本发明属于动物模型构建技术领域，具体地说，涉及一种pdgf-bb转基因小鼠脊髓全横断模型的构建方法与应用。
背景技术：
脊髓损伤(spinalcordinjury，sci)可导致严重的功能障碍和残疾，是临床常见的疾病，将给患者乃至整个社会带来沉重的负担。令人沮丧的是，虽经百余年来全世界神经科学研究者的孜孜努力，sci的治疗效果仍远不尽人意。直到1958年，liu和chambers第一次证实成年哺乳动物cns损伤后仍有可塑性后，才使人们重新将目光真正聚焦到cns(包括脊髓)损伤后的再生修复问题上来。
许多研究表明，脊髓具有可塑性，这种可塑性表现为神经环路遭到破坏时，附近未受损伤的神经纤维可以在一定程度上发生侧枝出芽，以代替邻近溃变的轴突，形成新的轴突联系。如今，大量研究证实：哺乳动物外周神经系统之所以远比cns有更强的再生能力，原因之一即为cns缺乏为其自身损伤提供足够营养支持的能力，而营养支持主要来源之一为神经营养因子(neurotrophicfactors，ntfs)。ntfs在中枢神经系统发育、存活、功能维持方面起着十分关键的作用，并具有促进损伤神经元修复和重建突触的作用。然而，近年来随着研究的不断深入，也有文献指出：一些神经营养因子(neurotrophicfactors:ntfs)在神经损伤修复过程中可能具有双重作用。在先前的研究报道中证实了睫状神经营养因子(cilliaryneurotrophicfactor，cntf)具有促进损伤神经元存活、促进内源性神经祖细胞增殖分化的作用，从而扮演了有利于损伤神经元修复的角色，然而，近年的研究发现，在脊髓损伤的急性期，cntf可引起星形胶质细胞的增殖和肥大，而后形成疤痕阻碍轴突再生。由此看来，cntf在脊髓损伤中扮演了双重角色，一方面促进神经元存活，另一方面阻碍损伤轴突向远端生长。类似的在sci损伤修复中发挥双向作用的ntfs还有转化性生长因子-α和-β(transforminggrowthfactor-α、-β，tgf-α、-β)。近年来，血小板源性生长因子(platelet-derivedgrowthfactorbb，pdgf-bb)在脊髓损伤中的作用也得到了关注。
pdgf-bb是由多种细胞合成和分泌的多功能蛋白，pdgf-bb及其受体pdgf-r-β在中枢神经系统(centralnervoussystem，cns)神经元和胶质细胞广泛表达。pdgf-bb与pdgf-r-β结合后可诱导一系列生物学效应，如dna合成、细胞的增殖和分化、细胞因子的趋化作用和细胞凋亡。作为ntf的主要成员之一，与其它细胞因子一样，pdgf-bb起始信号是通过酪氨酸磷酸化依赖通路发出，然后激活多种细胞内分子来发挥作用。首先，pdgf-bb与细胞膜上的酪氨酸激酶受体pdgfr-β结合，使酪氨酸受体的残基发生磷酸化。这些磷酸化的酪氨酸受体残基可为其下游的一组蛋白质提供结合位点。从而激活这些蛋白或者酶的活性。这些蛋白质包括src同源区2结构域(sh2)，如磷脂酶c-γ(plcγ)，src，原位磷酸3'激酶(pi3k)，ras-gap等。与其它细胞因子受体相似，pdgfr-β还激活多种jak家族激酶和stat家族蛋白质(jak-stat)。因此，pdgf-bb不仅在正常生理情况下，而且可能在病理条件下对cns起作用。虽然已证明pdgf-bb可保护损伤的神经元免受死亡和促进胶质细胞有丝分裂，但其在cns损伤中的具体作用及其潜在的机制仍不清楚，也鲜有报道涉及，特别是对于脊髓全横断损伤(sct)后尤为如此。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种pdgf-bb转基因小鼠脊髓全横断模型的构建方法与应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种pdgf-bb转基因小鼠脊髓全横断模型的构建方法，包括以下步骤：
1)构建转基因小鼠，所述转基因小鼠包括pdgf-bb全身过表达小鼠和pdgf-bb全身低表达小鼠；
2)麻醉步骤1)制备得到的转基因小鼠，俯卧位固定，备皮，剪开背部皮肤、筋膜及肌肉层，咬骨钳去除椎板，逐层显露t9-t11节段脊髓，于t10水平横断，用1mm直径的细绳穿过损伤平面以确保脊髓全横断；操作成功后即观察到小鼠出现尾部及四肢抽动；术毕，止血，逐层缝合；脊髓t10水平成功横断的小鼠表现为术后双下肢瘫痪、无自主运动，排尿放射消失、双下肢疼温觉消失。
进一步地，所述pdgf-bb全身过表达小鼠通过以下方法制备得到：
步骤1、构建pdgf-bb转基因片段，体外鉴定pdgf-bb的过表达效率；
步骤2、将构建好的转基因片段线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；并用pcr鉴定阳性转基因鼠；
步骤3、运用rt-pcr及westernblot技术筛选出pdgf-bb最高及最低表达的品系，建立稳定的pdgf-bb过表达小鼠。
进一步地，所述步骤1中的构建pdgf-bb转基因片段，体外鉴定pdgf-bb的过表达效率具体为：
步骤1.1、pcr克隆扩增目的基因pdgf-bb的开放读码框(orf)，扩增引物序列如下：
上游引物为5′cgctcctttgatgatctcc3′，其核苷酸序列如seqidno.1所示；
下游引物为5′ttggtgcggtctatgagg3′，其核苷酸序列如seqidno.2所示，目的片段230bp；
步骤1.2、构建pcdna3.1(+)-h-pdgf-bb质粒，经过酶切、dna片段回收、连接反应用内切酶ecori与xhoi酶切pcdna3.1(+/-)vector载体和插入的目的片段pdgf-bb的orf；
步骤1.3、将构建好的质粒载体转入菌种进行dna的提取，通过大量制备质粒dna，电泳、用qiagendna凝胶回收试剂盒回收dna片断；
步骤1.4、用sephedexg50的凝胶柱纯化dna，用te溶液对dna进行溶解回收；
步骤1.5、回收片断，用于显微注射。用0.22μm的滤膜过滤的te显微注射稀释液稀释dna样品，12000g，离心2小时，上清液的2/3进行分装，用于显微注射。
进一步地，所述步骤2中的将构建好的转基因片段线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；并用pcr鉴定阳性转基因鼠具体为：
步骤2.1、用显微注射法制作转基因小鼠具体为：
