本发明属于分子诊断领域，具体涉及hpv16-hpv18重组序列、包含其的质粒及其应用。
背景技术：
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,hpv)是一种嗜上皮性病毒，能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖。分子生物学研究结果显示，90％以上的宫颈癌伴有hpv感染。hpv有120多种类型，其中hpv16和hpv18与宫颈癌及宫颈癌前病变的发生发展最为密切，属高危型hpv。高危型hpv的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件，hpv感染使得宫颈癌的相对危险性增加250倍，而从高危型hpv的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展为宫颈癌大约需要5-10年。因此，高危hpv病毒是目前最为明确的致癌病毒，有针对性地对高危型hpv进行全面检测，对宫颈癌的早期诊断和治疗具有重要的意义。
现阶段常采用荧光pcr检测hpv16dna和hpv18dna，但该方法存在以下缺陷：(1)检测敏感性不够高，无法检测到低浓度的hpv16dna和hpv18dna；(2)检测特异性不够高，与hpv其他类型存在交叉反应；(3)许多试剂盒采用是定性的方法，无法精确定量测定hpv16dna和hpv18dna浓度。因此，研究开发敏感性高、特异性好且能够定量检测hpv16dna和hpv18dna浓度的技术，对于分子诊断，尤其是hpv的普查和宫颈癌的防治具有重大意义。
技术方案
本发明的一个目的是提供一种hpv16-hpv18重组序列，所述重组序列用于实时荧光定量pcr检测hpv16dna和hpv18dna，特异性好，pcr扩增效率高，敏感性高。
本发明的另一个目的是提供含有本发明hpv16-hpv18重组序列的质粒。
本发明的再一个目的是提供本发明hpv16-hpv18重组序列及含有本发明hpv16-hpv18重组序列质粒在实时荧光pcr检测hpv16dna和/或hpv18dna作为参考标准品或阳性质控品的用途。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种hpv16-hpv18重组序列，序列如seqidno.1所示：
gaattcgacgactatccagcgaccaagatcagagccagacaccggaaacccctgccacaccactaagttgttgcacagagactccgtggacagtgctccaatcctcaaagcttgggtgacactgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcgtgcttcacctggcagctgtgtgtattctccctctccaaggatcc。
本发明人在综合分析hpv16、hpv18和hpv多型序列的基础上，发现hpv16dna的一段保守序列和hpv18dna的一段保守序列尽管在基因组的位置相同，但两者有很大差异，与hpv其他型的序列也有较大差异，将这两段保守序列进行重组得到的重组序列，用于实时pcr检测hpv16dna和hpv18dna的特异性好。此外，针对上述重组序列的引物和探针都结构优良，无二聚体和发夹结构，pcr扩增效率高，检测hpv16dna和hpv18dna的敏感性也非常高。
第二方面，本发明提供含有本发明hpv16-hpv18重组序列的质粒，将seqidno.1所示序列插入到pac57质粒中构建而成。
所述含有本发明hpv16-hpv18重组序列的质粒，是将pac57质粒经ecorⅰ和bamhⅰ双酶切消化后，与上游加入ecorⅰ酶切位点、下游加入hindⅲ酶切位点、如seqidno.2所示的hpv16dna保守序列，和上游加入hindⅲ酶切位点、下游引入bamhⅰ酶切位点、如seqidno.3所示的hpv18dna保守序列在连接酶作用下进行连接而成。
所述seqidno.2所示序列如下：
gacgactatccagcgaccaagatcagagccagacaccggaaacccctgccacaccactaagttgttgcacagagactccgtggacagtgctccaatcctca，其中，下划线的碱基c也可以为碱基a；
所述seqidno.3所示序列如下：
gggtgacactgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcgtgcttcacctggcagctgtgtgtattctccctctccaa。
在一些优选的实施方案中，所述含有本发明hpv16-hpv18重组序列的质粒，由如下方法制备得到：
步骤(1)：提取hpv16dna和hpv18dna，pcr扩增，
其中，hpv16dna扩增的上游引物序列为：
cggaattcgacgactatccagcgaccaag，cggaattc为保护碱基及ecorⅰ酶切位点，
下游引物序列为：
ccaagctttgaggattggagcactgtcc，ccaagctt为保护碱基及hindⅲ酶切位点；
hpv18扩增的上游引物序列为：
ccaagcttgggtgacactgtgcctcaatcc，ccaagctt为保护碱基及hindⅲ酶切位点，
下游引物序列为：
cgggatccttggagagggagaatacacac，cgggatcc为保护碱基及bamhⅰ酶切位点；
