本发明涉及农药的制备方法，具体地指一种l-草铵膦的生物合成制备方法。
背景技术：
草铵膦，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-dl-高丙氨酸，由赫斯特公司(现德国拜耳公司)于上个世纪80年代开发生产，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成抑制剂，非选择性触杀型除草剂，其作为除草剂获得登记使用是1984年。2004年我国才有草铵膦原药登记，2005年我国才有产品登记。
草甘膦自广泛应用以来，抗草甘膦杂草不断增加，危害逐步加重。百草枯是一种强烈的杀灭杂草除莠剂，对人畜有很强的毒性作用。2014年7月1日，我国撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产；2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。草铵膦是世界大吨位农药品种，也是世界第二大转基因作物耐受除草剂。草铵膦毒性低，较为安全，在土壤中易于降解，对作物安全，不易飘移，除草谱广，活性高，用量少，环境压力小，杀草迅速，能快速杀死100种以上的禾本科和阔叶杂草，可用水做基剂，使用安全方便，这些是该品优于其他除草剂的特点，所以这个产品在出现了众多高效超高效的产品后，依然可以畅销。
目前国内外草铵膦的合成技术路线较多，严海昌等(《农药》，2002，41(9)，46-48)做过综述报道，但各路线普遍存在反应步骤多，生产成本高的问题。拜尔公司在专利us4521348及us6359162中提出了以合成二氯甲基膦再合成甲基亚磷酸酯，经过一系列反应合成草铵膦的方法。该路线收率高、成本低，但起始路线二氯甲基膦合成原料、产物物化性质活泼，易燃易爆。合成过程处于500～600℃，如控制不稳定，容易产生极易自然的黄磷和磷化氢，危险性很大。另外，物料具有强腐蚀性，对反应设备材质选择及其加工制造工艺要求苛刻，目前国内加工制造水平难以满足生产要求。
这些方法都是制备草铵膦的方法，草铵膦为l/d混合型，其中起主要作用的是l型；l-草铵膦可在土壤中经微生物降解，而d-型草铵膦较难降解，最终可导致土壤板结。因此，l-草铵膦比较传统草铵膦更加高效、更低成本、更加安全。
因此，研发一种能提高原料利用率、降低生产成本同时避免工业化过程中的危险性的l-草铵膦的生物合成制备方法显得十分必要。
技术实现要素：
本发明所要解决的问题就是要克服背景技术的不足，提供一种l-草铵膦的生物合成制备方法，能提高原料利用率、降低生产成本，并且适合工业化生产。
本发明提供了式ii化合物l-2-氨基-4-(r基甲基膦酰基)-丁酸的生物合成制备方法，由式iv化合物2-氨基-4-(r基甲基膦酰基)-丁酰胺在酶的作用下反应制备，
其中，r选自烷基、硅烷基、硅醚保护基、苄醚保护基、烷氧基甲基、烷氧基取代甲基、c2-c10直链或支链烯烷基、c2-c10直链或支链炔烷基、3-8元脂环族基团、芳基、杂芳基、ar(ch2)n-基团中的一种，ar代表芳基、杂芳基，n取1-6，所述酶包括生物酶和辅酶。
优选地，生物酶包括酰胺消旋酶和l-酰胺水解酶，所述辅酶为磷酸吡哆醛。
进一步地，式iv化合物2-氨基-4-(r基甲基膦酰基)-丁酰胺由式i化合物2-氨基-4-(r基甲基膦酰基)-丁腈在腈水合酶的的作用下反应制备，
其中，r选i自烷基、硅烷基、硅醚保护基、iv苄醚保护基、烷氧基甲基、烷氧基取代甲基、c2-c10直链或支链烯烷基、c2-c10直链或支链炔烷基、3-8元脂环族基团、芳基、杂芳基、ar(ch2)n-基团中的一种，ar代表芳基、杂芳基，n取1-6。
进一步地，式ii化合物由式i化合物在酶的的作用下经一锅法反应制备，r的定义如上所述，所述酶包括生物酶和辅酶。其中，生物酶包括腈水合酶、酰胺消旋酶和l-酰胺水解酶，辅酶为磷酸吡哆醛。反应式如下：
本发明还提供了l-草铵膦的生物合成制备方法，当用上述方法制备好式ii化合物后，由式ii化合物脱保护基得到，
其中，r的定义如上所述。
优选地，r为乙基，控制反应体系的ph为5-8。
进一步地，腈水合酶基因包括但不限于来源于rhodococcusrhodochrous，pseudomonaschlororaphis，brevibacterium，agrohaeteriwntumefadens，myrothcciumverrucaria，corynehacterium，pseudomonasputida，pseudomonasfluorescens，nocardiasimplex，rhodococcussp，nocardiabrasiliensis，pichiapastoris，escherichiacoli；酰胺消旋酶基因包括但不限于来源于achromobacterobae，cryptococcuslaurentii，cryptococcussp，pseudomonassp，candidahumicola，achromobacter，alcaligenesfaecalis，flavobacteriumarborescenstrichosporoncutaneum，escherichiacoli；l-酰胺水解酶基因包括但不限于来源于brevundimonasdiminuta，ochrobactrumanthropi，streptomyces，bacilluscereus，comamonasacidovorans，rhodococcusrhodochrous，mycobacteriumtuberculosis，brevibacteriumsp，delftiaacidovorans，brevibacillusborstelensis，variovoraxparadoxus，escherichiacoli。
进一步地，腈水合酶为氨基酸序列为seqidno：1所示的蛋白质，或seqidno：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有腈水合酶活性的蛋白质，或与seqidno：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有腈水合酶活性的蛋白质；所述酰胺消旋酶为氨基酸序列为seqidno：2所示的蛋白质，或seqidno：2经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有酰胺消旋酶活性的蛋白质，或与seqidno：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有酰胺消旋酶活性的蛋白质；所述l-酰胺水解酶为氨基酸序列为seqidno：3所示的蛋白质，或seqidno：3经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有l-酰胺水解酶活性的蛋白质，或与seqidno：3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有l-酰胺水解酶活性的蛋白质。
进一步地，腈水合酶、酰胺消旋酶、l-酰胺水解酶的投量比控制为1︰0.8-2︰0.8-3，优选为1︰1︰1。
进一步地，酶转化反应体系中加入cocl2。
更进一步地，酶转化在溶剂中进行，溶剂为缓冲溶液，缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、tri-hcl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、mops缓冲溶液中的一种。
腈水合酶、酰胺消旋酶、l-酰胺水解酶均可为基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉或固定化酶或固定化细胞。
本发明生物转化过程中利用hplc-ms和hplc进行监控，直至底物完全利用。
本发明的优点主要体现在如下几方面：
其一，本发明工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产；
其二，本发明底物利用率高，纯化后l-草铵膦晶体纯度达到95％以上，光学纯度为99％以上；
其三，本发明催化剂包括腈水合酶、酰胺消旋酶、l-酰胺水解酶，三种酶共同作用，催化效果好，用量少，专一高效。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的液相图。
图2为l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸标准品的液相图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制。
实施例1
1、腈水合酶的制备
重组腈水合酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pet28a的ndei和xhoi酶切位点，转化宿主菌e.colibl21(de3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入e.colibl21(de3)菌株中，获得可以诱导表达重组腈水合酶的重组腈水合酶基因工程菌。