步骤2.1.1、超数促排卵操作，即第一天注射孕马血清促性腺激素10iu/只，，48小时后注射人绒毛膜促性腺激素10iu/只；同时，选取健康雄性6周c57bl/6小鼠与上述接受促排卵操作的雌性小鼠1:1合笼交配，观察阴栓情况，有阴栓的小鼠提出待用，即为供卵小鼠，备用；
步骤2.1.2、取卵：将供卵小鼠麻醉后腹部向上放置，备皮暴露腹部，用剪刀和镊子逐层分离皮肤、筋膜、肌肉，暴露卵巢、输卵管和子宫，分离输卵管，用镊子将输卵管放置到m2培养基中，解剖显微镜下打开输卵管的壶腹部，使卵流到培养液里；向培养液里加入lmg/ml的透明质酸酶，并用m2培养基冲洗3-4遍，去除颗粒细胞；在显微镜下进行观察，对受精卵与其他细胞进行鉴别，因受精卵排出第二极体，而未受精卵和其他变成异常形态的卵可以容易地进行区别。选好的受精卵，移到盛着m2培养基液滴的塑料皿中，移至二氧化碳孵箱中培养直到受精卵适合注射为止，其中，二氧化碳孵箱的温度为37℃，含有5％二氧化碳和95％空气；
步骤2.1.3、显微注射：显微注射法将线性化的转基因载体片段注射到c57bl/6小鼠的受精卵雄性原核中；在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用；在载物玻片上作成约有20个受精卵的培养液滴和转基因载体片段溶液滴，固定到载物台上，用持卵吸管将受精卵加以固定，玻璃吸管注入转基因载体片段溶液滴，将其缓慢地注入雄性原核；注射完毕后收集受精卵，37℃二氧化碳培养箱中培养一夜；
步骤2.1.4、移植：将假孕小鼠麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口；显微镜下，挑出分裂为两细胞的受精卵，备用；吸取上述受精卵，将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，逐层缝合；
步骤2.2、pcr法鉴定阳性转基因鼠：
转基因小鼠在出生9-14天用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组dna，利用特异引物通过pcr法进行检测，检测引物序列如下：
上游引物为5′cgctcctttgatgatctcc3′，其核苷酸序列如seqidno.1所示；
下游引物为5′ttggtgcggtctatgagg3′，其核苷酸序列如seqidno.2所示；
pcr鉴定阳性者作为实验组，阴性者作为同窝野生型对照。
进一步地，所述步骤3中的运用rt-pcr及westernblot技术筛选出pdgf-bb最高及最低表达的品系，建立稳定的pdgf-bb过表达小鼠具体为：
步骤3.1、pcr法鉴定f1代阳性转基因鼠，阳性者作为实验组，阴性者作为同窝野生型对照；
步骤3.2、取材：每个品系首建鼠的f1代阳性转基因鼠雌雄不限，每个品系7只，麻醉后迅速取一下部位：嗅球、大脑皮质、大脑额叶、基底前脑、小脑、下丘脑、延髓、脊髓、气管、肺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、肠、骨骼肌、表皮，共十八个部位，每个部位分成两份，一份用于rt-pcr检测，另一份用于westernblot法检测，预冷生理盐水冲洗干净后，分别放入干净ep管中-80℃冻存或立即进行实验检测。
步骤3.3、rt-pcr法检测f1代阳性pdgf-bb过表达转基因鼠，取组织后，按150mg/1.5mltrizol的比例，放入预加了预冷的trizol试剂的匀浆器中，冰浴下匀浆至不粘无颗粒，逐步离心分离、提取rna；新提取的rna用depc处理过的双蒸水溶解后，紫外分光光度计检测rna样品的纯度和浓度；取2μgrna用于逆转录反应，用逆转录试剂盒以rna为模板合成cdna链,使用的是revertaidtmm-mulvreversetransciptase酶体系，合成的cdna可直接用于pcr检测反应。每个样本取cdna模板1.5μl，加入2×pcrmastermix12.5μl、上、下游引物各0.5μl，引物序列为：
上游引物：5'aagcgggctactatactatgcg3'，其核苷酸序列如seqidno.3所示；
下游引物：5'gagatgacggtaaggaccactaa3'，其核苷酸序列如seqidno.4所示；
加去离子水补足25μl反应体系，94℃5分钟，94℃1分钟、56℃1分钟、72℃1分钟共35个循环，最后72℃5分钟，完成pcr检测反应；pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；以β-tubulin为参照基因，电泳检测时同一基因扩增产物在同一凝胶上进行，用bio-rad公司的凝胶成像仪紫外模式下摄取凝胶图片、并进行电泳条带积分光密度分析，计算各组pdgf-bb基因条带与β-tubulin积分光密度值的比值，得出每个样本pdgf-bb基因的相对表达量；
步骤3.4、westernblot法检测f1代阳性pdgf-bb过表达转基因鼠全身多个部位pdgf-bb的表达水平；取组织后，将各组织放入含有0.05m、ph7.4的tris-hcl，0.5medta，30％tritonx-100，nacl，10％sds和1mmpmsf的裂解液中冰浴下匀浆，直到无肉眼能够看见组织块；离心、取上清液，bca试剂盒检测蛋白含量；每个样品取50μg蛋白检测pdgf-bb的蛋白表达，12％sds-page电泳、转膜、封闭、pdgf-bb抗体孵育、二抗孵育、化学发光法检测pdgf-bb相对表达量，β-tubulin作为内参，计算各组pdgf-bb蛋白印迹条带与β-tubulin积分光密度值的比值，得出每个样本pdgf-bb蛋白的相对表达量；
取不同品系小鼠全身多个部位进行pdgf-bb的表达检测，最终确定出pdgf-bb过表达率最高的品系为founder70，大量繁殖备用。
进一步地，所述pdgf-bb全身低表达小鼠通过以下方法制备得到：
步骤1)、构建pdgf-bb低表达转基因片段，体外鉴定pdgf-bb表达抑制的效率；
步骤2)、将构建好的转基因片段线性化，用显微注射法制作转基因小鼠，并用pcr鉴定阳性转基因鼠。
进一步地，所述步骤1)中的构建pdgf-bb低表达转基因片段，体外鉴定pdgf-bb表达抑制的效率具体为：
1.1)cmv-emgfp-sirna-pdgf-bb低表达转基因片段的构建，沉默表达载体cmv-emgfp-sirna-pdgf-bb购买自invitrogen公司，并用该公司网站提供的软件针对目的基因pdgf-bb的靶位点为cggctgctgcaa-taaccgcaa，设计沉默的质粒，然后由中美泰和公司完成质粒构建；
