OSTN基因作为猪免疫性状的分子标记及其应用的制作方法

本发现属于猪的分子标记筛选技术领域，具体涉及ostn基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。

背景技术：

养猪业在我国畜牧业中占据重要的位置，近年来不但培育出具有地方特色且生产性能优秀的品种或品系，而且通过引进外种猪加速猪品质的遗传改良，促进了我国养猪业的发展。随着集约化生产模式的普及，疫病问题接踵而至，主要表现在对某些疫病的控制能力弱，疾病检测、诊断、预防和扑灭等环节处理不当。因此，疾病问题是影响养猪产业发展的关键因素之一。生猪养殖过程中疾病的爆发可直接导致生猪的死亡，出栏率降低，进而影响生猪养殖的经济效益。而为了预防疾病而大量使用药物增加了养殖成本和药物残留，残留的药物破坏了生态环境。尤其是抗生素的滥用不仅导致病菌出现耐药性增加了养殖场疾病防治的难度，而且威胁猪肉的品质安全，造成食品存在安全隐患。因此，在生猪养殖过程中的疾病防控，直接关系到这一产业的发展和猪肉食品市场。尽量避免大量使用药物，寻找抗病新策略，从培育抗病品系入手，是改善养猪行业行情的热门研究方向。

免疫力与抗病力密切关联，抗病力能够体现机体对疾病的整体防御能力，而免疫指标可代表机体的免疫功能状态，间接反映机体的抗病能力，因此可将免疫指标作为抗病能力的选择指标。研究表明免疫与生长存在负相关(唐国庆等,猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医,2002,29(6):29-32；严燕等,猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学,2007,6:58-61.)，而用于检测免疫指标的因子在中外猪种中存在显著差异(刘筱等,猪toll样受体4基因(tlr4)外显子snp检测及生物信息学分析.江苏农业学报,2011,27(4):782-789；董文华等,猪cd14基因多态性及其对部分免疫指标的遗传效应分析.中国畜牧杂志,2014,50(13):1-5.)。因此可以筛选与免疫性状关联的基因作为检测免疫性状的遗传标记。

骨泌素(osteocin:ostn)基因是thomas(thomas等,osteocrin,anovelbone-specificsecretedproteinthatmodulatestheosteoblastphenotype.jbiolchen,2003,278:50563-50571.)于2003年在小鼠胚胎和新生小鼠颅盖骨内发现，与2004年日本学者nishzawa(nishizawah等,musclin,anovelskeletalmuscle-derivedsecretoryfactor.jbiolchen,2004,279:19391-19395.)等人在小鼠骨骼肌中检测到的musclin基因为同一基因所编码，只是存在时空性表达差异，因此ostn基因又被称为musclin基因。大量文献报道，musclin基因与机体疾病和生长密切相关。musclin可能通过葡萄糖转运体-4(glucosetransporters-4,glut-4)基因参与调控骨骼肌的胰岛素抵抗(insulinresistance,ir)，并且与glut-4基因的表达呈负相关，在高脂饮食wistar大鼠腓肠肌中musclin的表达量上调，glut-4表达下调(曹玲玲等,长期高脂饲养大鼠骨骼肌musclin表达上调及其与胰岛素抵抗的相关性.中华内分泌代谢杂志,2009,25:208-209.)。对分化的c2c12细胞的研究发现，musclin基因可能会通过抑制glut-4蛋白的活性而抑制了细胞葡萄糖的摄取(liu等,musclininhibitsinsulinactivationofakt/proteinkinasebinratskeletalmuscle.jintmedres,2008,36:496-504.)。在小鼠体内过表达musclin蛋白可以减少小鼠肥胖症的发生(nishizawah等,musclin,anovelskeletalmuscle-derivedsecretoryfactor.jbiolchen,2004,279:19391-19395.)，而在肥胖kay小鼠和db/db小鼠的腓肠肌中该基因的表达量上升，因此推测musclin基因可能是调控脂肪和肌肉的一个连接因子。在猪中关于musclin基因的研究则表明，该基因在猪脂肪组织中大量表达且随着猪生长阶段的不同而表现出差异，并且该基因可以通过抑制脂肪的生成来实现降低脂肪的目的(sun等,thepotentiallipolysisfunctionofmusclinanditsmrnaexpressionbothinpigadiposetissueandprimaryadipocyte.afrjbiotech,2009,8:6457-6463.)。研究表明musclin与炎症因子相关，在离体大鼠骨骼肌中，musclin基因通过nf–кb通路限制肌细胞对葡萄糖的摄取，同时骨骼肌中nf–кb和il-6表达量升高(刘英等,肌肉素干预大鼠骨骼肌葡萄糖摄取与nf–кb的相关性.同位素,2007,20(4):206-208.)。综上所述，ostn基因对机体的免疫和生长具有重要的影响。

