本发明涉及一种得到高表达、高活力及高稳定性的酶突变体的方法，属于基因工程及酶工程
技术领域：
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背景技术：
：基于表达量及热稳定性对酶应用性能的重要影响，获得高表达量和高热稳定性的酶一直是酶工程领域的研究热点。表达量，热稳定性及酶催化活力之间存在一定的相互促进关系，表达量方面，现有技术通常通过表达元件的优化或末端融合表达标签来提高蛋白酶的表达量，但是表达元件的优化具有一定的不确定性，并且最常用的表达标签mbp及gst等大分子，对酶的后期应用都具有一定的影响，往往需要繁琐的程序将其去除；稳定性方面，随着结构生物学与生物信息学的发展，研究者可以通过一些结构参数的分析(如b-因子、rmsf值等)或同源序列比对，较准确地定位影响酶分子热稳定性的氨基酸残基或肽段，进而对其进行定点突变提高酶的热稳定性。尽管已成为酶热稳定性改造的常规策略，上述分子改造技术仍有其固有的技术缺陷。定点突变的前提是获得准确的酶分子结构信息，体外定向进化则面临大量的突变体筛选，导致短时间内难以获得热稳定性明显提升的突变体。因此，建立一种高效、便捷的酶稳定化策略成为国内外研究者关注的焦点。值得注意的是，融合短肽对酶的表达量及热稳定性的提高是在无酶结构信息和大量突变体筛选的条件下完成的，较传统分子改造技术的效率显著提高。其最早是由日本大阪大学urabe团队在研究嗜热脂肪芽孢杆菌过氧化氢酶的热稳定性时发现的(natbiotechnol,1999,17(1):58-61)；研究者在过氧化氢酶c-端随机融合不同长度和氨基酸序列的短肽，得到一系列高热稳定性的突变体；此后，大阪大学kanaya团队发现c-端融合嗜热古菌核糖核酸酶c-端七肽(igciilt)，可以不同程度地提高不同来源的核糖核酸酶的热稳定性(plosone,2011,6(1):e16226)。saps是一类亲疏水氨基酸交替分布，能自发组装成纳米结构的短肽，其特有的两亲性质使得其在水中能形成水凝胶，从而对目的蛋白或其他小分子进行固定化。基于此，在本研究室前期研究中(applmicrobiolbiot,2013,97(21):9419-9427)，将一类saps融合在酶n端进行融合酶异源表达，发现saps具有提高酶表达量及稳定性的功能，其中具有特殊电荷分布的s1(aeaeakakaeaeakak)具有一定的普适性效果；清华大学lin等(faradaydiscuss,2013,166:233)利用与s1氨基酸组成类似的sap(lelelklklelelklk)融合在酶末端，可促进生成活性包涵体，说明氨基酸组成对saps融合蛋白的分泌表达及稳定性有重要影响。另一方面，saps与酶之间的连接肽的组成对融合酶的表达及稳定性也起到重要作用(enzymemicrobtech,2016,82:105-109)。本发明尝试以saps为基础构建一种多肽文库，以快速、高效、便捷的得到具有高表达、高活力及高稳定性的蛋白酶突变体。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种得到高表达、高活力及高稳定性的酶突变体的方法。此方法基于以saps为基础构建的功能性多肽文库，整个获得酶突变体的过程快速、高效、便捷；同时，应用此功能性多肽文库而得的碱性果胶酶突变体，相较于野生型碱性果胶酶，胞外酶活最高提高了15.32倍，稳定性最高提高了3.86倍，比酶活最高提高了2.55倍；脂肪氧合酶融合酶突变体胞内酶活最高提高了2.49倍，稳定性最高提高了3.82倍，比酶活最高提高了0.49倍；天冬酰胺酶融合酶突变体胞外酶活最高提高了2.33倍，稳定性最高提高了1倍，比酶活最高提高了1.17倍。