1.2)构建好的沉默质粒转染293t细胞，然后用rt-pcr的方法筛选出沉默效果好的构建，选择干扰pdgf-bb表达的效率最高的质粒，留作后续使用；
1.3)用avrii将干扰效率最高的沉默质粒线形化，获得转基因片段，调整浓度至5ng/μl，用于显微注射。
进一步地，所述步骤6)中的将构建好的转基因片段线性化，用显微注射法制作转基因小鼠，pcr鉴定阳性转基因鼠具体为：
2.1)用显微注射法制作转基因小鼠，采用上述的操作步骤进行制作转基因小鼠；
步骤2.2)pcr法鉴定f1代阳性转基因鼠，阳性者作为实验组，阴性者作为同窝野生型对照；
2.3)取材：每个品系首建鼠的f1代阳性转基因鼠雌雄不限，每个品系7只，麻醉后迅速取一下部位：嗅球、大脑皮质、大脑额叶、基底前脑、小脑、下丘脑、延髓、脊髓、气管、肺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、肠、骨骼肌、表皮，共十八个部位，每个部位分成两份，一份用于rt-pcr检测，另一份用于westernblot法检测，预冷生理盐水冲洗干净后，分别放入干净ep管中-80℃冻存或立即进行实验检测；
2.4)rt-pcr法检测f1代阳性pdgf-bb低表达转基因鼠，取组织后，按150mg/1.5mltrizol的比例，放入预加了预冷的trizol试剂的匀浆器中，冰浴下匀浆至不粘无颗粒，逐步离心分离、提取rna；新提取的rna用depc处理过的双蒸水溶解后，紫外分光光度计检测rna样品的纯度和浓度；取2μgrna用于逆转录反应，用逆转录试剂盒以rna为模板合成cdna链,使用的是revertaidtmm-mulvreversetransciptase酶体系，合成的cdna直接用于pcr检测反应；每个样本取cdna模板1.5μl，加入2×pcrmastermix12.5μl、上、下游引物各0.5μl，引物序列为：
上游引物：5'aagcgggctactatactatgcg3'，其核苷酸序列如seqidno.3所示；
下游引物：5'gagatgacggtaaggaccactaa3'，其核苷酸序列如seqidno.4所示；
加去离子水补足25μl反应体系，94℃5分钟，94℃1分钟、56℃1分钟、72℃1分钟共35个循环，最后72℃5分钟，完成pcr检测反应；pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；以β-tubulin为参照基因，电泳检测时同一基因扩增产物在同一凝胶上进行，用bio-rad公司的凝胶成像仪紫外模式下摄取凝胶图片、并进行电泳条带积分光密度分析，计算各组pdgf-bb基因条带与β-tubulin积分光密度值的比值，得出每个样本pdgf-bb基因的相对表达量；
2.5)westernblot法检测f1代阳性pdgf-bb过表达转基因鼠全身多个部位pdgf-bb的表达水平，取组织后，将各组织放入含有0.05m、ph7.4的tris-hcl，0.5medta，30％tritonx-100，nacl，10％sds和1mmpmsf的裂解液中冰浴下匀浆，直到无肉眼可见组织块；离心、取上清液，bca试剂盒检测蛋白含量；每个样品取50μg蛋白检测pdgf-bb的蛋白表达，12％sds-page电泳、转膜、封闭、pdgf-bb抗体孵育、二抗孵育、化学发光法检测pdgf-bb相对表达量，β-tubulin作为内参，计算各组pdgf-bb蛋白印迹条带与β-tubulin积分光密度值的比值，得出每个样本pdgf-bb蛋白的相对表达量；
取不同品系小鼠全身多个部位进行pdgf-bb的表达检测，最终确定出pdgf-bb表达率抑制率最高的品系，大量繁殖备用。
本发明还公开了一种上述的构建方法得到的pdgf-bb转基因小鼠脊髓全横断模型。
本发明还公开了一种上述的pdgf-bb转基因小鼠模型在制备预防或者治疗疤痕增生药物中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明首次成功构建了全身过表达pdgf-bb的转基因小鼠品系；
2)本发明首次成功构建了全身低表达pdgf-bb的转基因小鼠品系；为研究预防或者治疗疤痕增生药物提供了良好的研究工具。
3)本发明首次探讨了pdgf-bb过表达以及表达干预后对小鼠脊髓损伤修复、疤痕增生、功能恢复的影响，并发现了其部分分子机制，为后续研究奠定了客观基础。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明pdgf-bb过表达转基因片段；其中，cmvpromoter:bases232-819.bghpa:bghpolyadenylation；ampr:ampicillinresistancegene(bla):bases4432-5428(complementarystrand)；
图2是本发明rt-pcr表达水平筛选结果；体外运用rt-pcr检测各表达载体pdgf-bb的表达水平，共八个，箭头标记为保留品系；
图3是本发明pcr鉴定阳性pdgf-bb的过表达转基因鼠；其中，a为小鼠脚趾编号示意图，1-10代表小鼠的后脚趾编号，20、30、40、50、60、70、80及90代表小鼠的前脚趾编号；b为pcr鉴定阳性pdgf-bb的过表达转基因鼠的结果，lane1:dnamarkerdl2,000(从上往下分子量分别为:2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)；lane2-11:pdgf-bb的过表达转基因鼠基因组插入片段的pcr鉴定产物；lane2:founder42，即f0代转基因鼠42号，lane3:founder70，f0代转基因鼠70号；lane4:founder84，f0代转基因鼠84号；lane5:founder18，f0代转基因鼠18号；lane6:founder71，f0代转基因鼠71号；lane7:founder72，f0代转基因鼠72号；lane8:founder22，f0代转基因鼠22号；lane9:founder35，f0代转基因鼠35号；lane10:founder93，f0代转基因鼠93号；lane11:founder52，f0代转基因鼠52号；
