本发明属于基因工程技术领域，涉及il21融合蛋白及其制备方法和在制备靶向治疗肿瘤药物中的用途，具体涉及一种il21-apoa1融合蛋白（基因）、其编码核苷酸序列以及融合蛋白（基因）及其制备方法和在制备靶向免疫治疗肿瘤药物中的用途。
背景技术：
资料显示了恶性肿瘤严重影响人类健康甚至威胁生命，中国恶性肿瘤的发生率和死亡率逐年上升。临床实践中通常采用外科手术、放化疗等干预方式，由于肿瘤具有难以根治、易复发和易浸润转移的特点，传统治疗手段效果差强人意，因此新型肿瘤治疗方法亟需出现。自上个世纪五十年代开始，肿瘤免疫学进入公众视野，其通过外源性药物激发体内免疫系统，刺激和调节体内免疫细胞，进而改善机体肿瘤微环境，从而控制并杀伤肿瘤细胞；肿瘤免疫疗法包括若干治疗手段，其中细胞因子治疗是研究相对成熟的一类肿瘤免疫疗法。
研究报道白细胞介素是调节机体免疫系统最重要的一大类细胞因子，目前已发现38种白细胞介素，其中白细胞介素2家族在免疫生理、病理，尤其是肿瘤免疫应答方面发挥极其重要的作用。研究显示，白细胞介素2家族中白细胞介素21由cd4+t细胞和nkt细胞产生，其可促进cd4+t细胞分化成t17细胞，后者会引起炎症；白细胞介素21还可以通过抗cd4抗体共刺激促进成熟b细胞的增殖，进而分化为浆细胞（pc），合成和分泌各类抗体；也可促进cd8+t细胞和nk细胞的产生，产生直接的细胞毒性，后者还可产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（adcc）；还可促进补体激活后产生的膜攻击复合物，发挥抗体依赖的细胞毒性作用；另外，白细胞介素21能使γ/δt细胞分化为中心记忆细胞，与肠道炎症有关；促使骨髓单个核细胞向树突状细胞（dc）分化，但其抑制成熟dc的功能，等。sondergaardh等研究发现il-21在治疗小鼠b16黑色素瘤和renca肾癌过程中，通过增加肿瘤中cd8+t淋巴细胞密度从而抑制肿瘤生长。实践显示，目前白介素-21血浆半衰期为2-4h，在临床应用中存在不足，部分研究表明融合蛋白可弥补这一缺陷，gassenrb等构建表达了融合蛋白il-21/免疫球蛋白，以延长il-21体内半衰期，但其构建的融合蛋白缺乏靶向性。
研究还公开了血清载脂蛋白a1是人高密度脂蛋白（hdl）的重要组成部分，血清载脂蛋白中高密度脂蛋白体积最小、密度最高，具有促进胆固醇的代谢的作用；通过hdl介导的胆固醇逆向转运，可减少脂质在血管壁的沉积，降低血浆和血管壁中的胆固醇水平；血清载脂蛋白a1占hdl的70%，由肝脏或小肠分泌的血清载脂蛋白a1和内皮细胞表明的三磷酸腺苷结合转运体a1结合后，逐步形成成熟的hdl；在机体中，肾脏、肝脏等器官均存在血清载脂蛋白a1受体，肿瘤细胞表面大多存在apoai受体。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟供新的il21融合蛋白及其制备方法和用途；尤其提供一种il21-apoa1融合蛋白及其在制备靶向治疗肿瘤药物中的用途。
技术实现要素：
本发明的目的是克服普通重组人白细胞介素21在体内半衰期短的不足之处，提供白细胞介素21的新用途，具体涉及il21融合蛋白及其制备方法和用途；尤其提供一种il21-apoa1融合蛋白及其在制备靶向治疗肿瘤药物中的用途。
本发明中基于hdl类似于天然的脂质体，将其作为载体运载药物，通过制备apoai、卵磷脂、小分子药物制备重组hdl-药物复合物，进行肝癌靶向治疗；更具体的，本发明中通过基因工程的手段构建出表达il21-apoa1融合蛋白的质粒，表达il21-apoa1融合蛋白，利用肝脏、肾脏上有apoa1受体的生理特点，将白细胞介素21选择性地运输到肾、肝等器官，促进t淋巴细胞、nk细胞杀伤肿瘤细胞，且提高白细胞介素21在体内的半衰期，延长其作用。
本发明所述il21-apoa1融合蛋白不仅有肝靶向作用，还可增强il-21体内抗肿瘤作用，且该融合蛋白的两部分均为人源蛋白，具有极高的生物安全性。
具体的，本发明提供了一种融合基因，所述的融合基因包括白细胞介素21及血清载脂蛋白a1编码基因，所述的白细胞介素21及血清载脂蛋白a1编码基因之间通过n个编码氨基酸的基因连接，其核苷酸序列如seqid.1；
本发明提供了一种新型的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白的由白细胞介素21及血清载脂蛋白a1融合基因所表达的，所述的白细胞介素21及血清载脂蛋白a1之间通过n个柔性氨基酸组成的连接肽段连接（n≥0）。