本发明的技术方案如下：本发明提供了一种得到高表达、高活力及高稳定性的酶突变体的方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤1：构建功能性多肽文库；步骤2：将步骤1中功能性多肽文库所得的表达宿主细胞以荧光强度为筛选标准，进行初筛，筛选出强荧光强度的宿主细胞；步骤3：将步骤2中初筛后获得的强荧光强度的宿主细胞进行培养，以荧光强度为筛选标准，进行复筛鉴定，再次筛选出具有强荧光强度的宿主细胞；步骤4：将步骤3中复筛所得的具有强荧光强度的宿主细胞中的表达载体进行荧光蛋白表达基因缺失，将缺失后的表达载体重新进行异源表达，获得酶突变体；步骤5：将获得的酶突变体经过热处理后进行稳定性测定，筛选出具有高稳定性的酶突变体；所述步骤1中的功能性多肽文库由含有功能性表达载体的宿主细胞表达所得；所述功能性表达载体包含不同长度及氨基酸组成的双亲短肽(self-assemblingamphipathicpeptide，sap)、不同长度及不同刚柔性的连接肽(linker)、荧光蛋白表达基因以及待筛选酶表达基因。在本发明的一种实施方式中，所述步骤2中初筛为用流式细胞仪进行初筛。本发明提供了一种用于得到高表达、高活力及高稳定性的酶突变体的功能性多肽文库，所述功能性多肽文库由含有功能性表达载体的宿主细胞表达所得；所述功能性表达载体包含不同长度及氨基酸组成的双亲短肽(self-assemblingamphipathicpeptide，sap)、不同长度及不同刚柔性的连接肽(linker)、荧光蛋白表达基因以及待筛选酶表达基因。在本发明的一种实施方式中，所述sap以linker连接至待筛选酶表达基因的5’端。在本发明的一种实施方式中，所述荧光蛋白表达基因融合在待筛选酶表达基因的3’端。在本发明的一种实施方式中，所述sap是以序列为seqidno.1的基因经过编码所得的sap和/或以序列为seqidno.1的基因经过编码所得的sap为模板，进行进一步的长度及氨基酸的随机突变所得的saps。在本发明的一种实施方式中，所述linker包含不同的刚性肽和柔性肽组合单元。在本发明的一种实施方式中，所述刚性肽和柔性肽的组合单元氨基酸序列分别为seqidno.2和seqidno.3。在本发明的一种实施方式中，所述刚性肽和柔性肽的组合单元分别为序列为seqidno.4和seqidno.5的基因编码所得的。在本发明的一种实施方式中，所述linker中刚性肽与柔性肽组合的长度为1到5个单位之间。在本发明的一种实施方式中，所述linker中刚性肽与柔性肽的组合方式包含表1所示内容。表1连接肽序列表本发明提供了一种用于得到高表达、高活力及高稳定性的酶突变体的功能性多肽文库的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：步骤1：在表达载体的多克隆位点引入多个多克隆位点，对表达载体进行改造；步骤2：在步骤1所得的改造后的表达载体的多克隆位点依次引入待筛选酶表达基因、sap和荧光蛋白表达基因；步骤3：在步骤2引入的待筛选酶表达基因的上游引入linker基因，使得sap以linker与待筛选酶表达基因相连，得到功能性表达载体；步骤4：将步骤3所得的功能性表达载体转化至表达宿主细胞进行异源表达，得到功能性多肽文库。在本发明的一种实施方式中，所述表达载体骨架为pet-22b(+)。在本发明的一种实施方式中，所述步骤1中引入的多克隆酶切位点数量为四个。在本发明的一种实施方式中，所述步骤2为在待筛选酶基因的5’端用linker基因连接sap，在待筛选酶表达基因的3’端融合荧光蛋白表达基因。在本发明的一种实施方式中，所述步骤2为用pcr方法将表达载体线性化，在待筛选酶表达基因上游区域利用简并引物引入sap突变。在本发明的一种实施方式中，所述步骤3为用含有步骤2同源臂的引物对linker基因进行pcr，以连接了不同linker的重组质粒为模板对linker进行扩增，最后将linker融合至sap与待筛选酶表达基因之间使得sap以linker与待筛选酶表达基因相连，得到功能性表达载体。在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒为pmd-18t。本发明提供了一种酶突变体，所述酶的氨基酸序列为seqidno.6。本发明提供了一种酶突变体，所述酶的氨基酸序列为seqidno.7。本发明提供了一种酶突变体，所述酶的氨基酸序列为seqidno.8。