可以是该目的产物生物合成的基因或基因簇。
可采用本领域周知的方法引入所述attb位点。在某些实施方案中，可利用本领域周知的crispr/cas9系统将attb位点插入所述天蓝色链霉菌中。
优选的是，attb位点插入到被删除的基因簇的位置上。例如，在某些实施方案中，当工程改造天蓝色链霉菌m1146或m1152时，可在其基因组中被删除的放线紫红素、十二烷基灵菌红素、钙依赖型抗生素和黄色i型聚酮类隐性化合物的生物合成基因簇的任意1、2、3、4个位置上引入1、2、3或4个attb位点。
在某些实施方案中，在无抗性ms培养基中培养正确转入attb位点的菌株2-3代，以除去所转入的敲除载体。
因此，本发明提供一种经基因工程改造的天蓝色链霉菌，所述天蓝色链霉菌的基因组中含有2个以上attb位点，例如含有2～5个或2～4个attb位点。优选地，所述经基因工程改造的天蓝色链霉菌中，相邻的两个attb位点之间间隔500kb以上。对所述attb位点的插入位置并无特殊限制，但在某些实施方案中，所述attb位点优选存在于所述天蓝色链霉菌的被删除的基因簇的位置上。这些基因簇包括但不限于放线紫红素(act)、十二烷基灵菌红素(red)、钙依赖型抗生素(cda)和黄色i型聚酮类隐性化合物(ycpk)的生物合成基因簇。在某些实施方案中，本发明的天蓝色链霉菌的rna聚合酶β亚基中存在s433l突变。
在进一步的实施方案中，本发明的经基因工程改造的天蓝色链霉菌是基因工程改造天蓝色链霉菌m1146或m1152而获得的。在这些实施方案中，在天蓝色链霉菌m1146或m1152的基因组中再插入1、2、3或4个attb位点，从而构建得到本发明的经基因工程改造的天蓝色链霉菌。优选的是，在这些实施方案中，在天蓝色链霉菌m1146或m1152基因组中被删除的放线紫红素、十二烷基灵菌红素、钙依赖型抗生素和黄色i型聚酮类隐性化合物的生物合成基因簇位置中的1～4个位置中插入所述attb位点。更优选地是，在被删除的十二烷基灵菌红素、放线紫红素和黄色i型聚酮类隐性化合物的生物合成基因簇位置中的1个、2个或3个位置中存在所述attb位点。
本发明经基因工程改造的天蓝色链霉菌中还可在所述一个或多个attb位点上插入了天然产物的合成基因或合成基因簇。例如，所述天然产物可以是任何感兴趣的天然产物，可以是具有药学活性的天然产物，也可以是具有工业生产价值的天然产物，如酶、抗体或其它功能分子。例如，可插入氯霉素、ym-216391、埃博霉素和/或多杀菌素的合成基因。
可利用本发明的经基因工程改造的天蓝色链霉菌来生产感兴趣的天然产物。例如，可通过发酵本发明的在2个或2个以上attb位点插入了感兴趣的天然产物的合成基因的天蓝色链霉菌，从而生产所述天然产物。可使用常规的发酵天蓝色链霉菌的培养基和发酵条件来进行本发明的发酵。例如，发酵可在液体gym培养基中进行。通常，以1升的gym培养基计，其通常含有3～6g葡萄糖，3～6g酵母粉，8～12g麦芽提取物，0.5～1.5g蛋白胨，0.8～1.2gnacl，ph通常为7.2±0.2。通常在30±2℃和200±50rpm的条件下发酵一段时间。发酵可以是连续发酵或分批发酵，这可根据实际生产情况来确定。发酵之前可先在ms培养基中培养本发明的天蓝色链霉菌，以获得足量的新鲜菌体，然后在2×yt培养基中进行种子液的发酵。1l的ms培养基可采用15～25g黄豆饼粉、15～25g甘露醇、15～25g琼脂粉和1l蒸馏水配制。而1l的液体2×yt培养基通常含有14～18g蛋白胨、8～12g酵母粉和4～6gnacl。可在30±2℃和200±50rpm的条件下进行种子液发酵，时间通常为5～12h。
发酵结束后，可采用本领域周知的方法从发酵液中分离出感兴趣的天然产物。
通过在基因组中提前引入更多的attb位点，本发明开发了一系列新一代的异源表达底盘菌。这些表达宿主可以一步实现次级代谢产物生物合成基因簇多个拷贝的整合，从而显著提高了目标产物的产量。利用目标基因簇的快速扩增，将加快新的活性天然产物的挖掘与组合生物合成的研究。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明使用的菌株、质粒与试剂：
天蓝色链霉菌streptomycescoelicolorm1146和m1152为本领域常规的streptomycescoelicolorm1146和m1152，可参见gomez-escribano,j.p.和bibb,m.j.，(2011)engineeringstreptomycescoelicolorforheterologousexpressionofsecondarymetabolitegeneclusters，microb.biotechnol.4，207-215。
本发明中使用的dna胶回收纯化以及质粒提取试剂盒购自axygen公司，e.z.n.a.