本发明申请中，申请人分析了ostn基因的第1内含子片段，鉴定了一个与猪免疫性状密切相关的功能突变位点，为猪免疫性状的标记辅助选择提供了新的snp分子标记。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供ostn基因片段作为猪免疫性状的分子标记及应用。本发明通过pcr扩增ostn基因第1内含子片段，利用sequenomsnp技术，在杜洛克×二花脸f2代猪群体中进行分型，分型结果与该群体的免疫指标关联分析，进而鉴定获得与猪免疫性状相关的分子标记，为猪的抗病育种提供了新的分子标记资源和应用。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过基因克隆的方法，得到ostn基因第1内含子片段，其序列如表序列表seqidno：1所述。具体如下所述：

ggccaccacacataactttgcttctgacccacccacrttccctggcttccctatggtcccactttggaggttgcatt，

上述序列的37bp碱基处的r是a或t，该突变导致sequenomsnp分型多态性。

该基因片段可以作为检测与猪免疫性状相关的分子标记。

申请人提供了一种检测如序列表seqidno:1所述的分子标记的引物对(即扩增ostn基因第1内含子序列的引物对)，该引物对的正、反向引物起始处(即下划线所示的序列)各包含10bp的序列标签，该引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：5’-acgttggatgggccaccacacataactttg-3’

反向引物：5’-acgttggatgaatgcaacctccaaagtggg-3’。

申请人提供了一种检测如序列表seqidno：1所述的分子标记的用于基因分型的延伸引物组合，该引物组合的核苷酸序列如下所示：

引物1：5’-ttctgacccacccac-3’；

引物2：5’-ttctgacccacccaca-3’；

引物3：5’-ttctgacccacccact-3’。

一种筛选猪免疫性状的分子标记的方法，其步骤如下：

①提取猪耳朵组织基因组dna并对dna进行质量检测；

②根据snp位点序列信息，使用sequenom公司的引物设计软件assaydesign3.1，设计pcr反应和单碱基扩增引物；

③利用sequenomsnp方法进行分型检测；

④采用sas9.1软件进行基因型与猪免疫性状间的关联分析。

本发明分子标记可用于非诊断目的的猪免疫性状标记辅助选择中。

本发明筛选的分子标记可用于非诊断目的的对猪相关基因的基因型或与猪免疫性状之间的关联分析中，为猪免疫性状的分子标记辅助选择提供了一个新的分子标记资源。

与现有技术相比本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外采用sequenomsnp方法检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的免疫能力，与目前的pcr-rflp、elisa、流式细胞仪等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表seqidno：1是本发明克隆的ostn基因内含子序列片段，即本发明筛选的分子标记的核苷酸序列。在该序列的37位碱基处的r存在一个a/t的等位基因突变。

序列表seqidno：2是本发明克隆ostn基因的内含子序列片段和分子标记的正向引物序列。

序列表seqidno：3是本发明克隆ostn基因的内含子序列片段和分子标记的反向引物序列。

序列表seqidno：4、seqidno：5和seqidno：6是检测序列表seqidno：1的sequenomsnp多态性的延伸引物序列。

图1：本发明的总体技术流程示意图。

图2：是本发明克隆的ostn基因的内含子序列和本发明分子标记的核苷酸序列。附图标记说明：图2中序列的37位碱基处存在一个a/t等位基因突变(37bp处的英文字母“r”为突变位点)。