有益效果：(1)本发明得到的酶突变体，相较于野生型碱性果胶酶，碱性果胶酶的融合酶突变体的胞外酶活最高提高了15.32倍，稳定性最高提高了3.86倍，比酶活最高提高了2.55倍；脂肪氧合酶融合酶突变体胞内酶活最高提高了2.49倍，稳定性最高提高了3.13倍，比酶活最高提高了0.9倍；天冬酰胺酶融合酶突变体胞外酶活最高提高了2.25倍，稳定性最高提高了3.56倍，比酶活最高提高了1.34倍。(2)本发明结合saps自身组成特点，连接肽组成特点，应用于酶的表达量，稳定性筛选，催化活性，底物亲和性或综合效果的筛选。(3)本发明构建的功能性多肽文库容量可达到106以上，正向突变率可达到86％，且突变种类平衡(如图2)。(4)本发明以gfp为表达量筛选标记，筛选方法简单，可以进行高通量筛选，在酶表达量及稳定性改造方面具有广泛用途。(5)本发明以流式细胞仪对荧光细胞进行高通量分选，流式细胞仪分选技术具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。附图说明图1本发明功能性多肽文库构建示意图。图2-7本发明功能性多肽文库突变率表征分析图。具体实施方式以下是本发明的实施例，但不以任何形式限制本发明。本发明中相关融合酶表达菌株培养方式、纯化方式及酶学性质测定如下所示。培养基组成(g/l)：种子培养基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠5；发酵培养基：将下列组分溶解在0.9l水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml。各组分溶解后高压灭菌；冷却到60℃，再加100ml灭菌的0.17mol/l的kh2po4、0.72mol/l的k2hpo4溶液(2.31g的kh2po4和12.54g的k2hpo4溶在足量的水中，使终体积为100ml；0.22μm的滤膜过滤除菌)；培养方法：种子培养，挑取工程菌单菌落接入装液量为25ml的三角瓶(250ml)中，培养温度37℃，摇床转速200r/min，培养12h；发酵培养，按3％的接种量接入装液量为25ml的三角瓶(250ml)中，培养温度37℃，当od600达到0.6时，加入iptg诱导(其中pgl诱导量为0.04mm，lox为1mm，asn为1mm)，并同时调整温度到该酶最适宜的诱导温度下培养(pgl为30℃培养48h，lox为20℃培养24h，asn为30℃培养12h)。配置蛋白纯化液体：a液：20mm磷酸盐缓冲液，500mmnacl，20mm咪唑。b液：20mm磷酸盐缓冲液，500mmnacl，500mm咪唑。20mm的ph7.4的磷酸盐缓冲液配制方法：190ml20mm的nah2po4加810ml20mm的na2hpo4。碱性果胶酶酶活及热稳定性测定：采用分光光度法测定。单位酶活定义：单位时间裂解聚半乳糖醛酸产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所用的酶量。酶活测定条件为：酶活力检测：发酵液8000rpm离心10min，胞外pgl即包含于发酵上清液之中，取一定量做检测。pgl反应体系：含0.2％聚半乳糖醛酸(底物)的甘氨酸-naoh缓冲液(0.2mol/l，0.44mmol/l的cacl2，ph9.4)2ml，待测样品20μl，无活性的酶液为空白对照。pgl反应条件为：将反应体系置于45℃下水浴15min，用3ml磷酸溶液(0.03mol/l)终止反应，在235nm处测定吸光度值。将稀释好的酶液分装并置于60℃金属浴中，每隔3min取样进行残余酶活测定，计算半衰期。脂肪氧合酶酶活及热稳定性测定：采用分光光度法测定lox酶活。1个单位lox酶活定义为：25℃下每分钟催化底物亚油酸形成1μmol亚油酸氢过氧化物(hpod旋光系数＝25000l/(mol×cm))所需的酶量。酶活测定条件：以亚油酸为底物，在25℃下利用shimadzuuv-2450分光光度计在线测定234nm下吸光值的变化，以吸光值变化曲线初始部分的斜率计算酶活。将纯化后的酶用buffera稀释到蛋白浓度为100μg/ml并在50℃保温，间隔测定残余酶活，计算半衰期。