本发明使用的培养基：
1、液体lb培养基(1l)
蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，蒸馏水1l；121℃灭菌20分钟。
2、固体lb培养基(1l)
蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，琼脂粉20g，蒸馏水1l；121℃灭菌20分钟。
3、固体ms培养基配方(1l)
黄豆饼粉20g，甘露醇20g，琼脂粉20g，蒸馏水1l；121℃灭菌20分钟。
4、固体m-isp4培养基配方(1l)
黄豆饼粉5g，甘露醇5g，淀粉5g，蛋白胨2g，酵母粉1g，nacl1g，(nh4)2so42g，k2hpo31g，caco32g，琼脂粉20g，无机盐微量元素溶液1ml，蒸馏水1l，调节ph至7.0；121℃灭菌20分钟。
5、液体2×yt培养基配方(1l)
蛋白胨16g，酵母粉10g，nacl5g；121℃灭菌20分钟。
6、液体gym培养基配方(1l)
葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽提取物10g，蛋白胨1g，nacl1g，调节ph至7.2；115℃灭菌15分钟。
7、实验中使用的引物列表(seqidno:1－53)
注：下划线代表酶切位点，大写碱基为attb位点序列，斜体部分为grna的n(20)序列。
8、实验中使用的菌株及质粒
*jiang,y.、chen,b.、duan,c.l.、sun,b.b.、yang,j.j.和yang,s.，(2015)multigeneeditingintheescherichiacoligenomeviathecrispr-cas9system，appl.environ.microb.81，2506-2514；
**jian,x.h.、pan,h.x.、ning,t.t.、shi,y.y.、chen,y.s.、li,y.、zeng、x.w.、xu,j.和tang,g.l.，(2012)analysisofym-216391biosyntheticgeneclusterandimprovementofthecyclopeptideproductioninaheterologoushost，acschem.biol.7,646-651。
实施例1：系列天蓝色链霉菌异源高效表达宿主的构建
由于m1146与m1152中已经将4个活性的生物合成基因簇进行了敲除，所以本发明直接在其敲除的位点引入attb位点(见seqidno:54)，引入的顺序分别为已删除的ycpk、red、act和cda合成基因簇的位点(图1a)。工程菌株构建的详细步骤如下：以已删除的ycpk合成基因簇位点引入一个attb整合位点为例，首先采用引物ycpk-up-fw\rev、ycpk-down-fw\rev与ycpk-sgrna-fw\dm-sgrna-rev通过pcr扩增分别获得敲除的上下游同源臂ycpk-up、ycpk-down与靶向ycpk的grna表达元件ycpk-sgrna，然后采用ycpk-up-fw与sgrna-rev为引物，以上述三个pcr产物为模板，以overlappingpcr扩增的方式获得ycpk-up-down-sgrna，然后采用spei与hindiii酶切，连接至采用相同限制性内切酶酶切的载体pkccas9(huang,h.、zheng,g.s.、jiang,w.h.、hu,h.f.和lu,y.h.，(2015)one-stephigh-efficiencycrispr/cas9-mediatedgenomeeditinginstreptomyces，acta.biochim.biophys.sin.47，231-243)中，最终获得ycpk靶向敲除载体pkccas9-ycpk。其中，attb位点已经添加在引物至ycpk-down-fw中。采用m-isp4培养基，pkccas9-ycpk接合转移至底盘菌m1146或m1152中，长出的菌落采用id-ycpk-fw与id-ycpk-rev进行pcr鉴定与测序。结果正确的菌株在无抗性ms培养基中培养2-3代丢掉质粒pkccas9-ycpk，获得工程菌m1246或m1252。
在已删除的red、act与cda合成基因簇位点引入attb整合位点类似，以m1246或m1252为出发菌引入第2个attb位点获得m1346或m1352，以m1346或m1352为出发菌敲除引入第3个attb位点获得m1446或m1452，以m1446或m1452为出发菌敲除引入第4个attb位点获得m1546或m1552。引物序列如下表1所示。
通过上述高效的cripsr/cas9基因组编辑方法，本发明总共构建了8株含有不同数目attb位点的底盘菌，分别为m1246、m1346、m1446、m1546与m1252、m1352、m1452和m1552，并通过pcr鉴定与测序进行了最终确认(图1b)。这些可一步实现目标基因簇多拷贝扩增的底盘菌，将加快新的天然产物的挖掘，以及组合生物合成开发新的衍生物。
实施例2：氯霉素和ym-216391合成基因簇插入效率的系统鉴定
为了探究上述8株底盘菌是否可有效实现外源次级代谢产物合成基因簇的扩增，本发明选取了氯霉素与一种抗癌小分子ym-216391合成基因簇进行鉴定(基因簇分别位于粘粒pah91与pst85中)。利用接合转移，分别将它们导入了m1152-m1552中。除了导入m1552时没有接合子外，其他均有10个以上的接合子长出。随着拷贝数的增多，接合子数量逐渐减少。我们从中随机挑取了10个进行多拷贝插入效率的鉴定，实验重复两次。结果显示，两种基因簇均可高效地整合至m1252-m1452中，效率为80％-100％，一步最多插入4个拷贝(图2和3，表2)。
表2：pah91与pst85整合至m1252-m1552的插入效率鉴定
注：nd表示未检测到。
实施例3：氯霉素和ym-216391在m1152-m1452中异源表达测试
通过有效插入氯霉素和ym-216391合成基因簇至m1152-m1452中，我们获得了含有不同基因簇拷贝数的工程菌。具体发酵过程如下所述：在ms培养基中获得足量的新鲜菌体后，转移至2×yt培养基中30℃，200rpm培养7-10h后，将培养液直接转移至gym培养基中30℃，200rpm培养，每隔1天取样。
发酵结果显示，随着拷贝数的增加，两种化合物的产量也逐渐提高。在发酵第5天，m1452/pah91(含有4个氯霉素合成基因簇)氯霉素产量达到最大值(110.4mg/l)，相对m1152/pah91(含有1个氯霉素合成基因簇，其氯霉素产量为36.3mg/l)提高2倍。同时，m1452/pst85(含有4个ym-216391合成基因簇)也合成了最高水平的ym-216391(36.4mg/l)，相对m1152/st85(含有1个ym-216391合成基因簇，其产量为3.3mg/l)提高了10.2倍。
与此同时，我们也对这些工程菌中基因簇的转录水平进行了分析，结果显示，随着拷贝数的增加，基因簇中所选取的基因的转录水平均有显著提升(图4)。
这些结果表明，我们构建的异源表达宿主，可以快速实现目标基因簇多拷贝扩增，通过增加结构基因的转录水平，大幅提高目标产物的产量。
实施例4：ym-216391在m1146-m1446中异源表达测试
与此同时，我们也将ym-216391合成基因簇导入了m1146-m1446中进行了检测。具体发酵结果参照实施例3。
发酵结果显示，随着拷贝数的提高，ym-216391的产量也相应增加，其中m1446/pst85的ym-216391产量最高(12.1mg/l)，相对m1146/pst85(0.5mg/l)提高22.8倍。