图4是本发明rt-pcr检测pdgf-bb在过表达转基因鼠基因表达情况；其中，wt，同窝野生型小鼠；founder70，f0代转基因鼠70号；founder84，f0代转基因鼠84号；founder18，f0代转基因鼠18号；founder22，f0代转基因鼠22号；founder35，f0代转基因鼠35号；founder93，f0代转基因鼠93号；founder71，f0代转基因鼠71号；founder72，f0代转基因鼠72号；founder42，f0代转基因鼠42号；founder52，f0代转基因鼠52号；olfactorybulb，嗅球；cortex，大脑皮质；frontallobe，大脑额叶；basalforebrain，基底前脑；cerebellum，小脑；hypothalamus，下丘脑；medullaoblongata，延髓；spinalcord，脊髓；trachea，气管；lung，肺；heart，心脏；liver，肝脏；spleen，脾脏；kidney，肾脏；adrenalgland，肾上腺；intestines，肠；skeletalmuscles，骨骼肌；epidermis，表皮；纵坐标代表pdgf-bbmrna的相对表达量；*与野生型相比差异具有显著性，p<0.05(n＝7)；
图5是本发明westernblot检测pdgf-bb在过表达转基因鼠蛋白表达情况；其中，lane1，wt，同窝野生型小鼠；lane2:founder70，f0代转基因鼠70号；lane3:founder84，f0代转基因鼠84号；lane4:founder18，f0代转基因鼠18号；lane5:founder22，f0代转基因鼠22号；lane6:founder35，f0代转基因鼠35号；lane7:founder93，f0代转基因鼠93号；lane8:founder71，f0代转基因鼠71号；lane9:founder72，f0代转基因鼠72号；lane10:founder42，f0代转基因鼠42号；lane11:founder52，f0代转基因鼠52号；a,a:olfactorybulb，嗅球；b,b:cortex，大脑皮质；c,c:frontallobe，大脑额叶；d,d:basalforebrain，基底前脑；e,e:cerebellum，小脑；f,f:hypothalamus，下丘脑；g,g:medullaoblongata，延髓；h,h:spinalcord，脊髓；i,i:trachea，气管；j,j:lung，肺；k,k:heart，心脏；l,l:liver，肝脏；m,m:spleen，脾脏；n,n:kidney，肾脏；o,o:adrenalgland，肾上腺；p,p:intestines，肠；q,q:skeletalmuscles，骨骼肌；r,r:epidermis，表皮；
图6是本发明pdgf-bb低表达转基因片段；
图7是本发明在体外运用293t细胞鉴定pdgf-bb低表达转基因片段对pdgf-bb的表达抑制效率，图为定量pcr的扩增曲线图；
图8是本发明在体外运用293t细胞鉴定pdgf-bb低表达转基因片段对pdgf-bb的表达抑制效率，图为pcr扩增产物pdgf-bb的电泳图片；1-8号泳道分别为：1，dna2000dl分子量标准；2，空白对照组；3-8为pdgf-bb低表达转基因片段，3为14号；4为27号；5为29号；6为4号；7和8均为38号；
图9是本发明在体外运用293t细胞检测pdgf-bb低表达转基因片段对pdgf-bb的表达抑制效率；图为对各片段转染后pdgf-bb定量pcr扩增ct值的定量统计，数值来源于三次独立实验(n＝3)；
图10是本发明pcr鉴定阳性pdgf-bb的低表达转基因鼠；
图11是本发明rt-pcr检测pdgf-bb在低表达转基因鼠的基因表达情况；其中，wt，同窝野生型小鼠；founder39,f0代转基因鼠39号；founder29,f0代转基因鼠29号；founder1,f0代转基因鼠1号；founder20,f0代转基因鼠20号；founder5,f0代转基因鼠5号；founder16,f0代转基因鼠16号；olfactorybulb，嗅球；cortex，大脑皮质；frontallobe，大脑额叶；basalforebrain，基底前脑；cerebellum，小脑；hypothalamus，下丘脑；medullaoblongata，延髓；spinalcord，脊髓；trachea，气管；lung，肺；heart，心脏；liver，肝脏；spleen，脾脏；kidney，肾脏；adrenalgland，肾上腺；intestines，肠；skeletalmuscles，骨骼肌；epidermis，表皮；纵坐标代表pdgf-bbmrna的相对表达量；*与野生型相比差异具有显著性，p<0.0.5；
图12是本发明westernblot检测pdgf-bb在低表达转基因鼠表达情况；其中，lane1,wt，同窝野生型小鼠；lane2:founder39,f0代转基因鼠39号；lane3:founder29,f0代转基因鼠29号；lane4:founder1,f0代转基因鼠1号；lane5:founder20,f0代转基因鼠20号；lane6:founder5,f0代转基因鼠5号；lane7:founder16,f0代转基因鼠16号；a,a:olfactorybulb，嗅球；b,b:cortex，大脑皮质；c,c:frontallobe，大脑额叶；d,d:basalforebrain，基底前脑；e,e:cerebellum，小脑；f,f:hypothalamus，下丘脑；g,g:medullaoblongata，延髓；h,h:spinalcord，脊髓；i,i:trachea，气管；j,j:lung，肺；k,k:heart，心脏；l,l:liver，肝脏；m,m:spleen，脾脏；n,n:kidney，肾脏；o,o:adrenalgland，肾上腺；p,p:intestines，肠；q,q:skeletalmuscles，骨骼肌；r,r:epidermis，表皮；
图13是本发明脊髓全横断损伤后pdgf-bb过表达小鼠bbb功能评分；其中，*表示与wt相比具有统计学差异，n＝12；
图14是本发明脊髓全横断损伤后pdgf-bb低表达小鼠bbb功能评分；其中，*表示与wt相比具有统计学差异，n＝12；
图15是本发明脊髓全横断损伤后pdgf-bb基因在各组的表达变化；其中，wt，野生型组；sham，假手术组；sct，全横断损伤组；*与wt-sham组相比，p<0.05；#与pdgf-bb过表达-sct组相比，p<0.05；&与pdgf-bb过表达-sham组相比，p<0.05；$与wt-sct组相比，p<0.05；