天冬酰胺酶酶活及热稳定性测定：采用奈氏试剂法测定asn的酶活，(1)酶解反应：1ml磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph值为7.5)，300μl酶液，100μl底物，37℃反应30min后加入100μl三氯乙酸终止反应。混匀后12000r/min，离心2min。(2)显色反应：第一步酶解反应液200μl，3.3ml去离子水，500μl奈氏试剂。混匀后于436nm处测定吸光值。酶活性单位定义：每分钟水解l-天冬酰胺生成1μmol氨所需要的酶量定义为asn活力单位。标准曲线的绘制：配制18mmol/l的(nh4)2so4的标准溶液，分别在1.5ml管中加入0μl，50μl，100μl，200μl，250μl，300μl，350μl，400μl的(nh4)2so4的标准溶液，用去离子水补至400μl，然后加入1ml磷酸盐缓冲液(10mmol/l，ph值为7.5)，37℃反应30min后加入100μl三氯乙酸终止反应，混匀后12000r/min，离心2min后进行显色反应。将稀释好的酶液分装并置于55℃金属浴中，每隔3min取样进行残余酶活测定，计算半衰期。本实施例一共设置pgl，lox及asn一组对比组，sl1-pgl、sl2-pgl、sl3-pgl、sl1-lox、sl2-lox、sl3-lox及sl1-asn、sl2-asn、sl3-asn三组实施组。本实施例所涉及功能性多肽文库构建及筛选过程如图1所示。所涉及功能性多肽文库突变率表征分析如图2-7所示。所涉及sap和连接肽氨基酸序列如表2所示表2sap和连接肽序列实施例1：构建功能性多肽文库根据双亲短肽的氨基酸序列9s1(aeaeakakaeaeakak)9，化学合成其基因并连接至相待筛选酶(pgl，lox及asn)的基因序列n端，并将其克隆至目标酶或蛋白的质粒pet-22b(+)/enzyme(enzyme为待筛选蛋白表达基因，此处为pgl，lox及asn)的ndei和ncoi酶切位点之间，构建成为pet-22b(+)/9s1-enzyme质粒。在pet-22b(+)/9s1-enzyme末端融合gfp表达基因gfp，构建pet-22b(+)/9s1-enzyme-gfp质粒。以pet-22b(+)/9s1-enzyme-gfp质粒为模板，简并上游引物nsap-up及特异性的下游引物nsap-downenzymepcr获得线性化的含有不同氨基酸组成及长度的sap的pet-22b(+)/nsap-enzyme-gfp线性化基因片段。将连接肽基因预先化学合成并连接在pmd18-t载体上，以通用的上游lr-up及lf-up，及特异性的下游lr-downenzyme及lf-downenzyme为引物进行pcr获得连接肽基因片段。并与线性化的pet-22b(+)/nsap-enzyme-gfp基因片段进行同源重组。获得pet-22b(+)/nsap-linker-enzyme-gfp混合质粒。实施例2：初筛初筛：将重组质粒及重组质粒库转化至表达宿主大肠杆菌e.colibl21(de3)，种子培养基培养并诱导，继续培养一定时间(与待筛选酶的表达情况有关)后，(相关菌培养方式为：当od600达到0.6时，加入iptg诱导(其中pgl-gfp融合酶的iptg诱导量为0.04mm，lox-gfp为1mm，asn-gfp为1mm)，并同时调整温度到该酶最适宜的诱导温度下培养(pgl-gfp为30℃培养5h，lox-gfp为20℃培养10h，asn-gfp为30℃培养5h)。)将待筛选细胞进行稀释，设定流式细胞仪mofloxdpflowcytometry(beckmancoulter，usa)喷嘴大小为100μm，20mm的ph7.4的磷酸盐缓冲为鞘液，细胞od600设定为0.1以下，细胞流速为5000个粒子/秒，激发光波长为488nm，发射光波长为530/40nm的检测参数对样本进行分析测试。扣除相应的空白对照。实施例3：复筛鉴定复筛鉴定：将流式细胞仪分选后获得的强荧光强度突变体进行摇瓶培养及荧光强度测定。