我们也对这些工程菌中ym-216391合成基因簇的转录水平进行了分析，结果显示，随着拷贝数的增加，基因簇中所选取的基因的转录水平均有明显提升(图5)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>系列天蓝色链霉菌高效异源表达宿主的构建与应用
<130>166764
<160>58
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>54
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<213>人工序列
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<210>6
<211>29
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<213>人工序列
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<211>19
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<213>人工序列
<220>
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<213>人工序列
<220>
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<213>人工序列
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<223>引物
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<213>人工序列
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tagaaatactcaaaaaaagcaccgactcgg90
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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tggtcaccgtctccatggtcatgt24
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catgacgcaacgcgaagaagagct24
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<213>人工序列
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ctgcctggtgggcgacgtca20
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acggacagggtgtcggcgagca22
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gtcacgtacgcggaactcct20
<210>41
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>41
caccacgacgttccggtcga20
<210>42
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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acctggacctacgaggagct20
<210>43
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>43
tgcacggcgtggctgcgcat20
<210>44
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>44
acaggcgtcgaccttcgaca20
<210>45
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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acccggtgcatgccgtcgat20
<210>46
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>46
gaacatcatgaccgctgag19
<210>47
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>47
tcgtcggcggcgacgtcca19
<210>48
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>48
atggcgcgctacgtcatcag20
<210>49
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>49
agcgggaagctgtaggtgtg20
<210>50
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>50
tgcgcgaccgactcgcggacct22
<210>51
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>51
tccagggatcggtgaccaca20
<210>52
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>52
agtcccggtcagctgcaatg20
<210>53
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>53
catcgcagctcgagccgta19
<210>54
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>φc31attb位点
<400>54
cggtgcgggtgccagggcgtgcccttgggctccccgggcgcgtactccacc51
<210>55
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<213>人工序列
<220>
<223>φbt1attb位点
<400>55
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aa62
<210>56
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>r4attb位点
<400>56
agttgcccatgaccatgccgaagcagtggtagaagggcaccggcagacac50
<210>57
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>tg1attb位点
<400>57
gatcagctccgcgggcaagaccttctccttcacggggtggaaggtc46
<210>58
<211>55
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<213>人工序列
<220>
<223>sv1attb位点
<400>58
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