图16是本发明脊髓全横断损伤后stat-3基因在各组的表达变化；其中，wt，野生型组；sham，假手术组；sct，全横断损伤组；*与wt-sham组相比，p<0.05；#与pdgf-bb过表达-sct组相比，p<0.05；&与pdgf-bb过表达-sham组相比，p<0.05；$与wt-sct组相比，p<0.05；
图17是本发明脊髓全横断损伤后pdgf-bb、stat-3以及p-stat-3蛋白在各组疤痕中的表达变化；其中，*与wt全横断组相比，p<0.05；
图18是本发明脊髓全横断损伤后pdgf-bb基因在各组的表达变化；其中，wt，野生型组；sham，假手术组；sct，全横断损伤组；*与wt-sham组相比，p<0.05；#与pdgf-bb低表达-sct组相比，p<0.05；&与pdgf-bb低表达-sham组相比，p<0.05；$与wt-sct组相比，p<0.05；
图19是本发明脊髓全横断损伤后stat-3基因在各组的表达变化；其中，wt，野生型组；sham，假手术组；sct，全横断损伤组；*与wt-sham组相比，p<0.05；#与pdgf-bb低表达-sct组相比，p<0.05；&与pdgf-bb低表达-sham组相比，p<0.05；$与wt-sct组相比，p<0.05；
图20是本发明脊髓全横断损伤后pdgf-bb、stat-3以及p-stat-3蛋白在各组疤痕中的表达变化；其中，*与wt全横断组相比，p<0.05。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1构建pdgf-bb高表达转基因小鼠模型
用转基因技术构建pdgf-bb过表达转基因小鼠，pcr鉴定阳性转基因鼠，运用rt-pcr及westernblot技术筛选出pdgf-bb最高及最低表达的品系，建立稳定过表达的小鼠模型。
1)构建pdgf-bb过表达转基因片段，该构建方法包含以下实验步骤：
1.1)pcr克隆扩增目的基因pdgf-bb的开放读码框(orf)，扩增引物序列如下：
上游引物为5′cgctcctttgatgatctcc3′，其核苷酸序列如seqidno.1所示；
下游引物为5′ttggtgcggtctatgagg3′，其核苷酸序列如seqidno.2所示，目的片段230bp；
1.2)pcdna3.1(+)-h-pdgf-bb质粒构建。经过酶切、dna片段回收、连接反应用内切酶ecori与xhoi酶切pcdna3.1(+/-)vector载体和插入的目的片段pdgf-bb的orf。
1.3)将构建好的质粒载体转入菌种进行dna的提取，通过大量制备质粒dna，电泳、用qiagendna凝胶回收试剂盒回收dna片断；
1.4)用sephedexg50的凝胶柱纯化dna，用te溶液对dna进行溶解回收；
1.5)回收片断，用于显微注射。用0.22μm的滤膜过滤的te显微注射稀释液稀释dna样品，12000g，离心2小时，上清液的2/3进行分装，用于显微注射。
如图1所示，目的基因全长750bp，通过mcs上的ecori与xhoi重组进载体，以载体上4875bp处的pvui进行显性化，送注射。h-pdgf为人pdgf-bb基因(pdgfbplatelet-derivedgrowthfactorbetapolypeptide(simiansarcomaviral(v-sis)oncogenehomolog)[homosapiens]，geneid:5155)。
如图2所示，体外运用rt-pcr检测各表达载体pdgf-bb的表达水平，共八个，箭头标记为保留品系；由图可见与其余六组相比，这两个载体pdgf-bb的表达量显著增加，说明这两个表达载体可以获得pdgf-bb过表达的效果，保留进行后续实验研究。
2)将构建好的转基因片段线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；pcr鉴定阳性转基因鼠；
2.1)显微注射法制作转基因小鼠方法包含以下实验步骤：
2.1.1)超数促排卵操作，即第一天注射孕马血清促性腺激素(pmsg)10iu/只(0.2ml/只)，48小时后注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)10iu/只(0.2ml/只)；同时，选取健康雄性6周左右c57bl/6小鼠与上述接受促排卵操作的雌性小鼠1:1合笼交配，观察阴栓情况，有阴栓的小鼠提出待用，即为供卵小鼠，备用。
2.1.2)取卵。将供卵小鼠麻醉后腹部向上放置，备皮暴露腹部，用剪刀和镊子逐层分离皮肤、筋膜、肌肉，暴露卵巢、输卵管和子宫，分离输卵管，用镊子将输卵管放置到m2培养基中，解剖显微镜下打开输卵管的壶腹部，使卵流到培养液里。向培养液里加入lmg/ml的透明质酸酶，并用m2培养基冲洗3-4遍，去除颗粒细胞。在显微镜下进行观察，对受精卵与其他细胞进行鉴别，因受精卵排出第二极体，而未受精卵和其他变成异常形态的卵可以容易地进行区别。选好的受精卵，移到盛着m2培养基液滴的塑料皿(直径35mm)中，移至二氧化碳孵箱(37℃，5％二氧化碳，95％空气)中培养直到受精卵适合注射为止。
2.1.3)显微注射：显微注射法将线性化的转基因载体片段注射到c57bl/6小鼠的受精卵雄性原核中。在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。在载物玻片上作成约有20个左右受精卵的培养液滴和转基因载体片段溶液滴，固定到载物台上，用持卵吸管将受精卵加以固定，玻璃吸管注入转基因载体片段溶液滴，将其缓慢地注入雄性原核。注射完毕后收集受精卵，37℃二氧化碳培养箱中培养一夜。
2.1.4)移植：将假孕小鼠麻醉，手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。显微镜下，挑出分裂为两细胞的受精卵，备用。吸取上述受精卵，将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，逐层缝合。
2.2)pcr法鉴定阳性转基因鼠:
转基因小鼠在出生9-14天用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组dna，利用特异引物通过pcr法进行检测，检测引物序列如下：
上游引物为5′cgctcctttgatgatctcc3′，其核苷酸序列如seqidno.1所示；
下游引物为5′ttggtgcggtctatgagg3′，其核苷酸序列如seqidno.2所示；
pcr鉴定阳性者作为实验组，阴性者作为同窝野生型对照；