本发明提供了il21-apoa1融合蛋白（基因），所述的融合蛋白为白细胞介素21和血清载脂蛋白a1的二聚体融合蛋白（基因），所述的白细胞介素21和血清载脂蛋白a1之间通过柔性连接肽段连接；
所述的白细胞介素21选自人白细胞介素21；所述的血清载脂蛋白a1选自人血清载脂蛋白a1，所述连接肽段是ggggsggggs；
所述的白细胞介素21为人白细胞介素21，其氨基酸序列如seqid.2所示；所述的血清载脂蛋白a1为人血清载脂蛋白a1，其氨基酸序列如seqid.3；所述的融合蛋白氨基酸序列如seqid.4所示，第132-141位氨基酸残基为连接肽段。
本发明提供了编码融合蛋白的dna分子，所述的dna核苷酸序列如seqid.5所示。
本发明提供了含有dna分子的重组载体，包括原核动物细胞表达载体以及真核动物细胞表达载体，如pet28a、、pgex-6p-1、pgex-4t-1、puc57、ppic9k、pcmvp-neo-ban、pcdna3.1(+)、pvax1等。
本发明提供了含有重组载体的宿主细胞，原核动物表达细胞，如e.colibl21、top10、rosetta菌株等；真核动物表达细胞，如p.pastorisgs115等。
本发明进一步提供了一种融合基因il21-apoa1在制备基因治疗药物中的应用，如抗肿瘤药物。
本发明提供了融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其在制备肿瘤靶向基因治疗药物中的应用，优选的所述肿瘤为黑色素瘤、肾癌及肝癌。
本发明提供了一种长效的il21-apoa1融合蛋白，该重组融合蛋白，在体内、外均可表现出良好的生物活性和稳定性，能有效抑制肿瘤生长，同时延长白细胞介素21的血浆半衰期；本发明的一个实施例中，所述的融合蛋白il21-apoa1延长il-21半衰期，il21-apoa1半衰期为il-21的3倍左右，还具有明显的肝靶向作用，明显优于现有技术的融合蛋白体系。
附图说明
图1是含有编码il21-apoa1融合蛋白的核苷酸序列的重组载体结构图。
图2是含有融合基因il21-apoa1的核苷酸序列的重组载体结构图。
图3是il21-apoa1融合蛋白重组表达质粒的pcr产物电泳图，其中lane1dl2000dnamarker（2000,1000,750，500，250，100bp），lane2il21-apoa1融合蛋白重组表达质粒的pcr产物。
图4是纯化后的il21-apoa1融合蛋白的sds-page分析图，其中lane1蛋白marker（120，90，60，40，30，20，14kd）；lane2纯化的融合蛋白。
图5是il21-apoa1融合蛋白的血浆半衰期测定结果。
图6是il21-apoa1融合蛋白促进人外周血单核细胞增殖曲线。
图7是il21-apoa1融合蛋白促进人外周血单核细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用曲线。
具体实施方式
实施例1il21-apoa1融合蛋白重组表达质粒的构建
编码白细胞介素21及血清载脂蛋白a1基因片段可从puc57/il21（①质粒）、puc57/apoa1（②质粒）e.coli（于南京金斯瑞生物科技有限公司购买）经双酶切法获得；将上述两种大肠杆菌划含氨苄霉素抗性的lb平板活化，挑选阳性菌落进行扩增，并抽提质粒，①质粒经过ndeⅰ和bamhⅰ的双酶切，dna凝胶验证正确后dna凝胶回收，得到白细胞介素21目的基因，以②质粒为模板pcr扩增血清载脂蛋白a1基因，所用引物序列（下游引物含连接肽段核苷酸序列）如下
上游引物：5’-cgcggatccgaaggtgaaggtagtgacgaaccacctcaat
下游引物：5’-cgcctcgagttgtgtgttcaatttc
用50μl的pcr反应体系，其中premixtaq酶加25μl；ddh2o加22μl；20mm的引物各加1μl；②质粒加1μl，应条件为94℃预变性5min；94℃45s、50℃45s、72℃90s，30个循环；72℃退火10min，4℃终止。pcr产物dna凝胶验证正确后dna凝胶回收，得到血清载脂蛋白a1目的基因（含连接肽段）；将含pet28a质粒的e.coli菌株活化后抽提质粒，经ndeⅰ和bamhⅰ双酶切后，与白细胞介素21目的基因经t4dna连接酶连接，并转化top10e.coli菌株，筛选抗卡那霉素的阳性菌落并进行pcr验证，验证正确的菌株扩增抽提质粒，经bamhⅰ和xhoⅰ双酶切后，与血清载脂蛋白a1目的基因（含连接肽段）经t4dna连接酶连接，并转化top10e.coli菌株，筛选抗卡那霉素的阳性菌落经测序比对，与预期序列完全一致，将含pet28a/il21-apoa1质粒(含连接肽段)的菌株25%甘油，-70℃保存。