步骤(2)：将hpv16dnapcr扩增产物经ecorⅰ和hindⅲ双酶切消化，hpv18dnapcr扩增产物经hindⅲ和bamhⅰ双酶切消化，pac57质粒经ecorⅰ和bamhⅰ双酶切消化；
步骤(3)：将步骤(2)所得消化产物纯化后在连接酶作用下进行连接即得。
第三方面，应用本发明hpv16-hpv18重组序列或含有本发明hpv16-hpv18重组序列的质粒作为参考标准品或阳性质控品，实时荧光pcr检测hpv16dna和/或hpv18dna，包括以下步骤：
步骤a：配制一系列浓度的含有本发明hpv16-hpv18重组序列质粒的标准溶液；
步骤b：分别以步骤a中不同浓度的含有本发明hpv16-hpv18重组序列质粒的标准溶液为模板，以gacgactatccagcgaccaag为上游引物，以tgaggattggagcactgtcc为下游引物，以fam-cggaaacccctgccacac-mgb为探针，实时荧光pcr，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，制得hpv16dna检测标准曲线；和/或分别以步骤a中不同浓度的含有本发明hpv16-hpv18重组序列质粒的标准溶液为模板，以gggtgacactgtgcctcaatcc为上游引物，以ttggagagggagaatacacac为下游引物，以vic-caggtgaagcacgcata-mgb为探针，实时荧光pcr，以浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，制得hpv18dna检测标准曲线；
步骤c：提取待测样品的hpv16dna，同步骤b的方法进行实时荧光pcr，根据步骤b制得的hpv16dna检测标准曲线得到待测样品hpv16dna浓度；和/或提取待测样品的hpv18dna，同步骤b的方法进行实时荧光pcr，根据步骤b制得的hpv18dna检测标准曲线得到待测样品hpv18dna浓度。
上述方法将hpv16-hpv18重组序列作为实时荧光定量pcr检测hpv16dna和hpv18dna的参考标准品或阳性质控品，不仅敏感特异，而且使用非常简单方便，在一个反应体系内即可完成hpv16dna和hpv18dna的精确定量测定。
附图说明
图1为含有hpv16-hpv18重组序列的重组质粒经ecorⅰ和bamhⅰ酶切消化的电泳图，其中，1是含有hpv16-hpv18重组序列的重组质粒，2是含有hpv16-hpv18重组序列的重组质粒经ecorⅰ和bamhⅰ消化的产物，m是dl3000marker，分别为100、250、500、750、1000、1500、2000、3000bp；
图2为实施例2制得的线性曲线图；
图3为实施例3制得的实时定量pcr测定hpv16dna的标准曲线图；
图4为实施例4制得的线性曲线图；
图5为实施例5制得的实时定量pcr测定hpv16dna的标准曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于解释说明本发明，并非限制本发明。
分子生物学试剂及材料：核酸提取试剂盒，购于上海透景生命科技；引物；上海生工合成提供；探针，上海辉睿生物合成提供；高保真pcr试剂，购于大连宝生物；pcr产物纯化试剂盒，购于上海生工；限制性内切酶，购于大连宝生物；dna连接酶，购于大连宝生物；原核克隆质粒pac57(ampr)，购于金斯瑞；琼脂糖，购于biorad；定量pcr检测试剂，购于南京诺唯赞生物；hpv16dna液体标准物质，购于广州邦得盛生物；hpv18dna液体标准物质，购于广州邦得盛生物。
仪器：伯乐cfx96荧光定量pcr仪。
dna片段的连接、转化及转化子筛选，限制性内切酶分析等常规方法均参照文献sambrookj,etal.molecularcloning-alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,newyork,2ndedition,1989或厂家提供的产品说明书；dna序列分析在金斯瑞测序服务中心完成。
实施例1hpv16-hpv18重组序列及含有hpv16-hpv18重组序列质粒的构建
取hpv16、hpv18阳性标本各一例，用核酸提取试剂盒提取dna，用高保真pcr试剂盒进行pcr扩增。其中，hpv16扩增的上游引物序列为：
cggaattcgacgactatccagcgaccaag，cggaattc为保护碱基及ecorⅰ酶切位点，
下游引物序列为：ccaagctttgaggattggagcactgtcc，ccaagctt为保护碱基及hindⅲ酶切位点；
hpv18扩增的上游引物序列为：
ccaagcttgggtgacactgtgcctcaatcc，ccaagctt为保护碱基及hindⅲ酶切位点，
下游引物序列为：cgggatccttggagagggagaatacacac，cgggatcc为保护碱基及bamhⅰ酶切位点。
hpv16、hpv18扩增反应体系：primestarmaxpremix(2×)25μl，上游引物10pmol，下游引物10pmol，dna模板2μl，灭菌蒸馏水补至50μl。扩增条件为：94℃，5min→94℃，30sec，55℃，20sec，72℃，20sec，35个循环→72℃，5min。