从图3可知，成功获得表达230bp目的片段的pdgf-bb过表达转基因小鼠，共十个品系，根据脚趾编号分别命名为foundern，如图注所述。
3)运用rt-pcr及westernblot技术筛选出pdgf-bb最高及最低表达的品系，建立稳定的pdgf-bb过表达小鼠模型；
一般首建鼠合笼后可以得到数只f0代鼠，为排除不同插入位点对pdgf-bb表达的影响，运用rt-pcr及wb技术对f0代鼠产下的子代(f1代鼠)进行pdgf-bb的基因和蛋白表达检测，筛选出最高表达的品系，留种繁殖。本发明共获得10个品系的pdgf-bb过表达转基因f0代鼠，脚趾编号分别为70号、84号、18号、22号、35号、93号、71号、72号、42号和52号；包含以下实验步骤：
3.1)pcr法鉴定f1代阳性转基因鼠，阳性者作为实验组，阴性者作为同窝野生型对照；
3.2)取材：每个品系首建鼠的f1代阳性转基因鼠雌雄不限，每个品系7只，麻醉后迅速取一下部位：嗅球、大脑皮质、大脑额叶、基底前脑、小脑、下丘脑、延髓、脊髓、气管、肺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、肠、骨骼肌、表皮，共十八个部位，每个部位分成两份(一份用于rt-pcr检测，另一份用于westernblot法检测)，预冷生理盐水冲洗干净后，分别放入干净ep管中-80℃冻存或立即进行实验检测。
3.3)rt-pcr法检测f1代阳性pdgf-bb过表达转基因鼠。取组织后，按150mg/1.5mltrizol的比例，放入预加了预冷的trizol试剂的匀浆器中，冰浴下匀浆至不粘无颗粒，逐步离心分离、提取rna；新提取的rna用depc处理过的双蒸水溶解后，紫外分光光度计检测rna样品的纯度和浓度；取2μgrna用于逆转录反应，用逆转录试剂盒以rna为模板合成cdna链,使用的是revertaidtmm-mulvreversetransciptase酶体系，合成的cdna可直接用于pcr检测反应。每个样本取cdna模板1.5μl，加入2×pcrmastermix(fermentals)12.5μl、上、下游引物各0.5μl，引物序列为：
上游引物：5'aagcgggctactatactatgcg3'，其核苷酸序列如seqidno.3所示；
下游引物：5'gagatgacggtaaggaccactaa3'，其核苷酸序列如seqidno.4所示；
加去离子水补足25μl反应体系，94℃5分钟，94℃1分钟、56℃1分钟、72℃1分钟共35个循环，最后72℃5分钟，完成pcr检测反应；pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；以β-tubulin为参照基因，电泳检测时同一基因扩增产物在同一凝胶上进行，用bio-rad公司的凝胶成像仪紫外模式下摄取凝胶图片、并进行电泳条带积分光密度分析，计算各组pdgf-bb基因条带与β-tubulin积分光密度值的比值，得出每个样本pdgf-bb基因的相对表达量。
3.4)westernblot法检测f1代阳性pdgf-bb过表达转基因鼠全身多个部位pdgf-bb的表达水平。取组织后，将各组织放入含有0.05mtris-hcl(ph7.4,amresco),0.5medta(amresco),30％tritonx-100(amresco),nacl(amresco),10％sds(sigma)和1mmpmsf(amresco)的裂解液中冰浴下匀浆，直到无肉眼可见组织块；离心、取上清液，bca(sigma,st.louis,mo,usa)试剂盒检测蛋白含量；每个样品取50μg蛋白检测pdgf-bb的蛋白表达，12％sds-page电泳、转膜、封闭、pdgf-bb抗体孵育、二抗孵育、化学发光法检测pdgf-bb相对表达量，β-tubulin作为内参，计算各组pdgf-bb蛋白印迹条带与β-tubulin积分光密度值的比值，得出每个样本pdgf-bb蛋白的相对表达量。
取不同品系小鼠全身多个部位进行pdgf-bb的表达检测，最终确定出pdgf-bb过表达率最高的品系为founder70，大量繁殖备用。如图4及图5所示，pdgf-bb在pdgf-bb过表达转基因小鼠10个品系(founder70,founder84,founder18,founder22,founder35,founder93,founder71,founder72,founder42andfounder52)全身18个部位的表达检测结果，pdgf-bb(基因/蛋白)的过表达率计算公式：pdgf-bb过表达率＝o.d.(founder-wt)/o.d.wt×100％，founder为具体某一品系，wt为野生型，o.d.为积分光密度值。由此公式计算得出：相较于其他品系，pdgf-bb在founder70的上调量最大，接近61％，故确定pdgf-bb过表达率最高的品系为founder70，留作后续实验研究。其余各品系pdgf-bb过表达率分别为founder8448％，founder1830％，founder2234％，founder3518％，founder9310％，founder718％，founder427.3％，founder724％以及founder522％。
实施例2构建pdgf-bb低表达转基因小鼠模型
用转基因技术构建pdgf-bb低表达转基因小鼠，pcr鉴定阳性转基因鼠，运用rt-pcr及westernblot技术筛选出pdgf-bb最高及最低表达的品系，建立稳定低表达的小鼠模型。
1)构建pdgf-bb低表达转基因片段，体外鉴定pdgf-bb表达抑制的效率，包括以下实验步骤：
1.1)cmv-emgfp-sirna-pdgf-bb低表达转基因片段的构建。如图6所示，沉默表达载体cmv-emgfp-sirna-pdgf-bb购买自invitrogen公司，并用该公司网站提供的软件针对目的基因pdgf-bb(pdgfbplatelet-derivedgrowthfactorbetapolypeptide,geneid:nm_011057)的靶位点为(cggctgctgcaa-taaccgcaa)，设计沉默的质粒，然后由中美泰和公司完成质粒构建。
1.2)构建好的沉默质粒转染293t细胞，然后用rt-pcr的方法筛选出沉默效果好的构建，如图7、8、9所示，4号质粒干扰pdgf-bb表达的效率最高，留作后续使用；从图7可知，与内参基因gapdh相比，转染了pdgf-bb低表达转基因片段的细胞由pcr扩增等量pdgf-bb需要更多循环数，这意味着在此细胞中国pdgf-bb的表达降低了；从图8可知，与其他片段相比，转染了pdgf-bb低表达转基因4号片段后，pdgf-bb的表达显著降低；从图9可知，与其他各组相比，4号低表达片段的转染后pdgf-bb扩增的ct值最高，与图7的结果一致，说明4号低表达片段的干扰效率最高。