图3：是本发明标记的snp位点的峰图。

具体实施方式

实施例1：基因分型检测

(1)利用苯酚抽提法提取杜洛克×二花脸f2代猪群体的耳朵组织dna

1)将杜洛克×二花脸f2代群体(广东华农温氏畜牧股份有限公司提供)的耳样组织在液氮中磨碎，加入等体积1×set(1ml)，蛋白酶k(10ng/ml)至终浓度200ug/ml，十二烷基硫酸钠(即sds，10％)至终浓度0.5％，摇匀。55℃水浴温育过夜消化。

2)将消化后的组织样加入等体积的tris饱和酚，缓慢颠倒离心管15min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清液转移至另一离心管中，标上相应记号。

3)加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25：24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温离心机中4℃、11000rpm离心10min，小心吸取上清，转移至另一个干净的离心管中。

4)加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24：1)，缓慢颠倒离心管10min，于低温冷冻离心机中4℃、11000rpm离心10min。

5)将上清液吸入标记好的的离心管中，加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，即可以看到白色絮状dna。

6)用枪头将dna沉淀挑出，置于装有对应号码的ep管中，室温下让乙醇挥发干净，加入适量的超纯水(一般300ul左右)溶解dna。

7)在dna浓度测定仪上测定其浓度与纯度，并在1％琼脂糖凝胶80伏电泳约2h，紫外灯下检测提取的dna质量。

(2)引物设计

根据snp位点序列信息，以猪ostn基因(ensssct000000011815)第1内含子序列为模板，使用sequenom公司的引物设计软件assaydesign3.1，设计pcr反应和单碱基扩增引物。

pcr扩增引物(引物序列的前10个碱基为标签序列，即下划线的所示序列)：

正向引物：5’-acgttggatgggccaccacacataactttg-3’

反向引物：5’-acgttggatgaatgcaacctccaaagtggg-3’。

pcr产物延伸引物组合：

引物1：5’-ttctgacccacccac-3’(如序列表seqidno：4所示序列对应)；

引物2：5’-ttctgacccacccaca-3’(如序列表seqidno：5所示序列对应)；

引物3：5’-ttctgacccacccact-3’(如序列表seqidno：6所示序列对应)。

(3)pcr扩增

反应体系(384孔pcr版+38％的试剂损耗)见表1。

表1pcr反应体系--1

扩增条件：94℃预变性900s，(94℃变性20s、56℃退火30s、72℃延伸60s)45个循环，72℃延伸180s，4℃终止反应。将pcr产物进行碱性磷酸酶处理。

(4)碱性磷酸酶(sap)消化：

反应体系(384孔pcr板+38％的试剂损耗)见表2。

表2pcr反应体系--2

扩增条件：37℃40min，85℃5min，4℃终止反应，将pcr产物进行延伸反应。

(5)延伸反应：

反应体系(384孔pcr板+38％的试剂损耗)见表3。

表3pcr反应体系--3

扩增条件：94℃预变性30s，{94℃变性5s，(52℃退火5s，80℃延伸5s)5个循环}40个循环，72℃延伸180s，4℃终止反应。将pcr产物进行上机检测。

(6)上机检测：

a)将反应产物(共9μl)稀释3倍，按常规方法，使用树脂进行脱盐；

b)将脱盐处理后的样品点在样品靶上，使其自然结晶；

c)上机进行质谱检测，并收集数据。

根据收集数据，统计基因型分型检测结果。基因型检测结果表明，在384个样品中检测出382个样品，检出率99.48％。其中在382个个体中aa基因型有228个个体，占59.69％；tt基因型有18个个体，占4.71％；at基因型有136个个体，占35.60％。