将重组腈水合酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的lb培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的tb培养基中，接种量为含卡那霉素的tb培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的iptg诱导，使iptg终浓度达到0.1mm，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞。
采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞的破碎酶液。
所得腈水合酶为氨基酸序列为seqidno：1所示的蛋白质。
2、酰胺消旋酶的制备
重组酰胺消旋酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pet28a的ndei和xhoi酶切位点，转化宿主菌e.colibl21(de3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入e.colibl21(de3)菌株中，获得可以诱导表达重组酰胺消旋酶的重组酰胺消旋酶基因工程菌。
将重组酰胺消旋酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的lb培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的tb培养基中，接种量为含卡那霉素的tb培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的iptg诱导，使iptg终浓度达到0.1mm，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞。
采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞的破碎酶液。
所得酰胺消旋酶为氨基酸序列为seqidno：2所示的蛋白质。
3、l-酰胺水解酶的制备
重组l-酰胺水解酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pet28a的ndei和xhoi酶切位点，转化宿主菌e.colibl21(de3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入e.colibl21(de3)菌株中，获得可以诱导表达重组l-酰胺水解酶的重组l-酰胺水解酶基因工程菌。
将重组l-酰胺水解酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的lb培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的tb培养基中，接种量为含卡那霉素的tb培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的iptg诱导，使iptg终浓度达到0.1mm，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶基因工程菌全细胞。
采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶基因工程菌全细胞的破碎酶液。
所得l-酰胺水解酶为氨基酸序列为seqidno：3所示的蛋白质。
实施例2
l-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1l摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液为溶剂重悬3g的来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、3g的来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、3g的来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mm，再向摇瓶中加入cocl2，cocl2的投入浓度为1mm，控制转化体系的ph值为6.5，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。转化时间为16h，转化率为99.1％。对含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。反应式如下：
步骤2：向装有纯化后的l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的烧杯中加入60g浓度为10％-37％(质量分数)的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即l-草铵膦)的溶液，纯化，得到l-草铵膦晶体，所得l-草铵膦的ee值为99.7％。1hnmr(400mhz，d2o)1.267(s，3h)，1.603～1.742(m，2h)，1.989～2.080(m，2h)，3.876～3.905(m，1h)，11.013～11.106(1h)。ms(esi)：m/z182.05[m+h]+反应式如下：
实施例3
l-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在500ml摇瓶中进行，以20g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用200ml磷酸盐缓冲溶液重悬2g的来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞，控制转化体系的ph值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min，转化至底物完全消耗完，纯化得到2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酰胺。ms(esi)：m/z209.11[m+h]+反应式如下：
步骤2：反应在500ml摇瓶中进行，以10g纯化后的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酰胺为底物，用200ml磷酸盐缓冲溶液重悬1.6g的来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、6g的来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为5mm，再向摇瓶中加入cocl2，cocl2的投入浓度为0.5mm，控制转化体系的ph值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min，转化率为88.4％。反应式如下：
步骤3：向含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，去保护基，得到含有l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即l-草铵膦)的溶液，纯化，得到l-草铵膦晶体，所得l-草铵膦ee值为99.3％。反应式如下：
实施例4
l-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在500ml摇瓶中进行，以20g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用200ml磷酸盐缓冲溶液重悬2g的来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、1.6g的来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、6g的来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为5mm，再向摇瓶中加入cocl2，cocl2的投入浓度为0.5mm，控制转化体系的ph值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min。
转化时间为18.5h，转化率为91.3％。
步骤2：向含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，去保护基，得到含有l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即l-草铵膦)的溶液，纯化，得到l-草铵膦晶体，所得l-草铵膦ee值为99.5％。
反应式如实施例2。
实施例5