1.3)用avrii将干扰效率最高的4号沉默质粒线形化，获得转基因片段，调整浓度至5ng/μl，用于显微注射。
2)将构建好的转基因片段线性化，用显微注射法制作转基因小鼠，方法如前述；pcr鉴定阳性转基因鼠：
运用rt-pcr及westernblot技术筛选出pdgf-bb最高及最低表达的品系，建立稳定的pdgf-bb过表达小鼠模型；一般首建鼠合笼后可以得到数只f0代鼠，为排除不同插入位点对pdgf-bb表达的影响，运用rt-pcr及wb技术对f0代鼠产下的子代(f1代鼠)进行pdgf-bb的基因和蛋白表达检测，筛选出最低表达的品系，留种繁殖。本发明共获得6个品系的pdgf-bb低表达转基因f0代鼠，脚趾编号分别为39号、29号、1号、20号、5号、16号；包含以下实验步骤：
2.1)pcr法鉴定f1代阳性转基因鼠，阳性者作为实验组，阴性者作为同窝野生型对照；
2.2)取材。每个品系首建鼠的f1代阳性转基因鼠雌雄不限，每个品系7只，麻醉后迅速取一下部位：嗅球、大脑皮质、大脑额叶、基底前脑、小脑、下丘脑、延髓、脊髓、气管、肺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、肠、骨骼肌、表皮，共十八个部位，每个部位分成两份(一份用于rt-pcr检测，另一份用于westernblot法检测)，预冷生理盐水冲洗干净后，分别放入干净ep管中-80℃冻存或立即进行实验检测。同前述。
2.3)rt-pcr法检测f1代阳性pdgf-bb低表达转基因鼠。取组织后，按150mg/1.5mltrizol的比例，放入预加了预冷的trizol试剂的匀浆器中，冰浴下匀浆至不粘无颗粒，逐步离心分离、提取rna；新提取的rna用depc处理过的双蒸水溶解后，紫外分光光度计检测rna样品的纯度和浓度；取2μgrna用于逆转录反应，用逆转录试剂盒以rna为模板合成cdna链,使用的是revertaidtmm-mulvreversetransciptase酶体系，合成的cdna可直接用于pcr检测反应。每个样本取cdna模板1.5μl，加入2×pcrmastermix(fermentals)12.5μl、上、下游引物各0.5μl，引物序列为：
上游引物：5'aagcgggctactatactatgcg3'，其核苷酸序列如seqidno.3所示；
下游引物：5'gagatgacggtaaggaccactaa3'，其核苷酸序列如seqidno.4所示；
加去离子水补足25μl反应体系，94℃5分钟，94℃1分钟、56℃1分钟、72℃1分钟共35个循环，最后72℃5分钟，完成pcr检测反应；pcr产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测；以β-tubulin为参照基因，电泳检测时同一基因扩增产物在同一凝胶上进行，用bio-rad公司的凝胶成像仪紫外模式下摄取凝胶图片、并进行电泳条带积分光密度分析，计算各组pdgf-bb基因条带与β-tubulin积分光密度值的比值，得出每个样本pdgf-bb基因的相对表达量。
2.4)westernblot法检测f1代阳性pdgf-bb过表达转基因鼠全身多个部位pdgf-bb的表达水平。取组织后，将各组织放入含有0.05mtris-hcl(ph7.4,amresco),0.5medta(amresco),30％tritonx-100(amresco),nacl(amresco),10％sds(sigma)和1mmpmsf(amresco)的裂解液中冰浴下匀浆，直到无肉眼可见组织块；离心、取上清液，bca(sigma,st.louis,mo,usa)试剂盒检测蛋白含量；每个样品取50μg蛋白检测pdgf-bb的蛋白表达，12％sds-page电泳、转膜、封闭、pdgf-bb抗体孵育、二抗孵育、化学发光法检测pdgf-bb相对表达量，β-tubulin作为内参，计算各组pdgf-bb蛋白印迹条带与β-tubulin积分光密度值的比值，得出每个样本pdgf-bb蛋白的相对表达量。
取不同品系小鼠全身多个部位进行pdgf-bb的表达检测，最终确定出pdgf-bb表达率抑制率最高的品系为founder39，大量繁殖备用。如图11及图12所示，pdgf-bb在pdgf-bb低表达转基因小鼠6个品系(founder39,founder29,founder1,founder20,founder5,founder16)全身18个部位的表达检测结果，pdgf-bb(基因/蛋白)的表达抑制率计算公式：pdgf-bb表达抑制率＝o.d.(wt-founder)/o.d.wtx100％(o.d.meansopticaldensity)，founder为具体某一品系，wt为野生型，o.d.为积分光密度值。由此公式计算得出：相较于其他品系，pdgf-bb在founder39的表达抑制率最高，全身18个部位平均为56％，故确定pdgf-bb表达抑制率最高的品系为founder39，留作后续实验研究。其余各品系pdgf-bb过表达率分别为founder2948％,founder122％,founder2020％,founder512％,founder162％。
由此，通过以上的步骤，本发明用转基因技术完成了pdgf-bb全身过表达以及pdgf-bb全身低表达小鼠的构建，获得了pdgf-bb最高/最低表达品系。
实施例3建立转基因小鼠脊髓全横断模型
运用得到的转基因小鼠模型，建立小鼠脊髓全横断损伤模型，具体步骤包括：麻醉转基因小鼠，俯卧位固定，备皮，剪开背部皮肤、筋膜及肌肉层，咬骨钳去除椎板，逐层显露t9-t11节段脊髓，于t10水平横断，用约1mm直径的细绳穿过损伤平面以确保脊髓全横断。操作成功后即可观察到小鼠出现尾部及四肢抽动。术毕，止血，逐层缝合。脊髓t10水平成功横断的小鼠表现为术后双下肢瘫痪、无自主运动，排尿放射消失、双下肢疼温觉消失。
通过免疫组化来检测纤维再生，用rt-pcr和westernblot对pdgf-b及其下游有关信号通路分子stat3进行检测；并在脊髓全横断损伤术后用bbb评分对小鼠后肢的运动功能进行评估，28天检测神经电生理csep和mep，探讨对pdgf-bb表达进行正向/反向调控后对脊髓全横断后疤痕形成与功能恢复的影响。