将单菌落接种于种子培养基过夜培养后转接至发酵培养基，当od600达到0.6时，加入iptg诱导(其中pgl-gfp融合酶的iptg诱导量为0.04mm，lox-gfp为1mm，asn-gfp为1mm)，并同时调整温度到该酶最适宜的诱导温度下培养(pgl-gfp为30℃培养48h，lox-gfp为20℃培养72h，asn-gfp为30℃培养24h)。实施例4：荧光蛋白基因缺失以上述获得的高表达突变体质粒为模板，进行gfp基因缺失，引物如表2所示。实施例5：酶突变体检测重组菌发酵培养，种子培养基37℃过夜培养后转接至发酵培养基，当od600达到0.6时，加入iptg诱导(其中pgl融合酶的iptg诱导量为0.04mm，lox为1mm，asn为1mm)，并同时调整温度到该酶最适宜的诱导温度下培养(pgl为30℃培养48h，lox为20℃培养72h，asn为30℃培养24h)。并在96孔板上对重组酶进行适当的稀释，分别将pgl重组酶置于65℃，lox重组酶置于55℃，asn重组酶置于70℃条件下进行热处理，进行残余酶活测定。检测结果如表4所示。表4融合酶突变体表达量及性质表征enzymes粗酶活(u/ml)半衰期(min)比酶活(u/mg)pgl131.17±2.45.2±0.22264.17±5.2sl1pgl2140.42±6.721.25±0.93918.72±8.4sl2pgl2033.9±9.125.29±1.1937.18±5.4sl3pgl1432.6±7.415.2±0.3710.2±5.7lox1.54±0.0210.2±0.230.2±0.97sl1lox5.38±0.0318.2±0.542.7±1.5sl2lox2.77±0.0242.2±0.926.21±0.13sl3lox3.08±0.0430.6±0.757.6±1.2asn3.8±0.0612.3±0.4217.24±0.23sl1asn12.36±0.1856.21±1.119.21±0.44sl2asn7.12±0.227.18±0.415.29±0.8sl3asn5.3±0.624.4±0.1740.4±1.88实施例6：酶突变体纯化碱性果胶酶纯化方法：将发酵上清液在9000r/min条件下离心15min获得含有碱性果胶酶的发酵上清液。在冰上进行硫酸铵沉淀对发酵液进行初步浓缩。透析除盐后，样品用0.22μm微孔滤膜过滤后，用5ml阳离子交换层析柱(hitraptmspff，ge)进行分离纯化。纯化条件为：10～15倍柱体积缓冲液a(20mmol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，ph7.4)平衡疏水柱，流速为2ml/min，1ml/min流速进样5ml后，2ml/min继续a液平衡至曲线平稳，用b缓冲液(20mmol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，1mol/lnacl，ph7.4)进行线性洗脱。将获得的含有pgl的洗脱液在a液中透析除盐，4℃保存。脂肪氧合酶纯化方法：将发酵上清液在9000r/min条件下离心15min获得含有碱性果胶酶的发酵上清液并加入10％(w/v)的甘油，缓慢加入研磨、干燥的硫酸铵粉末至硫酸铵的饱和度为40％并继续缓慢搅拌30min；随后将样品在12000rpm下离心15min，收集沉淀并复溶于含有50mmol/lnacl的缓冲液a中，离心去除沉淀后得到的上清液即为硫酸铵沉淀后的样品。将硫酸铵沉淀后的样品用截留分子量为50kda的透析袋在含有50mmol/lnacl的缓冲液a中透析24h，随后再在缓冲液a中透析24h脱盐。histrap1mlff纯化柱用缓冲液a以1ml/min的流速平衡，随后上样，平衡，b液线性洗脱收集重组lox的组分。将获得的含有lox的洗脱液在a液中透析除盐，4℃保存。天冬酰胺酶纯化方法：将发酵上清液在9000r/min条件下离心15min获得含有碱性果胶酶的发酵上清液。在冰上进行硫酸铵沉淀对发酵液进行初步浓缩。透析除盐后，样品用0.22μm微孔滤膜过滤后，用a液复溶，用5ml的疏水层析柱(hitraptmspff，ge)进行分离纯化。