实施例2融合基因重组质粒的构建
将puc57/il21-apoa1质粒(含连接肽段)经过bamhⅰ和hindⅲ双酶切后，dna凝胶验证正确后dna凝胶回收，得到il21-apoa1序列（含连接肽段），将pcdna3.1(+)质粒经bamhⅰ和hindⅲ双酶切后，与il21-apoa1目的基因（含连接肽段）经t4dna连接酶连接，并转化top10e.coli菌株，筛选抗g418的阳性菌落并经测序验证，与预期序列完全一致，将含pcdna3.1(+)/il21-apoa1质粒（含连接肽段）的菌株25%甘油，-70℃保存。
实施例3il21-apoa1融合蛋白表达和纯化
将构建成功的pet28a/il21-apoa1质粒(含连接肽段)转化至不同的感受态e.coli表达宿主（bl21、bl21（de3）、bl21（de3）plyss、rosetta菌株），采用卡那霉素和氯霉素双抗性筛选，筛选阳性菌落经pcr验证，验证正确的菌株进行诱导表达，取阳性菌落于3mllb培养基，37℃、200rpm培养，至od600nm值为0.6左右，加入1mmiptg，16℃、200rpm培养12h，经sds-page分析挑选高表达菌株，于5l摇瓶中扩大培养，诱导条件如上，收集菌体，加入适量pb重悬，冰浴超声破碎菌体，收集上清，用ni-ntx亲和层析柱纯化，用0.5mmnaoh清洗纯化柱，上样速度2ml/min，过5倍柱体积；用0.2mpb（ph8.0）清洗和平衡纯化柱，上样速度2ml/min,过10-15倍柱体积；上样，上样速度1ml/min；上样结束后，用0.2mpb（ph8.0）清洗纯化柱，上样速度1ml/min，过10-15倍柱体积；a泵进0.2mpb（ph8.0），b泵进200mm咪唑，洗脱速度2ml/min，过10倍柱体积梯度洗脱，收集与洗脱峰对应的洗脱液；纯化后的融合蛋白溶液经sephadex-g25柱脱盐，sds-page分析（如图4所示），脱盐后的融合蛋白溶液使用透析袋透析浓缩，-20℃保存。
实施例4il21-apoa1融合蛋白的血浆半衰期测定
7只balb/c小鼠（4-6周）皮内注射il21-apoa1融合蛋白，每只给药75μg，在30min、1h、2h、5h、12h、18h、24h、48h眼眶取血，血样用特异性elisa检测il21-apoa1融合蛋白的浓度，结果显示，il21-apoa1融合蛋白的血浆半衰期为30h，结果如图5所示。
实施例4il21-apoa1融合蛋白促进人外周血单核细胞（pbmc）增殖
从人外周血中分离得到人外周血单核细胞，分为3组：（1）空白对照组；（2）il21组；（3）il21-apoa1组，于96孔板内接种细胞悬液200μl，每组设3个复孔，每孔5×106个细胞，il21浓度为50ng/ml，il21-apoa1浓度为150ng/ml，置于37℃、5%co2、饱和湿度培养箱分别培养24h、48h、72h，cck8试剂盒测定细胞增殖情况，结果显示il21-apoa1融合蛋白可促进人外周血单核细胞增殖，与il21无显著性差异如图6所示（）。
实施例5il21-apoa1融合蛋白促进人外周血单核细胞（pbmc）对肿瘤细胞的杀伤
将k562细胞分为3组：（1）人外周血单核细胞+k562细胞；（2）il21+人外周血单核细胞+k562细胞；（3）il21-apoa1+人外周血单核细胞+k562细胞；ldh法检测杀伤率：靶细胞浓度为1x10^5/ml，每孔加入细胞悬液50μl，置于37℃、5%co2培养箱培养12h，细胞贴壁完全后，将效靶比为50:1的人外周血单核细胞加入上述2个实验组中，il21浓度为50ng/ml，il21-apoa1浓度为150ng/ml；另外每组细胞设置3个复孔，且分别设置最低控制孔（50μl靶细胞+50μl培养液），最高控制孔（50μlnk细胞+50μl培养液），各组细胞混合4h后，最高控制孔加入5μllysissolution，37℃孵育15min，每孔加入100μlreactionmixture，室温孵育30min，每孔加入50μlstopsolution，摇晃10s，酶标仪490nm处测吸光度；
细胞毒性%=（（效-靶细胞混合孔od值–效应细胞孔od值）-最低控制孔od值/（最高控制孔od值-最低控制孔od值））x100%
结果显示，il21-apoa1融合蛋白可刺激人外周血单核细胞对k562细胞产生杀伤作用（如图7所示）。
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