1)构建pdgf-bb过表达转基因脊髓全横断损伤小鼠模型，采用bda追踪和免疫组化操作来检测纤维再生和出芽。结果发现脊髓全横断损伤术后28天pdgf-bb过表达组未检测到损伤的下端有再生的纤维，bda追踪未检测到阳性反应；wt组，可见少数阳性纤维；说明pdgf-bb过表达抑制了影响损伤脊髓纤维向远端生长。
2)用行为学bbb评分系统对小鼠功能恢复进行评估。
过表达转基因小鼠脊髓全横断手术组(i组，40只)，低表达转基因小鼠脊髓全横断手术组(ii组，40只)，野生型脊髓全横断手术组(iii组，40只)。每组又分三个时间段即1天，3天，7天，14天，28天，每时间点各8只动物。
由图13和图14可知，脊髓全横断损伤后，野生型组(wt)小鼠具有一定程度的后肢功能的自发性恢复，推测与损伤后内源性修复通路的激活相关；而与wt相比，pdgf-bb过表达转基因小鼠显示出迟缓的恢复过程，从14天开始，具有统计学差异。在pdgf-bb低表达转基因小鼠组，情况正好相反，与wt组相比，pdgf-bb低表达转基因小鼠表现出较好的后肢运动功能恢复，从损伤后7天起与wt组相比具有统计学差异。
3)用rt-pcr和westernblot研究与pdgf-b下游有关的信号通路分子stat3等的变化。
用rt-pcr检测了sct损伤后各组小鼠损伤部位pdgf-bb以及stat3的表达变化，并于损伤后14天取疤痕组织用westernblot检测了pdgf-bb、stat3以及p-stat3的水平，同时，于损伤后28天检测了各组疤痕的大小，进行了比较，结果如图15-图17所示。
从图15-图17可知，与野生型组小鼠相比，脊髓全横断损伤后，pdgf-bb过表达组小鼠在损伤后各时间点(3dpo，14dpo)，pdgf-bb以及其下游信号通路中的stat-3分子呈现过表达，且stat-3的激活增加，表现为磷酸化的表达水平上调，差异具有统计学意义。
从图18-图20可知，与野生型组小鼠相比，脊髓全横断损伤后，pdgf-bb低表达组小鼠在损伤后各时间点，主要是损伤后3及14天，pdgf-bb以及其下游信号通路中的stat-3分子的过表达被逆转，且stat-3的激活状态被抑制，表现为与pdgf-bb过表达损伤组相反的趋势，与野生型组相比的差异具有统计学意义。
4)pdgf-bb表达调控对于损伤脊髓疤痕形成的影响。
进一步，本发明测量了各组在损伤后28天损伤断端的疤痕的大小，结果如下：
表1pdgf-bb过表达与低表达对sct后损伤脊髓疤痕周长及长度的影响(meanssd，n＝12)
说明：*与wt-sct组相比，p<0.05，差异具有统计学意义；#与pdgf-bb过表达-sct组相比，p<0.05，差异具有统计学意义。
由表1可知，pdgf-bb过表达后加重了全横断损伤部位疤痕的生长，而转基因抑制pdgf-bb的表达后疤痕周长、长度分别与wt-sct比较，p<0.05，有显著统计学差异。说明pdgf-bb过表达加重损伤脊髓疤痕增生，可能通过激活pdgf-bb/stat-3信号通路途径发挥其生物学作用，而抑制pdgf-bb的表达，则可以通过抑制该条通路中stat-3的表达及激活而显著减少疤痕的体积和长度，抑制疤痕增生，进一步明确了pdgf-bb在脊髓损伤修复中扮演的双面作用。
实施例4感觉功能csep及mep测定
1)感觉功能csep测定
csep(p1n1p2型)：在wt-sham以及在pdgf-bb转基因组-sham(假手术组)小鼠的整个实验研究期间均有明显信号。与pdgf-bb过表达-sct组脊髓全横断小鼠没有记录到csep，而pdgf-bb低表达转基因的小鼠能记录到csep，显示出部分的恢复，但是没有达到假手术组的水平。
表2pdgf-bb转基因小鼠sct后csepp1n1p2潜伏期检测结果(means±sd，n＝12)
说明：*与wt-sct组相比，p<0.05，差异具有统计学意义；#与sham组相比，p<0.05，差异具有统计学意义。
表3pdgf-bb转基因小鼠sct后csepp1n1p2波幅检测结果(means±sd，n＝12)
说明：*与wt-sct组相比，p<0.05，差异具有统计学意义；#与sham组相比，p<0.05，差异具有统计学意义。
2)mep测定
经统计学分析，sct各组与正常组比较，p＝0.000，<0.001，有显著性统计学差异；与pdgf-bb过表达-sct组比较，pdgf-bb低表达-sct组潜伏期明显变短，p＝0.000，<0.001，有显著性统计学差异；而pdgf-bb低表达-sct组和wt-sct组相比，p＝0.01，<0.05，有统计学差异，即虽然pdgf-bb低表达-sct组有了一定程度的恢复，但是并未达到野生型手术组水平，还有一定差距。
表4pdgf-bb转基因小鼠sct后mep检测结果(means±sd，n＝12)
说明：*与wt-sct组相比，p<0.05，差异具有统计学意义；#与pdgf-bb过表达-sct组相比，p<0.05，差异具有统计学意义。
此结果说明，pdgf-bb表达抑制可以对抗脊髓损伤后由pdgf-bb引发的神经再生功能恢复的阻碍，表现为减少stat-3的表达、减少stat-3的激活，拮抗全横断损伤部位胶质疤痕的生长，帮助断端纤维向远端生长，从而在一定程度上恢复了脊髓损伤小鼠的运动与感觉功能，表现为bbb评分后肢功能有所恢复，以及可以记录到改善的皮层体感诱发电位。在前期的研究工作中，我们完成了体内外rna干扰技术对pdgf-bb的基因表达干预、体内pdgf-bb抗体封闭对pdgf-bb的表达干预，并观察其对脊髓全横断后星形胶质细胞的生长影响、疤痕形成、神经再生功能恢复、pdgf-bb分子信号通路的作用，发现了在脊髓全横断损伤大鼠中干扰pdgf-bb的活性显著抑制了星形胶质细胞的增生和疤痕组织的形成，与此变化相平行的是大鼠后肢运动和感觉功能明显改善。在本发明中，运用pdgf-bb转基因小鼠，建立了小鼠脊髓全横断模型，从pdgf-bb过表达以及pdgf-bb低表达两个方向，进一步确定了pdgf-bb在损伤脊髓中扮演的负面作用，并首次发现并阐明其机制可能与pdgf-bb/stat-3这一通路有关，通过对通路中stat-3分子的表达调控、对stat-3磷酸化水平的调节，pdgf-bb对脊髓全横断后疤痕形成、神经功能恢复(运动与感觉功能)起到了阻碍的作用，从基因操作层面对其进行干扰可以达到治疗的目的，为临床治疗提供了重要参考资料。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。