纯化条件为：10～15倍柱体积缓冲液a(20mmol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，ph7.4)平衡疏水柱，流速为2ml/min，1ml/min流速进样5ml后，2ml/min继续a液平衡至曲线平稳，用b缓冲液(20mmol/l甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，1mol/lnacl，ph7.4)进行线性洗脱。将获得的含有asn的洗脱液在a液中透析除盐，4℃保存。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。序列表<110>江南大学<120>一种得到高表达、高活力及高稳定性的酶突变体的方法<160>80<170>patentinversion3.3<210>1<211>432<212>dna<213>人工序列<400>1gcagaagcagaagcgaaagccaaagcggaggcggaagccaaggctaaagcagaagcagaa60gcgaaagccaaagcggaggcggaagccaaggctaaagcagaagcagaagcgaaagccaaa120gcggaggcggaagccaaggctaaagcagaagcagaagcgaaagccaaagcggaggcggaa180gccaaggctaaagcagaagcagaagcgaaagccaaagcggaggcggaagccaaggctaaa240gcagaagcagaagcgaaagccaaagcggaggcggaagccaaggctaaagcagaagcagaa300gcgaaagccaaagcggaggcggaagccaaggctaaagcagaagcagaagcgaaagccaaa360gcggaggcggaagccaaggctaaagcagaagcagaagcgaaagccaaagcggaggcggaa420gccaaggctaaa432<210>2<211>5<212>prt<213>人工序列<400>2glualaalaalalys15<210>3<211>5<212>prt<213>人工序列<400>3glyglyglyglyser15<210>4<211>15<212>dna<213>人工序列<400>4gaagctgcggcaaaa15<210>5<211>15<212>dna<213>人工序列<400>5ggtggtggcggttcg15<210>6<211>401<212>prt<213>人工序列<400>6metaspalaaspleuglyhisglnthrleuglyserasnaspglytrp151015glyalatyrserthrglythrthrglyglyserlysalaserserleu202530asnvaltyrthrvalserasnargasnglnleuvalseralaleugly354045lysgluthrasnthrthrprolysileiletyrilelysglythrile505560aspmetasnvalaspaspasnleulysproleuglyleuasnasptyr65707580lysaspproglutyraspleuasplystyrleulysalatyrasppro859095serthrtrpglylyslysgluproserglythrglngluglualaarg100105110alaargserglnlysasnglnlysalaargvalmetvalaspilepro115120125alaasnthrthrilevalglyserglythrasnalalysvalvalgly130135140glyasnpheglnilelysseraspasnvalileileargasnileglu145150155160pheglnaspalatyrasptyrpheproglntrpaspprothraspgly16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