实施例2：ostn分子标记分型方法在猪免疫性状关联分析中的应用

(1)ostn分子标记分型结果与免疫性状关联分析

用于基因型与免疫性状关联检测分析所用的实验猪群来自广东华农温氏畜牧股份有限公司培育的杜洛克×二花脸杂交的f2代群体(为常规品种)。基因分型所用的dna由杜洛克×二花脸杂交的f2代(以下正文内容和表中的“杜洛克×二花脸杂交的f2代”简称“猪”)耳样提取，用于血常规检测和流式分析的血液采自20、33、35和80日龄的猪，其中20、33日龄的猪未接种聚肌胞(polyi:c)，第35日龄的仔猪接种聚肌胞(polyi:c)4小时后采集血样，用于elisa分析的血清也来自35日龄的猪接种聚肌胞(polyi:c)4小时后采集血样。运用固定模型统计分析ostn基因第1内含子序列snp位点的基因型效应与免疫指标的关系。

数学模型如下：y＝xβ+e

其中：y为免疫性状测定值向量；x为固定效应关联矩阵；β为固定效应参数向量，包括基因型效应、公畜效应、公畜内母畜效应；e为随机残差效应。

采用sas9.1进行统计分析，结果见表4、5。

表4ostn基因片段37a/t多态性与20日龄猪部分免疫性状的关联分析检测

表4注：p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。

表5ostn基因片段37a/t多态性与33日龄猪部分免疫性状的关联分析检测

表5注：p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著。

由表4、5可知，tt型个体20日龄的血小板数(plt)、血小板压积(pct)、血小板分布宽度(pdw)，33日龄的平均红细胞血红蛋白含量(mch)、平均血红蛋白浓度(mchc)等性状都显著高于aa或at基因型(p<0.05)；tt型个体20日龄的红细胞分布宽度性状显著低于aa型和at型(p<0.05)。因此，t等位基因对20日龄的血小板数(plt)、血小板压积(pct)、血小板分布宽度(pdw)、红细胞分布宽度(rdw)，33日龄的平均红细胞血红蛋白含量(mch)、平均血红蛋白浓度(mchc)等性状是有利的，因此选择t等位基因对猪免疫性状选择是有利的。

主要参考文献：

1.唐国庆等,猪抗病育种研究进展.中国畜牧兽医,2002,29(6):29-32.

2.严燕等,猪遗传抗性与抗病育种研究进展.猪业科学,2007,6:58-61.

3.刘筱等,猪toll样受体4基因(tlr4)外显子snp检测及生物信息学分析.江苏农业学报,2011,27(4):782-789.

4.董文华等,猪cd14基因多态性及其对部分免疫指标的遗传效应分析.中国畜牧杂志,2014,50(13):1-5.

5.thomasg,moffattp,saloisp,gaumondmh,gingrasr,godine,miaod,goltzmand,lanctotc:osteocrin,anovelbone-specificsecretedproteinthatmodulatestheosteoblastphenotype.thejournalofbiologicalchemistry2003,278(50):50563-50571.

6.nishizawah,matsudam,yamaday,kawaik,suzukie,makishimam,kitamurat,shimomurai:musclin,anovelskeletalmuscle-derivedsecretoryfactor.thejournalofbiologicalchemistry2004,279(19):19391-19395.

7.曹玲玲等,长期高脂饲养大鼠骨骼肌musclin表达上调及其与胰岛素抵抗的相关性.中华内分泌代谢杂志,2009,25:208-209.

8.liuy,huox,pangxf,zongzh,mengx,liugl:musclininhibitsinsulinactivationofakt/proteinkinasebinratskeletalmuscle.thejournalofinternationalmedicalresearch2008,36(3):496-504.

9.sunc,pengy,jiangd,zhangz:thepotentiallipolysisfunctionofmusclinanditsmrnaexpressionbothinpigadiposetissueandprimaryadipocyte.afrjbiotech,2009,8:6457-6463.

10.刘英等,肌肉素干预大鼠骨骼肌葡萄糖摄取与nf–кb的相关性.同位素,2007,20(4):206-208。

序列表

<110>华中农业大学广西扬翔股份有限公司

<120>ostn基因作为猪免疫性状的分子标记及其应用

<141>2017-10-03

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

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<212>dna

<213>猪(susscrofa)

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