hpv16pcr扩增产物经ecorⅰ和hindⅲ双酶切消化，hpv18pcr扩增产物经hindⅲ和bamhⅰ双酶切消化，pac57载体经ecorⅰ和bamhⅰ双酶切消化，三者消化产物纯化后在连接酶作用下进行连接，转化感受态细胞jm109。筛选阳性克隆，提取重组质粒经ecorⅰ和bamhⅰ酶切鉴定，结果见图1，送金斯瑞公司测序。
测得序列如下：
gaattcgacgactatccagcgaccaagatcagagccagacaccggaaacccctgccacaccactaagttgttgcacagagactccgtggacagtgctccaatcctcaaagcttgggtgacactgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcgtgcttcacctggcagctgtgtgtattctccctctccaaggatcc，
与预期完全相符。
实施例2hpv16-hpv18重组序列在实时荧光定量pcr检测hpv16dna中的应用
实时荧光pcr体系：2×acequ+probemastermix10μl，上游引物：4pmol，下游引物4pmol，探针2pmol，dna模板2μl，灭菌蒸馏水补至20μl。
hpv16扩增的上游引物序列为：gacgactatccagcgaccaag，下游引物序列为：tgaggattggagcactgtcc，与克隆用的引物相比，去掉了酶切位点与保护碱基。探针序列及标记为：fam-cggaaacccctgccacac-mgb。
扩增条件为：37℃，2min→95℃，5min→95℃，10sec，60℃，30sec，读板，40个循环。
将实施例1制得的含有hpv16-hpv18重组序列的质粒分别用灭菌蒸馏水稀释103、104、105、106、107、108、109倍，分别作为dna模板加入上述实时荧光pcr体系进行pcr扩增，制得线性曲线，结果见图2，结果表明线性优异，有助于精确定量测定hpv16dna含量。
实施例3实时定量pcr测定hpv16dna的标准曲线
将含有hpv16-hpv18重组序列的重组质粒稀释为：1.25×107iu/ml、1.25×106iu/ml、1.25×105iu/ml、1.25×104iu/ml的标准溶液，其中1.25×107iu/ml经hpv16标准品校准，其余浓度10倍递比稀释而成，将上述标准溶液作为dna模板加入实施例2的实时荧光pcr体系进行pcr扩增，制得标准曲线，结果见图3。
实施例4hpv16-hpv18重组序列在实时荧光定量pcr检测hpv18中的应用
实时荧光pcr体系：2×acequ+probemastermix10μl，上游引物：上游引物5pmol，下游引物5pmol，探针2.5pmol，dna模板2μl，灭菌蒸馏水补至20μl。
hpv18扩增的上游引物序列为：gggtgacactgtgcctcaatcc，下游引物序列为：ttggagagggagaatacacac，与克隆用的引物相比，去掉了酶切位点与保护碱基。探针序列及标记为：vic-caggtgaagcacgcata-mgb。
扩增条件为：37℃，2min→95℃，5min→95℃，10sec，60℃，30sec，读板，40个循环。
将含有hpv16-hpv18重组序列的重组质粒分别用灭菌蒸馏水稀释103、104、105、106、107、108、109倍，作为dna模板加入上述实时荧光pcr体系进行pcr扩增，制得线性曲线，结果见图4，结果表明线性优异，有助于精确定量测定hpv18dna含量。
实施例5实时荧光定量pcr检测hpv18的标准曲线
将含有hpv16-hpv18重组序列的重组质粒稀释为：1.2×107iu/ml、1.2×106iu/ml、1.2×105iu/ml、1.2×104iu/ml的标准溶液，其中1.2×107iu/ml经hpv18标准品校准，其余浓度10倍递比稀释而成，分别将标准溶液作为dna模板加入实施例4的实时荧光pcr体系进行pcr扩增，制得标准曲线，结果见图5。
序列表
<110>宁波市凯美生物技术有限公司
<120>hpv16-hpv18重组序列、包含其的质粒及其应用
<130>2018032701
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gaattcgacgactatccagcgaccaagatcagagccagacaccggaaacccctgccacac60
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actgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcgtgcttcacctggcagctgt180
gtgtattctccctctccaaggatcc205
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
gacgactatccagcgaccaagatcagagccagacaccggaaacccctgccacaccactaa60
gttgttgcacagagactccgtggacagtgctccaatcctca101
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
gggtgacactgtgcctcaatccttatatattaaaggcacaggtatgcgtgcttcacctgg60
cagctgtgtgtattctccctctccaa86