l-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1l摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液重悬10g/l的来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶的基因工程菌全细胞、10g/l的来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶的基因工程菌全细胞、20g/l的来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mm，再向摇瓶中加入cocl2，cocl2的投入浓度为1mm，控制转化体系的ph值为5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为150r/min，得到含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为15.3h，转化率为98.6％。
对含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向装有纯化后的l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的烧杯中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即l-草铵膦)的溶液，纯化，得到l-草铵膦晶体，所得l-草铵膦ee值为99.6％。
反应式如实施例2。
实施例6
l-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在5l烧杯中进行，以200g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用2l磷酸盐缓冲溶液重悬20g的来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、30g的来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、16g的来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶基因工程菌全细胞，向烧杯中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mm，再向烧杯中加入cocl2，cocl2的投入浓度为1mm，控制转化体系的ph值为6，控制转化体系的温度为35℃；机械搅拌转速控制为200r/min，得到含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为17.8h，转化率为97.8％。
对含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向纯化后的l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即l-草铵膦)的溶液，纯化，得到l-草铵膦晶体，所得l-草铵膦ee值为99.6％。
反应式如实施例2。
实施例7
l-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1l摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mlmops缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和na2po4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以3g的来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、6g的来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、4.5g的来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mm，再向摇瓶中加入cocl2，cocl2的投入浓度为1mm，控制转化体系的ph值为7，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为20.7h，转化率为97.2％。
对含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向纯化后的l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即l-草铵膦)的溶液，纯化，得到l-草铵膦晶体，所得l-草铵膦晶体纯度达到96.1％，光学纯度为99.5％。
反应式如实施例2。
实施例8
l-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1l摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，以300mlmops缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和na2po4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以3g的来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞破碎酶液、3g的来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞破碎酶液、3g的来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶基因工程菌全细胞破碎酶液，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mm，再向摇瓶中加入cocl2，cocl2的投入浓度为1mm，控制转化体系的ph值为6.5，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为17.9h，转化率为97.3％。
对含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向纯化后的l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即l-草铵膦)的溶液，纯化，得到l-草铵膦晶体，所得l-草铵膦晶体纯度达到95.3％，光学纯度为99.5％。
反应式如实施例2。
实施例9
l-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1l摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mlmops缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和na2po4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以3g的来源于rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶、来源于achromobacterobae的酰胺消旋酶、来源于brevundimonasdiminuta的l-酰胺水解酶共表达的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mm，再向摇瓶中加入cocl2，cocl2的投入浓度为1mm，控制转化体系的ph值为6.5，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为18.4h，转化率为92.8％。
对含有l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向装有纯化后的l-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的烧杯中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有l-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即l-草铵膦)的溶液，纯化，得到l-草铵膦晶体，所得l-草铵膦晶体纯度达到95.9％，光学纯度为99.5％。
反应式如实施例2。
本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。
序列表
<110>武汉茵茂特生物技术有限公司
<120>l-草铵膦的生物合成制备方法
<150>2017100597054
<151>2017-01-24
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>601
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<213>rhodococcusrhodochrous
<400>1
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